（微生物学专业论文）大鼠cuznsod基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达.pdf

堕堑查兰堡主堕塑竺兰些! 堂垡! 堡兰 摘要 在p c r 引物两端加上合适的酶切位点后扩增大鼠c u z n s o de d n a ，经双 酶切后与表达载体p b v 2 2 0 连接，转化大肠杆菌d h 5 a 筛选出正确的重组质 粒p b v r c s ，经质粒稳定性检测，证明该重组质粒在宿主菌中能稳定存在，加 入一定浓度的金属离子经4 2 诱导后，r c s 得到了高表达，薄层扫描测定表达 蛋白占菌体总蛋白的4 9 ，目前国内外s o d 表达菌株中，该菌株为高表达菌株表 达蛋白以包涵体形式存在于菌体内，用超声波破壁后，经透析复性和稀释复性 后表达蛋白可以恢复部分活性本文还就不同的诱导条件对重组蛋白表达效率 的影响进行了探索，总结出重组蛋白的最佳诱导表达条件转化子经3 7 培养 至0 d 值为0 4 时，加入c u ”( 终浓度为0 5 m m ) 和z n ”( 终浓度为0 1 【i m ) ，在4 2 诱导5 小时后重组蛋白表达量最高 关键词：超氧化物歧化酶基因诱导表达包涵体复性 堕堑查兰堡主竺壅竺兰些| _ 堡型型生生一 h i g hl e v e le x p r e s s i o no f r a tc o p p e r z i n cs u p e r o x i d ed i s m u t a s ec d n ai n 尼c o h t w od i f f e r e n ts i t e so fr e s t r i c t i o ne n d o n u c l a s ew e r ed e s i g n e di n t h e p r i m e r s t h er a tc o p p e r z i n cs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( r c s ) c d n aw a su s e d a sat e m p l a t et oa m p l i f ya4 8 6 b pf r a g m e n tb yp c r t h ed e s i g n a t e da m p i i f i e d f r a g m e n t w a st h e n l i n k e dt oa n e x p r e s s i o n v e c t o r p b v 2 2 0 v i ad n a 1 i g a s e t h ev e c t o rp b v 2 2 0c o n t a i n sp r p lp r o m o t e r ，c i t s8 7 5g e n e ，m u l t i p l e c l o n i n gs i t e s ( m c s ) a n d t w os t r o n gt r a n s c r i p t i o nt e r m i n a t o r f o r e i g ng e n e w i t ha t gs i g n a lc a nb ei n s e r t e di n t ot h em c s ，e x p r e s s i n gn o n f u s i o n p r o t e i n b e f o r et r a n s f o r m a t i o n ，t h ec o m p e t e n tc e l l sw e r ep r e p a r e db y u s i n gc a c l 2 a f t e rt r a n s f o r m e di n t ot h ec o m p e t e n td h 5ac e l l ，t h e r e c o m b i n a n tp b v 2 2 0 一r c sw i t ht h ec o r r e c ti n s e r t i o nw a s s e l e c t e d w e r a n d o m l ys e le c t e d7 5 8t r a n s f o r m a n t st od ot h es t a b l et e s ta n df o u n dt h a t n e a r l y 1 0 0 o ft h er e c o m b i n e dp l a s m i d sc o u l d s t a b l y e x i s ti nt h e d h 5qc e l l s c u z n s o di sam e t a le n z y m ec o n t a i n i n gm e t a li o n s ，s oc u 2 + a n dz n 2 + m u s t b ea d d e di n t ot h ec u l t u r em e d i aw i t ha p r o p e rc o n c