（无机化学专业论文）壳聚糖修饰电极在电化学传感器中的应用.pdf

青岛科技大学研究生学位论文 壳聚糖修饰电极在电化学传感器中的应用 摘要 壳聚糖是甲壳素经脱乙酰化反应得到的一种碱性高分子多糖，分子内既有亲 疏水基团，又有具有配位能力的氨基和羟基，其特殊的分子结构使壳聚糖对许多 离子，有机物，生物分子等具有离子交换，螯合，吸附等作用，已被广泛的应用 于食品工业、医药、农业和材料科学等领域。近年来，人们又利用壳聚糖的成膜 性、生物相容性、低毒性、生物可降解性等特点，将其作为一种新型的功能材料 广泛用于化学传感器和生物传感器的制备。本文分别研究了壳聚糖修饰电极对手 性分子对映体的识别以及葡萄糖氧化酶，辣根过氧化物酶在修饰电极上的直接电 化学。论文主要包括以下内容： 基于壳聚糖修饰电极的立体选择性对手性分子的识别。利用壳聚糖膜与对映 异构体之间不同的立体效应，通过测定循环伏安电流响应，实现了对三种具有环 状结构的手性分子( 抗坏血酸、肾上腺素、色氨酸) 的对映体识别。在最佳的p h 值和壳聚糖脱乙酰度条件下，三种手性分子在该修饰电极上的对映异构体选择性 系数r l ，d 分别为1 4 8 、1 5 6 、1 6 7 ，并利用计时库仑法以色氨酸为样品对壳聚糖 膜的立体选择性进行来验证，推导了测定手性物质对映异构体浓度的计算公式。 葡萄糖氧化酶，辣根过氧化物酶在壳聚糖膜中的直接电化学研究。以壳聚糖 为载体把葡萄糖氧化酶( g o d ) 、辣根过氧化物酶( 冲) 固定在玻碳电极上，在 不使用任何纳米材料和电子媒介的条件下实现g o d 、h r p 和电极之间的直接电子 传递( d e t ) 。考察了g o d 、h r p 在壳聚糖膜电极上的直接电化学行为。由于壳 聚糖独特的分子机构和特性，很好的保持了g o d 、h r p 的生物催化活性，在一定 条件下催化电流与葡萄糖、过氧化氢的浓度成正比，从而制备了无电子媒介体 的新型的葡萄糖传感器和过氧化氢传感器。 关键词：壳聚糖化学修饰电极手性识别直接电化学葡萄糖氧化酶辣根过氧 化物酶 壳聚糖修饰电极在电化学传感器中的应用 t 脏a p p l i c a t i o no fc h i t o s a nm o d i f i e d e l e c t r o d ei nt h 匣f i e l d0 f e l e c t r o c h e m i c a l s e n s o r a b s t r a c t c h i t o s a ni sd e r i v e df r o mc h i t h i n ( an a t u r a l l yo c c u r r i n gp o l y s a c c h a r i d ef o u n di n i n s e c t s ，m d 置r o p o d sa n dc r u s t a c e a n s ) b yd e a c e t y l a t i o n , a n di t ss p e c i a ls t r u c t u r em a k ei t d e m o n s t r a t eu n i q u ee x c h a n g e ，c h e l a t i o na n da d s o r p t i o na b i l i t i e st o w a r d sm a n ym e t a l c a t i o n s ，o r g a n i cs u b s t a n c e sa n d s oo n , w h i c ha l l o wi tt ob ew i d e l yu s e di nc h e m i s t r y n o wc h i t o s a nh a sn o to n l yb e e nu s e da sam a t r i xf o re e l la n de n z y m ei m m o b i l i z a t i o n , b u ta l s od e v e l o p e di n t om e m b r a n em a t e r i a lo fe l e c t r o d ef o rp r e p a r a t i o no fc h e m i c a l 鸵删的r sa n db i o s e n s o r s b e c a u s eo fi t se x c e l l e n tm e m b r a n e f o r m i n ga b i l i t y ，h i 吐 p e r m e a b i l i t yt o w a r dw a t e r ，g o o da d h e s i o n , h i g l lm e c h a n i c a ls t r e n g t h , b i o c o m p a t i b i l i t y ， n o n t o x i c i t y , s a f ea n db i o d e g r a d a b l em a t e r i a l sp r e s e n t e di nn a t u r e i nt h i st h