（有机化学专业论文）基于磁性微球的化学发光免疫标记技术的研究及其应用.pdf

| 爹， 、摹l - ；。j ! 幕于磁忡微球的化学发光免疫标记技术的圳究及j lj 衄用 l i ，张髓，。j 青岛科技人学研究生学位论义 1 j i i i j i i i l l l j i i j i i j i j il i l i i j i i l j l l l i l l l l l l r r l l l l 蠢 | y 17 4 0 3 3 9 基于磁性微球的化学发光免疫标记技术的研 究及其应用 摘要 本文将磁性微球技术、标记技术和纳米技术相结合，探索高灵敏度化学发光 免疫分析新方法。基于化学发光、光谱学等手段对构筑的免疫分析新方法性能进 行研究。结果表明，所建立的检测方法灵敏度高，易制作、简便，在生化分析中 将具有广阔的应用前景。 本文主要开展了以下几个方面的工作： 一、化学发光磁酶免疫分析方法的研究及其应用 研究基于磁性微球的化学发光双抗体夹心酶联免疫分析方法，利用 l u m i n 0 1 h 2 0 2 化学发光酶联免疫分析体系实现了对甲胎蛋白抗原( a f p ) 的灵敏 检测。该方法测得的相对化学发光强度与a f p 浓度在o 8 8 0n gm l 1 范围内呈 线性关系。用该方法应用于人血清样品中a f p 的检测，并与经典的e l i s a 法进 行了对照，二者相关性良好。 二、鲁米诺标记金纳米粒子化学发光磁性免疫分析方法的研究及其应用 研究以金纳米粒子为载体，利用共价结合作用固定发光底物鲁米诺和癌胚抗 原抗体( a n t i c e a ) ，建立了一种新型的、简便的化学发光标记技术，研究了一种 新型测定c e a 的化学发光磁性免疫分析方法。利用l u m i n 0 1 h 2 0 2 c 0 2 + 无酶化学 发光体系对c e a 测定的线性范围为线性范围为5 0n gm l q - 2 0 0n gm l 1 。用该方 法对人血清样品进行了测定，并与e l i s a 法进行了对照，二者相关性良好。 三、异鲁米诺标记聚苯乙烯微球化学发光法测定谷胱甘肽 结合标记技术，将异鲁米诺标记在官能团化的聚苯乙烯微球上。利用 i s l o u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 化学发光体系，以磁性微球作为载体，结合谷胱甘肽打断双 硫键的性质，研究测定游离谷胱甘肽和细胞内的游离巯基化合物的化学发光分析 方法。该方法测定谷胱甘肽的线性范围为5 0 1 0 一om o ll - i 8 0 1 0 罐t o o ll - l 。 关键词化学发光标记技术磁性微球纳米粒子 捧十磁- 降微球的化学发光免疫标记技术的研究及j e 心用 i l ，、谛巍帚嚣： 青岛科技人学硼f 究生学位论义 s t u d l e so nt h e c h e m l l u m i n e s c e n c e l m m u n o l a b e ll i n gt e c h n i q u e b a s e do nm a g n e t i cb e a d sa n dl t s a p p l i c a t i o n s a b s t r a c t t h i sp a p e rd i s c u s s e dt h en o v e la n ds e n s i t i v ec h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y s i n t e g r a t i n gw i lt h em a g n e t i cb e a d st e c h n i q u e ，l a b e l l i n gt e c h n i q u ea n dn a n o t e c h n i q u e t h ec lr e a c t i o nc o n d i t i o n sa n dt h ep e r f o r m a n c eo ft h eb i o s e n s o r sw e r es t u d i e db y u s i n gc h e m i l u m i n e s c e n c ea s s a ya n ds p e c t r a la n a l y s i s i ns u m m a r y , t h eh i g hs e n s i t i v i t y , e a s eo ff a b r i c a t i o na n dal o wc o s tm a k em e t h o d si nt h i sp a p e rm a yp r o v i d ea n i n t e r e s t i n ga l t e r n a t i v et o o lf o rd e t e c t i o np r o t e i ni nc l i n i c a ll a b o r a t o r y a n di t h a sa g o o dd e v e l o p m e n t a lp r o s p e c t t h em a i nj o b so ft h i sp a p e rc a nb ec o n c l u d e da sf o l l o w s ： 1 t h es t u d yo nt h ec lm a g n e t i ce n z y m e l i n k e di m m u n o a s s a ya n di t sa p p l i c a t i o n ac lm a g n e t i ce n z y m e - l i n k e di m m u n o a s s a yw a sd e v e l o p e di n t e g r a t i n gw i t ht h e m a g n e t i cb e a d sa n ds a n d w i c hi m m u n o c o m p l e x e s t h ec o n c e n t r a t i o no f 仅一f e t o p r o t e i n ( a f p ) w a sm o n i t o r e db a s e do nt h eh r p l a b e la c t i v i t yt o w a r dt h eo x i d a t i o no fl u m i n o l ， w h i c hw a sq u a n t i f i e db yc lm e t h o d t h el i n e a rr a n g ef o rh u m a na f pw a s0 8n g m l 8 0n g m l t h ec lm a g n e t i ce n z y m e l i n k e di m m u n o a s s a yf o rc l i n i c a la p p l i c a t i o n s w a si n v e s t i g a t e db ya n a l y z i n gs e v e r a lr e a ls a m p l e s ，i nc o m p a r i s o nw i t ht h ee l i s a m e t h o d t h ec a l i b r a t i o nc u r v ei n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e b e t w e e nt h er e s u l t sg i v e nb yt w om e t h o d s 2 t h e s t u d y o nt h ec lm a g n e t i c e n z y m e l i n k e di m m u n o a s s a y b a s e do n l u m i n o l a n t i b o d yl a b e l e dg o l dn a n o p a r t i c l e sa n di t sa p p l i c a t i o n af a c i l em a g n e t i ce n z y m e l i n k e di m m u n o a s s a yb yl o a d i n gl u m i n o la n ds e c o n d a r y 螭十磁件微球的化学发光免疫标记技术的研究及j e 应用 a n t i b o d yo ng o l dn a n o p a r t i c l e s ( a un p s ) w a sd e s c r i b e