（植物学专业论文）拟南芥内质网上的profilin2蛋白结合蛋白的分离与纯化.pdf

摘要 真核细胞内的微丝骨架在其它信号调控下呈现高度的动态变化，以适应变化的环境。 p r o f t l i n 是调节微丝骨架动态变化的重要成员之一。拟南芥中有5 种p r o f i l i n 异型体，它们 分别在植株的不同发育阶段及不同器官、组织中进行特异的表达，这些不同的p m f i l i n 异型 体可能分别执行不同的功能。p m f i l i n 在细胞内的定位已有很多人进行了研究。大多数实验结 果表明p m f i l i n 在细胞质和细胞核内均匀分布，而我们前期的实验结果表明p r o f l l i nl 和 p r o f l l i n2 在细胞质内的分布存在明显的差异。p r o f i l i n1 呈纤维状网络结构分布，而p m f i l i n 2 呈类似内质网的网格状结构分布因此我们推测p r o f i l i n2 可能与内质网共定位，而 p r o f i l i nl 与微丝共定位。这种分布上的显著差异说明这两种异型体在细胞内执行着各自不同 的生理功能。我们进一步推测p r o f i l i n2 可能特异地和内质网上的某类蛋白质相互作用，导 致了p m f l l i n2 与p r o f i l i nl 在细胞质内的不同形式的分布。 本论文研究根据前期研究达到的结果，试图从内质网上分离和鉴定与p r o f i l i n2 特异结 合的蛋白质，为说明p r o f i l i n2 在细胞中的特异分布提供科学依据，并进一步为说明p r o f i l i n 异型体的功能特异性提供实验证据。 为了从内质网分离蛋白，我们选用拟南芥悬浮细胞为实验材料，它的优点是繁殖速度快， 培养方便可以在较短时间内大量获得实验材料。利用密度梯度离心方法分离出纯化的粗面 内质网，经过对传统实验方法的改进，将原来2 0 0 分钟的离心时间缩短到了7 0 分钟，从而 保证了内质网膜上的膜蛋白具有更好的生物活性，并且通过改变蔗糖密度梯度离心时各层蔗 糖溶液的体积比例使粗面内质网的产率有了明显的增加。通过电镜观察，证明获得了较高 纯度的粗面内质网。利用纯化的内质网膜与原核表达、纯化的p m f i l i n2 包被的胶体金颗粒 的结合实验，证明了p o f i l i n2 是与粗面内质网上膜蛋白的相互作用而结合在内质网上的。为 了分离与p o f i l i n2 特异结合的膜蛋白，利用原核表达、纯化的p r o f i l i n1 和p m f i l i n2 结合 在n i - n t a 的琼脂糖上，再结合p u l l d o w n 技术，将分离出的蛋白质进行s d s - p a g e 电泳， 用改进的银染方法进行电泳结果显色，显示出有4 条比较明显地与p m f i l i n2 特异结合的内 质网上的膜蛋白。选择了其中一条含量最高的特异结合p r o f i l i n2 的蛋白条带( 2 8k d a 未知 蛋白) 进行切胶回收，使用l c m s m s 液相层析串联式质谱仪进行蛋白质的特性分析。根 据质谱仪检测到的所有肽段与拟南芥中已知蛋白质的质谱数据库进行匹对，结果显示，质谱 仪检测到的分值最高的肽段：拟南芥p r o f i l i n1 的n 末端第5 6 个氨基酸到第7 5 个氨基酸 中的1 9 个氨基酸序列d f e e p g f l a p l g l f l g g e k ，其在拟南芥p m f i l i n1 蛋白的二级结 构为无规则盘旋折叠折叠，此序列可能参与p r o f i l i n 与a c t i n 的相互作用。从而推测内质 网上分离出来的2 8k d a 未知蛋白也具有与a c t i n 结合的功能。 关键词：p r o f i l i n2 ，内质网，微丝，拟南芥 a b s t r a c t t h ep o l y m e r i z a t i o na n dd e p o l y m e r i z a t i o no fa e t i nf i l a m e n t sa r eh i g h l yr e g u l a t e d ，s p a t i a l l ya n d t e m p o r a l l y ，s ot h a tc e l l sa r ec a p a b l et or e m o d e lt h ec y t o s k e l e t o nr a p i d l yi nr e s p o n s et oe n d o g e n o u sc u e s o re x t e r n a ls i g n a l s p r o f i l i ni so n eo f 也em o s ti m p o r t a n tf a c t o r st or e g u l a t em i e r o f i l a m a n td y n a m i c s a n do r g a n i z a t i o ni nl i v i n gc e l l s i na r a b i d o p s i st h a l i a n a ，t h e r ea r ef i v ep r o f i