e n t r a t i o n t h e d h 5q ( w i t hp b v r c s ) w a si n d u c e da t4 2 cf o rs e v e r a lh o u r s u s i n gt h e s d s p a g ea n dc o m m a s s i s eb l u er 2 5 0t od e t e c tt h er e c o m b i n e dp r o t e i n ，w e f i n dt h a tt h er e c o m b i n a n tp b v r c sc a ne x p r e s sah i g h1 e v e lp r o t e i na n d a c c o u n tf o r4 9 o ft h et o t a lp r o t e i no ft h eb a c t e r i ac e l l t h ee x p r e s s e d p r o t e i ne x is t si nt h eb a c t e r i ai nt h ef o r mo fi n c l u s i o nb o d y t w o w a y so fr e n a t u r a t i o n ，i n c l u d i n gd i a l y t i cr e n a t u r a t i o na n dd i l u t i o n 2 堕堑查兰堡主堑塞兰兰些! 兰焦! 堡苎一 r e n a t u r a t i o n ，w e r eu s e dt or e n a t u r et h ea c t i v i t yo ft h e i n c l u s i o nb o d y w h i c hw e r et r e a t e db ys o n i c a t i o ni na d v a n c e t h em e t h o do fa u t o x i d a t i o n o fp y r o g a l l di st a k e na st h ee n z y m ea c t i v i t yd e t e c t i o nm e t h o dt od e t e c t t h ea c t i v i t yo ft h er e n a t u r e di n c u s i o n w ec o n c l u d e dt h a tap a r to ft h e a c t i v i t yo ft h ei n c l u s i o nc o u l db er e n a t u r e d d i f f e r e n tc o n d i t i o n sa n ds o m ef a c t o r s a f f e c t i n g t h e e x p r e s s i o n e f f i c i e n c yw e r ea l s os t u d i e da n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ec o n c l u d e d k e yw o r d s ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，g e n ee x p r e s s i o n ，i n c l u s i o nb o d y r e n a t u r a t i o n 3 堕墅盔兰堡主婴塑兰兰些! 兰丝鱼奎一 前言 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ，s o d ，e c l 1 5 1 1 ) 是机体 抗氧化应激酶系统中的重要成员，它是一种以超氧阴离子自由基为底物的酶，也 是一种疗效广泛的药用酶自由基是游离存在的，带有不成对电子的分子、原 子或离子，其化学性质很活泼需氧生物在正常的新陈代谢过程中必定会伴有 氧参与的各种各样复杂的生化反应，在这些反应中，氧分子可以通过单电子还 原反应生成超氧阴离子自由基o ，它可作为引发自由基而引起其他自由基的 产生，如h ，o ，o h 等这些氧的衍生物因为较氧分子有活泼的化学反应性， 被称为活性氧自由基 生物体内的自由基来源有内源性和外源性两种内源性自由基主要来自线 粒体、内质网、胞浆、血红蛋白等酶系统和非酶系统的反应外源性自由基产 生的主要原因是物理或化学因素，如电离辐射、高氧状态、高温状态等都可使包一 产生此外，年龄的增长和机体衰老亦会出现自由基积累妇】自由基特别是活 性氧自由基可造成生物大分子和细胞器的严重损伤，它们在癌症的发生、心血 管疾病、化学中毒、辐射损伤、炎症和衰老中起重要作用口】自由基对生物体 的损伤作用表现在以下几方面： 1 使脂质过氧化造成生物膜的损伤 2 使核酸交联或氧化造成细胞的损伤 3 使蛋白质和氨基酸氧化或交联造成损伤 4 对多糖高分子聚合物的氧化或降解引起损伤 m c c o r d 和f r i d o v o i c h 于1969 年首先从牛红细胞中发现了超氧化物歧 化酶，迸一步研究发现它具有催化超氧阴离子自由基0 2 一的生物学功能从此 掀开了s o d 的研究序幕不同领域的科学家对其生物学特性、化学特性、分子 组成、分子结构和功能、药理作用及临床应用等方面进行了广泛深入的研究它 是目前已知的二千多种酶中研究报道最多的酶 4 堕茎查兰堡堕壅竺兰些! 