di nt h i sw o r k t h el a b e lm e t h o d w a sf u r t h e re v a l u a t e dv i aas a n d w i c h t y p ec li m m u n o a s s a yo fc e ai ns e r u m i nt h i s p r o t o c o l ，t h ec e aa n a l y t ew a sc a p t u r e db yt h ep r i m a r ya n t i b o d yi m m o b i l i z e do nt h e s u r f a c eo fm a g n e t i cb e a d s ，a n dt h e nw a ss a n d w i c h e db yt h es e c o n d a r ya n t i b o d yl o a d e d o nl u m i n 0 1 1 a b e l e da un p s t h el i n e a rr a n g ef o rc e aw a s5 0 xlo 一2 0 x10 8gm l 1 b yu s i n gc 0 2 + a sc a t a l y s t s t h ec lm a g n e t i ce n z y m e l i n k e di m m u n o a s s a yb a s e do n l u m i n o l a n t i b o d yl a b e l e dg o l dn a n o p a r t i c l e sf o rc l i n i c a la p p l i c a t i o n sw a si n v e s t i g a t e d b ya n a l y z i n gs e v e r a l r e a ls a m p l e s ，i nc o m p a r i s o nw i t ht h ee l i s am e t h o d t h e c a l i b r a t i o nc u r v ei n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h er e s u l t s g i v e nb yt w om e t h o d s 3 t h es t u d yo nt h ec ld e t e c t i o no fg s hu s i n gi s o l u m i n o ll a b e l e do np o l y s t y r e n e m i c r o b e a d s an e ws t r a t e g yw a sd e s i g n e df o rd e t e c t i n gg s ha n df r e et h i o l si nk 5 6 2c e l l sb y c h e m i l u m i n e s c e n ts y s t e mo fi s o l u m i n o l - h 2 0 2 - h r pt h r o u g hg s hc l e a v i n gd i s u l f i d e c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o ni so fh i g hs e n s i t i v i t y , r a p i d i t ya n ds i m p l i c i t ya n dt h e l i n e a rr a n g eo fg s hw a s5 10 。