l i ni s o f o r m se x p r e s s e d r e s p e c t i v e l yi nd i f f e r e n tp l a n to r g a n sa n da td i f f e r e n td e v e l o p m e n ts t a g e s t h e s ei s o f o r m sm a yp l a y u n i q u ef u n c t i o n si np l a n tc e l l s r e p o r t e ds t u d i e ss h o w e dt h a tp r o f i l i ne v e n l yd i s t r i b u t e st h r o u g h o u t 恤ec y t o p l a s ma n dd o e sn o ts p e c i f i c a l l ya s s o c i a t ew i t ha n yc e l l u l a rs t r u c t u r e s h o w e v e r , o u r p r e v i o u s s t u d ys h o w e dt h a tp r o f i l i n1a n dp r o f i l i n2d i s t r i b u t e dd i s t i n g u i s h a b l yi nc e l l s a n a l y s i so ft w o g f p - p r o f i l i ni s o f o r m si nt r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sd e m o n s t r a t e dt h a tg f p ：p r o f i l i n1e x h i b i t e da s f i l a m e n t o u sn e t w o r k , r e s e m b l e st h em i c r o n l a m e n t s ，h o w e v e r ，g f p ：p r o f i l i n2p r e s e n t e dam e s h n e t w o r kl i k ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u m r ) i na r a b t d o p m sc e l l s s u c hd i f f e r e n td i s t r i b u t i o n s s u g g e s t e dt h a tt h e s et w op r o f i l i ni s o f o r m sm a yh a v ed i f f e r e n tf u n c t i o n si nc e l l s w ep r e s u m et h a t p r o f i l i n2m a y a s s o c i a t ew i t hc e r t a i np r o t e i n ( s ) l o c a t e da tt h ee rm e m b r a n e t h i ss t u d yf o c u s e so np r o f i l i n2 ，o n eo ft h r e ep r o f i l i n sc o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e di nv e g e t a t i v e t i s s u e s ，e x p e c t i n gt oi s o l a t es o m ep r o t e i n ss p e c i f i c a l l ya s s o c i a t e dw i t hp r o f i l i n2f r o me r ，a n d a n a l y s i st h e s ep r o t e i n sb ym so ra n i m oa c i ds e q u e n c i n g i np r e s e n ts t u d y ，s u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n t e e n t r i f u g a t i o nw a se m p l o y e dt op u r i f yt h er o u g he r 。