（微生物学专业论文）粗毛栓菌trametes+hirsuta+lg9非典型漆酶的研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 弛i 盗沼 e l期：2 1 1 1 ：岁 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) ：砌新签一期：坐厂 山东大学博士学位论文 目录 f | 录l c o n t e n t s 1 摘要i a b s t r a c t v i l 缩写词表x i l l 第一章研究背景1 1 1 生物质与可持续发展l 1 2 生物质中的木质素2 1 2 1 木质素的分布3 1 2 2 木质素的结构4 1 3 木质素降解酶及非酶因素8 1 4 漆酶1 0 1 4 1 漆酶的结构和光谱学特征。1l 1 4 2 漆酶的氧化还原机制1 3 1 4 3 在自然界中的分布和生理功能1 6 1 4 4 漆酶可以催化的反应2 0 1 4 5 漆酶的分子生物学改造2 l 1 4 6 漆酶的应用2 2 1 4 6 1 漆酶与脱木质素2 3 1 4 6 2 漆酶与印染废水的处理2 4 1 4 6 3 漆酶与食品工业2 4 1 4 6 4 漆酶与有机合成2 4 1 5 发酵及应用条件优化方法2 5 1 6 本文的立题依据、可行性分析及研究内容2 8 第二章菌株的筛选与鉴定2 9 引言2 9 2 1 材料与方法。2 9 2 1 1 菌株的来源2 9 2 1 2 材料及主要仪器3 0 2 1 3 培养基3 0 2 1 4 产漆酶真菌的筛选3 l 2 1 5 菌种的活化与保存3 l 2 1 6 所得菌株产漆酶能力比较3 2 2 1 7 子实体形态观察3 2 2 1 8 菌丝体形态3 3 2 1 9 菌种的i t s 分子生物学鉴定3 3 2 1 9 1 真菌基因组d n a 的提取3 3 2 1 9 2 基因组d n a 的电泳检测3 4 2 1 9 3p c r 反应体系3 4 2 1 9 4p c r 产物纯化3 5 2 3 6 3 7 3 7 3 7 3 7 3 9 3 9 4 0 。4 1 4l 4 1 4 1 4 1 。4 ：! 。l ：! 。l ：! 素一4 2 4 3 4 3 4 3 4 4 4 4 4 5 4 7 4 8 4 8 ! ；l 5 3 5 3 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 5 ! ；! ； 5 5 5 5 5 5 ! ；! ； 5 6 5 6 山东大学博士学位论文 4 1 3 6 漆酶的酶促动力学研究5 7 4 1 3 7 漆酶的最适p h 5 7 4 1 3 8 漆酶的最适反应温度和温度稳定性5 7 4 1 3 9 底物广泛性研究5 8 4 1 3 1 0 漆酶抑制剂5 8 4 1 3 1 1 介体对漆酶氧化活性的影响5 8 4 2 结果与讨论5 8 4 2 1 漆酶的纯化。5 8 4 2 1 1d e a e s e p h a r o s ef f 离子交换层析5 8 4 2 1 2s e p h a c r y ls 2 0 0 分子筛层析5 9 4 2 1 3 纯化过程总结5 9 4 2 2zh i r s u t al g 9 漆酶的性质研究5 9 4 2 2 1s d s - p a g e 和n a t i v e p a g e 6 0 4 2 2 2 等电聚焦电泳6 0 4 2 2 3 漆酶的全波段光谱吸收6 0 4 2 2 4 漆酶的金属离子含量测定6 l 4 2 2 5 蛋白质的氮末端测序6 1 4 2 2 6 漆酶酶促反应动力学研究6 2 4 2 2 7 漆酶的最适p h 6 2 4 2 2 8 漆酶的最适反应温度和温度稳定性6 3 4 2 2 9 漆酶的底物广泛性研究“ 4 2 2 1 0 漆酶的抑制剂研究“ 4 2 2 1 l 介体对漆酶氧化的影响6 4 4 3 总结讨论6 6 第五章有机物对漆酶活性测定的影响6 9 引言6 9 5 1 材料与方法7 l 5 1 1 漆酶与试剂。7 l 5 1 2 实验方法7 1 5 1 2 1 酶活性测定7 l 5 1 2 2 漆酶活性的p h 依赖性7 l 5 1 2 3 产物对反应体系p h 值的影响7 l 5 1 2 4 添加有机物影响因子对反应体系p h 值的影响7 1 5 2 结果与讨论7 2 5 2 1 产物对反应体系的影响。7 2 5 2 2 漆酶的p h 依赖性7 2 5 2 3 草酸对漆酶活性测定的影响7 3 5 2 4e d t an a 2 对漆酶活性测定的影响7 5 5 3 本章小结7 6 第六章7 = h i r s u t al g 9 漆酶氧化机制及染料脱色条件优化7 7 引言7 7 6 1 材料与方法7 7 6 1 1 试剂7 7 6 1 2 酶与酶活测定方法7 8 目录 6 1 3u v v i s 紫外可见检测反应动力学。