（植物学专业论文）美洲商陆耐锰毒机理研究.pdf

摘要 摘要 本文以美洲商陆为材料，研究了美洲商陆在2m m o l l 和8m m o l l 锰处理浓度下 植株的生物量、根系生长状况以及体内锰的积累随处理时间的变化，并从光合荧光系 统、抗氧化酶系统和金属元素吸收方面探讨了美洲商陆耐受锰毒害的生理响应机制。 主要研究结果如下： 1 锰胁迫对美洲商陆生长状况的影响 锰处理后，美洲商陆地上部分锰含量急剧增多，而植株在第二周才表现出相应的 锰毒害症状；锰处理初期，美洲商陆地上部分保持了较高的生物量，根系活力受到锰 的影响也相对较小，并且2m m o l l 锰处理促进了根的生长和植株前期生物量的积累。 以上结果说明美洲商陆体内存在高效的解毒机制，使高度积累的锰没有对植株表现出 明显毒害，其中，美洲商陆将大量锰向地上部分转运对美洲商陆耐受锰毒害起到重要 作用，它减少了锰对根系的毒害，使根系活力维持在较高水平。 2 锰胁迫下美洲商陆的光合响应机制 2m m o l l 锰处理第一周，光合速率p n 上升，美洲商陆的生长受到了一定的促进， 推测可能是由于适量高于正常水平的锰能促进相关的生理活动；两种锰浓度下，美洲 商陆前三周光合速率保持在对照的8 0 9 0 ，下降不明显，推测可能是锰离子鳌合 和区域化机制以及不平衡分布模式有效地避免了高度积累的锰对光合系统的影响。8 m m o l l 锰处理期间，f v f m 下降，n p q 上升，说明p si i 天线复合体中的激发能没 有到达p si i 反应中心就被耗散掉同时，f 慨和q p 值变化很小，因此非光化学淬 灭有效耗散了美洲商陆高锰毒害下的过剩光能 3 抗氧化酶系统在美洲商陆耐锰毒过程中的作用 2m m o l l 和8m m o l l 锰处理下，美洲商陆的m d a 值与对照相比分别在第四周和 第三周才表现出明显的上升，说明此期间过量的锰没有对美洲商陆的膜脂产生特异性 损伤，体系的氧化和抗氧化系统处于平衡状态。抗氧化体系中，s o d 在两种锰处理 下的敏感性都较高，体现了美洲商陆对氧化损伤较强的修复能力，并且s o d 活性下 降的同时伴随m d a 的明显上升，说明s o d 活性的高低对美洲商陆清除r o s 的能力 影响较大。c a t 和a p x 的活性在8m m o l j l 锰处理条件下被特异性提高，而a p x 可 能在锰胁迫后期比c a t 发挥更大作用。从抗氧化酶的活性和m d a 含量的变化可以 看出，美洲商陆能上调s o d 、c a t 和a p x 的活性，对氧化损伤具有较强的修复能力。 4 锰胁迫对美洲商陆矿质离子吸收的影响 锰处理下，钾供应充足，对美洲商陆的蒸腾和各种矿质离子的吸收具有重要的作 v 摘要 用，且能提高植物的光合速率、增强抗逆性。8m m o l l 锰处理下，植株对镁的吸收相 对减少，但含量维持在4e , k g 以上，缺镁的症状还不是很明显锌在两种锰处理下 受到的影响都比较小，推测锌可能在维持较高的抗氧化酶活性以及防止脂膜过氧化和 离子的渗漏方面起作用。此外，钙和铁等含量都处于比较稳定的水平，n a 在前期受 到的影响也很小综上，美洲商陆的金属元素含量在2l u l l o i l 锰处理下受到的胁迫 较小，8m m o l l 锰处理下离子含量下降相对明显，但都维持在正常的生理水平，维持 体内矿质离子的平衡很可能是美洲商陆耐受高锰胁迫的重要机制之一。 关键词：美洲商陆；耐锰毒害；光合作用；抗氧化酶；矿质离子吸收 v i a b s t m a a b s t r a c t 肋t o l a c c aa c i n o s ai sar e c e n t l yd i s c o v e r e dm a n g a n e s e ( m n ) h y p e r a c c u m u l a t o r f r o m s o u t h e r nc h i n a i nt h i ss t u d y , t h eb i o m a s s ，r o o tg r o w t ha n dm na c c u m u l a t i o no fp a c i n o s aw e r em e a s u r e dt oi n v e s t i g a t ei t sr e s p o n s et om ns t r e s s t h ep h o t o s y n t h e s i s ， a n t i o x i d a n te n z y m ea c t i v i t i e sa n dt h ec o n t e n to fm i n e r a le l e m e n t si n c l u d i n gp o t a s s i u m ( k ) ， s o d i u m ( n a ) ，m a g n e s i u m ( m 曲，c a l c i u m ( c a ) ，z i n c ( z n ) ，i r o nf i e ) u n d e rm n s t r e s sw e r e a l s oi n v e s t i g a t e d