t h ep u r i f i e a t i o nm e t h o dw a si m p r o v e ds ot h a t t h eh i g h e ra e d v i t yo fm e m b r a n ep r o t e i n sa n dt h e q u a n t i t yo fr e rw a so b t a i n e d t r a n s m i s s i o n e l e c t r i cm i c r o s c o p yi n d i c a t e dt h a t t h ei m p r o v e dm e t h o dw a se f f i c i e n ta n dt h a tt h em a j o rc o m p o n e n to f s e p a r a t e dm e m b r a n ew a sr e r t h eb i n d i n ge x p e r i m e n tu s i n gt h ec o l l o i d a lg o l dw h i c hc o v e db ye c o i l ( d e 3 ) e x p r e s s e dp r o f i l i n2a n dp u r i f i e dr e rd e m o n s t r a t e dt h a tp r o f i l i n2m a yd i r e c t l ya s s o c i a t e w i t he rb yp r o t e i n sa te rm e m b r a n e b yp u l l - d o w ne x p e r i m e n tb yp u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o f i l i n1 a n dp r o f i l i n2 ，m e m b r a n ep r o t e i n so f r e rs p e c i f i c a l l ya s s o c i a t ew i t hp r o f i l i n2w e r ei s o l a t e d t h e a n a l y s i so fs d s - p a g ea n ds t a i n i n gt h eg e lb yi m p r o v e ds i l v e rs t a i nm e t h o di d e n t i f i e daf e wb a n d so f p r o t e i n sw h i c ha r es p e c i f i c a l l ya s s o c i a t e dw i t hp r o f i l i n2 o n ea b u n d a n tp r o t e i nw i t hm o l e c u l a r m a s so f2 8k d aw a sc h o s e na n da n a l y z e db yl c m s m s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eu n k n o w n p r o t e i nh a sf r a g m e n to fp o l y p e p f i d ew i t ht h es e q u e n c eo fd f e e p g f l a p t g l f l g g e k w h i c h m a t c h e sp r o f i l i n1 a n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tt h i ss e q u e n c ei np r o f i l i nlm a yh a sa c t i nb i n d i n ga c t i v i t y ， s ow ep r e s u m et h a tt h e2 8k d au n k n o w np r o t e i nm a yh a v ea c t i nb i n d i n ga c t i b i t y , t o o t h i ss t u d y p r o v i d e si m p o r t a n te v i d e n c et os h o wt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np r o f i l i n2a n de r ，a n di nf u r t h e r , t o u n d e r s t a n dt h er e g u l a t o r yf u n c t i o no f p r o f i l i ni ne rd y n a m i c s k e y w o r d s ：p r o f i l i n2 ，e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ，m i c r o f i l a m e n t , a r a b i d o p s i st h i a f i a n a 缩写表 英文缩写英文全拼 中文名称 山 m i c r o l i l r e 微升 a c r a c r y l a m i d e丙烯酰胺 a p a m m o n i u mp e r s u l f a t e 过硫酸铵 b i s b i s a c r y l a m i d e二甲叉丙烯酰胺 璐ab o v i n es e r b i i ia l b u m i n牛血清白蛋白 2 耳- d 2 , 4 - d i c h l o r o p h e n o x y a e o