兰焦! 堡壅一一 为防御或修复自由基造成的损伤，生物体在进化过程中适应性的产生了一 整套多层次、相互独立的酶性和非酶性抗氧化系统，不同的抗氧化酶位于不 同的细胞器，且作用底物不同s o d 是清除0 2 的抗氧化酶，可将0 。特异 性催化为h 2 吼和0 2 ，使其不能诱发其它自由基的产生在p h 7 4 时，s o d 催 化的o ：一歧化反应速度常数至少是0 。自发性歧化反应速度常数的1 0 9 倍 其 反应如下： s o d 2 0 2 一十2 1 1 + _ h 2 0 2 + 0 2 s o d 是类金属酶，按金属酶辅基的不同可分为三类临1 ，即c u z n s o d 、m n s o d 和f e s o d c u z n s o d 主要存在于真核生物细胞的胞浆中，某些细菌中也有m n s o d 。 主要存在于真核生物细胞线粒体和原核生物细胞中f e s o d 主要存在于原核细 胞及少数植物中睁 c u z n s o d 是由两个亚基通过非共价键的疏水作用缔合起来的二聚体，肽链 内部由半胱氨酸c y s 5 5 和c y s l 4 4 的一s h 基构成的二硫桥对亚基缔合起重要作 用 每个亚基中含有一个c u 2 + 和一个z n 2 + g 】c u ”是酶催化作用的中心，而z n z + 则包埋于酶分子疏水区内部，对酶结构稳定性起重要作用m 酶的活性不仅取 决与酶蛋白，而且取决于c u ”和z n ”见图1 a 在一般的实验条件下，该酶的 蛋白质颇为稳定，其主要依据包括： 1 能耐受t s u c h i h a s h i 氏步骤，不被乙醇或氯仿破坏 2 在3 7 ( 2 ，p h 7 0 ，0 0 5 m 磷酸盐缓冲液中，活性可保持三周以上n 2 1 3 用4 s d s 处理，c u z n s o d 不解聚为贬基，且酶活性不受影响1 但在特定的实验条件下酶活性可下降，甚至完全丧失主要表现在氰化 物可抑制c u z n s o o 活力，并可致其活性完全丧失1 h 。o ：可使c u z n s o d 活性下 降1 ，氰化胍能抑制c u z n s o d 活性 壹堑盔兰堡主塑墨兰兰些! 羔2 垒l 一 图l ac u z n s o d 活性中心的“咪唑桥”结构示意圈 到目前为止，已经完成全部氨基酸序列分析工作的s o d 有2 0 余种其中大 鼠c u z n s o de d n a 及氨基酸序列由y e s h i hh o 等于1 9 8 7 年完成m 1 它的编码 区编码的氨基酸共1 5 4 个如图l b ， 与人c u z n s o dc d n a 的同源性高达8 6 由图l b 可以看出，大鼠c u z n s o de d n a 大鼠c u z n s o d 序列含有5 个外显子和 4 个内含子，基因全长6 0 0 0 b p ，包括2 个c c a a t 盒，1 个t a t a 盒和4 个不同 的g c 盒 由于s o d 在药物学、食品及化妆品工业、生化及诊断试剂等方面的广泛应用 从各种生物组织中提取s o d 已远远不能满足需求近年来，对s o d 的基因克隆 和表达进行了广泛研究 6 堕茎盔兰堕圭塑垄生望型l 竺型墨) _ 笙茎一 r a t s o d h u ms o da t gg c ga c c g 叠叁枣枣士：叠喜? ；c 点：鼍釜6 ：誊粤枣：毛；蠢 - + + + n ：毒。景。羹 ：c 套一? ；s 黑g 警e ? p 黑v 嚣v ? 墨v 翟s ? g 震o ? i 霉t a a 粤童 h，- + 、“7 “6 “ “” i ；j 。g = 昙点。h t 盏毒。嘉。v 。：，。基，y ，点盘a a “。a 1 c c 置品品一t t ， hc t t “。“1 。“ 盘 rt c a g t c t c a g a c t c a t c t g c t c t c c t g c t a a a c t c t a g a a a c c aa a c c a t t a a a c 一t g t a a t c v r a a c a g c cc1t-tag t g ttt ct aa ca 图l b大鼠及人c l l z n s o dc d n a 的核苷酸及氨基酸序列 细菌系统的遗传背景已相当清楚，利用细菌进行外源基因表达易培养，成 本低，产量高s o d 基本上是利用ec o l i 为宿主进行表达的m 3 g o r e c k i 等 人利用含有不同启动子的载体质粒在ec o l i 中表达c u z n s o d ，其表达的目的 蛋白最多占细胞总蛋白的2 0 左右”“1 国内施惠娟等人构建的表达载体表达 o 一吣 2 g 一 一 。