7 8 6 1 4 高压液相分析检测产物7 8 6 1 5 高压液相质谱连用分析产物一7 8 6 1 6 甲基红脱色条件优化7 8 6 1 6 1 部分因子试验7 8 6 1 6 2 最陡爬坡试验7 9 6 1 6 3 响应面分析试验7 9 6 2 结果与分析8 0 6 2 1u v v i s 紫外可见检测反应动力学8 0 6 2 2 高压液相分析检测产物8 l 6 2 3 高压液相质谱连用分析产物8 l 6 2 4 甲基红的氧化机制8 l 6 2 5 脱色条件优化8 3 6 2 5 1 部分因子试验8 3 6 2 5 2 最陡爬坡试验8 4 6 2 5 3 响应面分析试验8 5 6 3 本章小结8 9 全文总结及展望9 0 参考文献9 2 致 射10 7 发表论文1 0 8 论文l 1 0 9 论文2 1 1 6 4 山东大学博士学位论文 c o n t e n t s c o n t e n t s 1 a b s t r a c t ( c h i n e s e ) i a b s t r a c t ( e n g l i s h ) v i i a b b r e v i a t i o n s x i i i c h a p t e rlr e s e a r c hb a c k g r o u n d 1 1 1 b i o m a s sa n ds u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n t 1 1 2l i g n i n 2 1 2 1d s t r i b u t i o no f l i g n i n 3 1 2 2s t r u c t u r eo f l i g n i n 4 1 3e n z y m ea n do t h e rf a c t o r si nl i g n i nd e g r e d a t i o n 8 1 4l a c c a s e 1 0 1 4 1s t r u c t u r ea n ds p e c t r u mo f l a c c a s e l l 1 4 2o x i d a t i o nm e c h n i s mo f l a c c a s e 1 3 1 4 3d i s t r i b u t i o na n df u n c t i o n s 1 7 1 4 4r e a c t i o n so fl a c c a s e 2 0 1 4 5m o l e c u l o rm o d i f y 2 l 1 4 6a p p l i c a t i o n s 2 3 1 4 6 1l a c c a s ea n dd e l i g n i f i c a t i o n 2 4 1 4 6 2l a c c a s ea n dw a s tw a t e r 。2 4 1 4 6 3l a c c a s ea n df o o di n d u s t r y 2 5 1 4 6 4o r g a n i cs y n t h e s i s 2 5 1 5f e r m e n t a t i o na n dr e a c t i o no p t i m a t i o n 2 6 1 6p r o b l e mb a s e do ne s t a b l i s h e d ，f e a s i b i l i t ya n a l y s i sa n dc o n t e n t s 2 8 c h a p t e r2 i s o l u t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ff u n g u s 2 9 i n t r o d u t i o n 2 9 2 1 m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 。2 9 2 1 1f u n g i 2 9 2 1 2m a t e r i a la n d a p p a r a t u s 3 0 2 1 3m e d i u m 3 0 2 1 4s c r e e n i n go f f u n g u s 3 1 2 1 5 a c t i v a t i o na n ds t o r eo ff u n g i 3l 2 1 6s c r e e n i n go f h i g hp r o d u c t i o no f l a c c a s ef u n g u s 3 2 2 1 7m o r p h o l o g yo f f r u i t i n gb o d y 3 2 2 1 8m o r p h o l o g yo f m y c e l i u m 3 3 2 1 9i t sm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o no ft h ef u n g u s 3 3 2 1 9 1e x t r a c t i n go f g e n o m ed n a 3 3 2 1 9 2g e n o m ed n ae l e c t r o p h o r e s i s 3 4 c o n t e n t 2 2 1 9 3p c rr e a c t i o n 3 4 2 。