1 0t o8 10 8m o ll 1 t h i ss t r a t e g yp r e s e n t san e w m e t h o dt od e t e r m i n eg s ha n dt h i o l sw i t hh i g hv e r a c i t ya n df e a s i b i l i t y k e yw or d sc h e m i l u m i n e s c e n c e ；l a b e l l i n gt e c h n i q u e ；m a g n e t i cb e a d s ； i i 青岛科技人学l o f t s 生学位论文 目录 第1 章前言1 l 化学发光1 1 1 化学发光的历史1 1 2 化学发光的定义和原理1 1 3 常用的化学发光试剂2 1 3 1 鲁米诺及其衍生物化学发光试剂2 1 3 2 过氧草酰类化学发光试剂一3 1 3 3 吖啶酯类化学发光试剂4 1 3 4 钌( i i ) 联吡啶或钌( i i ) 邻菲哕啉配合物4 1 3 5 其它常用化学发光试剂4 1 4 化学发光分析法的应用5 1 4 1 化学发光分析在农药残留检测中的应用5 1 4 2 化学发光分析在药物分析中的应用5 1 4 3 化学发光分析在生物活性物质分析中的应用5 1 4 4 化学发光分析在其它物质分析中的应用6 1 5 化学发光分析法的发展趋势”6 2 免疫分析的简介6 2 1 免疫分析6 2 2 免疫分析方法的分类7 2 2 1 按测定原理分类7 2 2 2 按检测方式分类”7 3 化学发光免疫分析方法”8 3 1 化学发光免疫分析方法8 3 2 化学发光酶免疫分析方法8 3 2 1h r p 标记的免疫分析方法9 3 2 2a l p 标记的免疫分析方法9 3 3 电致化学发光免疫分析方法“9 4 化学发光免疫分析中的固定方法1 0 4 1 吸附法1 0 4 2 共价键合法1o 4 3 包埋法1 1 4 4 层层自组装法1 1 5 化学发光免疫分析中的载体1 1 摹十磁性微球的化学发光免疫标记技术的研究及j l ：h , i 用 5 1 化学发光免疫免疫分析方法对载体材料性能的要求11 5 2 磁性微球作为固相载体在免疫分析中的应用11 6 纳米技术在化学发光免疫分析中的应用1 2 6 1 纳米材料概述1 2 6 2 纳米材料在化学发光免疫分析方法中的应用一12 7 课题意义及主要内容l3 第2 章化学发光磁酶免疫分析检测甲胎蛋白1 4 1 弓i 言1 4 2 实验部分1 5 2 1 仪器与试剂15 2 1 1 仪器及试剂l5 2 1 2 溶液配置方法16 2 2 实验方法l6 2 2 1 免疫磁性微球的制备1 6 2 2 2 基于m b a n t i a f p a f p a n t i a f p h r p 鲁米诺过氧化氢t r p 化学发光体系 钡4 定a f p 17 2 2 3e l i s a 法测定a f p 17 3 结果与讨论1 7 3 1 制备免疫磁性微球的条件选择1 7 3 1 1a f p 单克隆抗体( a n t i a f p ) 浓度的选择1 7 3 1 2 磁性微球用量的选择一l8 3 2 基于m b a n t i a f p a f p a n t i a f p h r p 化学发光检测a f p ”l8 3 3 血清样品分析1 9 3 4 选择性2 0 3 5 重现性和回收率2 0 4 爿、结一2 l 第3 章基于磁性微球的鲁米诺标记金纳米粒子化学发光无酶免疫分 析检测癌胚抗原2 2 。l 引言：2 2 2 实验部分2 4 2 1 仪器与试剂2 4 青岛科投人学研究生学位论文 2 2 实验方法2 4 2 2 1l u m i n o l h 2 0 2 c 0 2 + 化学发光体系的实验方法2 4 2 2 2 金纳米粒子( a un p s ) 的制备与表征2 4 2 2 3 化学发光免疫探针l a a un p s 的制备2 4 2 2 4 免疫磁性微球的制备2 4 2 2 5 基于m b a n t i c e a c e a l a a un p s l u m i n 0 1 h 2 0 2 c 0 2 + 无酶化学发光体系检 澳0c e a 2 5 2 2 6e l i s a 法测定c e a 2 5 3 结果与讨论2 5 3 1 巯基丙酸( m p a ) 浓度的选择2 5 3 2a n t i - c e a2 和l u m i n o l 浓度的选择2 6 3 3i ，a a _ un p s 的光谱表征2 7 3 4l a a i un p s 的t e m 表征2 8 3 5 。l 舢札n p s 的化学发光性质研究2 9 3 6 基于磁性微球的鲁米诺标记金纳米粒子化学发光无酶免疫分析检测c e a 3 0 3 6 1l u m i n o l h 2 0 2 c 0 2 + 无酶化学发光体系条件选择3 1 3 6 2 基于磁性微球的鲁米诺标记金纳米粒子化学发光无酶化学发光体系测定 c e a ? 