一 g 从 p一 口“盏_ t c h 肌 k帆一 g o 从 t c s略一 c h 吼一击 t n m 一 ，m o 七c p 一 c 。_ 一 r i 。仃一： c t s阢 g o 盯t o从乱 一 g v 。簖；|。u 。 g a k m 一 。蓉。刍! | on g v盯一 t h m 一 。 g l盯l c d龃一 。趸； 南一 r h“一 r h 。黑伽 巷篇“ 。研。时矗。m 去一 。眦n 。；|点_。吾。咻! |熹价香；|。m 。l ；。研亿。山舌 r h t c o 从屺 品，盯 c x“一 t心一s 甜一 点 e卧一 t n m 一 c r c懈一 a k m 一 鑫g l丌 c o一 t o一 品。乏!五_ h 肥一 c r h 堕堑查堂堡主堕塞生望些! 堂垡上堡苎一 c u z n s o d 的c d n a ，最高表达量可占3 0 啪2 3 1 原核表达系统表达的c u z n s o d 均 以包涵体形式存在，活性极低 因此有人探索在真核表达系统中表达 s o d a y u b 2 4 1 用酿酒酵母s o c l p g k 双重突变的b c 。和a d 。株做宿主细胞，转入 酵母染色体外质粒y e p ，成功表达了c u z n s o d 基因张博润“剐等构建酵母工程 菌z d f 一4 8 ，亦表达了c u z n s o d 酵母起初被认为是有发展前途的表达外源蛋 白的真核细胞宿主虽然酵母也有哺乳动物糖基化合成途径的早期过程，但其 表达的n 一连接，o 一连接糖蛋白有长长的寡甘露糖外链，有极高的抗原性，因此 不提倡用酵母生产s o d 在ec o l i 中表达的外源蛋白可定位于细胞质内、周质空间和细胞外这 三种定位对外源蛋白的生产各有利弊他分泌到胞外的蛋白纯化非常简单，但 能实现分泌的例子不是很多，许多机理尚不清楚定位于周质空间的外源蛋白， 蛋白折叠基本正确，纯化也较为简便，但信号肽不能完全保证能够跨膜，也可 能形成包涵体定位于胞内的表达蛋白以包涵体形式存在，有利于分离，蛋白 产量高，但蛋白有错误折叠，纯化较为复杂 重组基因的高水平表达导致了表达蛋白不能自发折叠卷曲生成有一定空间 结构和特定生物功能的蛋白质，而是以一种不溶性的沉淀形式存在，这就形成 了包涵体【3 包涵体的成因是由于重组蛋白分子之间的疏水作用，蛋白质在折 叠过程中，本应于分子内部的疏水区暴露于溶液中，使多肽链的疏水区之间相 互作用、碰撞、导致凝聚o “，而二硫键的形成则决定了包涵体体积的大小o “随 着包涵体复性技术取得的进展，以能使复性后的重组蛋白用于结构或生化研究 等工业开发 本实验利用d n a 重组技术，在p c r 的两个引物上设计了两个不同的酶切位 点，通过双酶切反应后由连接酶将大鼠c u z n s o dc d n a 插到表达载体p b v 2 2 0 的 p 。p l 启动子下游，通过加入c u ”和z n “，在4 2 。c 诱导，以使其高效表达同时 对重组d n a 的最佳诱导表达条件和包涵体的复性进行了探讨 壹黧盔堂堡主照墼暨些兰焦上量登t 一 一毒孝辩 材料与方法 l 蔻抹窝貘羧 矮较p u c r c s ，农大藏c u z n s o d 的e d n a ，癌荚潼w a y n e s t a t eu n i v e r s i t y 的y e s h i h h o 教授惠赠 质黢p b v 2 2 0 t w l ，孛篱睽茨医学辩攀浣病毒掰张餐溘教授稳建，为豢舂p r p 黟联窟动予舷瀑度控割型表达载体a m e c o l id h 5a 和e c o l ij m l 0 9 均为本室保藏 2 培养基 l b 培养爨( 1 ) ：胰蛋白胨1 0 ，n a c i1 0 ，酵母提取物5 ，p h 7 0 7 ，4 l b 瓣体墙养基：添热1 5 琼瓣 s o b 培蓁墓c g i ) ：蛋鑫藏2 0 ，黪醛提取物5 ，n a c l 0 , 5 ， 2 5 0 m m o l lk c l1 0 m l ，2 m o l lm g c l 25 m l ， p h 7 0 - 7 ，4 瘸子质敉转位 3 抗生素配制及使用 将氨苄青鬟素用承溶解嚣，配藏5 0 m g m l 黧存液，2 0 y 3 保存。 王终浓度楚6 0 1 t g m l 。 4 酶及冀 彀试嗣 隈赣瞧疼惦骜，r n a s e ，p c r 试雾l 鑫，t 4 d n a 连接簿，天e c o r 姜融镞l m a r k e r ，疆白分子量m a r k e r ( 1 4 4 9 7 4 k d ) ，s d s ( 电泳级) ，氨苄霄霉素均购 爨华美公镯。 二蘸苏耱簿( d t t ) ，4 d n t p 麓龚上海燕工公霉s o d 标准燕魏蠡上 海东风试剂公司 9 堕互查堂堡主婴窒生望些兰些三兰苎一 p c r 引物合成由中科院微生物所基因工程中心完成 其他试剂为国产分析纯 二方法 l 质粒d n a 的小量制备( 碱裂解法) 1 接单菌落于3 m l 含6 0 ug m la m p 的l b 液体培养基中，3 7 。