（微生物学专业论文）产葡甘聚糖酶菌株的筛选及酶的分离纯化.pdf

产葡甘聚糖酶菌株的筛选及酶的分离纯化 摘要 经过富集培养、分离纯化，从土壤初步筛选出5 0 株产葡甘聚糖酶的菌 株；通过观察平板培养基中水解圈的大小和透明程度，得到1 0 株酶活较高 的菌株；经过摇瓶复筛( 用d n s 法测定酶活力) ，得到一株酶活力高、产酶 较快的菌株( 编号为d k 3 ) 。对d k 3 进行1 6 sr d n a 序列测定，并在互联网上 与其它菌株的相关序列进行比对，结果显示d k 3 是一株成团泛菌( p a n t o e a a g g l o m e r a n s ) 。 对d k 3 菌株所产葡甘聚糖酶的产酶条件进行了初步研究，得到的最佳 培养基配方为：葡甘聚糖0 6 ，硝酸钠0 3 ，酵母膏0 5 ，蛋白胨0 3 ， m g s 0 4 。7 h 2 00 5 ，k c l0 5 ，k t h p 0 40 1 ，f e s o 7 h z 00 0 0 1 ，p h 为6 o ；最佳产酶条件为：接种量1 ，发酵温度3 7 。c ，摇床转速1 6 0 r p m 。 在此优化条件下培养2 4 h ，菌液中的葡甘聚糖酶活力达5 8 5 4 u m l ，是优化 前的1 2 7 倍。 对葡甘聚糖酶的分离纯化方法进行研究：经超滤浓缩、阴离子交换柱层 析和凝胶过滤柱层析，所得酶液在s d s - 中a g e 电泳图谱中呈单一蛋白质区 带，分子量为5 4 k d a 。 对d k 3 菌株所产葡甘聚糖酶的酶学性质进行了初步研究，结果表明， 酶促反应的最适温度为3 7 。c ，最适p h 为6 0 ；该酶在4 0 0 c 以下较为稳定， 在p h 5 0 9 0 相对稳定。f e “、c u ”对该酶有强烈的抑制作用，e d t a 有较强 的抑制作用，n h + 、m g ”有较弱的抑制作用，n a + 则有较小的激活作用。 对固定化细胞产葡甘聚糖酶的条件进行了初步的研究，结果表明，在 培养基中加入2 c a c i ：，固定化细胞能反复使用4 次左右，后期产酶效率 降低。 对葡甘聚糖酶酶法制备葡甘低聚糖进行了初步的研究，采用反复加入 固体葡甘聚糖，反复液化葡甘聚糖溶胶的方法，使葡甘低聚糖溶液的最终 浓度达到2 4 。硅胶g 薄层层析结果表明，葡甘聚糖被酶解后所得到的低聚 糖的成分比较复杂。 关键词：葡甘聚糖酶； 筛选；发酵条件；酶学特性；分离纯化 n s c r e e n i n g o fg l u c o m a n n a n a s ep r o d u c i n g s t r a i n sa n dp u r i f i c a t i o no ft h ee n z y m e a b s t r a c t 5 0g l u c o m a n n a n a s ep r o d u c i n gs t r a i n sw e r ep r e l i m i n a r i l ys c r e e n e df r o ms o i l b ye n r i c h i n gc u l t u r e ，i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n 1 0s t r a i n sw i t hh i 【g he n z y m e a c t i v i t yw e r eo b t a i n e db yf l a ts c r e e n i n g t h e nt h es t r a i nd k 3w i t ht h eh i 【g h e s t e n z y m ea c t i v i t yw a so b t a i n e da f t e rt h es e c o n ds c r e e n i n gb ys h a k i n gc u l t u r e 1 6 s r d n as e q u e n c eb l a s ta n a l y s i si ng e n b a n kr e v e a l e dt h a td k 3w a sm o s tr e l a t e d t ot h es t r a i np a n t o e aa g g l o m e r a n s ( i d e n t i t i e s - - 9 9 ) t h eg l u c o m a n n a n a s ep r o d u c t i o nc o n d i t i o n sf o rd k 3s t r a i nw e r es t u d i e d p r e l i m i n a r i l y t h eo p t i m a l m e d i u m c o m p o s i t i o n i s8 sf o l l o w s ：o 6 g l u c o m a n n a n ，0 3 n a n 0 3 ，0 5 y e a s te x t r a c tp a s t e ，0 3 p e p t o n e ，0 5 