（有机化学专业论文）绿茶化学成分及其抗氧化性的研究.pdf

辽宁师范大学硕七学位论文 摘要 化学成分及其抗氧化性进行了研究。利用紫外分光光度法测定 糖的含量；高效液相色谱法测定其咖啡因和茶多酚的含量；利 ( g c m s ) 分析绿茶中的挥发性成分：流动注射化学发光法测 1 2 种绿茶进行了黄酮浸膏的提取，以槲皮素为标准品，三氯 黄酮类化合物的含量，最大吸收波长为4 2 0 0n l l l ，此方法的变 异系数小于0 1 1 ；方法回收率为9 4 4 4 1 0 5 6 ；绿茶样品黄酮类化合物含量为 0 9 4 2 8 6 5 9 8m g g 。以葡萄糖为标准品，采用浓硫酸、苯酚显色法测定1 2 种绿茶样品 的多糖含量，最大吸收波长为4 8 9 0n m ；本方法的变异系数小于0 2 0 ；方法回收率为 1 0 0 4 1 0 3 0 ；绿茶样品多糖含量为5 7 1 9 3 5 7 8m g g 。 同时提取1 2 种绿茶样品中的咖啡因和茶多酚，分别用氯仿和乙酸乙酯进行萃取， 经h p l c 分别测定其含量。绿茶样品的咖啡因含量为4 6 3 7 1 2 9 9m g g ，其中福建绿螺 含量最高。茶多酚含量为4 8 9 0 4 1 1 0 8 6m g g ，其中浙江龙井含量最高。 利用气相色谱质谱联用技术，通过水蒸气蒸馏提取法对两种工艺相同的绿茶样品 的挥发性成分进行分离和结构鉴定。运用气相色谱面积归一化法确定各个成分的相对百 分含量。结果表明人工培育的鞍山金壶中二苯胺含量最高。 以邻苯三酚一碳酸盐缓冲溶液一鲁米诺发光体系的发光强度为空白发光峰值，流动 注射化学发光法测定1 2 种绿茶样品的抗氧化性，其i c 5 0 值为0 1 8 2 0 8 4 0m g m l 。 关键词：绿茶；化学成分；高效液相色谱法；抗氧化性；流动注射化学发光法 d 绿茶化学成分与抗氧化性的研究 一 r e s e a r c ho fg r e e nt e a sc h e m i c a lc o m p o s i t i o na n da n t i o x i d a n ta c t i v i t y a b s t r a c t t h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fas e r i e so fg r e e nt e aa n di t sa n t i o x i d a n ta c t i v i t ya r es t u d i e d i nt h i sp a p e r t h ec o n t e n t so ft e af l a v o n o i d s ，a n dt e ap o l y s a c c h a r i d ea r ed e t e r m i n e db yu v s p e c t r o p h o t o m e t r y t h ec o n t e n t so fc a f f e i n ea n dt e ap o l y p h e n o l sa r ed e t e r m i n e db yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y v o l a t i l eo fc o m p o n e n t so fg r e e n t e aa r ea n a l y z e db yg a s c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( o c - m s ) a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fas e r i e so fg r e e nt e a a r ed e t e r m i n e db yf l o w i n gi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e t h ec o n t e n t so ft e af l a v o n o i d so f1 2s p e c i e so fg r e e nt e aa r ee x t r a c t e db yu l t r a s o n i c m e t h o d t a k et h eq u e r c e t i na sas t a n d a r da n dt h ea l u m i n u mt r i