c 过夜培养取 1 5 m l 菌液至e p p e n d o r f 管中，1 2 0 0 0 9 离心3 0 秒，弃上清用l m ls t e 洗涤 菌体一次将菌体悬浮于1 0 0 u l 冰预冷的溶液l 中，剧烈振荡) j n a 2 0 0 1 1 1 冰 预冷的溶液i i 中，冰浴3 分钟后再加入1 5 0 ul 溶液i i l ，冰浴5 分钟，1 2 0 0 0 9 离心5 分钟取上清，加入等体积的酚氯仿，颠倒混匀，1 2 0 0 0 9 离心2 分钟用 氯仿再抽提一次，取上清，2 倍体积无水乙醇沉淀2 3 小时，1 2 0 0 0 离心5 分 钟，弃上清，沉淀抽千后溶于5 0 u l 的t e 中 2 质粒d n a 的大量制备( 碱裂解法) p 接单菌落于3 m l 的l b 液体培养基中，3 7 c 过夜培养取1 0 0 ul 接种于含 a m p 的1 0 0 m l l b 培养基中，过夜培养4 c ，5 0 0 0 r p m 离心2 分钟，弃上清用 冰预冷的s t e 洗涤菌体一次加2 m l 溶液i 振匀后加入适量溶菌酶，冰浴2 0 分钟加4 m l 溶液i i ，混匀，冰浴5 分钟加入3 m l 溶液i ，混匀，冰浴2 0 分钟，1 2 0 0 0 r p m 、4 c 、离心2 0 分钟，取上清，加入0 6 体积的异丙醇室 温沉淀2 小时1 2 0 0 0 r p m 、4 o 、离心2 0 分钟，沉淀经真空干燥，溶于5 0 0 u i 的t e 中以等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提一次上相用2 倍体积的无水 乙醇沉淀，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，沉淀经干燥，溶于5 0 0 1 1l 的t e 中，2 0 。c 贮存备用 3 质粒d n a 浓度及纯度的测定【3 6 1 大量制备的质粒d n a 经适当稀释后，于2 6 0 r i m 和2 8 0 r i m 测其吸光值以 o d ：6 0 o d ：。确定样品纯度，若在1 8 2 0 之间则表示纯度较好，可以做酶切反 应 0 壹墅查兰堡主堕窭皇兰些兰些上笪兰一 d n a 浓度= o d 2 6 0 5 0 ug ，m i 稀释倍数 比色杯光径( e r a ) 4p c r 将两个引物分别溶于2 0 0 u1d d h ：o 中，一2 0 。c t 宣保存，将模板适当稀释备用 p c r 反应体系 l o b u f f e r m g c l 2 4 x d n t p s p r i m e r l p r i m e r 2 t e m p l a t e t a q 酶 6 7 8 51 x b t l f f e r 31 5 m m 1 1 5 6 1 2 3 0 5 l o 2 0 0 u m 5 0 p m o l 反应 5 0 p m o l 反应 l o n g 反应 4 u 反应 t a q 酶应在反应管于9 5 水浴5 分钟后再加，将反应管混匀，离心，上覆盖5 0 u l 石蜡油 p c r 循环 反应终止后，将下层水相移至另一e p p e n d o r f 管中，用等体积氯仿抽提一次， 取少量样品电泳，检查p c r 结果，其余可直接酶切 堕茎盔堂堡主堕壅生望些兰堡三兰苎一 p b v 2 2 0 1 52 1 51 5 2 0 3 7 c 7 熵1 小时，6 5 c 5 分钟，经酚，氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀，真空干燥后 分别溶于3 0 u l 的d d h ，o 中 6 连接反应 将适当的酶切后的p c r 产物和载体混合后加2 “l1 0 b u f f e r ，4 5 c 水浴5 分 钟，冷却后加入1 5ult 4 连接酶，补d d h 2 0 至终体积为2 0 ul _ 1 2 。c 1 6 。c 过 夜，7 0 c 水浴1 0 分钟终止反应，可用于转化 7 感受态细胞制备和转化 接一单菌落予3 m ll b 培养基中，3 7 o 过夜培养按l 接种量转入5 0 r a ll b 培养基中，3 t c 振荡培养至o d = 0 3 冰浴培养基至0 c 5 0 0 0 r p m 离心5 分钟， 弃上清，将管倒置1 分钟，使培养液完全流尽用5 m l 冰预冷的1 0 0 m m o l l c a c l ： 重悬菌体，冰浴l o 分钟。5 0 0 0 r p m 离心5 分钟将菌体重悬于适量的冰预冷的 1 0 0 m m o l l c a c l ，中，以2 0 0l al 管分装，4 c 保存1 2 2 4 小时 取】0 u1 连接产物与感受态细胞混匀，冰浴3 0 分钟，4 2 c 水浴热休克9 0 秒，再冰浴l 2 分钟然后向管中加8 0 0 u l l b 培养基，于3 7 c 振荡培养取 1 0 0 u l 培养基涂布于6 0 l ag m l a m p 的l b 平板上，过夜培养 8 产物的诱导表达 将筛选好的转化子转接于含a m p 的l b 培养基中，培养4 - - 6 小时至 o d = 0 4 0 5 ，加入c u “、z n 2 + 后迅速转入4 2 c 水浴诱导5 小时，离心收集菌体， 用s t e 洗涤菌体次，将菌体悬浮于定量t e 中，即可超声破壁 9 包涵体的获得 1 2 堕墅查兰堡主塑塞生望些! 