m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 5 k c i ，0 1 k 2 h p 0 4 ，0 0 0 1 f e s 0 4 7 h 2 0 ，p h6 0 t h e o p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s ：v o l u m eo f i n o c u l u ml ，3 7 c ，1 6 0 r p m u n d e r t h i so p t i m a lc o n d i t i o nf o r2 4 h ，t h eg l u c o m a n n a n a s ea c t i v i t yr e a c h5 8 5 4u m l ， 1 2 7f o l da sb e f o r e t h eg l u c o m a n n a n a s ew a st h e ns e p a r a t e da n dp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yb y l l i u l t r a f i l t r a t i o n ，i o n - e x c h a n g ea n dg e lf l i t r a t i o n t h ep u r i f i e dm a n n a n a s ea p p e a r e d a sas i n g l ep r o t e i nb a n do ns d s p a g eg e lw i t ham o l e c u l a rm a s so fa p p r o x 5 4 t h ec h a r a c t e r i s t i c so fg l u e o m a n n a n a s ep r o d u c e db yd k 3s t r a i nw e r e s t u d i e dp r e l i m i n a r i l y t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp i - if o rt h eg l u c o m a n n a n a s e a c t i v i t yw 舔3 7 ca n dp h 6 0r e s p e c t i v e l y t h eg l u c o m a n n a n a s ew a ss t a b l e w i t h i np h5 0 9 0a n du pt o4 0 ca tp h 6 0 f e 2 + a n dc u 2 + s t m n g l yi n h i b i tt h e g l u c o m a n n a n a s e ；e d t as l i g h t l y i n h i b i tt h eg l u c o m a n n a n a s e ；n i - 1 4 、m 9 2 + w e e k l yi n h i b i tt h i se n z y m e ；t h eg l u c o m a n n a n a s ew a sg e n t l ya c t i v a t e db yn d t h ec o n d i t i o n so fi m m o b i l i z e dc e i l sp r o d u c i n gk o n j a cg l u c o m a n n a n a s e w e r ep r e l i m i n a r i l ys t u d i e d w h e n2 c a c hw a sa d d e dt ot h ec u l t u r em e d i u m t h ei m m o b i l i z e dc e l l sc o u l db er e p e a t l yu s e df o ra p p r o x 4t i m e sa f t e rw h i c ht h e e f f i c i e n c yo fe n z y m ep r o d u c t i o nd e c r e a s e d e n z y m o l y s i s o fg l u c o m a n n a nb yg l u c o m a n n a n a s ew a sp r e l i m i n a r i l y s t u d i e d b yr e p e a t l ys u p p l y i n gs o l i dg l u c o m a n n a n ，t h ef i n a l c o n c e n t r a t i o no f g l u c o m a n n a no l i g o s a c c h a r i d e s i nt h es o l u t i o nr e a c h e d2 4 t h er e s u l t so f s i l