c h l o r i d ea sc h r o m o g e n i ca g e n t ， t h em a x i m u ma b s o r p t i o nw a v e l e n g t ho f4 2 0 0a m ，t h em e t h o dc o e f f i c i e n to fv a r i a t i o ni sl e s s t h a n0 11 ：t h er e c o v e r yo fm e t h o di s9 4 4 4 1 0 5 6 ；t h ec o n t e n to ff l a v o n o i d si s0 9 4 2 8 - 6 5 9 8m g g t a k et h eg l u c o s ea sas t a n d a r d ，t h ec o n t e n t so ft e ap o l y s a c c h a r i d eo f1 2 s a m p l e so fg r e e nt e aa r ed e t e r m i n e db yc o n c e n t r a t e ds u l f u r i ca c i d ，p h e n o lc o l o rm e t h o d ，t h e m a x i m u ma b s o r p t i o nw a v e l e n g t ho f4 8 9 0n m ；t h em e t h o dc o e f f i c i e n to fv a r i a t i o ni sl e s st h a n 0 2 0 ；t h er e c o v e r yo fm e t h o di s1 0 0 4 一1 0 3 o ；t h ec o n t e n to fp o l y s a c c h a r i d ei s5 7 1 9 3 5 7 8m g g t h ec o n t e n t so fc a f f e i n ea n dt e ap o l y p h e n o l so f1 2k i n d so fg r e e nt e aa r ee x t r a c t e dw i t h c h l o r o f o t l na n de t h y la c e t a t e ，a r ed e t e r m i n e db yh p l c t h ec o n t e n to fc a f f e ：i n ei s4 6 3 7 1 2 9 9 m g g i nw h i c ht h eh i g h e s tc o n t e n t o ff u j i a ng r e e nl o t h ec o n t e n to ft e a p o l y p h e n o l si s4 8 9 0 4 - 11 0 8 6m g g ，i nw h i c ht h eh i g h e s tc o n t e n to fz h e j i a n gl o n g j i n g v o l a t i l ec o m p o u n d so ft w ok i n d so fg r e e nt e as a m p l e sa r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e db y g c - m s ，w i t hw e td i s t i l l a t i o ne x t r a c t i o nm e t h o d s t h ec o n t e n to fr e l a t i v ep e r c e n t a g eo fe a c h i n g r e d i e n ti sd e t e r m i n e db yt h eg a sc h r o m a t o g r a p h ya r e an o r m a l i z i n g t h er e s u l t ss h o wt h a t t h ed i p h e n y l a m i n ei nt h ea r t i f i c i a lc u l t i v a t i o no fa n s h a nj i nh ui sh i g h e s t a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f1 