e s i s ，a g l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ec o a t e dw i t hc h i t o s a nm a t r i xh a sb e e nr e c o m m e n d e da san o v e l s t e r e o s e l e c t i v ee l e c t r o d e ( s s e ) b a s e do i lt h er e c o g n i z i n ga b i l i t yo fc h i t o s a nm a t r i xf o r c h i r a lm o l e c u l e ，a n db yc h i t o s a nm a t r i x - i m m o b i l i z e de n z y m ea c h i e v i n gd i r e c te l e c t r o n t r a n s f e r ( d e dr e a c t i o nb e t w e e ne n z y m ea n dm o d i f i e de l e c t r o d e s t e r e o s e l e c t i v ee l e c t r o d eb a s e d0 1 1c h i t o s a nm a t r i xf o rc h i l mm o l e c u l e sw i t h c y c h cs t r u c t u r e 1 1 1 ee n a n t i o s e l e c t i v er e s p o n s eo fs s e t ot h r e ec h i r a lc o m p o u n d s 晰t 1 1 c y c f i cs t r u c t u r ea n dm e c h a n i s mo fd i s e d m i n a t i n ge n a n t i o m e r sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d 1 1 1 ee l e c t r o c h e m i c a l e n a n t i o s e l e c t i v i t yr u do fa s c o r b i ca c i d , n o r e p i n e p h r i n ea n d t r y p t o p h a no nt h es s ew a sf o u n dt ob e1 4 8 ，1 5 6a n d1 6 7 ，r e s p e c t i v e l y n 圮 e n a n t i o s e l e c t i v i t yo fc h i t o s a nm e m b r a n ef o rc h i r a lm o l e c u l e sw a sf u r t h e rd e m o n s t r a t e d b yc h r o n o c o u l o m e t r y ，w h i c hs h o w e dt h a tt h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo fs s ei sm a i n l yd u e t o t h ed i f f e r e n c ei nt h ee l e c t r o n t r a n s f e ri n t e r a c t i o nc a u s e db ya na c c e l e r a t i o na n d r e t a r d a t i o no ft h em a s st r a n s f e ro f - a n dd - e n a n t i o m e ri nc h i t o s a nm a t r i x md i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo fg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 唧) i s s t u d i e do i lt h ec h i t o s a nm o d i f i e de l e c t r o d e g o d ，硼r pw a se n c a p s u l a t e di n n 青岛科技火学研究生学位论文 c h i t o s a nm a t r i xa n di m m o b i l i z e do n ag l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ，a c h i e v i n gd i r e c te l e c t r o n t r a n s f e r ( d e t ) r e a c t i o nb e t w e e ne n z y m ea n de l e c t r