嚣3 2 3 7 血清样品分析3 2 3 8 选择性3 3 3 9 重现性和回收率3 4 4d 、结j 3 4 第4 章异鲁米诺标记聚苯乙烯微球化学发光法测定谷胱甘肽3 5 1 引言_ 3 5 2 实验部分3 6 2 1 仪器与试剂3 6 2 1 1 仪器3 6 2 1 2 试剂3 6 2 2 实验方法3 6 2 2 1 异鲁米诺化学发光探针的制备3 6 2 2 2 磁珠一异鲁米诺化学发光探针复合物的制备3 7 2 2 3 谷胱甘肽打断双硫键3 7 2 2 4 化学发光检测3 7 2 2 5k 5 6 2 细胞中游离巯基的检测3 7 3 结果与讨论点一3 8 3 1 桥联d n a 体积的优化3 8 1 1 1 基于磁性微球的化学发光免疫标记技术的研究及应用 3 2 聚苯乙烯微球、桥联d n a 、异鲁米诺分子比例的计算”3 9 3 2 1 标准桥联d n a 溶液的紫外测定3 9 3 2 2 标准异鲁米诺溶液的紫外测定3 9 3 2 3 聚苯乙烯微球表面d n a 分子数的计算“4 0 3 2 4 聚苯乙烯微球表面异鲁米诺分子数的计算4 1 3 2 5 聚苯乙烯微球的个数计算4 l 3 2 6 聚苯乙烯微球、侨联d n a 、异鲁米诺分子比例的计算“4 1 3 3 磁珠与聚苯乙烯微球比例的计算4 l 3 3 1 标准异鲁米诺溶液的化学发光测定4 l 3 3 2 磁珠异鲁米诺化学发光探针复合物上异鲁米诺浓度的测定4 2 3 3 3 磁珠个数的计算4 2 3 3 4 磁珠与聚苯乙烯微球比例的计算“4 2 3 4 谷胱甘肽打断磁珠一异鲁米诺化学发光探针复合物中双硫键条件的选择一4 2 3 4 1 谷胱甘肽p h 的选择4 2 3 4 2 谷胱甘肽反应时间的选择”4 3 3 5 化学发光条件的选择4 4 3 5 1 底液p h 的选择4 4 3 5 2 过氧化氢浓度的选择4 5 3 6 谷胱甘肽浓度的测定4 5 3 7 细胞中游离巯基化合物的测定4 6 4 j 、结4 6 结论4 7 参考文献4 8 致谢5 8 攻读学位期间发表的学术论文目录5 9 声明6 0 i v 青岛科技人学研究生学位论文 l 化学发光 第1 章前言 1 1 化学发光的历史 最早发现的化学发光现象始于生物体( 如萤火虫) 发出的可见光，即所谓的 生物发光( b i o l u m i n e s c e n c e ) 。1 9 世纪末期，人们发现一些非生物有机化合物也 能具有化学发光现象。1 8 7 7 年，r a d z i s z e w s l ( i 【l 】发现洛粉碱( 2 ，4 ，5 一三苯基咪唑) 在碱性介质中与过氧化氢反应时可以产生绿光，这是人们首次利用人工合成的化 合物观察到化学发光现象。此后，研究者又合成一系列具有化学发光现象的化合 物，研究了它们的化学发光特性。1 9 0 2 年，s c h m i t z 合成了鲁米诺( l u m i n o l ，3 氨基苯二甲酰肼) 。1 9 2 8 年，a l b r e c h t 发现鲁米诺在碱性介质中会产生化学发光 现象，这一发现是化学发光史上一个重要的里程碑，对于化学发光应用于分析起 到了关键的作用。1 9 3 5 年，g l e u 和p e t s c h 2 】首次报道了光泽精( n ，n 二甲基二吖 啶硝酸盐) 与过氧化氢反应可以产生化学发光。 在研究有机化合物的发光现象的同时，研究者也研究了一些生物发光现象， 从低等细菌到高等发光鱼的发光现象，这些发光现象大多是由荧光素酶和荧光素 引起的发光反应。但是由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，并由于当时 检测系统灵敏度的限制，直至到2 0 世纪六十年代，化学发光分析方面的研究才 被用于分析化学。化学发光分析不需要9 1 、；o n 光源，可以避免检测过程中背景光和 杂散光的干扰，从而可以降低仪器噪音的影响，使得化学发光分析法具有很高的 灵敏度。近年来，化学发光分析法在生物医学领域得到了迅速发展。 1 2 化学发光的定义和原理 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) ，可以简单地定义为化学反应所产生的 光辐射现纠 5 1 。即反应体系中的某些物质分子吸收反应释放的能量而由基念跃迁 至激发态，然后再从激发态返回基态时将能量以光辐射的形式释放出来，产生化 学发光现象。