t i ea c i d2 ，4 - 二氯苯氧基乙酸 a a i 电o d i d i m i l l e dw a t e r 双蒸水 d t t d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e c o l i e s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 e d t ae t h y l e n ed i n i t r i l o t e t r a e e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e m e l e c t r o nm i c r o s c o p e 电子显微镜 g g r a m 克 h rh o u r 小时 i p t g i s o p r o p y l t h i o - o - g a l a c t o p y r a n o s i d e异丙基- b - d 虢代半乳糖苷 k 蛐 k a n a m y c i n 卡那霉素 k d ak i l od a l t o n 千道尔顿 l c l i q u i dc h r o m a t o g r a p h 液相层析 l - p r o l p r o l i n e l - 脯氨酸 m i n m i n u t e 分钟 m lmillilitre毫升 m gm i l l i g r a m 毫克 m sm a s ss p e c t r o m e t r y质谱 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝皎电泳 p l c p h o s p h o l i p a s ec 磷酸脂酶 p l p p o l yl - p r o l i n e 多聚脯氨酸 p m s f p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e p m s f r e r r i b o s o m i ce n d o p l s m i er e t i b u l u m 粗面内质网 r p mr e c y c l ep e rm i n u t e 转每分钟 m sm a s ss p e c t r o m e t r y质谱 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 t e m e d n , n ，n n - t e u am e t h y l e t h y l e n ed i a m i n e 苯甲基磺酰氟 t r i s t r i s ( h y t d r o x y m e t h y l ) m n i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 vv o l t伏 ww a t t瓦 独创性声明 y7 7 3 7 7 ； 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 孑匏 时间即嗲一年月即日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名 时间：铷。厂年6 月w 日 时间：彤d f 年b 月劢日 中国农业大学博士学位论文王风第一章文献综述 i i i 皇曼! 曼! 鼍曹鲁鲁置詈| 量量曼曼曼鼍鲁皇量邑曼曼量詈詈量量曼曼鼍寡詈曼曼鼍鼍皇詈詈詈皇鲁鲁曼量曼皇曼曼詈鲁置詈皇置童 第一章文献综述 1 1 植物p r o f i u n 的介绍 1 1 1p r o f i l i n 异型体 1 - 1 1 1植物p r o f i l i n 与非植物p m f f i i n 的相似性 p r o f i l i n 是1 2 - 1 5k d a 的a 州n 结合蛋白，1 9 7 7 年由c a r l s s o n 等人首次发现，是从脾脏 的提取物中与a c t i n 共纯化出的多肽( c a d s s o ne ta 。1 9 7 7 ) 。在真核生物中都有存在。许多 p r o f i l i n 的生化特性和细胞学功能的认识都是来自对非植物p r o f i l i n 的研究，但植物是一个研究 p r o f l i n 多态的异型体的很好的系统。p m f i l i n 在植物中的发现是由v a i e n t a 和他的同事在赤杨花 粉中作为致敏源而发现的( e n t a e t a l ，1 9 9 1 ) ，后来才被确定为a c t i n 结合蛋白( v a l e n t a e t a l ， 1 9 9 3 ) 。目前为止，许多种植物的p r o f i l i n 已经被研究的很详细了，但也不断有新发现的p r o f i l i n 异型体被报导。p r o f i l i n 是多基因家族，在组织中和在发育的不同时期特异表达( s t a i g e re ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。