1 9 4p c rp r o d u c t i o np u r i f i c a t i o n 3 5 2 1 9 5c o n n e c t i o nt r a n s f o r m a t i o n 3 6 2 1 9 6e x 仃a c f i o n go f p l a s m i d 3 7 2 1 9 7d n a s e q u e n c eb l a s t 3 7 2 2r e s u l t sa n dd i s c c u s i o n 3 7 2 2 1s c r e e n i n go fl a c c a s ep r o d u c t i o nf u n g u s 3 7 2 2 2m o r p h o l o g y 3 9 2 2 3i t ss e q u e n c i n g 一3 9 2 3c o n c l u s i o n 4 0 c h a p t e r3t h ei n f l u e n c ef a c t o r so fl a c c a s ep r o d u c t i o n 4 1 i n t r o d u t i o n z i l 3 1m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 4 l 3 1 1f u n g u s 4 l 3 1 2c u l t u r em e t h o d 4 l 3 1 3l a c c a s es e p a r a t i o na n da s s a y 4 2 3 1 4d e t e r m i n a t i o n o fb i o m a s s 4 2 3 1 5b i o m a s sa n dl a c c a s ep r o d u c t i o n 4 2 3 1 6o r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g n 4 2 3 1 7f a c t o r i a ld e s i g n 4 3 3 1 8s t e e p e s t a s c e n tp a t h 4 3 3 1 9r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s 4 3 3 2r e s u l t sa n dd i s c c u s i o n 4 4 3 2 1r e s u l t so f l a c c a s ep r o d u c t i o na n db i o m a s s 4 4 3 2 2r e s u l t so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g n 4 5 3 2 3r e s u l t so f f a c t o r i a ld e s i g n 4 7 3 2 4r e s u l t so f s t e e p e s t a s c e n tp a t h 4 8 3 2 5r e s u l t so f r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s 4 8 3 3c o n c l u s i o n ! ；l c h a p t e r4n l r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f l a c c a s e 5 3 i n t r o d u t i o n ! ；：； 4 1m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 5 4 4 1 1f u n g u sa n dc u l t u r em e t h o d s 5 4 4 1 2p r o c e s so fn l r i f i c a t i o n 5 4 4 1 2 1f r e e z e n t h r o w n 一5 4 4 1 2 2u l t r a f i l t r a t i o n 5 4 4 1 2 3a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n 5 4 4 1 2 4d e a e s e p h a r o s ef fa n i o n i ce x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y 5 5 4 1 2 5s e p h a c r y ls - 2 0 0s i z e - e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y 5 5 4 1 2 6p r o t e i nc o n c e n t r a t i o nd e t e r m i n a t i o n 5 5 4 1 3p r o p e r t i e so f l a c c a s e 一5 5 山东大学博士学位论文 4 1 3 1s d s p a g ea n dn a t i v e p a g e 5 5 4 1 3 2i s o e l e c t r i cf o c u s i n g 5 5 4 1 3 3s p e c t r aa b s o r p t i o no fl a c c a s e 5 6 4 1 3 4m e t a l sc o n t e n t 5 6 4 1 3 5n - t e r m i n a ls e q u e n c e a n a l y s i s 5 6 4 1 3 6k i n e t i cp a r a m e t e r sf o rl a c c a s e 5 7 4 1 3 7o p t i m a lp ho f l a c c a s e 5 7 4 1 3 8o p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dt h e r m a ls t a b i l i t y 5 7 4 1 3 9s u b s t r a t e so f l a e c a