o d ew i t h o u ta n yn a n om a t e r i a l t h e c h a r a c t e r so fe n z y m ei nc h i t o s a nm o d i f i e df i l m sw e r ei n v e s t i g a t e d b yc y c l i c v o l t a m m e t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tg o d ，h r pi nt h ef i l m sr e t a i n e dt h ee s s e n t i a l f e a t u r e so fi t sn a t i v es t r u c t u r eb e c a u s eo fc h i t o s a n ss p e c i a ls t r u c t u r ea n da b i l i t y , t w o p a i ro fw e l l - d e f i n e da n dq u a s i r e v e r s i b l ec y c l i cv o l t a m m e t r i cp e a k sw e r ea p p e a r e d t h e yb o t he x h i b i t e dal i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nc a t a l y t i cc u r r e n ta n dc o n c e n t r a t i o no f g l u c o s e ，h 2 0 2i nc e r t a i nr a n g e k e yw o r d s ：c h i t o s a n , c h e m i c a l l ym o d i f i e de l e c t r o d e ，e h i r a ld i s c r i m i n a t i o n , d i r e c t e l e l c t r o c h e m i s t r y , g l u c o s eo x i d a s e ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名： 蒙毅签字日期：朋7 年，2 月，9 e l ， z 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用使用 学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大 学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密 本人签名：裳 导师签字：么 签字日期：泗7 年压月印日 签字日期叩年馏月少日 “毅事 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 1 1 壳聚糖( , c h i t o s a n ) 壳聚糖是甲壳素经脱乙酰化反应而得到的一种直链大分子生物多糖，又称脱 乙酰甲壳素、甲壳胺，化学名称为聚( 1 ，4 ) - 2 一氨基- 2 脱氧- b d 葡萄糖。其结构如 下图所示： o h 图1 - 1 壳聚糖的分子结构 f i g 1 1t h em o l e c u l e rs t r u c t u r eo f c h i t o s a n 壳聚糖是一种天然生物高分子，其外观是白色或淡黄色半透明状固体，略有 珍珠光泽，是一种储量极为丰富的天然碱性高分子多糖，多为虾，蟹甲壳提取物。 其分子中既有亲水性和疏水性基团，又有氨基和羟基等具有配位能力的基团，且 化学稳定性好。壳聚糖约在1 8 5 分解，因制备工艺条件和需求的不同，脱乙酰 度由6 0 至1 0 0 不等l 。 壳聚糖分子链上有许多游离的氨基，其氮原子上一对孤对电子易于从溶液中 结合一个氢质子而使壳聚糖成为带正电荷的聚电解质1 2 】，这使得壳聚糖不同于甲 壳素而易溶于某些稀的弱酸溶液，如甲酸、乙酸、1 0 柠檬酸、丙酮酸和乳酸等。 壳聚糖溶解后，成为一种高聚物溶液，具有一定的粘度，溶液浓度越高则粘度越 大，但壳聚糖溶液的浓度一般不超过5 ，因为此时溶液已经成为一种极稠的象 凝胶一样的弹性体，很难再提高浓度。 人们充分利用生物高分子壳聚糖的生物相容性、低毒性、生物可降解性以及 可食用性，不断开发它的应用领域。1 9 9 9 年，在美国波士顿召开了第一次关于甲 壳素壳聚糖的国际会议。近年来，随着研究的深入，国内外学者对化学改性壳聚 糖展开了研究，拓宽了壳聚糖及其衍生物的应用领域，使其在化学化- - 3 1 、环保 【4 l 、食品、生物医药和纺织印染等方面展现叱巨大的应用价值，其相关产品的研 壳聚糖修饰电极在电化学传感器中的应用 发已越来越引起人们的重视，许多文献也介绍了甲壳素和壳聚糖的结构、性能、 制备和应用【5 捌。 1 1 1 壳聚糖在分析化学中的应用 壳聚糖分子结构中的氨基使酶易于固定，故壳聚糖可用作酶和活细胞的固定 化载体，进一步展示了壳聚糖在生物科学和生物技术中所起的作用。