植物的p r o f i l i n 可以补偿阿米巴变形虫“m o c h ad i c t y o s t e l i u m ) 的p r o f i l i n 缺失突变，说 明植物的p r o f i l i n 和非植物p r o f i l i n 有相似的功能，尽管它们只有约2 5 的氨基酸序列的同源 性( k a r a d e s i s o g l o u e t 以，1 9 9 6 ) 。 1 1 1 2 植物p r o f f l i n 异型体 拟南芥的5 种p r o f i l i n 异型体分别在不同组织中，以及在植株发育的不同时期中进行特异表 达，有两种异型体( p r o f i l i n 4 和p r o f i l i n5 ) 在花组织或花粉中特异表达，三种异型体( p r o f i l i ni 、 p m f i l m2 和p m f d i n3 ) 在其它营养器官中表达利用p r o f i l i n - g u s 的融合表达显示p m f i l i n2 特 异地在维管束中表达( c h r i s t e n s e ne la 1 ，1 9 9 6 ；h u a n ge ta ，1 9 9 6 ) 。在玉米中，有三种异型体在 花粉中特异表达( s t a i g 盱甜a l ，1 9 9 3 ) ，另两种异型体在整株表达( g i b b o ne l a l ，1 9 9 8 ；k o v a r e t a l ， 2 0 0 0 ) 。 由植物p r o f i l i n 异型体的多样性使我们提出一个问题：不同的异型体有不同的功能吗? 现在 已经提出了几种不同的模型来解释p r o f i l i n 异型体韵存在：一种解释是p m f i l m 异型体是在不同 组织和不同发育阶段表达的，并且p m f i l i n 异型体有独特的功能，所以适用于在不同细胞类型和 不同发育阶段；另一种解释是多种p r o f i f i n 异型体在一个细胞中表达，执行不同的功能。其它解 释是在特异的细胞中，如花粉，表达高水平的多种p m f i l m 基因是必需的。这些解释可能不是 相互独立的，可以相互补充( s t a i g e r e t a l ，1 9 9 7 ：m e a g h e re t a l ，1 9 9 9 ：m e a g h e r e t a l ，1 9 9 4 ) 。 1 1 2p r o f i l i n 的功能 尽管p r o f i l i n 只有1 2 1 5k d a ，它的生物学功能却很复杂并且具有多样性。在一种条件下， 它可以封闭a c t i n 单体，从而抑制微丝的生长；而在另一种条件下，p r o f i l i n 又可以释放a c t i n 单体井促进微丝生长。p m f i l i n 也属于信号途径中的一部分，由它连接外界的信号和胞内的微丝 中国农业大学博士学位论文 王风第一章文献综述 骨架的状态，并进行调控。与p r o f i l i n 相互作用的信号分子有：4 ，5 - 二磷酸磷脂酰肌醇 ( p p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 4 ，5 - b i s p h o s p h a t e p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 ) ( l a s s i n g 盯a ，1 9 8 5 ) ，富含脯氨酸的蛋白 片段( m c k i r m e y e ta 1 。2 0 0 1 ) 。这些相互作用说明p r o f i l i n 与信号转导的级联反应有关，使a c t i n 骨架重新组装。因此，p r o f i l i n 对a c t i n 聚合的复杂影响与多种多样的信号分子的相互作用有关。 此外缺失了p r o f i l i n1 的拟南芥植株，其正常的发育过程受到了很大的影响。比如种子苗时期， 萌发的速度和生长速度都比野生型慢，会长出多余的根毛，突变体会长出不正常的子叶和比较长 的上胚轴，这些结果都可以充分证实了p r o f i l i n 参与信号转导途径( m c k i n n e ye t a l ，2 0 0 1 ) 。 1 1 2 1p r o f i l i n 与g - a e t i n 单体结合 p r o f i l i n 对微丝骨架在受到内源和外源刺激下的重新组装中起重要作用，可以在不同条件下促 进微丝解聚或聚合。p r o f i l i n 通过与a c t i n 单体结合。阻止了游离的a c t i n 单体结合到微丝上， 抑制微丝的聚合、引起微丝的解聚。同时它也有促进微丝聚合的功能。p r o f i l i n 可以促进a c f i n 单 体上核苷酸的转换，主要促进a d p 向a t p 转换，从而降低了a c t i n 在倒刺端聚合的临界浓度， 进而促进微丝的聚合。a c t i n 是一个a t p 酶，水解a t p 伴随着微丝的聚合，在低的临界浓度下， a t f - a c t i n 比a d p - a c t i n 聚合的快。p r o f i l i n 与a c t l n 的结合使它与核苷酸的亲和力下降了 1 , o o o 倍。