一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下三个条件： 化学反应必须提供足够的激发能，并且是由某一步骤单独提供，以避免 反应释放的能量因振动驰豫消失在溶液中而不能产生化学发光； 有利的反应过程，确保反应释放的能量至少能被一种物质所接受并生成 激发态； 。 激发态分子具有一定的化学发光量子效率释放出光子，或者能够将其能 皋于磁忡微球的化学发光免疫标记技术的l j 究及ej 衄用 量转移给另一种分子使其激发至激发态，当它由激发念返回至基态时释放出光 子。也就是说并不是任何化学反应都能产生化学发光反应。但一些氧化还原反应 可以满足以上条件，可以产生化学发光现象。 化学发光反应之所以能应用于分析测定，是基于化学反应的发光强度与化学 反应的速率相关联。化学发光强度( i c l ) 取决于化学反应的速率( d p d t ) 和化学 发光量子效率( 晚l ) ，即： i c e ( t ) = t b l d p d t = 魂。q 准m d p d t ( 1 - 1 ) 式( 1 1 ) 中，吨为化学发光量子产率；晚m 为发光量子产率。 对于一定的化学发光反应，晚i ，为一定值，因此可以通过测定化学反应的化 学发光强度测定反应体系中影响反应速率的某种物质的浓度。例如，在一级反应 中，如果保持除物质a 外其余组分的浓度保持恒定，则有如下关系式： i c l = j i c l ( t ) d t = jq ) c l d a d t d t = 晚e c a ( 1 - 2 ) 即化学发光强度与物质a 的浓度( c a ) 成正比。 根据上述关系式，利用化学发光分析可以测定： 化学发光反应中的反应物； 化学发光反应中的催化剂、增强剂或抑制剂； 偶合反应中的反应物、催化剂、增强剂等。 另外，通过标记上述三类物质，还可以测定与这些物质有作用的相关物质， 如抗体或抗原、核酸等，从而进一步扩大了化学发光分析的应用范围。 1 3 常用的化学发光试剂 鲁米诺及其衍生物、过氧草酰类化合物、吖啶酯类化合物等化学发光分析中 常用的发光试剂。除以上早期开发的发光试剂外，研究者还合成了一些新型化学 发光试剂，并建立了一些新型的化学发光体系。以下仅介绍几种常用的化学发光 试剂。 1 3 1 鲁米诺及其衍生物化学发光试剂 鲁米诺是一种经典的化学发光试剂，在碱性条件下可以被一些氧化剂如 h 2 0 2 、k 3 f e ( c n ) 6 、k m n 0 4 、活性氧等氧化生成激发念中间体，返回至基态时发 射出光子，显示蓝光，其最大发射波长与溶剂、p h 值等因素有关。在此体系中 经常会加入一些催化剂，如过氧化物酶1 6 7 】、血红蛋白【8 1 、过渡金属离子 9 - 1 2 】，以 提高此反应体系的发光强度。另外，一些物质对鲁米诺的化学发光有增强或抑制 作用【1 3 ，1 4 】，根据其发光强度与反应体系中增敏剂或抑制剂的浓度呈线性关系，可 以对这些物质进行灵敏检测。鲁米诺因其结构简单、易合成、毒性小、水溶性好 及量子效率高等优点，在生物学和医学领域得到了广泛和深入的研究和应用 2 青岛科技人学研究生学位论文 【1 5 - i7 】 0 由于鲁米诺的氧化中间产物还没有得到统一的结论，只是确定了最终发光的 物质是氨基邻苯二甲酸盐离子，目f i i 公认的鲁米诺化学发光机理如图1 1 所示。 l u m i n o i 3 - a m i n o p h t h a l a t e3 - a m i n o p h t h a l a t e ( 3 - a p a )3 - a p a ) ，e x c i t e ds t a t eg r o u n ds t a t e 图1 1 鲁米诺化学发光机理 f i g 1 - 1t h e c h e m i l u m i n e s c e n c em e c h a n i s mo fl u m i n o l 1 3 2 过氧草酰类化学发光试剂 过氧草酰类化学发光试剂包括草酸氯、草酸酐、革酸酯和草酰胺四种羧基衍 生物。自1 9 6 3 年c h a n d r o s s 1 8 1 首次报道了草酰氯与过氧化氢、9 ，l o 二苯基葸( d p a ) 反应产生化学发光以来，人们在过氧草酰类化学发光试剂的合成、应用和发光机 理研究等方面做了大量工作。r a u h u t 等f 1 9 】发现，上述化学发光反应的量子产率高 达5 。