i c a - g e lgt h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h ys h o w e dt h a tt h ec o m p o s i t i o no ft h e o l i g o s a c c h a r i d e s o b t a i n e d b ye n z y m o l y s i s o fg l u c o m a n n a nw a sv e r y c o m p l i c a t e d k e yw o r d s ：g l u c o m a n n a n a s e ；s c r e e n i n g ；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ； c h a r a c t e ro f k o n j a cg l u c o m a n n a n a s e ；p u r i f i c a t i o n 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 耋拉青 r 学位论文使用授权说明 2 j 。7 年么月1 占日 ， 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 囤即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 一蟊清导一砑驯叩年6 月珈日 产葡甘聚捌 翻 r 棒的韩捌l 及的分离纯化 第一章文献综述 1 1 概述 在我国，魔芋的资源十分丰富，它主要生长在我国的湖北、四川、云南、贵州、陕 西等省。虽然人们将魔芋做为经济作物进行种植和开发，但是魔芋被开发成产品的种类 还不多。 魔芋是一种天南星科草本植物，它的主要开发价值在于其球茎中，在魔芋的球茎里 贮藏有4 0 6 0 的魔芋葡甘聚糖( k o n j a cg l u c o m a n n a n ，k o m ) 。魔芋葡甘聚糖经魔芋 葡甘聚糖酶分解后产生2 l o 个糖苷键连接而成魔芋低聚糖。研究表明该低聚糖具有降 血糖、降血脂、热值低、抗氧化等特殊生理功能，在食品工业中的应用具有非常有意义 的价值【”。 葡甘聚糖酶是魔芋开发利用的一个关键酶，目前国内对于魔芋葡甘聚糖酶的研究尚 处于初级阶段，魔芋葡甘聚糖酶产量低、酶活不高，严重影响了对魔芋的综合开发利用。 魔芋葡甘聚糖酶具有重要的经济价值，是酶工程研究的一个热点课题。 1 2 魔芋葡甘聚糖 1 2 1 葡甘聚糖的结构 魔芋是一种天南星科多年生草本块茎植物，块茎主要成分是魔芋葡甘聚糖( k o n j a c g l u c o m a n n a n ，k g m ) 。魔芋葡甘聚糖无色、无毒、无异味，吸水后体积可膨胀到原来的 1 0 0 倍甚至更高，具有很强的亲水性，呈胶液态 2 - s l 。对于k g m 确切的化学结构，虽然 有关的报道很多，但是它的确切结构至今尚无定论，仍在继续研究中【6 】。普遍得到认同 的k g m 的结构 7 , s l 推测如下：p d 葡萄糖和p - d 甘露糖以2 ：3 或1 ：1 6 的摩尔比以p - i ， 4 糖苷键结合构成的杂多糖 9 1 ，在主链甘露糖的c 3 位上存在着通过b 1 ，3 键结合的支 链结构，每3 2 个糖残基上有3 个左右支链，支链只有几个残基的长度。天然的k g m 分 子除具有葡萄糖和甘露糖外，还含有微量的乙酰基、糖醛酸残基和磷酸基。有人认为 k g m 主链中大约每2 0 个己糖残基中含有1 个糖醛酸，每1 9 个己糖基中含有1 个乙酰 产葡崔聚囊瞎苗糠的捌i 选反崮 的分离纯化 基，每7 0 个左右的己糖基中含有1 个磷酸基，分别以支链形成与酯结合。另外，有人 还认为大约每1 7 个糖残基中在甘露糖的c - 6 位上有1 个乙酰基。贾成禹眦1 等对国产 花魔芋和白魔芋中的k g m 进行了研究，花魔芋与白魔芋多糖经分离、纯化、超离心、 电泳和层析，证明二者所含均为均一多糖。通过化学结构分析，其中的葡萄糖与甘露糖 比例为l ：1 6 和1 ：1 6 9 ，其结构见图1 。 1 2 2 葡甘聚糖的理化性质 图l 魔芋葡甘聚糖分子结构示意图 f i g l t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo f k g m 纯度高的魔芋葡甘聚糖为白色粉末状固体，它是一种非离子型水溶性高分子多糖， 具有很强的吸水能力，溶于水中能形成高粘度的溶液。魔芋葡甘聚糖是目前己知的分子 量最大、粘度最高的膳食纤维【1 2 1 ，不溶于丙酮、氯仿等有机溶剂。除此之外，魔芋葡甘 聚糖还具有抗菌性、可食性、凝胶性、低热值等多种特性。 魔芋葡甘聚糖的比旋度 伍】d _ 2 6 = 2 7 5 ( c = i 2 7 m g m l h 2 0 ) ，红外光谱在4 0 0 0 - 4 0 0 c m d 区间中扫描时，具有多糖的特征吸收。在8 1 0 c m 1 和8 7 0 c m 1 处有吸光值，说明其 中含有甘露糖；8 1 9 c m o 处有吸光值说明，它的糖甘键连接方式主要为p 键。 