在细胞内，a t p 浓度远大于a d p 浓度，所以a t p 可以自动取代a d p ，p r o f i l i n 促 进了a t p 取代a d p 的过程，在没有p m f i l i n 的情况下，细胞内核苷酸的交换会更慢些 ( p a n t a l o n ie t a l ，1 9 9 3 ；b a i l w e b e r e t a l ，1 9 9 8 ) 。植物的p m f i l i n 促进微丝聚合的机制与此稍有差 异，它促进微丝组装的机制是通过与a d f 起加速微丝的转变速率来实现的( b a l l w e b e re la l ， 1 9 9 8 ) 。 1 1 。2 2 p r o f i l i n 与质膜上p t d l n s ( 4 , 5 ) p 2 结合 p m f i l i n 可以与p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 结合，但不能同时与a e t i n 、p t d i n s ( 4 ，5 ) p 2 结合。p r o f i l i n 和 p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 结合后抑制了p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 被磷酸脂酶p h o s p h o l i p a s ec ( p l c ) 水解，除非p l c 是 磷酸化的( g o l d s c h m i d te ta l ，1 9 9 0 ：g o l d s c h m i d te ta l ，1 9 9 1 ) 。当p l c 在酪氨酸位点被磷酸化 后，p m f i l i n 与p c , d i n s ( 4 ，5 ) p 2 结合作用被解除，p m f i l i n 释放到胞质。使a c t i n 发生重组 ( m a c h e s k y e t a l ，1 9 9 3 ；s o h ne t a l ，1 9 9 4 ) 。 1 1 2 3p r o f d i n 与富含多聚脯氨酸m o t i f 的蛋白质相互作用 植物p r o f i l i n 与p t d i i l s o ，5 ) p 2 间的相互作用已有了较细致的研究。p r o f i l i n 可利用 p l p s e p h a t o s e 的亲和柱从植物中提取出来。p m f i l i n 也可以与富含脯氨酸m o t i f 的蛋白相互作 用，包括v a s o d i l a t o r 激活的磷酸蛋白( 、，a s p ) 和类f o r m i n 蛋白( r e i n h a x d e t 耐，1 9 9 5 ：f r a z i e r e l 甜，1 9 9 7 ；k a n g e t a l ，1 9 9 7 ) 。比如f o r m i n - h o m o l o g y d o m a i nl ( f h i ) 蛋白可以与p r o f i l i n 相 互作用f h i 蛋白在胞质分裂及果蝇胚的极性建成和维持中起重要作用( m a n s e a ue ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 在一些器官中有多态的f o r m i n h o m o l o g y 蛋白与不同的r h o 异型体相互作用，单体r h o g t p a s e 是分子开关，在信号转导途径中，它使a c t i n 骨架重组成特殊列阵，例如在酿酒酵母 中国农业大学博士学位论文 王风第一章文献综述 ( s a c c h a r o m y c e s ) 中，b n ri p 专一地与r h o4 p 相互作用，b n il p 和r h ol p 相互作用( k o h n o e t a l ，1 9 9 6 ；l m a m u r ae t a l ，1 9 9 7 ) a 因为b n ii p 和b n rl p 都与p r o f i l i n 相互作用，推测p r o f i l i n 是个多条信号途径的关键因子。 1 1 3p r o f i l i n 在细胞中的定位 不同的p r o f i l i n 异型体在不同的组织器官中表达情况有很大的差异；比如拟南芥中的 p r o f i l i n 。其中组成型的p r o f i l i n1 、p r o f i l i n2 、p r o f i l i n3 在所有组织的不同发育阶段都有表达， 并在小孢子发生早期和胚珠中也有表达，而p r o f i l i n4 和p r o f l l i n5 只在花粉发育的晚期有表达， 在其它类型的细胞中：早期的小孢子和根毛细胞中没有表达。通过染色观察，发现p r o f i l i n1 、 p r o f i l i n2 主要在营养器官中，如根尖、根诱导的愈伤、花萼，在生殖器官如年幼的花药、胚珠、 雌蕊中分布。在发育的花药中、小孢子母细胞、早期的小孢子中，p r o f i l i nl 、p r o f i l i n2 都有很强 的染色，可能还有p r o f i l i n3 存在。