t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ee f f e c t so fe x c e s sm no nt h eg r o w t ho f p a c i n o s a n ov i s u a lt o x i cs y m p t o m sw e r eo b s e r v e du n t i lt h es e c o n dw e e k ，a l t h o u g hm nw a s s i g n i f i c a n t l ya c c u m u l a t e di ns h o o t s c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ，p l a n t st r e a t e dw i t he x c e s s m nk e p th i 曲a b o v e g r o u n db i o m a s si ne a r i l yp e r i o da n dw e r eo n l ys l i g h t l ya f f e c t e di nr o o t a c t i v i t i e s b o t ht h er o o tb i o m a s sa n dt h eg r o w t hr a t ew e r ee v e np r o m o t e di nt h ef i r s tt w o w e e k su n d e r2m m o l lm nl e v e l t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tp a c i n o s ae x h i b i t e dh j 曲m n t o l e r a n c ea n da c c u m u l a t e dm nw i t h i ns h o o t st ok e e pr o o ti nh i 曲a c t i v i t i e s 2 r e s p o n s eo fp h o t o s y n t h e s i st om ns t r e s si n 只a c i n o s a c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ，t h ep h o t o s y n t h e s i sr a t ei n2m m o l lm n t r e a t e dp l a n t sw a s h i g h e ra tt h ef i r s tw e e k ，a n dk e p t8 0 一9 0 o ft h ec o n t r o li nt h es e c o n dw e e ka n dt h i r d w e e kf o rb o t ht h e2m m o l la n d8m m o l lm n t r e a t e dp l a n t s p nw a sn o tr e m a r k a b l e l y c h a n g e di np a c i n o s aw h e na c c u m u l a t i n ge x c e s sm n a sf o rt h ef l u o r e s c e n c ep a r a m e t e r s ， f v f m d e c r e a s e da n dn p qi n c r e a s e du n d e rh i 曲m n ，w h i l ef v f ma n dq pc h a n g e dl i t t l e t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sn od a m a g ei nt h ep si ia c t i o nc e n t r ea n dt h e e x c i t a t i o ne n e r g ya b s o r b e db yp si ia n t e n n ac o m p l e xc o u l db ed i s s i p a t e db e f o r ea r r i v i n g p si ia c t i o nc e n t r e 3 r e s p o n s eo fa n t i o x i d a n te n z y m e st om n s t r e s si n 只a c i n o s a m d ac o n t e n ti nt h em nt r e a t e dp l a n t sw a sn o ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nt h ef i r s tt w o w e e k s ，s u g g e s t i n gt h a tn om e m b r a n ed a m a g ew a s c a u s e db ye x c e s sm