目前，可用 壳聚糖固定的酶有葡萄糖异构酶、尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等2 0 多种【l 们。 壳聚糖用途极为广泛，如生物工程、酶和细胞的固定化、生化药物的分离精制、 纺织、印染、造纸、医药、食品、化妆品、废水处理等。在分析化学上，己用于 分离富集痕量n i ( i i ) ，c i i ) ，c d ( i i ) j 。 壳聚糖作为化学修饰电极的研究己见报道。例如：k a z u n o r i 等用壳聚糖修饰 电极测定c d ( i i ) 。b a i 等【1 2 1 曾用壳聚糖修饰电极测定f e ( f f ) 。北京大学叶宪剖1 3 彤】 研究组曾用壳聚糖修饰玻碳电极，通过阳极溶出伏安法分别测定了贵金属元素 a u ( i i i ) ，a g ( i ) ，p t ( i i ) 和p d ( i i ) 。 壳聚糖无毒，无污染，可降解，安全可靠，易于成膜，亲水性大，具有良好 的生物相容性【1 6 1 。因此壳聚糖作为修饰电极的材料与蛋白质的相互作用也有报 道。例如，j u l i a 等【1 7 】将尿素酶固定在壳聚糖膜上制成电位型生物传感器，传感器 能保持两个月的活性，可被应用到测血清样中的尿素。h i k i m a 等【l8 】将乳酸氧化酶 固定在壳聚糖修饰的汞膜电极上得到了电流型l - 乳酸传感器，壳聚糖提供了良好 的选择渗透性和起到了排除外界电活性物质干扰的作用。这种传感器是以氧为受 体，被应用到人血清中l 乳酸的直接测定。m i a 0 等【1 9 2 0 1 将辣根过氧化物酶固定 在壳聚糖与戊二醛交联后修饰的碳糊电极上或固定在壳聚糖与硅凝胶混合修饰 的碳糊电极上，得到过氧化氢传感器，通过电子受体来实现酶的电化学。o k u m a 等【2 1 】将腐胺氧化酶固定在壳聚糖多孔小球上制成反应器和安培电极构成酶反应 系统，用于测定二胺。l o o t e e k 等1 2 2 】将亚硫酸盐氧化酶共价键合在壳聚糖聚羟 乙基异丁稀酸酯基底上通过媒介体来实现酶的电化学。s m i t h 等田】将脱氢酶固定 在壳聚糖与戊二醛交联后的膜中，并加入多壁碳纳米管制各了脱氢酶传感器。迄 今为止，蛋白质和酶的壳聚糖修饰电极的研究大都集中在蛋白质的间接电化学方 面，有关蛋白质在壳聚糖修饰电极上的直接电化学报道还很少。 1 2 手性和手性化合物 手性已是我们所熟悉的概念。一个化合物分子中的一个碳原子如果与四个不 同的原子或基团相连时，这个化合物在空间可有两种不同的排列。而且，化合物 2 青岛科技大学研究生学位论文 的分子和它的镜像不能重合，这和我们的左、右手一样，虽然相似，但不能重叠， 物质的这种特性称为手性( 或手性征) 。手性是化合物分子具有旋光性和对映异构 现象的必要条件，也就是说，一个化合物分子具有手性就有旋光性和对映异构现 象。 手性是宇宙间的普遍特征，从原子到人类本身都是不对称的。在生命的产生 和演变过程中，自然界往往对一种手性有所偏爱，自然界存在的糖为d 构型，氨 基酸为l 构型，蛋白质和d n a 的螺旋构象又都是右旋的，等等。 在分子级别上，手性代表肽，蛋白质，和多糖等生命结构单元，如氨基酸和 糖。虽然并不是所有的生物活性物质( 包括药物) 都是手性的，但它们都具有手性 中心。手性对映异构体中，每个异构体都有不同的三维结构，具有不同的生物化 学性质。如外销旋药物中的一种对映异构体具有生理活性，能够发挥正常药效的 作用：而另一对映异构体显示出不同的药效或相反的作用。因此，当研究宾主共 牺生物如药品，食品添加剂和香料时，必须考虑到它们的立体化学结构。 1 2 1 手性识别及其重要性 过去的几十年里，由于科学进步和经济发展，尤其在制药工业中，手性识别 得到了快速发展。它已引起了人们的普遍关注。 “t h a l i d o m i d e ”曾在欧洲作为镇静剂使用，一些妊娠妇女服用此药后，多例出 现畸变胎儿，引起轩然大波。在以后发现中表明，只有它的r 异构体有镇静作用 而s 异构体能使胎儿致畸。惨痛的教训使人们认识到，对手性药物必须对它的立 体构体进行分别考察，慎重对待。 目前，人们研究的主要目标集中在寻求更加安全和有效的药物。由于许多生 物过程具有高度的立体选择性，当一外消旋混合物作为药物时，两对对映异构体 并不能发挥同等作用。事实上，经常是它们中的一个代表最有活性的异构体，而 另一个并不是活性的，表现为毒副作用，或者充当对抗物。 近二十多年来，科学家己完全意识到手性化合物之间的差别。在纯的对映体 化合物方面，取得主要进步是新的非对称合成方法，分析和分离技术。直到近十 年来，实现纯对映体药物的商品化还有许多实际的限制和挑战渊。虽然使用的大 多数药品都是外消旋物药品，但是药品管理机构还是要求药品生产者提供单一对 映体【2 5 】。随着科学发展和技术进步，直到现在许多单一对映体药物的生产己经工 业化，并且纯的对映体药品也成功进入了市场。因此卫生管理局，例如美国的食 品和药品管理局( f d a ) 已经对新的外消旋药物申请专利提出更严厉的要求，制药 公司必须测定每个药物的立体异构体的组成，对每个异构体的药理学活性都要有 所比较，特别是新药的审批都应提供这些材料 2 6 2 7 。