兰堡三兰兰一 将诱导表达后的菌体，用b u f f e ra ( 5 0 m m t r i s c j 【p h8 0 1 ，2 m m e d t a ) 洗 涤两次用b u 虢ra 重悬后，冰浴超声波破壁破壁后用涂片染色法观察破壁 效果，4 ，5 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃沉淀1 5 0 0 0 r p m 离心3 0 分钟，弃上清， 沉淀即为包涵体 1 0 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - - p a g e ) 将样品与等体积2 上样缓冲液混匀后，可上样电泳积层胶为5 ，分离 胶为1 5 ，电泳开始后，将电压调至9 0 v ，待指示剂前沿进入分离胶后，提高 到1 4 0 v ，电泳结束后，将凝胶浸泡于染色液中，轻摇过夜以脱色液轻摇脱色， 至背景清晰为止 1 1 薄层扫描测定蛋白组分含量i ”i s d s p a g e 后的蛋白带，经日立c s 9 1 0 薄层扫描仪测定表达蛋白的含量由 中心实验室完成 1 2 包涵体的复性p ”9 i 将包涵体用b u f f e r a + 0 5 t r i t o n x 1 0 0 和b u f f e r a + 2 m 尿素，各洗两遍将 包涵体溶解于7 m 盐酸胍( 溶于含1 0 m md t t 的b u f f e ra ) 中，离心弃不溶物， 得包涵体粗提物 透析复性法：将包涵体粗提物对含l m 尿素，1 0 甘油的b u f f e ra 透析4 小 时，再对含1 0 甘油b u f f e ra 透析2 4 小时，其间换3 一次液离心去少量沉 淀，上清为复性液 稀释复性液：将包涵体粗提物缓慢滴入迅速搅拌的2 0 倍体积的复性缓冲液 ( b u f f e r a + 1 0 甘油+ l m md t t + o 2 t r i t o nx - l o o ) 中，4 过夜，加入硫酸胺 使饱和度达到8 0 ，1 0 0 0 0 r p m 离心3 0 分钟，取沉淀溶于少量b u f f e ra 中，透 析3 6 小时，其间多次换缓冲液，离心弃沉淀，上清即为复性液 塑翌叁堂塑! ：业壅生兰些! 兰丝! 堡兰 1 3 表达蛋白的活性测定1 4 0 1 采用连苯三酚法连苯三酚自氧化过程中产生0 2 - ，在s o d 存在时，自氧 化过程受到抑制以抑制反应的5 0 的s o d 为1 u ，据此可测定样品中的s o d 14 质粒稳定性检测m i 将转化子单菌落接种在含a m p ( 6 0 ug m 1 ) 的l b 液体培养基中，3 7 。c 过夜 培养敬5 0 l 接种到5 0 m l 无a m p 的l b 液体培养基中，3 7 。c 培养8 小时， 再连续转接三次到不含a m p 的液体l b 中每次转接时都进行活菌平板计数根 据如下公式计算生长代数 培养结束时的菌数 生长代数= l 0 9 2 培养前的菌数 最后一次培养结束后取少量菌接种于不合a m p 的l b 平板上，培养后再随 机选取菌落，点种于含a m p 的l b 平板上，培养后计数，与选取的菌落数作对 照 堕墅查兰堡主堕塑生生些兰垡三一垒茎一 结果 一c u z n s o dc d n a 在表达载体p b v 2 2 0 中的克隆 y e s h i hh o 等人于1 9 8 7 年克隆了大鼠c u z n s o d 的全长c d n a 其中 c u z n s o d 编码区d n a 序列长度为4 8 6 b p 且编码区与人c u z n s o d 编码区同 源性高达8 6 ，说明其有高度的进化保守性 p b v 2 2 0 ”i 图2 由以下几部分组成： 噬菌体的p a p l 启动子及c l t s 8 5 7 抑制 基因，p r c 2 3 中的s d 序列；核糖体r r n b 基因转录终止信号和p u g 8 的多酶切 位点，同时有氨苄青霉素的抗性基因p 。和p 。，为强启动子，串联在一起可增强 表达效率p r p 。受c i 基因的负调控c i 阻遏蛋白是温度敏感蛋白，在2 8 3 2 培养时c i 产生抑制作用；当温度升至4 2 时，c i 被破坏( 可逆过程) ，这样 就解除了对p 。