2k i n d so fg r e e nt e aa r ed e t e r m i n e db yf l o w i n gi n j e c t i o n c h e m i l u m i n e s c e n c e i c 5 0v a l u ei s0 1 8 2 0 8 4 0m g m l k e yw o r d s ：g r e e nt e a ；c h e m i c a lc o m p o s i t i o n ；h p l c ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y ；f l o wi n j e c t i o n c h e m i l u m i n e s c e n c e j j ：| 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i 1 ；者论1 1 1 茶的起源1 1 2 茶文化1 1 3 饮茶。2 1 4 茶叶的分类3 1 5 绿茶3 1 5 1 绿茶简介3 1 5 2 绿茶的分类4 1 5 3 绿茶的主要化学成分4 2 绿茶中黄酮类化合物含量的测定7 2 1 引言7 2 2 实验部分7 2 2 1 仪器和试剂7 2 2 2 样品7 2 2 3 样品的前处理7 2 2 4 超声波提取黄酮类化合物单因素试验8 2 2 5 样品浸膏的制备一1 1 2 2 6 样品溶液的制备1 2 2 2 7 槲皮素标准溶液的制备1 2 2 2 8 测定波长的确定1 2 2 2 9 标准曲线的绘制1 3 2 2 1 0 稳定性实验1 3 2 2 1 1 精密度实验1 4 2 2 1 2 回收率实验1 5 2 3 结果1 5 2 4 结论1 6 3 绿茶中多糖含量的测定1 8 3 1 引言1 8 3 2 实验部分1 8 摹习 绿茶化学成分与抗氧化性的研究 3 2 1 仪器与试剂1 8 3 2 2 样品1 8 3 2 3 样品溶液的制备1 9 3 2 4 葡萄糖对照品溶液的制备1 9 3 2 5 测定波长的确定1 9 3 2 6 标准曲线的绘制2 2 3 2 7 稳定性实验2 2 3 2 8 精密度实验2 3 3 2 9 回收率实验2 4 3 3 结果2 4 3 4 结论。2 5 4 h p l c 测定绿茶中咖啡因和茶多酚的含量2 6 4 1 绿茶中咖啡因含量的测定2 6 4 1 1 引言2 6 4 1 2 实验部分2 6 4 1 3 结果3 1 4 1 4 结论3 5 4 2 绿茶中茶多酚含量的测定3 5 4 2 1 引言3 5 4 2 2 实验部分3 6 4 2 3结果4 0 4 2 4 结论4 4 5 绿茶挥发性成分的测定4 5 5 1 弓i 言4 5 5 2 实验部分4 5 5 2 1 仪器与试剂4 5 5 2 2 样品4 5 5 2 3 水蒸气蒸馏提取法( w d e ) 4 5 5 2 4 挥发油含量的收率4 6 5 2 5 挥发油的g c m s 分析条件4 6 5 3g c m s 分析结果一4 6 5 3 1 色谱图4 6 rl 辽宁师范大学硕士学位论文 5 3 2 挥发性成分的比较4 7 5 4 结毒；：! ；1 6 绿茶抗氧化性的测定5 2 6 1 引言5 2 6 2 实验部分5 2 6 2 1 仪器与试剂5 2 6 2 2 样品5 2 6 2 3 样品的提取5 2 6 2 4 溶液的配置5 2 6 2 5 鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 碳酸盐缓冲溶液邻苯三酚化学发光体系及其测定 5 3 6 2 6 抗氧化性测定及抑制率计算5 4 6 3l 右裂5 4 6 4 结论一5 9 结论6 0 参考文献一6 2 攻读硕士学位期间发表学术论文情况一6 5 至定 谢6 6 一v 一 毒1 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 1绪论 我国是茶树原产国，也是世界上最早发现和利用茶叶的国家【l 】。茶属双子叶植物， 约3 0 属，5 0 0 种，分布于热带和亚热带地区，我国有1 4 属，3 9 7 种，主产长江以南各 地。绿茶是我国六大茶类之一，属于不发酵茶。绿茶做为中国的主要茶类，全国年产 1 0 万吨茶叶，产量位居六大初制茶之首。中国生产绿茶的范围极为广泛，浙江、 河南、安徽、江西、江苏、四川、湖南、湖北、广西、福建、贵州为我国的绿茶 主产省份。绿茶较多的保留了鲜叶内的天然物质。