农业化学和农作物的保护也 3 壳聚糖修饰电极在电化学传感器中的应用 会涉及到对映异构体，非活性或拮抗的立体异构体只会增加污染物，而不会对农 作物有任何益处。 在信息素化学中，不对称合成的发展和对映异构体混合物的分析相结合使立 体化学研究变得更加方便。这些来源于自然资源的化合物一个明显的缺点是它们 在生物体内的有限利用度。由于在信息素中手性具有极其重要的地位，所以首先 要建立活性物的绝对构型，此结构有利于人们对信息素及它们的不同生物过程的 理解，因此可以设计出能潜在地控制昆虫繁殖的相似物。 此外，手性化合物的分析在食物和临床研究中也得到了广泛的应用。食品中 的d 氨基酸检测可以用来估计影响食物组成，生物功能和安全性的因素。因为它 们来源于微生物资源，并且是我们食物的一部分；同时在食品消化过程中也能形 成各种氨基酸，它们的存在可以产生不能被新陈代谢和生理上不能被利用的氨基 酸。所以会使食品更加不安全和营养性更差。另外，食品中手性化合物的分析也 是确定食品质量的一种方法。 在临床上，手性标记物也有它们的应用。例如，尿中2 羟基酸的分析是诊断 m a p l es y r u pu r i n ed i s e a s e ( m s u d ) 疾病的基础，m s u d 是一种遗传性新陈代谢失 调，在人体中由于支链氨基酸的积累对神经造成伤害并引起精神迟钝。所以，相 关代谢物中对映体比率的确定是m s u d 疾病中代谢酶活性的一种旁证。 1 2 2 手性识别的方法 手性识别的方法主要有： ( 1 ) 圆二色性 圆二色性是研究分子立体构型和构象的有力手段，早在1 9 世纪末，c o t t o n 在 研究c u ( i ) 和c r ( i i ) 的酒石酸配合物时，发现在可见光吸收带区域内有旋光 异常色散和圆偏振光二色性( c i r c u l a rd i c h r o i s m ，简称c d ) ，这两种现象后被称 为c o t t o n 效应且广泛地用于配位化合物的研究。直n 1 9 6 0 年，c d 光谱仪问世，有 关c d 的研究应用才得以广泛开展，在金属有机化学、配位化学、生物化学、药物 化学等领域起着越来越重要的作用。 ( 2 ) 毛细管电泳 毛细管电泳是上世纪8 0 年代以来新兴的一种分离分析技术，由于它具有高 效、快速、简便等特点因而被广泛应用于药物、生物、大分子、临床医学等领域。 毛细管电泳对手性分子的识别以其操作模式，可分为：毛细管区带电泳 2 8 。3 0 】、胶 束电动毛细管色谱【3 1 1 、毛细管凝胶色谱【3 2 】和毛细管电色谱体系【3 3 1 。 ( 3 ) 高效液相色谱法 高效液相色谱( 唧l c ) 已成为对映体拆分强有力的手段之一。对手性对映 体的直接分离都是采用手性柱实现分离的。目前许多新型的手性固定相( c s p ) 4 青岛科技大学研究生学位论文 都实现了对映体化合物的分离。多糖，p i r k l e 类型、冠醚的c s p s 和其它商用手性 柱一样得到了广泛的应用。而在h p l c 中，手性固定相( c s p ) 的制备是关键。 h p l c c s p 有环糊精c s p 3 4 】，大环类抗生素c s p ，蛋白质c s p 3 5 刁7 】，聚合物c s p 等 箜 寸o ( 4 ) 气相色谱 。 在对映体的直接拆分中，环糊精气相色谱柱得到了广泛的使用。s c h n e i d e r 和 b a l l s c h m i t e r l 3 8 1 使用烷基硝酸盐作为手性和非手性探针，研究和制取了市售衍生化 b 环糊精柱、l i p o d e x d 柱的手性选择性，并讨论了溶解物的结构对手性拆分的影 响。q u a t t r i n i 等p 9 j 研究了用三种不同的环糊精手性柱在气相色谱中手性分离了a 紫罗酮，并讨论了手性选择器浓度的影响和制备级分离的可行性。 ( 5 ) 薄层色谱 最近，使用各种手性选择器的薄层色谱盘在对映体分离中也被使用。通常， 在浸渍的或预涂的t l c 盘上直接分离手性对映体，如分子烙印等其它的技术中也 使用此方法。 ( 6 ) 手性识别传感器。 虽然毛细管电泳，液相色谱，气相色谱等方法都能实现对分子的识别，但是 气相色谱和毛细管区带电泳可能对被分离溶质引起高温构型变化或破坏生物活 性，液相色谱由于键合手性固定相的化学不稳定性，以及残留硅羟基导致的“第二 效应”，以及有些固定相的刚性差，难以进行梯度洗脱。而且这些方法都需要较高 的仪器成本，精密和仔细的操作，价格昂贵的设备，费时费力，特别是难于实现 原位和在线检测。 手性选择传感体系是近年来发展起来的一种对映体纯度的定性和定量测定 较快的方法，也是一个很有发展前途的方法之一。在溶液中进行对映体的选择时， 通过溶液颜色或者荧光的显著变化，可以对对映体的纯度进行分析测定。建立的 对映体选择传感器可以与适当的变频器相联系，将化学信息转换成电信号，从而 用于在环境的技术测定过程和非对称性的合成的对映体纯度的即时测定。k a a e d a 等【加】制备了判断手性氨基酸绝对构型的颜色指示器。用偶氮红的手性尖端作为传 感体系，根据手性主体在可见光谱区的谱带移动可以判断手性氨基酸的对映体。 