1 3 魔芋低聚糖 魔芋低聚糖正是以魔芋胶，即魔芋葡甘聚糖( k g m ) 为原料，在葡甘聚糖酶的作用下 经水解而得。s h i m a h a mh 等将魔芋葡甘聚糖通过酶液水解后，得到m m 、g m 、 i ： ( ；、1 l - i - - - - m 、i ： l l - - - - m 、l i ( 。- - - - - m 、i j - - i s - - - m 、l i 、l j 、i m 、i ： l v l | 、i m 、 g - 】诳卅脚、g g _ l v i m 、m m m m m 、g _ 】珏_ 】惟- 】惟_ 1 垤等一系列葡 甘低聚糖的产物( 其中g 代表葡萄糖，m 代表甘露糖) 。 2 产葡甘聚糖嗣 曹羽l 的筛选a 荫珀9 分，# 化 1 3 1 低聚糖的生理功能 魔芋低聚糖是一种功能性低聚糖。所谓低聚糖，也称( o l i g os a c c h a r i d e s ) ，是1 9 3 0 年b h e l g e r i c h 等第一次提出来的。“o l i g o ”源自于希腊文，意思是“寡”。低聚糖是 由2 1 0 个单糖结合成的直链或支链低度聚合糖 1 4 ，1 5 。低聚糖包括普通低聚糖和功 能性低聚糖两类 1 6 ，1 7 。普通低聚糖有蔗糖、乳糖、麦芽糖等，它的作用主要是提供 人体所需的能量和怡人的甜味。当蔗糖被人体消化后，会转变为血液中的葡萄糖，即血 糖。而机体组织主要靠血糖来提供能量，以维持正常的生命活动。如果没有糖，生命就 会停止。但是肥胖和龋齿的直接起因主要是蔗糖( 包括一些高能量的甜味剂) 摄入过多造 成的，与糖尿病和富贵病也有直接的关系。普通低聚糖可以被人体消化吸收，对肠道有 益菌却无生长促进作用。 相反，功能性低聚糖，如低聚半乳糖、乳果糖、低聚异麦芽糖等，因为在人体的肠 胃道内没有水解功能性低聚糖酶的系统，同时也不被人体胃酸、胃酶降解，不在小肠吸 收。能直接进入大肠内优先为双歧杆菌所利用，是一类性能优良的双歧杆菌增殖因子。 并且功能性低聚糖具有糖类某些共同特性，即可直接代替糖料作为甜食的配料。随着生 物工程技术的发展，科学家们又陆陆续续发现了许多新的功能性低聚糖。食品专家指出： 低聚糖是功能性食品基料中最有发展前途的产品。如今人们把功能性低聚糖和促双歧杆 菌生长的化合物统称为“益生素” 1 4 ，1 6 ，1 7 。 功能性低聚糖之所以受到如此广泛的关注，成为种重要的功能性食品基料，皆因 其具有独特的生理功能 1 8 ，1 9 。 ( 1 ) 低热值 由于人体不具备分解消化低聚糖的酶系统，功能性低聚糖很难或几乎不能被人体所 消化吸收，它所提供的能量值很低或根本没有。一些具有功能性的低聚糖有一定程度的 甜味，可作为一种很好的功能性甜味剂，能在低能量食品中发挥作用，例如减肥食品、 糖尿病患者食品、高血压病人食品。 ( 2 ) 不会引起牙齿龋变 一 龋齿，是由口腔中的微生物所引起一种常发病，主要致病菌是突变链球菌 ( s t r e p t o c o c c u sm u t a n s ) ，这些口腔微生物不能利用功能性低聚糖作为合适的底物，因此 不会引起牙齿龋变。 ( 3 ) 能刺激双歧杆菌的增殖 低聚糖能有效地刺激双歧杆菌的增殖。双歧杆菌c o i f i d o b a c t e r i u m ) 是人类的生理性细 产葡甘聚糖酶l g 株的辨选及酮i 的分离纯化 菌，它与人是终生相伴。双歧杆菌的存在和含量是人体健康的一个标志。双歧杆菌具有 多方面的生理效应，研究表明：它可以调整肠功能的紊乱；可以调整腹泻与便秘；可 起双向调节功能，降低血内毒素，降低胆固醇浓度：对防止动脉硬化和高血压起一定作 用；可以抑制病原菌和腹泻；抗肿瘤作用，提供机体免疫功能和延年益寿作用。 ( 4 ) 其他 葡甘低聚糖可作为非常规膳食纤维源( n o n c o n v e n t i o n a ls o u r c eo fd i e t a r yf i b r e ) ，它具 有水溶性膳食纤维的部分功能，能降低血清胆固醇和预防结肠癌。 1 3 2 葡甘低聚糖的生理功能 葡甘低聚糖除具备一般功能性低聚糖的优点外，还有它自己的一些特点。 ( 1 ) 对有益微生物特别是耐氧双歧杆菌有明显地促生长作用 2 0 l 葡甘低聚糖对有益的微生物有明显地促进生长发育和繁殖的作用。它能使病原微生 物，如大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、产芽孢梭状、肉毒梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌等减少； 使有益微生物，如长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌等增加。研究表 明，葡甘低聚糖对双歧杆菌具有很强的增殖作用。 ( 2 ) 提高机体抗氧化能力 杨艳燕【2 1 1 等用5 及1 5 的葡萄糖溶液和同样浓度的魔芋低聚糖溶液分别灌喂小鼠 o g ) 。取血样测定了多项生化指标，研究了魔芋低聚糖对小鼠血糖含量及抗氧化能力的 影响。