b a s u m a t a r y 等【2 0 】合成了2 1 种草酸酯类试剂，发现含有电负性取代芳基的 草酸酯类化合物量子产率相对要高，例如，双 2 ，4 二硝基苯基】草酸酯( d n p o ) ， 量子产率可高达达2 3 5 ，双【2 ，4 ，6 三氯苯基】草酸酯( t c p o ) ，量子产率为18 ， 后者是一种常用的草酸酯类发光试剂。 0 0 0 0 r d 一墨一尝一o r + h 2 0 2 - r 争一旦一凸一。一o h + r d h 0 0 。0 - - 0 i i il 一卜卜沪洲一矿弋一一 0 - - 0 ii 矽弋+ 咖一叫“2 哂 d y e - h v c i 亿毗r c 卜 、c l 图1 - 2 过氧草酰类发光试剂的共同中间体发光机理 + f i g 1 2t h ec h e m i l u m i n e s c c n c em e c h a n i s mo fp e r o x a l a t e 在过氧草酰类化学发光体系中， 剂、荧光试剂、过氧化氢和催化剂。 必须具备4 种要素化合物，即过氧草酰类试 此类发光体系可用于过氧化氢的定量分析和 群。 _ 戈。 o 一嘲2 一m归一詈 o 基于磁- 降微球的化学发光免疫标记技术的研究及】e 应用 一些荧光试剂的检测【2 1 1 。这类化学发光体系优点是量子产率高，金属离子和氧分 子对其干扰少，具有较高的灵敏度。其化学发光的基本原理大致为：在荧光试剂 的存在下，过氧化氢诱导过氧草酰类释放出能量，释放的能量被发光染料分子吸 收将其转化为光能释放。这种发光体系除了能用于制造各种冷光源外，还广泛应 用于各类化学发光分析。图1 - 2 为双一( 2 ，4 ，6 三氯苯) 草酸酯( t c p o ) 的反应机理【2 2 。 1 3 3 吖啶酯类化学发光试剂 自19 3 5 年人们发现光泽精( n ，n 二甲基一- - f l , r 啶硝酸盐) 具有化学发光性质【2 3 后，研究者又发现了很多吖啶酯类化合物也具有这一特性。在碱性条件下，吖啶 酯类化合物被h 2 0 2 氧化迅速产生化学发光。此类发光体系具有很高的发光量子效 率，如吖啶芳香酯的量子产率为0 0 5 。图1 3 是吖啶酯的化学发光历程【2 4 】，研究表 明，反应历程受离去基因的性质、过氧化物浓度和溶液p h 的影唰2 5 】。当离去基团 共轭酸的p k a d 、予h 2 0 2 ( p k a = 1 2 ) 的p k a 时体系有较高的发光效率。在一些还原 性物质存在的情况下光泽精可产生化学发光，因此该化学发光试剂主要被用于无 机还原剂和有机还原剂的测定，如s n ，、f e 2 + 、u ”等金属离子【2 6 1 。 o h h 2 0 2 嘿一咿 。 图i - 3 吖啶酯的化学发光机理 f i g 1 - 3t h ec h e m i l u m i n e s c e n c em e c h a n i s mo fa c r i d i n ee s t e r 1 3 4 钌( i i ) 联吡啶或钌( i i ) 一邻菲哕啉配合物 钉( i i ) 联吡啶配合物( r u ( b p y ) 3 2 + ) 是一种常用的电致化学发光试剂，同时也 是一种较好的化学发光试剂。近几年，有关r u ( b p y ) 3 2 + 化学发光和电化学发光的 应用报道也比较岁2 7 。2 9 1 。 由于具有较好稳定性和灵敏的化学发光性质，钌( i i ) 邻菲哕啉( r u ( p h e n ) 3 2 + ) 也可作为化学发光试剂。何治柯等【3 0 ，3 1 】首次建立了c e ( i v ) 钌( i i ) 邻菲哕啉化学发 光体系，并此体系应用于药物分子的检测。 1 3 5 其它常用化学发光试剂 4 青岛科技人学研究生学位论义 除了上述这些化学发光试剂，洛粉碱、l ，2 二氧杂坏丁烷类、硅氧烯及其衍 生物、没食子酸、焦性没食子酸等物质都可作为良好的化学发光试剂。 1 4 化学发光分析法的应用 1 4 1 化学发光分析在农药残留检测中的应用 农药作为一种重要的农业生产资料，在消灭农作物病、虫、草害，保护农作 物生长方面具有重要的作用。但是农药的大量使用也给人们身体健康和生态环境 带来很大影响。目前，常见的农药残留检测方法有气相色谱法【3 2 1 、液相色谱法【3 3 】 等，这些方法所需要的仪器昂贵、样品前处理复杂、耗时长。