其中茶多酚、咖啡碱保留鲜叶 的8 5 以上，叶绿素保留5 0 左右，维生素损失也较少，从而形成了绿茶“清汤 绿叶，滋味收敛性强 的特点。最新科学研究结果表明，绿茶中保留的天然物质 成分，对防衰老、防癌、抗癌、杀菌、消炎等均有特殊效果，为其他茶类所不及。 现在，茶叶产区已经不在局限于北纬1 8 。海南岛的三亚至3 8 0 太行山脉的灵寿县五 岳寨地区了。人们经过不懈的努力在北纬4 1 。成功培育了茶树。在云南一带，人们 还把茶树以外的其他植物的叶片，甚至叶片以外的部分当做茶来饮用1 2 j 。这些“茶 外之茶 也在广泛的被利用，而我们也会很自然的称其为茶。 1 1 茶的起源 茶叶是当今世界消费量最大的饮料之一，它和咖啡、可可并称世界三大无酒 精饮料【3 1 。对于其起源问题，历来争论较多，随着考证技术的发展和新发现，才逐 渐达成共识，即中国是茶树的原产地，并确认中国西南地区，包括云南、贵州、 四川是茶树原产地的中心。由于地质变迁及人为栽培，茶树开始由此普及全国， 并逐渐传播至世界各地。 神农本草经记载：“神农尝百草，日遇七十二毒，得荼而解之”。据考 证：这里的荼是指古代的茶，“茶”字最早出现在百声大师碑和怀晖碑 中，时间大约在唐朝中期，公元8 0 6 年到公元8 2 0 年前后，在此之前，“茶 是 用多义字“荼”表示的。这虽然是传说，带有明显的夸张成份，但也可从中推论， 茶的发现和利用已有五六千年的历史了。 1 2 茶文化 据人文社会学家对文化一词的释义认为：文化即“人化”或“人类化”。那 么，茶文化可理解为：茶被“人化 了之后，人以茶为载体和活动内容而体现出 的一种特有的文化现象【4 1 。这包含和体现一定时期的物质文明和精神文明。 v r l i 绿茶化学成分及其抗氧化性的研究 茶文化是中华传统优秀文化的组成部分，其内容十分丰富，涉及科技教育、 文化艺术、医学保健、历史考古、经济贸易、餐饮旅游和新闻出版等学科与行业， 包含茶叶专著、茶叶期刊、茶与诗词、茶与小说、茶与祭祀、茶与禅教、茶与谚 语、饮茶习俗、茶艺表演、陶瓷茶具、茶馆茶楼、冲泡技艺、茶食茶疗、等廿一 个方面。 茶叶作为一种饮料，从唐朝开始，流传到我国西北各个少数民族地区，成为 当地人民生活的必需品，“一日无茶则滞，三日无茶则病 。与此同时，茶文化 也随之兴起。中唐时，陆羽茶经的问世使茶文化发展到一个空前的高度，标 志着唐代茶文化的形成。原始茶文化的主要精神是以神农为代表的先民们的实践 和艰苦开创精神。 中国人饮茶，注重一个“品 字。“品茶 不但是鉴别茶的优劣，也带有神思遐想 和领略饮茶情趣之意。品茶的环境一般由建筑物、园林、摆设、茶具等因素组成。饮茶 要求安静、清新、舒适、干净。中国园林世界闻名，山水风景更是不可胜数。利用园林 或自然山水间，搭设茶室，让人们小憩，意趣盎然。 1 3 饮茶 中医认为，茶叶上可清头目，中可消食滞，下可利小便，是天然的保健饮品。然而， 茶叶的产地和品种不同，其药理作用也不一样。一年有春夏秋冬四季之分，茶叶也有寒 热温凉性味的差别，因此，四季饮茶也要有所区别。 春天，属温，阳气上升，阴气下降，万物复苏。人们经过漫长的冬季，“内热积贮”， 因此应注意驱寒御邪，扶阳固气。此时宜饮花茶。因为花茶香气浓烈，香而不浮，爽而 不浊，具有理气、开郁、祛秽、和中的作用，促进机体阳气的生发，并能振奋精神，消 除春困。 夏天，属热，赤日炎炎，气候闷热，出汗甚多，造成水、电解质平衡紊乱，因此必 须补充大量水分。此时宜喝绿茶。因为绿茶性味苦寒，清鲜爽口，具有清暑解热、生津 止渴和消食利导等作用。 秋天，属凉，有萧杀之象，空气渐渐干燥，人们感觉皮肤、鼻腔、咽喉干燥不适， 这叫“秋燥”。此时宜喝青茶，色泽绿润，内质馥郁，不寒不热。秋凉饮之，可以润肤、 除燥、生津、润肺、清热、凉血。 冬天，属寒，天寒地冻，寒气袭人，人的机体处于收引状态，新陈代谢迟缓，容易 罹患“寒病”。此时宜饮红茶。这种茶，叶红、汤红，醇厚干温，滋养阳气，增热添暖， 可以加奶、加糖，芳香不收，还可以去油腻、舒肠胃。 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 1 4 茶叶的分类 以颜色( 或制作工艺) 分类 ，绿茶不发酵的茶( 发酵度为零) 龙井茶，碧螺春； l 红茶全发酵的茶( 发酵度为8 0 9 0 ) 祁门红茶，正山小种； i 白茶徽发酵的茶( 发酵度为1 0 2 0 ) 白牡丹，安吉白荣； 、l 青茶半发酵的茶( 发酵度为3 0 6 0 ) 铁观音，冻顶乌龙茶； l 黑茶后发酵的茶( 发酵度为1 0 0 ) 六堡茶，普洱茶； 【黄茶轻度发酵的茶( 发酵度为2 0 3 0 0 ) 君山银针。 