最j 匠k u b o 等1 4 l 】以芳烃为基础制造了一个非常好的选择性对映体发光传感器。在分 子传感器中，连接到杯顶端的两个靛酚是作为发色团，而引入的手性信息使处于 较低边缘的连接到联萘酚的冠醚上。由于冠醚之间的不同空间距离，可使手性联 萘酚更接近两个靛酚中的一个，从而保留了发色团的清晰度。在手性基底的键合 上，发色光团受到了不同程度的影响，并产生了不同强度的发色反应。s h a r o n l 4 2 1 利用分子印记的方法在i t o 电极上制备了溶胶凝胶膜，实现了对多巴胺和二茂铁 5 壳聚糖修饰屯极在屯化学传感器中的应用 衍生物的手性识别。 手性选择传感器代表了对传统和仪器化的对应分离技术的一种有发展前途 的替代技术。特别是低廉的和一次性的传感器可以代替传统的方法，所以，许多 研究者都在寻求一种价格低廉、操作简便，能进行原位和在线检测手性对映体的 新方法。本文所研究的壳聚糖膜立体选择性电极就是其中之一 1 3 酶生物传感器的概念及特点 酶生物传感器就是将酶作为生物敏感基元，通过各种物理、化学信号转换器 捕捉目标物与敏感基元之间的反应所产生的与目标物浓度成比例关系的可测信 号，实现对目标物定量测定的分析仪器与传统的分析方法相比，酶生物传感器具 有独特的优点： ( 1 ) 选择性高，能够直接在复杂试样中进行测定；( 2 ) 反复多次使用；( 3 ) 响应 快；( 4 ) 体积小，可实现在线检测；( 5 ) 成本低，便于推广普及。 酶生物传感器一般有两个主要组成部分：感受器( 固定化酶) 和换能器。作为生 物敏感基元的感受器( 固定化酶) 是酶生物传感器的心脏，也是整个生物传感器的 技术核心。感受器的制备包括两个方面的工作：一是选择最佳的载体材料；二是 在载体上固定化酶。换能器可以感知酶与待测物质特异性结合产生的微小变化， 并把这种变化转变成其他可以记录的信号，如：电信号( 电位、电流等) 、光信号( 荧 光、化学发光、电化学发光等) 、热信号以及密度、质量等性质的变化。酶传感器 的工作原理图如下所示： 睁囟昏十 换能 输出 图1 - 2 酶生物传感器的传感原理 f i g 1 - 2s e n s o rt h e o r yo f e r m y m eb i o s e n s o r 6 网栩翻阁冈翮圈菡 雒潮瀚啦胡醐翔瑚物捌一搬 青岛科技大学研究生学位论文 酶生物传感器中的换能器可分为：电化学型信号转换器、离子敏场效应晶体 管型信号转换器、热敏电阻型信号转换器、压电晶体型信号转换器、光纤光学型 信号转换器和表面等离子体共振型信号转换器。换能器质量的好坏决定了传感器 灵敏度的高低。 1 3 1 葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶的结构及特征 葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o d ) 1 9 2 8 年由m l l l l e r 等发现，此后 n e k a m a t s u 、k o n e l i a 、y o s h i o 等先后对其作了大量的研究并投入生产【4 3 , 4 4 1 。葡萄 糖氧化酶对b d 葡萄糖具有高度专一的催化氧化作用。其主要的两种来源为黑曲 霉菌和灰绿霉菌葡萄糖氧化酶分子量为1 5 0 至1 8 0k d a 的二聚体，其结构包括5 8 0 个氨基酸残基，f a d 辅因子，6 4 1 n 乙酰氨基葡萄糖残基，3 4 甘露糖残基和1 5 2 个溶剂分子，亚单元的解离可能只在变性条件下发生，并伴随着辅酶f a d 的损失。 辅酶在氧化还原酶中起重要作用。氧化还原酶进行催化作用的过程中，辅酶实际 上起到电子和质子中间体的作用。 辣根过氧化物酶( 阳姆，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ) 是广泛存在于辣根体内的过 氧化物酶，分子量为4 0 k d ，它是一种糖蛋白，糖的含量约1 8 ，酶活性中心含 有一个正铁血红素叶琳环化合物，在4 0 3n m 和2 7 5n m 处有两个吸收峰，纯的 h r p 呈米色。h r p 具有高度多态性，功能多种多样而且互异，根据电泳行为将h r p 分为酸性、碱性和中性同工酶，其中中性同工酶最具有应用价值【4 5 j ，h r p 是结合 了氧化血红素的糖蛋白，除f e # b 每分子中还含有两个c a 2 + 。肽链由3 0 8 个氨基酸组 成。另有8 个糖链( 占分子质量的1 8 ) 分别与1 3 ，5 7 ，1 5 8 ，1 8 6 ，1 9 8 ，2 1 4 ， 2 5 5 和2 6 8 位的天冬酰胺残基连接，它们分布在分子表面。肽链n 末端为一个吡咯 烷酮羧基所封闭，c 末端为丝氨酸 4 6 1 。 1 3 2 酶在电极上的固定化 7 由于酶在水溶液中一般不太稳定，而且酶只能和底物作用一次，因此，使用 起来不方便。要把酶作为生物敏感膜使用，必须研究如何将酶固定在各种载体上。 同常规的方法相比，在电极表面的固定化酶具有很多特征： 钆当酶被固定化时，可以很快从反应混合物中分离，并能重复使用； b 通过合理地控制固定化酶的微环境，可改善很多修饰电极的性质，如增加稳 定性、提高灵敏度、快速的响应等： c 在选择电极尺寸和形状方面具有较大的灵活性，易微型化或采用复杂的电极 表面如网状玻碳： d 可防止溶液中其它物质的干扰和对电极表面的沾污。 