nw h i c hm i g h tb e a t t r i b u t e dt ot h eb a l a n c eb e t w e e nt h eo x i d a n ta n da n t i o x i d a n ts y s t e m s c a ta n da p x a c t i v i t i e si n c r e a s e dr e m a r k a b l yo n l yu n d e r8m m o l lm nw h i l es o da c t i v i t yw e r ee l e v a t e d i nb o t ht r e a t m e n t s t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tp a c i n o s ac o u l du p - r e g u l a t et h ea c t i v i 够o f s o d 、c a ta n da p xt os c a v e n g ea c t i v eo x y g e nf r e er a d i c a l s 4 m i n e r a lc o n t e n t si n 只a c i n o s au n d e rm ns t r e s s v l l a b s t r a c t p o t a s s i u mc o n t e n ti np a c i n o s ak e p th i g hw h e nt r e a t e dw i t ht h ee x c e s sm n 。z i n c c o n t e n ti nt r e a t e dp l a n t sw a sl o w e rt h a nt h a to ft h ec o n t r 0 1 c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ，t h e c o n t e n to fm a g n e s i u mi np l a n t su n d e rm ns t r e s sk e p ta b o v e4g k gw h i c hw a si nn o r m a l l e v e l b e s i d e s ，b o t hc a l c i u ma n di r o nk e p ti nas t e a d yl e v e li np l a n t su n d e rm ns t r e s s m i n e r a la b s o r b t i o nw a sl e s sa f f e c t e d i nt h ep l a n t st r e a t e dw i m2m m o l lm nt h a nt h o s e w i t l l8m m o l lm n k e e p i n gm i n e r a l sa b s o r p t i o ni nb a l a n c em a yb eo n eo ft h er e s p o n s e m e c h a n i s m sf o rp a c i n o s at or e s i s th i e , hm nc o n c e n t r a t i o n s 。 k e yw o r d ：p a c i n o s a ；m nt o l e r a n c e ；p h o t o s y n t h e s i s ；a n t i o x i d a n te n z y m e ；m i n e r a l s a b s o r p t i o n 缩略符号 a p x c a t c l l l c i e t r f m f o f v f m f v 7 f m 7 舀 m d a n p q p n p p f d p si p s q p s o d t b a t t c o p s 缩略词表 英文名 a s c o r b a t ep e r o x i d a s e c a t a l a s e c h l o r o p h y l l i n t e r c e l l u l a rc 0 2c o n c e n t r a t i o n e l e c t r o nt r a n s p o r tr a t et h r o u g hp si i m a x i m a lf l u o r e s c e n c e i n i t i a lf l u o r e s c e n c e m a x i m a lp h o t o c h e m i s t r yo fp s e x c i t a t i o ne n e r g yc a p t u r ee f f i c i e n c yo f p si ir e a c t i o nc e n t r e s s r o m a t a lc o n d u c t a n c et ow a t e rv