，p 启动子的封闭，使转录开始r r n b 基因是一个强的转录终止 信号，可防止通读，有利于宿主一质粒系统上稳定此外，整个质粒仅3 6 6 k b ， 有利于插入较大的外源片段并保持稳定 基因克隆的具体操作如图3 采用屁0 ri 和b a r d 4i 双酶切法插入外源基 因因屁积i 和b a n f fi 可共用同一种酶切缓冲液，且双酶切法便于筛选转化 子利用p e r 引物设计在需要扩增的目的基因两端加上相应的酶切位点，引物 设计如下： 引物a 长2 3 b p 5 t g t 姒a ca t gg c ga t c 从gg c3 e c o r i 酶切位点 引物b 长2 1b p 5 a g tq g a 工e ct t a i t gg g cg a t 3 ， b a m hi 酶切位点 1 5 堕墅奎堂堡主竺窒生兰些! 兰些! 丝兰 h l n d h i n d h ! n ：l j p s ：i t t a a a a a a a t t t t t ( a 、 ( b ) 图2 p b v 2 2 0 的质粒图谱 a p b v 2 2 0 的结构及酶切位点 b p b v 2 2 0 的s d 序列 1 6 i j 堕茎查堂堡主塑壅皇兰些! 塑2 塑生一 p c r 1 。r _ 。t e c o r ip s i i b a r n hi le c o r i + b a m h i t r _ r 一_ 一1 e c o r lp s i ib a m hi e c o r i + b a m h i e c o r ip s i lb a m h i 州3 p b v r c s 蜘建小意心 1 7 一掣 南开大学t i i , t ：f h 究生毕业( 学位) 沦史 p c r 产物的电泳结果显示有一条4 8 6 b p 的带，图4 图4p c r 产物电泳图 i6 p g e m 7 z f h a ei j lm a r k e r 2 - 5p c r 产物 p c r 产物和p b v 2 2 0 用e c o ri 和b a m hl 双酶切后，电泳检查酶切结果 后( 图5 和6 ) 进行连接反应。转化c a c i ：诱导的感受念细胞d h 5a ，获得大量 转化予采用质粒小量提取法，初筛出若干分予量较p b v 2 2 0 稍大的转化子( 图 7 1 图5 p c r 产物经e c 。r i 和b a m h l 的酶切后电泳圈 8 直珏厶堂熊：班筮垒生些i 堂焦2 迨童 图6 p b v 经e c o r i 和b a m h l 的酶切j 厅电泳图 图7 重组质粒的初筛 1 5重绢质粒 6 p b v 7 1 2重组质粒 正确连接的转化子应具备如下特征：用e c o r i 和b a m h i 双酶切能切下条 约4 8 6 b p 的片段，其上位于2 7 6 b p 处有一n fi 酶切位点，而p b v 2 2 0 的n ，i 酶切位点只有一个t 位于第2 6 个碱基处，故转化子使用胎，i 单酶切后可得到 4 1 4 b p 和3 1 7 k b 的两个片段 经大量提取质粒后，筛选符合上述要求的转化子，其酶切图谱如图8 和图 9 所示，我们称这些转化子为p b v r c s 9 鹰五厶芏熊l 蜊筮生星些l 堂世2 迨皇 图8 重组质粒p b v - r c s 的鉴定 图9 转化子的鉴定 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 二p b v r c s 在e c o l i d h 5a 中的诱导表达与复性 重组质粒中c u z n s o d 的转录在p a p 。启动子控制之下，而p r p l 又受控于温 度敏感性阻遏物c l t s 8 5 7 用带有p b v 2 2 0 的d h 5a 菌株为对照，先将菌体在3 7 培养到合适时机，再高温诱导外源基因的表达当培养基中的菌体生长到 o d 。= 0 4 时，开始转入4 2 c 诱导，诱导结束后测菌体浓度 取少量诱导后的菌液，超声破壁后，经8 d s - p a g e 电泳后发现在3 2 k d 位置 左右，d h 5 ( 带p b v r c s ) 比d h 5q ( 带p b v 2 2 0 ) 明显多出一条蛋白带，即 c u z n s o d 得到了表达( 图1 0 ) 根据m a r k e r 的相对迁移率计算出表达蛋白的分子 量为3 1 8 6 0 ，与文献m 3 报道的s o d 分子量在3 0 5 0 0 3 5 7 0 0 之间相符经薄层扫描 分析，表达蛋白量占菌体总量的4 9 ( 图1 1 ) 幽1 0d h 5a ( p b v r c s ) l jd h 5a ( p b v ) 辛1 | 比褂剑了表达 is o d 标准品 2 p b v - r c s 3 p b v 4m a r k e r 5 p b v - r c s 6 p b v - r c s 图1i薄层扫描测定表达蛋白含量 培养物经超声破壁后，先低速离心弃去未破碎的细胞，再高速离心分别取 上清和沉淀进行s d s p a g e 结果发现表达蛋白存在于沉淀中，上清中几乎不可 见故可认为c u z n s o d 是以不溶的包涵体存在于细胞中( 图1 2 ) 沉淀中的包涵 体进行活性测定，活性很低，有必要进行复性分别用稀释复性法和透析复性 法复性后的沉淀和上清行s d s p a g e ，结果如图1 3 ，表明复性后的表达蛋白存在 于复性的上清中 图1 2 超声破壁后结果比较 