结果显示，高浓度的葡萄糖可使小鼠血糖含量增高。而同样浓度的魔芋低聚糖在 小鼠体内未使血糖含量发生明显变化，却使超氧化物歧化酶( s o d ) 活性明显升高，同时 还降低了过氧化脂质( l p o ) 水平。因此认为，魔芋低聚糖不会引起血糖升高，而且还能 提高机体抗氧化的能力。 ( 3 ) 对实验性高脂血症防治，降血脂及护肝作用 2 2 2 3 2 町 通过给实验性高脂血症的小鼠灌喂一定剂量的魔芋低聚糖，陈黎瞄1 发现魔芋低聚糖 能有效地抑制总胆固醇( t c ) 和血清甘油三酯( t g ) 水平地升高，同时能提高高密度脂蛋白 胆固醇( h d l c ) 水平。从而证实，魔芋低聚糖对抗小鼠实验性高脂血症地形成有一定 的作用。同时对灌喂一定剂量的魔芋低聚糖的小鼠进行血脂、血清丙氨酸氨基转移酶 ( a l t ) 、血清尿素氮( u n ) 的研究。结果发现，魔芋低聚糖有非常明显的降脂作用和有一 定的护肝作用。 4 产葡咽- 聚糟翻 菌株的筛莲及胡由分离纯化 ( 4 ) 排毒与增强免疫功能作用【2 5 1 葡甘低聚糖在动物和人的肠道内都不被吸收，当通过小肠时，它与病原菌的分子构 造的某一部分相结合后随着粪便排出体外，其微小分子留在肠道的部分也能使对人与动 物有害的物质排出体外，即所谓我们所说的“排毒”作用。究其原因，是甘露低聚糖分 子覆盖在人和动物肠道内肠壁的表面，当有病原微生物侵入到肠道时，病原微生物的细 胞表面有一种叫外源凝集素( 1 e c t i n ) 的物质，它可以识别糖类中某些低聚糖( 如魔芋葡甘 露低聚糖) ，并与低聚糖粘附着。之后，病原微生物不进行增殖并失去活性。从而将病原 微生物及其毒素排出体外，提高了人和动物的免疫功能，不易生病。还可以作为高血脂糖 尿病的辅助治疗产品闭。 所以，葡甘低聚糖作为一种功能性低聚糖有很好地开发价值。 1 3 3 魔芋低聚糖的制备 获得低聚糖的途径【2 7 1 主要有以下几个途径：第一是从天然原料提取。但是从天然原 料中分离未衍生化的低聚糖产品几乎不太可能，主要是因为它们浓度极低且无色、不带 电荷；第二是化学合成。化学生产过程中设备腐蚀严重，环境污染突出，且水解程度难 于控制，生产成本较高；第三是天然多糖的酸水解。此种方法获得的水解物中糖类组分 复杂，不容易获得所需特定结构的低聚糖；第四是天然多糖的生物酶解法。由于，而生 物酶解法很好地克服了这些缺点，是目前较为理想的且具有强大发展潜力的工业生产手 段之一。 生物酶法降解葡甘聚糖可通过两种途径，一种是采用微生物代谢产生的葡甘聚糖酶 酶解k g m ，另一种是从魔芋块茎中直接提取葡甘聚糖酶酶解k g m 。目前一般采用的方 法是选取微生物酶源，因为它的特点是分布广、种类齐全、易于大量制取。 因此，获取魔芋葡甘聚糖酶就成为了生产魔芋低聚糖关键因素。 1 4 葡甘聚糖酶的研究现状及进展 在动、植物和微生物细胞中普遍存在着酶，它具有极佳的催化活性，可以显著提高 反应速度i x l 0 6 - - 1 x 1 0 1 0 倍网。魔芋葡甘聚糖酶的研究首推日本，早在十年前o k a y 卅m a p r e f e c t u r a lu n i v e r s i t y l 2 9 1 曾经分离出可以降解k g m 的酶，n o r t hc a r o l i n as t a t eu n i v e r s i t y 3 0 i 也曾在研究过程中发现产葡甘聚糖酶的细菌。国内有关科研单位，如中科院微生物研究 5 产葡甘景j 蕾翻| 1 | 糠的筛聋l 覆翻 的分离捌 化 所、无锡轻工业大学、南开大学、广西大学等也相继对此类酶进行了研究。 目前，大部分的研究报道是有关于葡甘聚糖酶的类似酶甘露聚糖酶 ( m a n n a n a s e ) 1 3 1 - 3 5 ，而对葡甘聚糖酶的报道则相对较少。尽管这两种酶的作用位点不同， 但是都可以将葡甘聚糖降解成为低聚糖。因此，甘露聚糖酶的研究在理论上可以为葡甘 聚糖酶的研究提供参考。 p 甘露聚糖酶1 3 6 是能水解p 1 ，4 d 吡喃甘露糖为主链的内切水解酶【p - l ， 4 - m a n n a n a s e ；e c 3 2 1 7 8 ，其作用底物主要是葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半 乳葡萄甘露聚糖以及甘露聚糖。p 甘露聚糖酶水解底物的深度和方式主要与葡萄糖残基 和静半乳糖残基在主链中的含量、位置、酯酰化的程度有关，并且底物本身的物理状态 也会影响酶对底物的作用。不同的底物由不一样的b 甘露聚糖酶来分解。 1 9 8 2 年，ta r a k i 和m k i t a m i k a d o 等从嗜水气单胞菌s p f 2 5 中获得一种甘露聚糖 酶，该酶蛋白的p h 5 9 ，最适作用p h 6 0 ，平均分子量为6 4 k d a ，最适作用温度在4 5 以下 3 7 1 ；1 9 9 7 年，ym a t s u u r a 等发现人体消化道内的厌氧菌可以产生水解魔芋葡甘聚 糖的酶 3 8 1 ，并从人体中将产酶菌分离出来对酶进行了研究，结果表明该酶是一种由单肤 链构成的蛋白，分子量大约为5 0 5 3 k d a ，最适作用p h 7 0 8 o ；1 9 9 8 年，nk a t a o k a 和 yt o k i w a 等从土壤中分离出的梭状芽胞杆菌k t 一5 a 可以产生活性较高的甘露聚糖酶 1 3 9 1 ；近年来，国内对葡甘聚糖的酶的研究也在不断升温。