以季节分类 春茶 夏茶 秋茶 冬茶 1 5 绿茶 是指当年3 月下旬到5 月中旬之前采制的茶叶； 是指5 月初至7 月初采制的茶叶； 就是8 月中旬以后采制的茶叶； 大约在1 0 月下旬开始采制。 1 5 1 绿茶简介 绿茶，又称不发酵茶。以适宜茶树新梢为原料，经杀青、揉捻、干燥等典型工艺过 程制成的茶叶。其干茶色泽和冲泡后的茶汤、叶底以绿色为主调，故名。 绿茶为我国产量最大的茶类，产区分布于各产茶省、市、自治区。其中以浙 江、安徽、江西三省产量最高，质量最优，是我国绿茶生产的主要基地。在国际 市场上，我国绿茶占国际贸易量的7 0 以上，销区遍及北非、西非各国及法、美、 阿富汗等5 0 多个国家和地区。在国际市场上绿茶销量占内销总量的1 3 以上。同 时，绿茶又是生产花茶的主要原料。 据日本读卖新闻报道，日本东北大学医学系的栗山进一讲师通过临床调 查发现，每天喝2 杯以上绿茶的人比每周不足3 杯绿茶的人，发生识别功能障碍 等老年痴呆症的倾向要小得多。 -r 1 绿茶化学成分及其抗氧化性的研究 1 5 2 绿茶的分类 中国绿茶中，名品最多，不但香高味长，品质优异，且造型独特，具有较高的艺术 欣赏价值。绿茶按其干燥和杀青方法的不同，一般分为炒青、烘青、晒青和蒸青绿茶。 炒青绿茶：由于在干燥过程中受到机械或手工操力的作用不同，成茶形成了长条形、 圆珠形、扇平形、针形、螺形等不同的形状，故又分为长炒青、圆炒青、扁炒青等等。 烘青绿茶：是用烘笼进行烘干的。烘青毛茶经再加工精制后大部分作熏制花茶的茶 坯，香气一般不及炒青高，少数烘青名茶品质特优。以其外形亦可分为条形茶、尖形茶、 片形茶、针形茶等。 晒青绿茶：是用日光进行晒干的。主要分布在湖南、湖北、广东、广西、四川，云 南、贵州等省有少量生产。 蒸青绿茶：以蒸汽杀青是我国古代的杀青方法。唐朝时传至日本，相沿至今；而我 国则自明代起即改为锅炒杀青。 1 5 3 绿茶的主要化学成分 随着科学的发展，到了1 9 世纪初，茶业的成分才逐渐明确起来。经过现代科学的 分离和鉴定，茶叶中含有机化学成分达四百五十多种，无机矿物元素达四十多种。茶叶 中的有机化学成分和无机矿物元素含有许多营养成分和药效成分。有机化学成分主要 有：茶多酚类、植物碱、蛋白质、氨基酸、维生素、有机酸、脂多糖、糖类、酶类、色 素等。 茶是纯天然的、符合人体生理健康的卫生、安全、保健、无公害的饮料。茶不仅 是中国的“国饮”，而且是世界性的饮料。有人预测，2 1 世纪将是茶饮的世纪l 引。明 顾元庆茶谱上记述：“人饮真茶能止渴、消食、除痰、少睡、利尿道、明目、益思、 除烦、去腻、人固不可一日无茶。目前茶叶被广泛应用到医药、保健、化妆品等行业。 经现代科学技术分析及临床实践表明具体的茶的二十三功效：少睡、安神、明目、清 头目、止渴生津、清热、消暑、解毒、消食、醒酒、减肥、下气、利水、通便、治痢、 去痰、祛风解表、坚齿、治心痛、疗疮治瘘、疗饥、益气力、延年益寿。这些功效均是 由茶叶中的化合物作用而得，无论这些化合物是单一作用还是协同作用，对人体健康均 起到了重要作用。 绿茶作为不发酵茶，保留了茶叶最原有的化学成分；绿茶主要含有茶多酚，咖啡碱， 糖类，黄酮类化合物等。 ( 1 ) 黄酮类化合物 ，ii孽1 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 黄酮类化合物是绿色植物特有的产物，而且多存在于一些有色植物中【6 】，天然黄酮 类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以 组成各种各样黄酮苷类。 大多数黄酮类化合物具有清除自由基的作用，一些研究结果显示大多数黄酮类化合 物清除自由基的能力大于维生素c 和维生素e 川。黄酮类化合物是一种天然的抗氧化 剂1 8 j ，除了具有抗氧化能力，还能够调节酶活性、抗病毒、调节免疫细胞功能、调节内 分泌与代谢等功能。人类通过膳食摄取的黄酮类化合物在人体内发挥着潜在的作用。 ( 2 ) 茶多糖 多糖类化合物广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是由醛基和酮基 通过苷键连接的高分子聚合物，也是构成生命的四大基本物质之一。茶多糖是一种酸性 糖蛋白，并结合有大量的矿质元素，称为茶叶多糖复合物，简称为茶叶多糖或茶多糖( t e a p o l y s a c c h a r i d e ) 。 茶多糖具有降血糖1 9 1 、降血脂【1 0 l 、抗凝血及抗血栓【1 、增强免疫功能【1 2 】1 2 、降血压、 耐缺氧及增加冠状动脉血流量、防辐射1 1 3 】等作用。