l p b v 超声后的沉淀 2 , 4 p b v r c s 超声后的沉淀 3 p b v - r c s 超声后的上清 5m a r k e r 6 p b v 超声后上清+ b s a 三表达蛋白的活性测定 表1s o d 样品活力测定 图1 3 复性结果 l m a r k e r 2 透析复性后的沉淀 3稀释复性后的沉淀 4 s o d 标准品 5 透析复性后的上清 6稀释复性后的上清 壁曼12 34z8 2 l q 垩塑 包涵体1 0 51 1 51 3 01 3 0 1 1 09 51 2 51 2 01 1 51 1 51 1 6 稀释1 0 4 71 1 5 21 1 9 01 0 3 0 1 1 2 51 0 3 91 2 6 0 1 1 3 51 2 0 51 1 4 01 1 3 2 复性后 透析 1 2 3 01 2 5 51 3 9 6l1 6 51 4 1 7 1 2 9 01 3 0 01 2 4 51 4 0 01 2 8 51 2 9 8 * s o d 标准品活性为1 7 6 0 0 u m g ，测定结果为1 6 0 5 2 u 鸭，每份样品测三次，取平 均值 由表l 可见，s o d 包涵体几乎无活性，稀释复性后平均活性为1 1 3 2 ，透析 复性后平均活性为1 2 9 8 ，后者稍高于前者 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 四p b v r c s 在c o j i d h 5a 中诱导表达的最佳条件 将d h 5a ( 带p b v r c s ) 于3 7 。c 培养，隔1 小时取少量菌液，测o d 。 表2 3 79 c 培养不同时间的菌液浓度 由上表可以看出，d h 5a ( 带p b v r c s ) 在3 7 c 培养3 小时后进入对数生长 期，7 8 小时后生长速度减慢，进入停滞期 c u z n s o d 为依赖c u “和z n 2 + 的金属酶，诱导开始前加入不同浓度的c u z + 和z n n + 对蛋白的诱导表达有不同的影响，如图1 4 所示过低的离子浓度外源蛋白的表 达量不够多，但过高的离子浓度又会抑制蛋白的表达 图1 4 不同离子浓度诱导后的电泳结果 1m a r k e r 2 c u 2 + ( 终浓度为o 2 5 神m z n 2 * ( 终浓度为o 0 5 m m ) 3 c u 2 + ( 终浓度为0 5 m m ) z n 2 * ( 终浓度为0 i m m l 4 c u 2 + ( 终浓度为o 7 5 m m l z n 2 + ( 终浓度为o 1 s m m ) 5 c u 2 + ( 终浓度为1 0 m m ) z n “( 终浓度为0 2 r a m ) 6 s o d 标准品 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 将d h 5 ( 带p b v r c s ) 在3 7 c 培养在o d = o 4 左右时，转入4 2 诱导每隔 l 小时测o d 。收集菌体进行s d s p a g e 结果如图1 5 表3 4 2 。c 诱导不同时间的菌液浓度 ( h ) o d 6 0 0 0 4 10 5 8 0 8 31 1 0 1 2 51 3 41 4 4 1 4 9 图15 4 2 诱导不同时间的电泳结果 查墅查兰堡! ：堕窒生兰些! 兰竺! 堡苎 开始诱导的最初3 小时内，外源蛋白几乎没有表达，这段时间内，细菌仍 进行生长诱导4 小时后生长速度减慢，胞内开始表达外源蛋白至5 “小时 时，表达量达到高峰，诱导8 小时后，表达量稍有下降可能是由于菌浓过高， 代谢活动减慢，蛋白的合成速度随之减慢已合成的外源蛋白还可能受到胞外 蛋白酶的降解 五质粒稳定性检测结果 表4 每次接种前后的菌液浓度( 菌数5 0p1 ) 据上表计算出菌体共生长约4 l 代最后一次培养后取少量菌液稀释后转接 于不含a m p 的l b 平板上，随机选取7 5 8 个菌落转种在含a m p 的l b 平板上，培 养后共长出7 4 6 个菌落，根据公式计算出质粒稳定率为9 8 4 含a m p 平板上的菌落数 质粒稳定率： 不含a m p 平板上的菌落数 2 6 1 0 0 堕茎叁兰婴主塑壅兰兰些! 兰垡三曼翌一 讨论 用p c r 成功扩增目的基因后，选择双酶切位点作为外源基因的插入位点双 酶切位点连接避免了单酶切位点连接可能产生的目的基因的反向连接，有利于 重组子的筛选目的基因与质粒载体连接后，起始密码子a t g 距离上游的s d 序列相距5b p ，这对翻译起始和提高翻译效率极为有利h 7 1 质粒p b v 2 2 0 作为 表达载体，拥有温度诱导的可控制表达的启动子，即菌体被诱导前几乎无表达 或表达水平极低，仅诱导后才大量表达p r p 为串联在一起的强启动子所有 这些都成为c u z n s o d 的d n a 能高效表达的必备条件 由于c u z n s o d 为金属酶，因此必须在开始诱导之前加入c u “和z n 2 + 会 属离子的浓度对s o dc