中国科学院微生物研究所从枯 草芽抱杆菌b m 9 6 0 2 中提取出了一种甘露聚糖酶，该酶为中性酶，它的p h 4 5 ，最适 p h 5 8 ，平均分子量为3 5k d a ，最适作用温度为5 0 - c t 4 0 j 。 酶法生产低聚糖产品是目前产业化的一种大趋势，获得高活性酶制剂也是研究工作 重点攻克的难题之一。 1 4 1 葡甘聚糖酶产生菌的筛选方法及酶的诱导 大部分的产b 甘露聚糖酶的菌株都是从土壤中筛选得到【4 l - 4 6 1 ，同样地，筛选魔芋葡 甘聚糖酶产生菌也不例外。常用的筛选方法有透明圈法、水解圈法 4 7 4 8 1 及降解物着色法 等。因为大多数的b 甘露聚糖酶是一种可诱导的细胞外泌酶，当进行菌体培养时，它可 以分泌到菌体外的培养基中，与培养基中的底物作用。通过用显色剂，如刚果红或碘液 染色，在平板培养基上能看到黄色透明的水解圈。此种筛选方法简便易行。 研究资料表明，b 甘露聚糖酶很少以结构酶形式存在，一般以胞外诱导酶的形式存 6 产葡甘曩糖嗣r 棒的鲥i 翊l 反嗣 的分离纯化 在于生物体中。对于大部分的产b 甘露聚糖酶的微生物，在培养基中添加少量的甘露多 糖或甘露寡糖，如魔芋粉或其水解物等，就能极大地提高产酶水平。但有时某些微生物 的争露聚糖酶的分泌水平也能被其它一些半纤维素类物质或苯酚类化合物有效地增加。 比如植物病原菌野油菜黄单胞菌( x a n t h o m o n a ac a m p e s t r i s ) 在含有c m 纤维素、木聚糖的 培养基，产b 甘露聚糖酶量几乎与含有槐豆胶半乳甘露聚糖培养时的相持平嗍；而如在 培养基中添加少量的黎芦酸、香草酸及阿魏酸，就能有效地提高分解木质素的真菌 p h l e b i a r a d i a t a f r i v 0 7 9 b 甘露聚糖酶的产量【蛐】。因此我们可以据此推测，这可能是由于 多糖的分解一般需要多种糖苷酶类的参与，它们的诱导与合成常常相互关联，互相影响， 所以不同的诱导物也会产生相类似的诱导效果。 魔芋葡甘聚糖酶同样也是可诱导的细胞胞外酶。周海燕【5 1 】等通过对高活性魔芋葡甘 聚糖酶产生菌b 2 3 培养条件进行优化得出，菌株b 2 3 可以较好的利用葡甘聚糖、乳糖 和淀粉，但是只有葡甘聚糖做碳源时才可以诱导产生目的酶。 1 4 2 葡甘聚糖酶的酶活测定方法 酶活性的测定对确定葡甘聚糖酶的活性水平及特异性有重要影响。测定葡甘聚糖酶 的方法可参照测定p - 甘露聚糖酶活力方法。测定p 甘露聚糖酶活力的方法较多，主要有： 还原糖的测定法( 包括d n s 5 2 】法和s o m o 鲥n e i s c n 法) 、刚果红染色法【5 3 】、测粘法、地 衣酚- 硫酸法；还可以依据粘稠性多糖在酶作用下变稀，流出粘度计的时间发生变化的 性质测定酶活力。还原糖测定方法最为常用，因为这一方法操作简单、重复性好，但是 最大的缺点是专一性较差。所以，在使用这一方法测定酶活时一般还需结合其他一些方 法，如纸色谱法、薄板色谱法进行水解产物的鉴定。必须指出，测定时特别要注意区分 另外两类外切型的甘露多糖水解酶类：p 1 ，4 d 甘露二糖酶( p 1 ，4 - d - m a n n a n m a n n o b i o h y d r o l a s ee c 3 2 1 1 0 0 ) 和p - d 一甘露糖苷酶( p d m a n n o s i d e m a n n o b i o h y d r o l a s ee c 3 2 2 5 ) ，避免它们相互间的干扰带来的误差 5 4 1 。 1 4 3 葡甘糖酶的分离纯化研究 国外对来源于不同菌种的3 - 甘露聚糖酶的分离纯化有不少报道【5 5 9 1 。所以葡甘聚糖 酶的分离提纯与一般蛋白质提纯相类似，只要条件选择适当，一般都能得到比较纯的酶。 但是p 甘露聚糖酶有点特殊，那是由于p - 甘露聚糖酶常常和其它别的糖苷酶共存且自身 有时含有多种分子型，故而它们之间的理化性质非常相似。因此酶的纯化是有一定难度。 7 产葡崔- 聚糖酶菌株的筛选a 的分离纯化 目前通常采用的方法主要有：硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换、吸附层析、凝胶 过滤、亲和层析及高压液相层等等。 国内外，已经有不少关于微生物产生b 甘露聚糖酶纯化的报道，如在1 9 8 4 年，日 本的r i h e it a k a h a s h i 等人 6 0 1 报道了s t r e p t o m y c e s 产生的b - 甘露聚糖酶，四年之后a k j n o 等人m j 报道了关于嗜碱芽孢杆菌产生的碱性b 甘露聚糖酶。1 9 9 3 年在国内，田新玉等 人1 6 2 1 首次报道了嗜碱芽孢杆菌b 甘露聚糖酶的纯化与性质。不久，杨文博等人 6 3 1 报道 了地衣芽孢杆菌产b 甘露聚糖酶的纯化及性质。