现已有制备含有茶多糖的降血糖和抗 糖尿病用的药物和健康食品的专利和生产工艺1 1 4 1 5 】。 ( 3 ) 咖啡因 咖啡因( c a f f e i n e ) 是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱。少量的摄入 咖啡因可兴奋大脑皮质，振奋精神，提高其注意力；增强警觉性和减少疲乏感， 提高警惕性和维持持久的工作能力 1 6 , 1 7 】；增强识别能力，缩短快速与选择反应时 间，并能提高瞬时口头记忆力【1 8 1 ；影响睡眠f 1 9 1 。而摄入咖啡因量较多可引起失眠、 焦虑、心烦气躁、易怒等。据资料报道，从茶叶中提取咖啡因的主要方法有水提 取法、醇提取法、升华法【2 0 】及其它有机溶媒提取法【2 1 , 2 2 】；重量法、沉淀法、六十 至七十年代报道有离子交换、柱层析、深剂浸提等方法【2 3 1 。 ( 4 ) 茶多酚 茶多酚是一种稠环芳香烃，可分为黄烷醇类、羟基【4 卜黄烷醇类、花色苷类、黄酮 类、黄酮醇类和酚酸类等。在茶叶中的含量一般在1 5 2 0 。绿茶中的茶多酚含量为 2 0 3 0 ，主要包括儿茶素，黄酮醇及其配糖物，无色花色素，酚酸及缩酚酸1 2 4 j 。 茶多酚能够清除活性氧自由基，阻断脂质过氧化过程，提高人体内酶的活性，从而 起到抗突变、抗癌症i 压2 8 】的功效；还可防治高脂血症引起的疾病血压。茶多酚通过调节 免疫球胆白的量活性，间接实现提高人体综合免疫能力、抗风湿因子、抗菌抗病毒的功 效i z w ；提高人体的综合免疫能力的功效。此外茶多酚还具有抗脂质过氧化，预防衰老、 防辐射【2 6 】损伤、清除口臭的作用、助消化等作用。 绿茶化学成分及其抗氧化性的研究 在食品工业上可作抗氧化剂，对淀粉酶、蔗糖酶均有良好的抑制能力；是理想的水 果保鲜剂；由于茶多酚具有强还原性，可以做保色剂和除臭剂消除异味闭j 。茶多酚的抗 氧化性能比b h a ( 丁基羟基茴香醚) 、b h t ( 二丁基羟基甲基茴香醚) 高2 3 倍，且安全 无毒【3 。 茶多酚在日用化工产品上的应用也还有极为广泛的发展前景。在化妆品中添加少量 的茶多酚作保质剂【3 2 l ，茶多酚对波长为2 0 0 3 3 0n m 埃的紫外线有较强吸收，因而茶多 酚可直接阻止紫外线损伤皮肤【矧，可减少紫外线引进的皮肤黑色素形成。茶多酚在医疗 保健上具有防治癌症等多种疾病和抗衰老增强免疫等功能；在农业上可抑制病原细菌， 作为植物的生长促进剂【卅。茶多酚还是一种极有潜力的新型饲料添加剂1 3 5 1 。 翻l 。毒1 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 2 绿茶中黄酮类化合物含量的测定 2 1 引言 黄酮类化合物是一类重要的广泛存在于自然界的天然有机化合物【矧，是以黄酮( 2 苯基色原酮) 为母核而衍生的一类黄色色素，泛指由两个芳香环( a 和b ) 通过中央三碳 链相互连接而成的一系列化合物【3 刀。 本章采用超声提取法提取绿茶样品中的黄酮类化合物，紫外分光光度法测定绿茶样 品中黄酮类化合物的含量。该提取法具有实验设备简单、操作方便，与常规提取法相比， 提取时间短、产率高、无需加热1 3 8 】的特点。紫外分光光度法灵敏度较高；精密度和准确 度较高；应用范围广；仪器操作简便，快速，价格较低，测定方法易于推广。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器和试剂 h x 一2 0 0 a 型华西高速中药粉碎机( 浙江省永康溪岸五金药具厂) a l 2 0 4 电子天平( 梅特勒托利多公司( 上海) 有限公司) u v 一0 3 6 紫外分光光度计( 美国v a r i a n 公司) k q 2 5 0 b 型超声波清洗器( 昆山市超声波仪器有限公司) 2 0 2 2 a 型数显电热恒温干燥箱( 上海阳光实验仪器有限公司) 甲醇( 分析纯，天津化学试剂有限公司) 无水乙醇( 分析纯，天津市光复精细化工研究所) 9 5 乙醇( 分析纯，沈阳化学试剂厂) 丙酮( 分析纯，天津市光复精细化工研究所) 槲皮素( 标准品，中国药品生物制品检定所) 二次蒸馏水，自制 2 2 2 样品 1 ：福建绿螺2 ：浙江龙井3 ：江西雨雾4 ：四川竹叶青 5 ：阳羡雪芽6 ：南京雨花7 ：安徽松针8 ：六安瓜片 9 ：广东绿茶1 0 ：极峰绿茶1 1 ：西乡特炒1 2 ：鞍山金壶 2 2 3 样品的前处理 将绿茶样品分别粉碎后，过孔径为o 4 5m m 的筛子，得绿茶样品粉末备用。 