7 壳聚糖修饰电极在电化学传感器中的应用 在电极上固定酶有多种途径，通常包括夹心法、吸附法、共价键合法、聚合 物包埋法、交联法以及l b 膜技术。选择固定化技术时需考虑如下要求： a 对不同电极表面方法的可用性； b 处于固定化状态的酶应呈现最大的生物活性； c 固定化酶应能在较宽的p h 范围或不同的p h 下操作； d 具有较高的稳定性： e 具有同时固定多种酶的能力； 必须尽量避免或很少有酶的泄漏。 在电极上酶的固定化有以下几种方法： ( 1 ) 吸附法 酶在电极上的吸附通过挥发含酶的缓冲溶液来进行。当温度为4 c 时酶不会 发生热降解，吸附后，还可以通过交联法来增加稳定性。蜊y 撇a 等【4 7 】人采用 直径小于5 0g m 的微铂电极，在含有六氯铂酸和葡萄糖氧化酶的溶液中进行恒电 流或恒电位电解，使酶分子同时吸附在增长的铂黑微粒基底上。i k e d a 等m 】通过溶 剂挥发，在碳糊电极表面吸附一层葡萄糖氧化酶，然后用火棉胶乙醇进行处理， 火棉胶在电极表面形成一层薄的硝纤膜，而使酶保持在电极表面，一周后，电极 仍保留其起始响应。 z a i t s e v 等【4 9 】采用等摩尔的卵磷脂溴化十六烷基三甲铵单层吸附葡萄糖氧化 酶，发现对葡萄糖的电流响应与膜形成时的表面压力即吸附的酶量具有很好的线 性关系，并随类脂一蛋白质层数的增加而增加，1 0 层时达饱和，表明传感器的信 号从动力学模式过渡到质量转移控制模式。 ( 2 ) 共价键合法 酶在电极上的共价键合通常要求在低温、低离子强度和生理p h 条件下进行， 并常加入酶的底物以防止酶的活性部位与电极表面发生键合。 电极表面的共价键合较吸附困难，但提供了较稳定的固定化酶，因此，被较 多的采用。当向电极表面共价键合生物组分时，需通过以下几个步骤：基底电极 表面活化，酶的偶联及除去键合疏松的酶。电极表面的活化通常采用化学试剂来 完成，然后酶直接附着在活化的表面或同己附着到表面的双功能团试剂联接，两 种方法均能使酶在电极表面有效的附着。 ( 3 ) 聚合物包埋 聚合物包埋是将酶分子或细胞包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结 构中，最常用的聚合物为聚丙烯酰胺。其特点是： 可采用温和的实验条件及多种聚合物：大多数酶可很容易地掺入聚合物膜 中；一般不产生化学修饰：对酶活性影响较小；膜的孔径和几何形状可任意控制； 8 青岛科技大学研究生学位论文 包埋的酶不易泄漏，并可采用其它固定化技术如共价键合和交联进一步改进包埋 的稳定性；可固定高浓度的活性生物组分等。 ( 4 ) 交联法 通过采用双功能团试剂，在酶分子之间、酶分子与聚合物之间交联形成网状 结构而使酶固定化的方法。最常用的交联试剂为戊二醛，它能在温和的条件下与 蛋白质的氨基反应。 物理吸附和聚合物包埋法中也常辅以交联法来防止酶的泄漏。w i n g r a d 等【5 0 l 文献表明交联膜的厚度及戊二醛的含量对传感器的响应具有重要的影响。当膜较 厚时，由于扩散受到阻碍，致使响应信号下降，响应时间延长；戊二醛的浓度较 低时，蛋白质溶液不易被固定化，而戊二醛的浓度较高又会使酶失活；同时，双 功能团试剂也可能不是选择性的，既可发生分子间键合又可能发生分子内键合。 交联膜可通过共价键合或吸附法附着在电极表面。膜的共价键合可通过 y a o i 5 1 】研制的类似步骤进行，电极表面先通过3 氨基丙基三乙氧硅烷化活化，使 得双功能试剂戊二醛与酶交联并附着于电极表面，制得的传感器响应时间仅1 0s ， 可在室温下重复使用3 0 天而无响应变化。 ( 4 ) 其它方法 将植物和动物组织用于生物传感器始于1 9 7 9 年，由r e c h n i t z 等【5 2 l 首先报道 并从此引起了其它研究者广泛的兴趣。另外，由于组织切片较大的厚度导致缓慢 的响应，固定化通常采用渗析膜，但不适合于采用化学手段。w a n g 和 b r e n m t e 曲【5 3 】，将香蕉组织与碳糊直接混合制作了多巴胺传感器，该固定化方法 无需采用渗析膜来进行物理限制，并可采用其它类型的组织。 1 3 3 蛋白质直接电化学研究意义 一切生物的生命过程都是建立在组成它的生物大分子的结构、运动及其相互 作用的基础之上的，生物大分子作为生命科学的基本内容，有关它的研究就显得 尤为重要，常见的生物大分子有蛋白质，核酸和生物多糖。 蛋白质( 酶) 作为一类典型的生物大分子和特殊催化剂，在生命过程中扮演 着极为重要的角色。生命过程中的新陈代谢几乎都是在蛋白质( 酶) 的催化作用 下完成的，很多蛋白质( 酶) 在催化过程中都要经历电子转移过程，在其氧化型 和还原型之间相互转化，因此非常适合采用电化学的方法对氧化还原蛋白质( 酶) 进行研究。蛋白质( 酶) 在生命体内的氧化还原反应都发生在带电荷的生物膜或 其附近，因而其电子的传递必然要受到电场的作用或影响，这与电化学研究中工 作电极或其附近的情况相似。因此，氧化还原蛋白质( 酶) 在电极上的直接电化 学研究，可以为研究生命体内的电子交换提供模型，对理解和认识它们真实的电 9 壳聚糖修饰电极在电化学传感器中的应用 子转移机制具有重要意义【5 4 1 。 