s e 5 8 4 1 3 1 0l n h i b i t o r so f l a c c a s e 5 8 4 1 3 1 ll n f l u n c eo fm e d i a t o r so nl a c c a s eo x i d a t i o n 5 8 4 2r e s u l t sa n dd i s c c u s i o n 5 8 4 2 1p u r i f i c a t i o no f l a c c a s e 5 8 4 2 1 1d e a e - s e p h a r o s ef fa n i o n i ce x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y 5 9 4 2 1 2s e p h a c r y ls 2 0 0s i z e e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y 5 9 4 2 1 3s u m m a r yo f p u r i f i c a t i o n 5 9 4 2 2p r o p e r t i e so fl a c c a s e 6 ( ) 4 2 2 1s d s p a g ea n dn a t i v e p a g e 6 0 4 2 2 2i s o e l e c t r i cf o c u s i n g 6 0 4 2 2 3s p e c t r aa b s o r p t i o no f l a c c a s e 。6 0 4 2 2 4m e t a l sc o n t e n t 6 l 4 2 2 5n t e r m i n a ls e q u e n c ea n a l y s i s 6 1 4 2 2 6k i n e t i cp a r a m e t e r sf o rl a c c a s e 6 2 4 2 2 7o p t i m a lp ho f l a c c a s e 6 3 4 2 2 8o p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dt h e r m a ls t a b i l i t y 6 3 4 2 2 9s u b s t r a t e so f l a c c a s e 6 4 4 2 2 1 0i n h i b i t o r so f l a c c a s e 6 4 4 2 2 1 li n f l u n c eo fm e d i a t o ro nl a c c a s eo x i d a t i o n 6 5 4 3c o n c l u s i o n 6 6 c h a p t e r5i n f l u e n c eo fo r g a n i s mo nl a c c a s ea c t i v i t yd e t e r m i n a t i o n 6 9 i n t r o d u t i o n 6 9 5 1m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 7 1 5 1 1l a c c a s ea n dr e a g e n t s 7 l 5 1 2m e t h o d s 7 1 5 1 2 1l a c c a s e a s s a y 7 l 5 1 2 2p hd e p e n d a n c eo f l a c c a s e 。7 1 5 1 2 3i n f l u e n c eo f t h ep r o d u c t i o no np h 7 l 5 1 2 4i n f l u e n c eo f o r g a n i s mo np h 7 1 5 2r e s u l t sa n dd i s c c u s i o n 7 2 5 2 1i n f l u e n c eo f t h ep r o d u c t i o n 7 2 5 2 2r e s u l t so f p hd e p e n d a n c eo f l a c c a s e 7 2 3 c o n t e n t 5 2 3i n f l u e n c eo f o x a l i ca c i do nl a c c a s ea c t i v i t yd e t e r m i n a t i o n 7 3 5 2 4i n f l u e n c eo f e d t a n a 2 0 nl a c c a s e a c t i v i t yd e t e r m i n a t i o n 7 5 5 3c o n c l u s i o n 7 6 c h a p t e r6r e a c t i o ns c h e m eo fm e t h y lr e d a n dd e c o l o r i z a t i o no p t i m i z a t i o n 7 7 i n t r o d u t i o n 77 6 1m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 7 7 6 1 1r e a g e n t s 7 7 6 1 2l a c c a s ea n dl a c c a s e a s s a y 7 8 6 1 3u v v i sd e t e c t i o n r e a c t i o nd y n a m i c s 7 8 6 1 4h p l ca n a l y s i s d e t e c t i o no f p r o d u c t i o n 7 8 6 1 5e s i m sa n a l y s i s 。