绿茶化学成分及其抗氧化性的研究 2 2 4 超声波提取黄酮类化合物单因素试验 ( 1 ) 溶剂的选择 精确称取2 2 - 3 中粉碎的绿茶样品1 0 0g ，分别用水、甲醇、无水乙醇和丙酮溶液在 室温条件下，料液比( g ：m l ，下同) 1 ：1 5 ，超声提取2 0r a i n ，抽滤，滤渣重复提取1 次， 合并滤液，用相应溶剂定容至5 0m l ，以三氯化铝为显色剂，在相同条件下扫描其最佳 吸收波长及其吸光度值。见表2 1 。 表2 1 不同溶剂 t a b l e2 1d i f f e r e n ts o l v e n t s 由表2 1 可知，经不同溶剂提取的样品提取液在相同条件下的最佳吸收波长不同， 由于甲醇具有毒性，不易大量使用；而水作为溶剂时的最佳吸收波长比无显色剂条件下 测定波长红移较小，因此选择无水乙醇作为溶剂。 精确称取2 2 3 中粉碎的绿茶样品1 0 0g ，分别用5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、 9 5 和无水乙醇在室温条件下，料液比i ：1 5 ，超声提取2 0r a i n ，抽滤，滤渣重复提取 1 次，合并滤液，用相应溶剂定容至5 0m l ，以三氯化铝为显色剂，在相同条件下扫描 其最佳吸收波长及其吸光度值。见表2 2 。 表2 2 不同浓度的乙醇水溶液 t a b l e 2 2 a q u e o u ss o l u b i l i t yo fe t h a n o li nd i f f e r e n t ，l ；j1 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 由表2 2 可知，不同浓度的乙醇水溶液提取的样品提取液在相同条件下的最佳吸收 波长不同，根据其最佳吸收波长与吸光度的大小应选择9 5 的乙醇水溶液。 ( 2 ) 料液比对总黄酮提取率的影响 精确称取2 2 3 中粉碎的绿茶样品1 o og ，用9 5 的乙醇，在室温条件下，超声提 取2 0m i n ，料液比分别为1 ：5 、1 ：1 0 、1 ：1 5 、1 ：2 0 、1 ：2 5 ，抽滤，滤渣重复提取1 次，合并滤液，用9 5 乙醇定容至5 0m l ，测定其吸光值，得吸光度与料液比之间的关 系如图2 1 所示。 料液比 图2 1 吸光度与料液比的关系 f i g 2 1 t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea b s o r b a n c ea n dt h es o l i d - l i q u i dr a t i o 由图2 1 可知，相同条件下，当料液比为1 ：1 5 时样品吸光度最大，则样品的提取 率最大。 ( 3 ) 提取时间对总黄酮提取率的影响 精确称取2 2 3 中粉碎的绿茶样品1 0 0g ，用9 5 的乙醇，在室温条件下，分别超 声提取1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0m i n ，料液比1 ：1 5 ，抽滤，滤渣重复提取1 次，合并滤液， 用水稀释定容至5 0m l ，测定其吸光值，得吸光度与超声时间之间的关系如图2 2 所示。 绿茶化学成分及其抗氧化性的研究 0 6 o 5 5 o 5 羚4 5 宦s o 4 o 3 5 o 3 1 01 52 0 2 53 03 5 超声时间i n 图2 2 吸光度与超声时间的关系 f i g 2 2 t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea b s o r b a n c ea n dt h eu l t r a s o n i ct i m e 由图2 2 可知，相同条件下，随着超声时间的增长样品吸光度增大，当超声时间超 过2 5m i n 后趋于平稳，因此选择超声2 5m i n 。 ( 4 ) 提取温度对总黄酮提取率的影响 精确称取2 2 3 中粉碎的绿茶样品1 0 0g ，用9 5 的乙醇，料液比1 ：1 5 ，分别在o 、 1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 ，超声提取2 0r a i n ，抽滤，滤渣重复提取1 次，合并滤液，用 9 5 乙醇定容至5 0m l ，以三氯化铝为显色剂，在相同条件下扫描其最佳吸收波长及其 吸光度值，如表2 3 所示。 