a p o r m a l o n y l d i a l d e h y d e n o n p h o t o c h e m i c a lq u e n c h i n g n e t p h o t o s y n t h e s i sr e t e p h o t o s y n t h e t i cp h o t o f l u xd e n s i t y p h o t o s y s t c m i p h o t o s y s t e mi i p h o t o c h e m i c a lq u e n c h i n g s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 2 t h i o b a r b i t u r i ca c i d 2 ，3 ，5 一t r i p h e n y lt e t r a z o l i u mc h l o r i d e q u a n t u my i e l do fp sp h o t o c h e m i s t r y i v 中文名 抗坏血酸过氧化物酶 过氧化氢酶 叶绿素 胞间c 0 2 浓度 非环式电子传递速率 最大荧光 初始荧光 最大光化学效率 p s 反应中心激发能捕 获效率 气孔导度 丙二醛 非光化学淬灭系数 净光合速率 光合光量子流量密度 光合系统i 光合系统 光化学淬灭系数 超氧化物歧化酶 2 硫代巴比妥酸 2 3 5 三苯基氯化四氮唑 p si i 实际量子产量 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送 交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏盘堂可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名；导师签名： 签字日期：年月日签字日期：年月日 致谢 在浙江大学求学的宝贵两年里，我不仅收获了知识与技能，更收获了师生情谊和 许多友谊。在这里，我要向所有帮助过我和伴我度过这两年宝贵学习生涯的老师和同 学表示感谢。 首先，我要衷心感谢我的导师翁晓燕老师，感谢她在科学研究理念和研究思路上 给我的启发和指导，在过去两年中导师为我倾注了大量心血，她严谨端正的科研态度 以及耐心细致、认真负责的品质都深深感染了我。同时，我要真诚感谢蒋德安老师， 感谢他在学习和研究上给我的指点和帮助，感谢他和朱诚老师对我的毕业设计提出宝 贵的意见和建议。此外，我还要感谢周启发老师和杨建立师兄对我毕业论文所做的修 改和所提供的宝贵建议。 在这里，我还要感谢实验室潘薛波、王盾、王飞娟、熊杰、沈国民、陆开形等师 兄师姐和黄莹莹、冯旭萍、丁艳菲、陆含等师妹以及杨万军、上官李娜、董方帅、段 毓兴、何漪等同学，实验室就像一个大家庭，他们不仅在学习和实验上给了我很多指 导和帮助，也在生活上给了我很多关爱和照顾。两年中，我和他们分享了许多快乐与 感动，和他们在一起的点点滴滴我都将铭记于心此外，我还要感谢已经毕业的杨勇、 曹保华、曾冰、孙伟、傅石军、王剑锋等师兄以及耿彬、朱傅赞、井明艳等师姐，他 们在实验中给了我很多指导和建议，在生活上也提供了很多帮助，让我在入学以后能 很快地适应并融入了新的学 - j 和生活环境。 衷心感谢同寝的杨梦、尤广奕、陈烨烨，赵路以及康燕，感谢洪亮、韩香和秀云， 感谢她们与我一路同行，感谢她们对我细心的关爱和照顾，两年的相惜相伴给我留下 了许多感动。 感谢我的家人以及我的男友，感谢他们总是一直默默地支持着我、爱着我，在我 需要的时候给我依靠、信任和鼓励，给我巨大的精神支持 两年时间转瞬即逝，要分别了，有很多不舍很多留恋，我会带上那些满满的情谊 和祝福去迎接新的生活，也衷心祝愿所有的老师、同学和朋友一帆风顺、幸福、快乐! 郑陈娟 二零零八年五月 于浙大紫金港 第一章文献综述 第一章文献综述 锰是植物生长发育的必需元素之一，但锰在植物体中的含量一般不超过十万分之 几，超过植物需要量的锰会影响植物体的一系列生理活动，导致有毒物质如超氧自由 基、多酚类等物质的积累，从而对植物产生毒害，并通过食物链的传递进入人体内， 最终对人的健康造成极大的危害。 锰对植物的毒害主要发生在酸性土壤上，当土壤的p h 较低( 5 5 ) 或土壤被还 原的时候，锰以二价的形式大量进入土壤，并在植物体内积累，对植物造成毒害。近 几十年来，随着我国工业的发展，酸性气体大量排放，酸性沉降物对环境的影响不断 增加，我国南方地区酸沉降的频率和强度也不断增加( 赵其国，2 0 0 2 ；易杰祥等， 2 0 0 6 ) 。广大酸性土壤的存在使锰大量进入土壤，对植物和人类都造成巨大的危害。 因此，在控制酸性土壤扩张的同时，有效的清除土壤中已经存在的锰成为当务之急， 锰污染问题引起了科学家们极大的关注和研究。 为防治锰的毒害，人们采取了许多有效措施，进行土壤改良，如使用石灰提高土 壤p h ，减少硝酸根的淋施，增加土壤中使锰氧化的微生物群落等等。此外人们还选 育了对锰耐性较高的作物进行种植，以减少锰毒害对生产的影响( 臧小平，1 9 9 9 ) 。