相反地，在成熟的花粉和花粉管中这三种p r o f i l i n 染色结 果都很浅，说明它们的表达量都比较低。 p r o f i l i n4 和p m f l l i n5 主要在成熟的花粉和花粉管中表达，在根、叶诱导的愈伤组织、花萼、 年幼花药、雌蕊、胚珠、叶、根中都没有分布。在类似花粉管生长的根毛中，只有很弱的弥散状 的分布，说明只含有痕量的p m f l i n 4 和p r o f i t i n5 表达( m u t h u g i t p a t t ie t a ，2 0 0 2 ) 。 p r o f i l i n 在植物细胞中的定位在早期的研究结果中表明几乎都是在细胞内呈均匀分布的状 态。用荧光标记方法分析百合p m f i l i n 在花粉管中的分布则是均一分布的( v i d a l ie ta 1 ，1 9 9 7 ) ， 用免疫金标标记油点百合( l e d e b o u r i a ) 花粉显示在营养细胞和生殖细胞胞质中分布较均一( h e s s “a ，1 9 9 5 ) 。往绿藻( m i c r a s t e r i a s ) 中注射荧光标记的赤杨p m f l l i n 说明分布位置积累在细胞核 中( h o l z i n g e re ta l ，t 9 9 7 ) 。将荧光标记的玉米p r o f i l i n 注射到成熟的紫竹梅( t r a d e s c a n t i a ) 雄 蕊毛细胞中，显示p r o m i n 也积累在核内，且在花粉的营养核和生殖核中都有分布( h e s se ta ， 1 9 9 7 ) 。赤杨花粉p r o f i l i n 在哺乳动物细胞中表达时也积累在核处( r o t h k e g e le t a ，1 9 9 6 ) 。p r o f i l i n 在核处的作用可能是调节信号转导，也许通过结合核的多磷酸肌醇。最近也有报导说p r o f i l i n 与 定位在核处的蛋白和蛋白复合体结台( p e t e r s o ne t a l ，1 9 9 8 ；g i e s e m a n ne t a l ，1 9 9 9 ) 。 随着对p r o f i l i n 定位的研究不断的增加，新的发现也相继出现，在不同细胞类型和不同发育 阶段中p r o f l l i n 不均一分布的证据也在增加。在赤杨花粉的小孢子和水稻的小孢子中，都显示 p r o f i l i n 与质膜结合( v o n w i t s e he t a l ，1 9 9 8 ) 。在生长的十字花科植物和拟南芥的根毛中，p r o f i l i n 形成一个顶冠，当生长终止时消失( b r a u ne ta 1 。1 9 9 9 ) 。p r o f i l i n 结合质膜的机制还不清楚，也许 其中的相互作用需要多磷酸肌醇作为中介，也许与富含脯氨酸序列的膜蛋白相互作用导致这种在 质膜处的特异定位。 我们实验室以前使用转基因方法，在拟南芥中表达g f p - p m f l l i n l 和g f p - p r o f i l i n 2 融合蛋 白后，进行活细胞内的两种组成型异型体的定位观察时发现。拟南芥p r o f i l i n1 和p r o f i l i n2 在 不同细胞中的胞质中的分布形式存在着显著的差异，o f p - p m f i l i n1 呈纤维状网络结构分布。而 g f p ，p r o f i l i n2 呈网格状网络结构分布。在前人的研究结果中也表明，拟南芥( g u n n i n ge t a l ，1 9 9 8 ) 和烟草的细胞中内质网的分布也呈现网格状网络分布( c h r i se l a ，2 0 0 1 ) 。 通过比较荧光蛋白标记的拟南芥叶片表皮细胞中的内质网分布的情况，我们推测p m f i l i n2 3 - 与内质网共定位。不同的p r o f i | i n 异型体在细胞内的定位与它的功能的执行有着密不可分的联 系，因此对它们的分布方式的研究及其分布机制的研究，都会对我们更详细地了解它们的特殊 功能起重要的作用。 1 2 内质网与细胞骨架的关系 在动物细胞中，内质网的存在形式是一个内部连续的管状与囊泡结构，它可以从细胞核的外 膜一直扩展到细胞的周边。内质网的管状结构是具有高度动态变化的结构，内质网的存在形式有 三种：线形管状、多边形网络状、三边连接状( l e ee t a l ，1 9 9 8 ) 。在无细胞体系中的研究表明， 把细胞溶质加入到去掉e r 的囊泡中后，会促进网络状结构的内质网形成( d r e i e r e t a l 。2 0 0 0 ) ，尽 管内质网在体外的形成不需要微管，但还是有些实验结果表明，在体内微管控制着e r 的结构与组 装。更近的研究报导指出： 1 ) 内质网向细胞周边扩展的机制是e r 沿着微管向它的正端移动而实现的。 2 ) 内质网管可以与动态的微管顶端及微管的侧面相结合。 在植物中，e r 的动态变化经常是以微丝为基础的。许多的光镜及电镜观察结果表明内质网 与微丝束及它的结合蛋白有共定位的情况( g o o s e n - d ee t a l ，1 9 8 3 ；l i c h t s c h e i d le t a l 。