2 0 0 3 年，余红英等 6 4 1 人也报道了利用 双水相萃取技术直接从枯草芽孢杆菌发酵液中提取b 甘露聚糖酶的方法。最近，郑强江 6 5 1 报道了从新分离出来的芽胞杆菌w y 3 4 中耐热p 甘露聚糖酶的纯化和性质。许多p 甘露聚糖酶都得到了纯化，其中有些酶还还获得了蛋白结晶嘲，如枯草杆菌和黑曲霉的 b 甘露聚糖酶。 以上所进行的分离提纯工作都是在实验室中小规模制备而得，而且生产成本较高， 不适宜进行大规模地生产。随着社会的发展，提纯技术必须逐步地向工业化生产靠拢。 蒋燕军掣6 7 】通过采用盐析法( 选用硫酸铵作中性盐) ，有机溶剂沉淀法( 选用丙酮作沉淀溶 剂) ，水溶性非离子型聚合物沉淀法( 选用聚乙二醇作沉淀剂) 来制备枯草芽孢杆菌k 3 一1 4 菌株产的p 甘露聚糖酶，得到了凝胶电泳均一的酶制品，为将来p 甘露聚糖酶的工业化 生产积累了有价值的资料。从这三种纯化方法中，蒋燕军得出了聚乙二醇沉淀法的纯化 效果最好；丙酮沉淀法能得到较高的酶比活力和收率，操作简便，耗时短，且丙酮易于 回收，成本低。 1 5 本课题研究的意义和内容 1 5 1 意义 葡甘聚糖酶能将魔芋葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖。魔芋低聚糖有一定的甜度，能替 代蔗糖和葡萄糖但又不使血糖升高；它不被人体内消化道所消化，产能低；可通过促进 肠道双歧杆菌增殖，减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生；增强机体的免疫力和抗氧 化能力。魔芋低聚糖可作为功能性食品添加剂应用于保健食品的生产中。研究表明该低 聚糖具有热值低、降血糖、降血脂、抗氧化等特殊生理功能。而且，魔芋低聚糖衍生物 作为药物开发也有广阔的前景。因此，开发功能性葡甘低聚糖在食品工业中具有广泛的 8 产葡甘泉糖翻 菌糠的姊选a 肆的分离纯化 应用价值。目前国内对于葡甘聚糖酶的研究尚处于初级阶段，魔芋葡甘聚糖酶产量低酶 活不高，严重影响了对魔芋的综合开发利用。魔芋葡甘聚糖酶具有重要的经济价值，是 酶工程研究的一个热点课题，具有良好的应用前景。 1 5 2 内容 1 、采集大量土壤样品进行划线培养，挑选在培养基中产葡甘聚糖酶的单菌落。把 所挑的单菌落进行摇瓶发酵培养，测定培养液中酶的活力进行复筛，筛选出高酶活的菌 株。 2 、对筛选到的菌株进行产酶条件的研究，如碳源、氮源、培养温度、接种量、发 酵时间、初始p h 等条件的研究，掌握该菌株的最佳发酵产酶培养基配方，使酶活力达 到较高水平。 3 、对粗酶液进行分离纯化，得到较纯的酶液。 4 、分析该菌株葡甘聚糖酶的酶学特性，如最适p h 值、最适温度、酶的稳定性等等。 5 、对固定化细胞的产酶条件进行初步研究，并用酶法制备魔芋葡甘低聚糖。 9 产葡甘聚糟荫 菌株的筛选及嘲 的分离纯化 2 1 材料 第二章产葡甘聚糖酶菌株的筛选 2 1 1 土壤来源 土壤样品从广西大学农场甘蔗地、广西南丹县魔芋种植地和南宁绿源肥料厂堆肥地 采集。 2 1 2 主要试剂 葡甘聚糖( 商品名：魔芋精粉) 购自武汉市清江魔芋制品有限公司； 其它试剂均为国产分析纯试剂。 2 1 3 培养基的配制 培养基的配制见附录l 。 2 2 实验方法 2 2 1 富集培养 称取l g 土壤于试管中，加入1 0 m l 蒸馏水，振荡混匀，取i m l 接种到1 0 0 m l 富集 培养基中，3 7 c ，1 6 0 r p m 培养2 4 h 。 2 2 2 西株初筛 选择培养液粘度明显下降的菌液，用无菌水梯度稀释到1 0 9 稀释度，分别取l o 7 、 l 旷、1 旷稀释度各o i m l ，涂布到固体分离培养基中，置于3 t c 培养箱中培养2 4 h ，分 离出单菌落。 挑取单菌落。在固体分离培养基上培养( 3 7 c ) 2 4 h 后，往平板中倒入o 1 刚果红染 色，静置l o m i n 。观察菌落周围有无水解圈，筛选水解圈大、透明度好的菌株。 l o 广西，叫塑习n b 论文 产葡甘聚糟翻糠的筛选及翻 的分离纯化 2 2 3 菌种的复筛 将初筛得到的菌株接入发酵培养基中，摇瓶培养( 3 7 c ，1 6 0 r p m ) 2 4 h 。测定培养液中 葡甘聚酶的活力，筛选出酶活力高的菌株。选择最好的一株作为下一步研究的出发菌株。 2 2 4 租酶液的制备 将发酵液离一c , , ( 5 0 0 0 r p m ，6 i n i n ) ，去沉淀，上清液即为粗酶液。 2 2 5 葡甘聚糖酶活力测定 ( 1 ) 标准曲线的绘制 分别取标准甘露糖液( 1 m g m l ) 0 ，0 2 ，0 4 ，0 6 ，o 8 ，1 0 ，1 2 ，1 4 ，1 6 ，1 8 m l ， 置于1 0 支2 5 m l 具塞试管中，加入d n s 试剂2 m l ，混匀后置沸水浴中加热2 m i n ，以 流水迅速冷却，用蒸馏水定容至2 5 m l ，以空白液调零，在5 4 0 r i m 处测定o d 值，绘制 标准曲线。 