2 0 世纪9 0 年代，植物修复技术兴起并得到了科学家、政府及企业的广泛关注。植物修复 技术( p h y t o r e m e d i a t i o n ) 是利用对污染物( 包括重金属) 具有忍耐和超富集能力的植物 或植物与微生物的共生体系，通过提取、吸收、分解、转化等方式清除污染物，最后 达到修复环境污染目标的技术( 浙江大学环境修复与生态健康教育部重点实验室， 2 0 0 6 ) 。多年来，人们对植物中锰元素的生理特性以及耐锰植物的耐锰机制进行了研 究，取得了一定的成果，这些理论研究成果为植物修复技术奠定了坚实的理论基础， 本文就这些方面的研究进行综述。 1 1 锰在植物中的作用及其毒害 1 1 1 锰在植物中的作用 锰是维持植物正常的生理活动的必需元素之一，对植物起着不可替代的作用。首 先，锰是光系统i i 上水氧复合物的组成部分之一，直接参与了光合作用中的光合放氧 过程，参与光合作用是锰在植物体内最重要的生理功能。锰也是维持叶绿体结构的必 需元素，叶绿体中含有较多的锰( 施益华和刘鹏，2 0 0 3 ) 其次，锰是植物体内一个 重要的氧化还原剂，可参与植物体内许多氧化还原体系的活动锰能通过影响细胞的 第一章文献综述 氧化还原电位调节细胞中二价铁离子的浓度以及抗坏血酸和谷胱甘肽的氧化还原状 态( 施益华和刘鹏，2 0 0 3 ；刘铮，1 9 9 1 ) 含锰的超氧化物歧化酶m n s o d 、二价锰盐 和依赖于锰的过氧化氢酶可催化超氧化物的自由基转交为过氧化氢和氧气，从而保护 膜脂免于过氧化，对保护植物细胞膜的完整性具有重要的功能( 施益华和刘鹏，2 0 0 3 ) 。 此外，锰还是一系列酶的辅助因子，对植物体内多种酶具有活化作用锰所活化的是 一系列酶触反应主要是磷酸化作用、脱羧基作用，还原反应、歧化反应和水解反应等 ( 施益华和刘鹏，2 0 0 3 ) 。过氧化物酶体、线粒体和内质网膜上都发现有锰的存在，许 多定位在高尔基体上的酶如糖基转移酶也需要锰的参与才能行使相关的功能( w ue t a 1 ，2 0 0 2 ) 锰离子也与植物呼吸作用以及氨基酸、木质素的合成有密切的关系。 1 1 2 锰对植物的毒害 锰毒害通常发生在酸性土壤中，锰对在植物地上部的毒害很难找到一种十分典型 的专一性症状，症状的表现主要取决于植物本身的基因型以及生长条件( 张福锁等， 1 9 9 4 ) 地上部锰毒现象在植物老组织中一般表现为明显的暗褐色斑点、坏死斑( 马 铃薯茎的条状坏死，苹果内皮坏死) 、失绿斑以及叶缘、叶尖失绿；在幼叶中表现为 幼叶变形或是幼叶失绿( c l a r k ，1 9 8 1 ；e 1 j a o u a l c o x ，1 9 9 8 ；张福锁等，1 9 9 4 ；徐向华， 2 0 0 6 ) 。锰被大量运往地上部，因此对植物的毒害主要表现在地上部，当植物体内的 锰浓度较高时，也会对地下部产生毒害，使根系生长受到抑制，使氧化态酚和氧化锰 在根细胞中积累和沉淀，导致根表皮细胞呈现褐色( 张福锁等，1 9 9 4 ) 。 在生理上，过量的锰会抑制酶的活性、抑制光系统i i 的多个位点、提高光抑制程 度、形成氧化胁迫、改变脂膜的代谢、扰乱必需微量元素的吸收等( s t o b a r t e t a l ，1 9 8 5 ； b a r o n e t a l ，1 9 9 5 ；j o n e s & h a r w o o d ，1 9 9 3 ；h e n d r i k e t a l ，2 0 0 2 ) 过量的锰能破坏叶绿 素分子构造或阻碍其生成叶绿素分子，使萎黄病加剧( k i i p p e we ta l ，2 0 0 0 ) ，同时也能 对植物的叶绿荧光，气孔导度等产生影响，导致光合速率下降，使植株的生物量下降 ( m a c f i e & t a y l o r ，1 9 9 2 ；p e t o l i n o & c o l l i n s ，1 9 8 5 ) 过量的锰也会加剧0 2 ，h 2 0 2 和o h 等活性氧的产生，形成氧化胁迫，使生物分子如类脂、蛋白质、核酸遭受到氧化损伤， 对植物造成伤害( d e m i r e v s k a - k e p o v ae ta 1 ，2 0 0 4 ；v a n & c l i j s t e r s ，1 9 9 0 ) 。此外，过量 的锰也能影响植物对其它营养元素的吸收和利用，高锰诱导的钙，镁、铁等元素缺乏 导致的营养不平衡是锰毒发生的机理之一如过量锰会引起f e 功能的失调，使有生 理活性的f e 2 + 转变成钝化的f c 3 + ，从而使铁积累在生物体内产生毒害( a k i oe ta 1 ， 2 0 0 6 ) 此外，锰等重金属能与蛋白质结合或取代其中的c a 2 + 、m 9 2 + ，z n 2 + 等离子使 蛋白质变性，并造成以蛋白质为主要组分之一的膜系统损伤，改变脂膜的代谢( 肖凤 娟和张欣杰，2 0 0 3 ) 第一章文献综述 1 2 锰在植物体内的吸收、迁移和分布 1 2 1 锰在植物体内的吸收 关于植物对锰的吸收，人们发现许多因素都能影响植物对锰的吸收酸性土壤是 影响锰离子吸收的重要因素之一与其它的能迁移的金属如铜、铁类似，锰离子有多 种氧化状态，锰能否被植物吸收取决于他的氧化状态，其c m n 0 1 0 和m n ( i v ) 是不 能被植物吸收和积累的( c l a r k s o n ，1 9 8 8 ；r e n g e l ，2 0 0 0 ) 植物吸收的锰多数是以i v i n ( i i ) 形式进入细胞的，土壤中二价锰离子的浓度因土壤p h 值的不同而有较大差异，土壤 中的p h 影响植物对锰离子的吸收。