电化学生物传感器是利用生物反应的特异性，结合电分析方法的灵敏性所研 制的一种生物传感器。其中发展最迅速，并已经部分商品化的生物传感器就包括 蛋白质( 酶) 传感器。按照其发展历史可以将蛋白质( 酶) 传感器的发展分为三 代f 5 5 】，以葡萄糖氧化酶( g o d ) 催化葡萄糖为例加以说明如下： ( 1 ) 以氧为受体的催化为第一代： 酶反应：g o d o x + g l u c o s e _ g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e d g o d r e d + 0 2 _ g o d o x + h 2 0 2 电极反应：h 2 0 2 _ 0 2 + 2 h + + 2 e ( 2 ) 基于媒介体的电催化为第二代： 酶反应：g o d o x + g l u c o s e _ g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e d g o d r e d + m o x _ g o d o x + m r e d 电极反应：m r e d _ m o x + n e ( 3 ) 以酶的直接电化学为基础的是第三代： 酶反应：g o d o x + g l u c o s e g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e d 电极反应：g o d r e d + 一g o d o x + r e 前两代蛋白质( 酶) 传感器都需要借助媒介体才能完成电化学催化循环，因 此均属于间接的电催化，它们由于引进了外界媒介体而给蛋白质( 酶) 电极的研 究带来了复杂性和局限性。基于蛋白质( 酶) 在电极上的直接电子转移的第三代 蛋白质( 酶) 传感器是当前蛋白质( 酶) 电极研究的新方向，它不但在理论研究， 而且在选择性、灵敏度和测量范围等方面都有望比前两代蛋白质( 酶) 传感器有 新的突破。因此氧化还原蛋白质( 酶) 的直接电化学研究也将为开发新一代的蛋 白质( 酶) 电化学生物传感器奠定重要基础【蚓。 但迄今为止，溶液相中的氧化还原蛋白质( 酶) 很难在裸的工作电极上表现 出良好的电化学行为。可能的原因是：蛋白质( 酶) 在电极表面的取向不利于其 电活性中心与电极表面直接进行电子交换；多数蛋白质( 酶) 的分子量较大，其 电活性基团或氧化还原中心深埋在多肽链的内部，距电极表面较远；同时溶液中 的大分子杂质在电极表面的吸附和蛋白质( 酶) 本身的吸附变性也会阻碍蛋白质 ( 酶) 与电极间的直接电子转移【5 7 1 。为了解决这些问题，提出了很多方法。溶液 中蛋白质的电化学研究主要是借助于媒介体和促进剂。 早期的蛋白质( 酶) 的电化学研究多借助于媒介体【5 1 1 。媒介体多为一些小 分子量的具有氧化还原性质的物质，它们在所研究的电位范围内本身是电活性 的。可以通过媒介体在电极上的氧化还原反应来催化蛋白质的氧化或还原，从而 间接研究蛋白质的电子转移过程。媒介体在蛋白质与电极之间起电子传递桥梁的 1 0 青岛科技火学研究生学位论文 作用，电子传递发生在媒介体的氧化还原电位处。因此，蛋白质在媒介体作用下 的电化学称为间接电化学。使用可溶性的氧化还原媒介体是最为简单的电催化方 式。例如，h e i n e m a n 等【6 2 】在溶液中加入媒介体吩嗪甲氧基硫酸盐( p h e n a z i n e m e t h o s u l f a t e ，p m s ) ，研究了血红蛋白( h b ) 的间接电化学行为。溶液中的媒介体的 主要缺点是其催化效率比较低。于是，有的研究者将媒介体修饰在电极表面来研 究氧化还原蛋白质与电极间的间接电子转移。如d o n g 等【6 3 1 的研究表明，亚甲绿媒 介体修饰的碳糊电极可以有效地催化氧化1 3 烟碱腺嘌呤二核苷( n a d h ) 。另外，利 用媒介体催化辣根过氧化物酶( h r p ) 的间接电化学研究开展得比较多。如甲基绿 湖，硫堇 6 5 1 ，聚邻苯二胺删等均可作为媒介体修饰在电极上用于催化h r p 的电化 反应。 以媒介体为桥梁的蛋白质的间接电化学研究的主要缺点是，它无法真正深入 研究氧化还原蛋白质的电化学性质及其电极过程，因为所有的电化学响应实质上 都来自于媒介体而不是蛋白质本身。因此，2 0 世纪8 0 年代，以促进剂( p r o m o t e r ) 为特点的蛋白质直接电化学的研究成为主流【6 7 1 。促进剂通常也是小分子化合物， 但在所研究的电位范围内是非电活性的。当在蛋白质溶液中加入促进剂后，促进 剂一方面可以在电极表面吸附，另一方面又可以与蛋白质相互作用，使得蛋白质 的氧化还原中心以更有利的取向接近电极表面，从而达到实现或加速蛋白质与电 极之间的直接电子交换的目的。与媒介体的作用不同，在促进剂作用下的蛋白质 的电化学是蛋白质与电极之间的直接电子转移，故属于蛋白质的直接电化学。如 1 9 7 7 年，h i l l 等1 6 8 1 发现4 ，4 联吡啶能够促进细胞色素c ( c y tc ) 在金电极上的直接电 子转移，并开创了利用促进