1 9 9 0 ；w h i t e e t a ，1 9 9 4 ；l i e b ee t a ，1 9 9 5 ：b o e v i n k e t a l ，1 9 9 8 ) 。另外，在丽藻( c h a r a c e a a l g a l ) 细胞中的 细胞环流过程中，内质网是沿着微丝骨架运动的( k a c h a r e t a l ，1 9 9 8 ) ，而在苦草( v a l l i s n e r i a ) 叶肉细胞中e r 的运动是需要微丝和肌球蛋白的( l i e b ee t a l ，1 9 9 5 ) 。如果用诱发根瘤的药物刺 激苜蓿( 一扣扣) 的根，会导致微丝和内质网的重排，胞质环流、细胞核的运动、液泡的形状 也会发生变化( a l l e ne ta l ，1 9 9 6 ) 。 免疫荧光定位研究显示在酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 细胞中，内质网分为与质膜并列分布的周边内质网( c o r t i c a le r ) 和围绕在核膜周围 的核周内质网( n u c l e a r e r ) ( r o s ee t a l ，1 9 8 9 ；p r e u s se l a l ，1 9 9 1 ) 。酵母中在周边分布的内 质网是呈高度动态变化的网络分布的管状结构，以闭合环状或管状分枝的结构运动，与部乳动 物细胞内的外周内质网( p e r i p h e r a le r ) 相似( p f i n z e t a l 。2 0 0 0 ) 。 虽然周边的内质网和核膜外的内质网分布上有差异，但它们的功能表面上看还是相同的， 都发挥着蛋白质运输的功能。冷冻置换实验已经证明了酵母细胞中靠近质膜的内质网膜上也结 合有核糖体( b a b a e t a l ，1 9 8 7 ) 。免疫电镜结果表明周边的内质网和核膜外的内质网上的驻留 蛋白种类是相似的( p r c u s se t a l ，1 9 9 1 ；r o s s a n e s ee t a l ，1 9 9 9 ) ，r o s s a n e s e 等人的实验结果显示 了瞬时内质网标记蛋白s e e l 2 p ( 具有起始c o p i i 类型囊泡的组装作用) ，在周边的内质网和核 膜外的内质网中都有分布。并且发现，a e t i n 骨架在周边内质网的正常结构的形成中起重要作用。 在细胞周期中早期的内质网结构对破坏微丝的药物特别敏感。用微丝的去稳定剂处理后。周边 的内质网的正常结构也不能形成( f e h r e n h a e h e r e t a l ，2 0 0 2 ) 。这一结果也与另一个实验结果； 用l a t - a 短时间处理细胞后，使周边内质网的动态变化减弱的结果相一致( p d n ze ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 3 p r o f i l i n2 与内质网共定位的推测 关于与p r o f i l i n 结合的一个重要的物质：p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 在细胞内的分布情况，一个新的研 - 4 - 中国农业大学博士学位论文王风第一章文献综述 究结果表明，并不是只有质膜中有p t d i n s ( 4 ，5 ) p 2 ，而在细胞内的其它细胞器的膜上都有 p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 的分布，并且内质网上的p t d i n s ( 4 ，5 ) p 2 并不是占很多的比例，具体数字是； p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 在内质网上只占5 左右，而绝大多数的p t d l n s ( 4 ，5 ) p 2 都在质膜上，占了6 5 左右，1 5 的p t d l n s ( 4 。5 ) p 2 在其它细胞器的膜上，如核膜、其它囊泡等结构( s t e p h e ne t a l ， 2 0 0 2 ) 。然而p r o f i l i a 2 与内质网的共定位却很特异，这些说明可能p r o f i l i n 2 与内质网共定位 的主要原因不是因为p r o f i l i n 与p t d i n s ( 4 ，5 ) p 2 的结合作用导致的，很有可能是由于其它蛋白质 或其它类型的大分子与p m f i l i n 2 相互作用，使它特异分布在内质网周围。 结合我们在以前的实验中观察到的现象，我们推测p m f i l i n 2 与内质网共定位是由于与内 质网上的某种蛋白质的结合导致的。其可能的结合方式有两种：一种是与细胞内其它蛋白质相 互作用，组成复合体结合在内质网上的膜蛋白上，另一种是直接和内质网上的虽白质相互作用 而与内质网共定位。 微丝骨架与内质网有密切的关系，而p r o f i l i n 又调控着微丝骨架的复杂变化因此，可以推 测p r o f i l i n 在内质网的形态维持及结构变化中一定也起着重要的作用，虽然现在还研究的很少， 但这方面仍然存在着很大的研究潜力。 - 5 中国农业大学博士学位论文 王风第一章文献综述 本研究工作的目的和意义