f e r n a n d o 等人( 2 0 0 8 ) 发现，在酸性土壤和基本土 质上生长的锰超积累植物m f o u n i e r 对锰的积累量具有差异性，只有生长在酸性土壤 上m f o u n i e r i 才体现出对锰的超积累特性。然而，土壤太酸时( p h 5 5 ) ，会形成 锰毒害，对植株的生长造成影响( j o n ，2 0 0 5 ) 。 除土壤的p h 值外，植物的根系分泌物也能够增强植物对锰等金属元素的吸收 ( m a r s c h n e r , 1 9 9 5 ) 。酸性土壤中，由根部排出的h + 和有机酸使根围土壤酸化，增加了 锰在细胞中的积累。例如，根围能通过h + a t p a s e 释放出质子，促进锰离子的吸收， 同时形成的电位梯度也促进了其它营养元素的吸收( p a l m g r e n ，2 0 0 1 ) d i n k e l a k e r ( 1 9 9 5 ) 等人发现，土壤中的锰能溶解在白羽扇豆的根所分泌的羧酸盐液体中并被迅 速从根部吸收到叶片，从而导致锰的积累。也有研究表明在某些植物中锰是以 m n 2 + e d t a 的复合物形式进入细胞的( l a u r i ee t a l ，1 9 9 5 ) 1 2 2 锰在植物体内的迁移 m n 和z n ，c o ，f e 等微量金属元素被认为是通过韧皮运输的( t a k a h a s h ie ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。总体来说，蒸腾动力是锰等金属元素体内再分配的重要途径，它通过木质部 对金属离子进行地下部到地上部、从木质部到韧皮部的运输，并通过韧皮部对金属离 子进行再定位( v a l e r i ee ta ，2 0 0 6 ) h a n n a m 等a ( 1 9 8 5 ) 通过放射自显影技术对白羽 扇豆不同时期的锰含量进行研究，发现锰在标记4 天后快速从根部转移至叶片。在这 个过程中，锰能利用蒸腾作用从根部通过木质部迅速到达完全展开且光合作用活跃的 的叶片，但它只停留在它所到达的第一片叶子，不再通过韧皮部分布到其它的叶子中 去( v a l & i ee ta 1 ，2 0 0 6 ) 锰在植物的叶片中几乎不迁移可能是由于其无法进入韧皮 部或是在叶片中以不溶形式存在，这些有待进一步证实 到2 0 0 5 年，一系列与锰运输有关的载体相继得到鉴定，多个运输蛋白基因家族被 报道与m n 2 + 的运输有关，这些蛋白家族包括z r t i r t l 相关载体蛋i ! i z i p 、与防御机制 相关的巨噬细胞天然蛋白$ 涮k n r a m p 、离子交换蛋白家族c a x 、c a t i o n h + 反向运输载 第一章文献综述 体、阳离子扩散相关的转运家族c d f 和p 型a t p 酶等( i o n ，2 0 0 5 ) 此外，其它一些蛋 白如存在于玉米、水稻等许多植物质膜上的y s 和y s l 蛋白也参与锰离子的转运 ( r o b e r t se ta 1 ，2 0 0 4 ) 虽然几乎所有的y s l 转运体主要是转运铁的螯合物，但其中 部分蛋白如水稻中的o s y s l 2 、玉米中的z m y s l 等也参与了锰复合物的运输( k o i k ee t a i ，2 0 0 4 ；s c h a a f e ta 1 ，2 0 0 4 ) 定位分析表明，水稻中的o s y s l 2 能通过质膜转运 f e 2 + n a 和m n 2 + n a ，将金属运送到木质部以便长距离运输( k o i k ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 1 2 3 锰在植物体内的分布 大多数金属如n i ，z i l c d 和a s 等最初在植物叶片中积累部位主要在非光合作用 部位如表皮毛和表皮细胞的液泡等( v a l 缸ee t a l ，2 0 0 6 ) ，不少锰耐受植物也发现有类 似的现象。例如，有人对日本的两种锰积累植物e l e u t h e r o c o c c u ss c i a d o p h y l l o i d e s 和i l e x c r e n a t a 进行研究，发现锰最初主要积累在非光合作用部位，少量积累在多层栅栏组 织的叶肉细胞中( m e m o n & y a t a z a w a ，1 9 8 0 ；m e m o ne ta 1 ，1 9 8 1 ) 。但另外一些锰耐受植 物则表现出不同的积累特性。