酶活力的测定：取0 4 m lo 5 ( w v ) 葡甘聚糖( 用p h 7 0 ，o 0 1 m o l l 磷酸钠缓冲液配 制) ，加入0 1 m l 适当浓度的酶液，3 7 c 水浴反应1 5 r a i n ，用d n s 法测定所产生的还原糖。 酶活力单位定义：在上述反应条件下，每小时由底物释放出相当于l m g d - 甘露糖的 还原糖所需酶量为1 个酶活力单位f u ) 。 2 2 6 菌种保藏 ( 1 ) 斜面保藏 在固体分离培养基上挑选生长较好的菌落，在斜面培养基上划线，3 7 c 培养2 4 h 后， 于4 保藏。 ( 2 ) 液体保藏 把待保藏的菌液与等体积的3 0 无菌甘油混合，置于一2 0 或一8 0 冰箱保藏。 2 2 7 菌种鉴定 委托上海生工公司对菌株进行1 6 sr r n a 的编码基因一1 6 sr d n a 进行序列测定，将 测定结果与互联网g e n eb a n k 数据库中其它菌株的1 6 sr d n a 序列进行比对，找出与其 具有最大同源性关系的菌株，从而确定其在分类学上的位置。 产葡甘聚糟嗣| 1 鼻期l 的姊鼍i 夏翻 的分离纯化 2 3 结果与分析 2 3 1 标准曲线的绘制 按2 2 4 所述方法测得数据并绘制甘露糖标准曲线( 图2 1 ) 。 2 3 2 产酶菌株的筛选 图2 - 1 甘露糖标准曲线 f i 班一1 t h es 乜：n d a r dc u i - v eo f m a n n o s e 2 3 2 1 寓集与初筛 按照2 2 1 富集培养的方法，每次取l m l 样品液加入到1 0 0 m l 富集培养基中培养， 选择培养液粘度明显下降的菌液，用无菌水梯度稀释后，涂布于固体分离培养基中，分 离得到5 0 株产葡甘聚糖酶的菌株。分别接到固体分离培养基和产酶培养基上，待长出 菌落在平板上加入0 1 刚果红，静置1 0 m i n 染色。观察水解圈的透明度和直径大小， 发现共有1 0 个菌株的水解圈大、透明度好( 表2 1 ) 。其中，编号为d k 3 菌株的水解圈最 大，透明度最好( 图2 - 2 ) 。选择这1 0 个菌株进行下一步的复筛。 1 2 广西大掌习l 哇螗文产q 膏甘粟糖嗣| r l 的姊癌盘酶的分离0 化 “+ ”越多表示透明度越好 2 3 2 2 复筛 把初筛得到的1 0 菌株先接入产酶培养基培养1 2 h ，再各取l m l 菌液加入到l o o m l 广西大增e 硕士论文产葡- h - t ! 1 * l l m l l r , x 悯姊造反茸咱9 分离纯化 发酵培养基中，摇床培养( 3 7 c ，1 6 0 r p m ) 2 4 h ，测定培养液的酶活力。结果表明，d k 3 、 d k 4 、d k l 0 三株菌株的葡甘聚糖酶活力都在4 0 u m l 以上，其中菌株d k 3 的最高，因 此选择d k 3 为下一步研究的出发菌株( 表2 - 2 ) 。 表2 - 21 0 株菌的酶活力测定 t a b l e 2 - 2t h ee f f l z y m ea c t i v i t yo f1 0s t r a i l l f i 菌株 酶活( u m e ) d k l d k 2 d k 3 d k 4 d k 5 d k 6 d k 7 d k 8 d k 9 d k l o 2 8 8 钍0 5 2 2 9 0 3 + 0 4 8 4 6 4 4 o 6 7 4 2 1 2 0 6 3 3 0 4 7 0 5 9 2 6 4 6 0 3 7 2 5 3 8 0 4 0 3 3 1 6 o 5 6 3 3 9 l 0 5 1 4 4 6 0 o 6 1 2 3 2 3 葡甘聚糖酶定位鉴定 把d k 3 菌株接入发酵培养基中，摇床培养( 3 7 ，1 6 0 r p m ) 2 4 h ，离，t l , ( 5 0 0 0 r p m ，6 r a i n ) 收集菌体和上清。用o 0 5 m o l l ，p h 6 0 的磷酸钠缓冲液将菌体悬浮，用超声波破壁，分 别测定上清液和破壁菌体的葡甘聚糖酶活力。结果表明，在上清液中酶活力大大高于破 壁菌液的酶活力( 表2 3 ) 。由此可知，葡甘聚糖酶被分泌到菌体外的发酵液中，是胞外酶。 表2 - 3 葡甘露聚糖酶定位 t a b l e 2 - 3l o g a t i o no f g l u c o m a n n a n a s e 上清液( u m l )破壁菌液( u m e ) 4 6 4 4 0 6 6 2 7 ：l - 0 3 1 2 3 3 菌种鉴定 2 3 3 1 测序结果 1 4 产葡甘聚糖萌| r 株的筛选反翻晴分离纯化 委托上海生工公司对d k 3 菌株进行1 6 sr d n a 序列测定( 结果见附录4 ) 。 2 3 3 2b i a s t 结果 登录h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ，点击b l a s t ，将测序结果与所有已知的1 6 sr d n a 基因序列进行最大同源性比较，发现该菌与成团泛菌( p a n t o e aa g g l o m e r a n s ) 具有9 9 的 同源性关系( 比对结果见附录4 ) ，因此可鉴定