表2 3 不同的提取温度 t a b l e 2 3d i f f e r e n te x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e s 由表2 3 可知，随着超声温度的提高，样品吸光度增大，但最佳吸收波长不同，根 据其最佳吸收波长和吸光度大小选择超声温度为2 0 。c 。 l】 i_1j 辽宁师范大学硕士研究生学位论文 根据各因素结果可知，超声辅助提取绿茶样品黄酮类化合物的条件应为：9 5 的乙 醇，超声温度2 0 c ，超声时间2 5r a i n ，料液比1 ：1 5 ( g ：m l ) 。 2 2 5 样品浸膏的制备 分别称取2 2 3 中粉碎的绿茶样品1 0 0 0g 置于2 5 0m l 锥形瓶中，用9 5 的乙醇在 2 0 c 条件下，超声提取2 5m i n ，料液比1 ：1 5 。抽滤，滤渣重复提取1 次，合并滤液， 减压浓缩，得浸膏在6 0 c 烘箱中干燥至恒重，测其重量。样品浸膏的提取率如表2 4 所 示。 表2 4 绿茶样品浸膏提取率 t a b l e2 4t h es a m p l er a t eo fe x t r a c t i o no fg r e e nt e ae x t r a c t 根据表2 4 ，对其提取率作柱状图进行比较，以样品浸膏的提取率为纵坐标，样品 名称为横坐标，如图2 3 所示。 绿茶化学成分及其抗氧化性的研究 注1 ) 1 ：极峰绿茶 5 ：四川竹叶青 9 ：广东绿茶 。 l 23 4567891 01 11 2 图2 3 样品浸膏提取率柱状图 f i g 2 3s a m p l ee x t r a c te x t r a c t i o nr a t eh i s t o g r a m 2 ：西乡特炒 6 ：六安瓜片 1 0 ：安徽松针 3 ：浙江龙井 7 ：阳羡雪芽 1 1 ：江西雨雾 4 ：福建绿螺 8 ：南京雨花 1 2 ：鞍山金壶 2 2 6 样品溶液的制备 准确称取一定质量的2 2 5 所得的浸膏，用9 5 乙醇定容至5 0m l 容量瓶中，摇匀， 备用。 2 2 。7槲皮素标准溶液的制备 精确称取槲皮素标准品0 0 0 4 0g ，用9 5 乙醇定容至5 0m l 容量瓶中，摇匀，备用。 2 2 8 测定波长的确定 从2 2 6 中制得的绿茶样品储备液中，取1m l 溶液置1 0m l 容量瓶中，用1 的三 氯化铝溶液定容，摇匀，室温放置1 0m i n ，以相应试剂为空白，在2 0 0 8 0 0n n l 范围内 扫描，最大吸收波长在4 1 7 0 4 2 2 0n m 之间。 从2 2 7 制得的槲皮素标准储备液中，取1m l 溶液于1 0m l 容量瓶中，用1 的三 氯化铝溶液定容，摇匀，室温放置1 0m i n ，以相应试剂为空白，在2 0 0 8 0 0n m 范围内 扫描，最大吸收波长为4 2 0 0n m 。 由上可知，超声波法提取绿茶中的黄酮可用槲皮素做标准品，测定波长为4 2 0 0n m 。 ，i1j 46 81 01 2 浓度c ( 1 i g m l ) 图2 4 槲皮素标准曲线 h g 2 4m o n g o l i a no a ks k i ne l e m e n ts p e c i f i c a t i o nc u r v e 表2 5 浓度与吸光度的关系 t a b l e2 5t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc o n c e n t r a t i o na n da b s o r b a n c e m l 置1 0 m l 为空白，在 以槲皮素质量浓度( c ) 为横坐标、吸光度( a ) 为纵坐标，绘制标准曲线，如图 2 4 所示，求得吸光度a 与槲皮素质量浓度c 关系的线性回归方程为：a = 0 0 7 6 8 7 c 一 0 0 1 1 9 2 ，相关系数r = 0 9 9 9 7 ，说明槲皮素标准品在浓度2 4 0 0 1 0 4 0 p g m l 范围内，吸 光度a 与浓度c 呈良好线性关系，可按标准曲线法进行定量分析。 2 2 10 稳定性实验 用与绘制吸收曲线相同方法配制的样品进行稳定性实验，结果表明：样品放置o 1 2 0m i n ，测得其吸光度值基本不变。如图2 5 所示。 啊 上 t h ( m h l 图2 5黄酮类化合物稳定性光谱扫描图 f i g 2 5 f l a v o n o i ds t a b i l i t ys p e c t r o g r a p hs c a n n i n gp a