化学发光分析法由 于操作简便、成本低、分析快速等优点，已成为高灵敏检测农药的方法之一。 宋正华等【3 4 】结合试剂固定化技术，建立了流动注射化学发光测定毒死蜱的绿 色分析方法，毒死蜱测定的线性范围为o 4 8 4 8 4 0m g l ，检出限为0 1 8m g l 。范 顺利等【3 5 】建- 0 y 痕量氧乐果的流动注射化学发光分析方法，检测限为o 0 2m g l 。 此外，方卢秋等【3 6 】以二氯荧光素作为能量转移剂，n 溴代丁二酰亚胺氧化盐酸吗 啉胍产生化学发光，建立了测定盐酸吗啉胍的流动注射化学发光分析法。饶志明 等【37 】建立了流动注射化学发光测定甲基对硫磷的新方法。 1 4 2 化学发光分析在药物分析中的应用 抗生素也叫抗菌素，是一类消除病源微生物的特效药物。用于抗生素药物质 量控制的传统分析方法有分光光度法、微生物法、电化学法等。分光光度法灵敏 度较低；微生物法操作繁琐，误差大；而电化学法分析过程过于复杂。因此，化 学发光分析法检测抗生素引起了广泛关注。例如：阿莫西林【3 8 1 、青霉素【3 9 】等许多 抗生素药物可被高锰酸钾或c e ( i v ) 等强氧化剂直接氧化产生发光而被测定。 维生素是人体的六大营养要素之一，是维持机体正常代谢和机能的必需物 质，对各种维生素含量的测定方法的研究方兴未艾。例如，化学发光法对维生素 c 4 0 】测定的研究较多，检出限达1 0 撂m ；维生素b 【4 l 】的测定多采用鲁米诺化学发光 体系，通过问接法、抑制法、增强法进行测定。 1 4 3 化学发光分析在生物活性物质分析中的应用 化学发光分析在核酸、氨基酸、蛋白质、激素、尘物碱等生物活性物质的分 析研究中得到了广泛地应用。 y a k o v l e v a 等【4 2 】采用多种不同的方法将抗体固定在硅芯片上，与自由的和h r p 标记莠去津发生竞争性免疫反应，然后注入l u m i n 0 1 h 2 0 2 对碘苯酚混合液进行抗 原的c l 法检测。吴晓明等【4 3 】将地高辛标记在d n a & ，用l u m i n 0 1 h 2 0 2 一对碘苯酚 化学发光体系进行定量检测建立了一种检测细胞色素p 4 5 0 1 a 1 基因多态性新方 法。z u a n k a i 等【删等利用化学发光检测的方法，对细胞进行计数检测。s e o n g 等t 4 5 】 暴十磁性微球的化学发光免疫标记技术的研究及) lj 避用 利用化学发光方法对荧光素酶分子进行单分子检测，对基因表达和酶动力学的研 究起到了积极的推动作用。d o n g t 4 6 】等研究化学发光酶联免疫分析法检测食品中的 西唯因，检测限达0 2p g k g h u 47 】等无需化学发光试剂，流动注释化学发光检测 血清中的麦角新碱盐。z s u z s 籼a 【4 8 】等研究化学发光方法检测眼泪中的凝结因子及 其复合物，为病理学研究提供检测方法。 近年来，借助化学发光分析法检测细胞内活性物质的研究取得了一系列进 展。e n s a f i 掣4 9 】采用高碘酸钠氧化鲁米诺，流动注射化学发光法检测血红细胞中 的谷胱甘肽，检测限达8 x 1 0 一m 。z h a n g 笔j s 5 0 】合成双核铜化合物作为化学发光探针， 检测细胞中谷胱甘肽等巯基化合物。 1 4 4 化学发光分析在其它物质分析中的应用 对于其它可以猝灭或者增强化学发光强度的物质，也可以采用化学发光分析 法检测。例如，f r a n c i s c o 等【5 l 】采用l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 增强化学发光体系，建立黄 草灵除草剂的检测体系，检测限可达0 1 2n g m l 。“u 等【5 2 】利用电致化学发光方法 同时检测人尿液中甲基麻黄碱和假麻黄碱，检测限分别达1 8 x l o 。8m 和9 2 x 1 0 9 m 。 1 5 化学发光分析法的发展趋势 化学发光分析为材料科学、生命科学、环境科学的研究提供了新的、高灵敏 度的有效分析手段，推动了这方面科学理论和技术的发展；同时，其他相关学科 的研究成果也为化学发光分析法提供了新的技术和手段，出现了许多新的化学发 光法，如纳米发光、发光成像、发光活体分析，大大促进了化学发光的发展及应 用。 2 免疫分析的简介 2 1 免疫分析 免疫是机体免疫系统对抗原物质的一种生物学应答过程，其生理功能是识别 和排除抗原等异性物质，以维持机体的生理平衡与稳