i d e n t i f i c a t i o no fo x i d a t i o np r o d u c t s 7 8 6 1 6d e c o l o r i z a t i o no p t i m i z a t i o n 7 8 6 1 6 1f a c t o r i a ld e s i g n 7 8 6 1 6 2s t e e p e s t a s c e n tp a t h 7 9 6 1 6 3r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s 7 9 6 2r e s u l t sa n dd i s c c u s i o n 8 0 6 2 1u v - v i sd e t e c t i o n r e a c t i o nd y n a m i c s 8 0 6 2 2h p l ca n a l y s i s d e t e c t i o no fp r o d u c t i o n s 。8 l 6 2 3e s i m sa n a l y s i s i d e n t i f i c a t i o no fo x i d a t i o np r o d u t 81 6 2 4p r o b a b l yr e a c t i o ns c h e m eo f m e t h y lr e d 8 l 6 2 5d e c o l o r i z a t i o no p t i m i z a t i o n 8 3 6 2 5 1r e s u l t so f f a c t o r i a ld e s i g n 8 3 6 2 5 2r e s u l t so f s t e e p e s t a s c e n tp a t h 8 4 6 2 5 3r e s u l t so f r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s 8 5 6 3c o n c l u s i o n s 8 9 g e n e r a lc o n c l u s i o n s 9 0 r e f e r e n c e s 9 2 a c k n o w l e d g e m e n t s 1 0 7 c o n t e n t so f a r t i c l e sa n dp a t e n t s 1 0 8 p a p e rl 1 0 9 p a p e r 2 1 1 6 4 山东大学博士学位论文 摘要 能源、环境、粮食问题是人类二十一世纪所面临的三大主要问题。生物质能 源的开发和利用让人们找到了化石能源的很好的替代品。生物质是地球上数量最 丰富的可再生性资源，这些生物质主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，它们 能够为人类提供燃料、饲料、以及化工原料等，具有重要的开发价值。合理的利 用自然界中的生物质发酵生产乙醇是目前最有应用前景的可持续发展的策略之 一。而木质素的包被作用恰恰是阻碍生物质转化产乙醇的主要瓶颈之一。研究木 质素的降解机理对于解决该问题有着重要的意义。造纸、印染等行业的污水中的 有机污染物主要是木质素的小分子片断，以及木质素单体的衍生物及稠环类芳香 族化合物。木质素是一种高聚芳香族化合物，木质素在自然界中的降解不产生毒 性，而工业产生中的芳香族化合物有着在自然界中的难降解性和毒性，使得芳香 族化合物的污染成为人们的主要研究对象。 漆酶有着很好的底物广泛性( 典型的单酚、双酚、多酚、苯胺、甲氧基酚以 及细胞色素c 等) 。漆酶氧化的过程中伴随着还原氧气生成水。漆酶还能够直接 氧化一些小分子物质生成自由基，自由基能够引发一系列的氧化反应。漆酶是木 质素代谢过程中的一个主要酶，绝大多数漆酶不能够直接氧化非酚型芳香族化合 物，这使得漆酶在木素代谢的研究中被人们所忽略。介体发现以后，人们对漆酶 有了一个新的认识，漆酶的氧化机理和应用研究也越来越受到人们的重视。漆酶 能够利用氧气为电子受体氧化芳香族化合物的特性以及具有很强的底物专一性 和底物广泛性，使得漆酶被广泛应用于纸浆造纸、造纸污水处理、印染污水处理、 食品饮料行业以及有机合成中。 在本论文从分离菌株出发，并对菌株进行了鉴定和酶的纯化及酶学性质研 究。主要工作如下： 1 高效产漆酶的菌株的分离及鉴定。 从本实验室菌株库、院菌种室以及选择性购买、筛选得到一株高效产漆酶的 菌种，该菌株生长迅速，能够高效生产漆酶。经过形态学，及子实体形态观察， 摘要 结合i t s 序列分析，鉴定该菌株为t r a m e t e sh i r s u t al g - 9 ，并对该菌株进行了保藏， 其保藏编号为：c g m c cn o 2 4 2 2 。 2 影响该菌株产酶的因素及c n 比值进行研究 我们通过正交试验、全因子试验、最陡爬坡和响应面分析对影响zh i r s u t al g 9 产漆酶的因素进行了分析( 其策略如图l 所示) ，结果表明c n 比值在漆酶发酵 生产中有很大的影响。优化最佳碳源和氮源的值为c = 1 0 3 1gl 一和n =