2 0 0 6 年，f e r n a n d o 等人利用质子激发x 荧光能谱x 射线 能谱分析法对g o s s i a b i d w i l l i i 等四种锰积累植物的锰分布进行研究，发现过量的锰主 要积累在叶片中且主要集中在光合作用部位，栅栏组织是锰积累的最初部位，并且发 现这几种植物的栅栏组织层数较多，表皮细胞中则没有发现锰的积( f e m a n d oe ta 1 ， 2 0 0 6 a , b ) 。人们发现在植物体内的积累的必需元素的z n 也有类似的分布( k f i p p e re ta 1 ， 2 0 0 0 ) 2 0 0 8 年, f e r n a n d o 等人利用x 射线微量分析技术研究了锰在坛f o u n i e r i 叶片中 的空间分布，发现锰含量高的叶片中的锰主要分布在皮层细胞中，而锰含量较少的叶 片中的锰更多分布在叶肉细胞中，作者推测可能是由于锰的积累部位在一定程度上受 到植物体内的锰浓度的影响。 由此可见，锰在植物叶片中的不同分布可能与其特殊的锰耐受机制有关，这还有 待于进一步深入研究。植物中可能存在多种防御机制，特异的防御机制是多种因素如 叶子的解剖形态、积累元素的毒害性、植物的生长条件、季节的变化及植物的特异适 应性等综合作用的结果( f c r n a n d oe ta 1 。2 0 0 8 ) 。 1 3 植物耐锰机制研究 通过对众多重金属耐性植物的研究，发现植物对重金属的耐性可通过两条基本途 径：金属排斥( m e t a le x c l u s i o n ) 和金属积累( m e t a la c c u m u l a t i o n ) ，前者指重金属被植物 吸收后又排出体外，或者重金属在植物体内的运输受到阻碍；后者指重金属在植物体 内以不具有生物活性的解毒形态存在，主要也包括两个方面，一方面是通过与金属离 子鳌合，形成失活的整合物，另一方面是将金属离子或其鳌合物区域化，使其积累在 非代谢区域如液泡中，这些积累的鳌合物最终通过衰老机制排出体外( b a k e r ，1 9 8 7 ) 4 第一章文献综述 正常生长的植物锰含量一般在2 0 5 0 0 m g k g ( 干重) ，因植物种类不同而有所差异， 但很少超过1 0 0 0 m g k g ，而锰超积累植物的叶片或地上干物质中锰的浓度超过1 0 9 k g ( b a k e r b r o o k s ，1 9 8 9 ) ，且地上部锰含量远高于根部，这种超强的锰超积累和耐受能 力必定有一套特殊的超积累与耐性机制在起调控作用目前，关于锰超积累或耐受植 物的耐锰机制研究在借鉴其它超积累植物研究成果和研究手段的基础上有了一定的 进展，其耐锰机制与其它超积累植物的重金属耐受机制既有相同之处也有不同之处， 主要有以下几方面： 1 3 1 细胞壁的固定作用及细胞膜的作用 人们发现，细胞壁能将金属离子吸收并固定住，缓解金属离子对细胞质膜的损害。 b r i n g e z u 等发现耐受重金属的植物s i l e n ev u t g a ms s p h u m i l i s 能通过蛋白或硅酸盐 将多种金属离子累积在表皮细胞壁上( b r i n g e z ue ta 1 ，1 9 9 9 ) 。但细胞壁与离子的结合 比例及其在金属耐受机制中的作用一直存在争议。虽然根细胞壁和土壤中的金属离子 直接接触，但将金属离子吸收并固定住的能力有限，只能相对缓解金属离子对细胞质 膜的损害，并且也很难解释植株忍耐金属离子的特异性( h a l l ，2 0 0 2o 质膜是重金属离子发生毒害作用的第一个作用部位，在高浓度的金属作用下，质 膜很可能受到损伤而加剧细胞内物质的渗漏。质膜的损伤主要是发生了氧化作用，蛋 白二硫键交联，关键膜蛋白如h + - a t p a s e 受到抑制或是膜的组成和流动性发生改变等 ( m e h a r g , 1 9 9 3 ) 因此要耐受重金属的毒害就得保护细胞质膜的完整性，减少由膜 损伤造成的细胞内溶物的渗漏。人们认为对金属具有耐受性的植株的细胞膜具有更强 的抗性和修复机制，但目前对细胞在金属胁迫下如何减少膜损伤的了解还不多，关于 锰超积累或耐受植株的细胞膜对锰的抗性和修复能力方面的报道也十分的少。人们推 测，这可能跟金属对膜的作用具有特异性有关，如锌离子具有保护膜免受氧化损伤的 作用，从而避免了细胞的膜渗漏( e r n s te ta 1 ，1 9 9 2 ) 另一种可能是，受到重金属损 伤后的膜的修复能力增强，有利于膜完整性的保持，这个过程涉及了热激蛋白和金属 硫因蛋白等( s a l te t a l ，1 9 9 8 ) 。目前，人们仍需要找到直接的证据证明细胞膜的这种 特性，相关方面的研究有待进一步深入 1 3 2 排出机制 细胞膜在维持金属离子的平衡方面起到重要作用，它可以阻止或减少金属离子进 入细胞并通过外排机制控制金属离子排出细胞，最终达到金属离子的平衡由于许多 阳离子是植物生长所必需，因此植物更多的是选择性外排而非完全排除所有的金属离 子( h a l l ，2 0 0 2 ) 。细菌的外排机制研究的较为透彻，研究发现，通过耗能的排出机制 将有毒害的离子排出机体是细菌最主要的一种抗性机制，其中涉及的转运体有p 型 5 第一章文献综述 a t p 酶、阳离子旷反向转运体等( s i l v e r & j i ，1 9 9 4 ；s i l v e r , 1 9 9 6 ) c u 、c d 、z n 、c o 和n i 等多种金属离子的排出泵系统也已经得到确定( s i l v e r , 1 9 9 6 ) 高等植物中关于 金属的排出机制或减少金属离子吸收的机制的报道较少，其中阐述比较清楚的是砷耐 受植物对于耐锰植株，人们推测其能通过m n 2 + h + 反向运输机制将锰运出细胞 ( c l a r k s o n ，1 9 8 8 ) ，但目前还没有足够的生理生化和分子方面的证据。此外，依赖a t p 的转运体如p 型a t p 酶和a t p b i n d i n gc a s s 甜e b c ) 转运体家族能介导其底物穿过 质膜。研究表明，锰转运体系中的a b c 转运体也在细菌中广泛存在，a b c 转运体参 与细胞内广泛的解毒过程，对有毒的次级代谢物和重金属等的毒害起到一定的缓解作 用( m a r t i n o i ae ta 1 ，2 0 0 2 ；h a l l & w i l l i a m s ，2 0 0 3 ) 。虽然，目前还没有足够的证据表明植 物中的a b c 转运体能够转运阳离子，但植物如水稻和a r a b i d o p s i s 基因组中含有大量 的a b c 转运体，这些转运体的特性还有待于深入研究( h a l l ，2 0 0 2 ) 。另外，人们在多种 植物如番茄，土豆和豆类的叶表面及其它植物如芥末，大麦和黄瓜的叶片边缘发现有 液滴存在，因此作者猜想液滴可能是白羽豆排出过量锰的途径之一，这种设想还有待 进一步探讨( v a l 缸ee ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 3 3 形成金属螯合物 细胞质中的金属能与高亲和性的配体结合形成螯合物，是植物重要的重金属解毒 和耐受机制之一。潜在的配体包括氨基酸、有机酸以及植物螯合物( p c s ) 和金属硫 因蛋白( m t s ) 这两种多肽( h a l l ，2 0 0 2 ) 。 1 3 3 1 有机酸和氨基酸 羧酸和氨基酸如柠檬酸、苹果酸、组氨酸等能与重金属有效螯合，在植物耐受和 缓解重金属毒害中有重要作用( r a u s e r , 1 9 9 9 ；c l e m e n s ，2 0 0 1 ) 例如，n i 超积累植物 a l y s s u ml e s b i a c u m 在n i 处理后，木质部汁液中的组氨酸含量呈线形增加，n i 超积累植 物a l y s s u ml e s b i a c u m 中组氨酸的含量与非超积累植物a l y s s u mm o n t a n u n 相比增加了3 6 倍( k r a m e r e t a l ，1 9 9 6 ) 。向非超积累植株彳枷聊m o n t a n u n 添加外源组氨酸后，发现 其耐受n i 的能力和将n i 运输到地上部分的能力大大增强( k r a m e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 。目前发 现，多种有机酸的存在可能对植物解除锰毒性起关键作用，有机酸能螯合金属离子形 成复合物，并储存在液泡中b i d w e l l 等人( 2 0 0 2 ) 研究发现，耐锰植物a u s t r o m y r t u s b i d w i l l i i 叶片中存在大量有机酸如草酸、琥珀酸、苹果酸、丙二酸等，其浓度达到了叶 子的总锰浓度的3 倍摩尔当量，这些有机酸能与自由形态的锰离子结合形成鳌合物， 从而减少自由锰离子的数量，减轻了锰对机体的毒害。 1 3 3 2 植物螯合多肽和金属硫因蛋白 鳌合多肽p c s 是一类金属复合性多肽家族，具有( y g l u c y s ) n - g l y ( n = 2 - 11 ) 的基 6 第一章文献综述 本结构，由植物体内g 可g s h 在p c 合酶的催化下合成的，能够与金属结合形成复杂复 合物p c s 并被储存在液泡中，从而达到解毒的作用。g i s b e r t 等( 2 0 0 3 ) 发现，在烟草中 过表达编码p c 合酶的基因t a p c s l 能提高植株对p b 和c d g j 耐性，转基因植株的根系要 比野生型的多出1 6 0 金属硫因蛋白m t s 是广泛存在于生物体内的低分子量蛋白，它富含半胱氨酸巯基 基团，能稳定结合金属形成复合物。目前，m t s 基因已经被转入多种植物尤其是模式 植物烟草中，用于对c d ，p b 和c u 的抗性研究( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 已经有证据说明， m t s 在重金属的耐受机制中起作用，但其在植物的重金属解毒机制中的作用还不是很 清楚( h a r r i e r , 1 9 8 6 ) ，它们有可能直接作用于金属代谢过程，也可能具有与抗氧化物 类似的功能( d i e t ze ta 1 ，1 9 9 9 ) ，还可能参与到质膜的修复过程中( s a l te ta l ，1 9 9 8 ) ， 其具体的作用还有待进一步深入研究。 目前，关于螯合多肽和金属硫因蛋白在锰耐受或超