（植物学专业论文）大豆dreb基因gmdreb1改良紫花苜蓿耐盐性的研究.pdf

，v 、弋、； 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究 工作所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名：厶盐日期： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其它复制手段保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 言雠姗糍嘉链髻 日 期：递 窆! 查! 6 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 日期： 电话： 邮编： 溢 摘要 盐胁迫严重影响作物和牧草产量。在我国由于水资源日益短缺，干旱半干旱地区土壤干 旱和盐渍化问题越发严峻。紫花苜蓿( m e d i c a g os a t i v a l ) 作为一种营养丰富的豆科牧草在 我国西北干旱半干旱及吉林省西部地区农牧业生产和生态建设中发挥重要作用。可是，大 多数苜蓿品种对盐胁迫的耐受能力不强，产量受到很大限制。在改良作物抗逆能力方面， 传统育种方法的成功案例并不多。相对而言，应用基因工程技术提高植物抗逆性更快捷更 有效。在逆境胁迫下，d r e b 转录因子以与d r e 顺式作用元件特异结合的方式，可以调控 一系列逆境相关下游基因表达。此类基因已被证明在改良植物抗逆性方面具有相当重要的 应用价值。 、 本论文实验以基因工程技术为手段扩增了大豆g m d r e b l 基因，构建了重组植物表达载 体r d 2 9 a ：g m d r e b l ：g f p 。将这个表达载体转入农杆菌l b a 4 4 0 4 并以农杆菌介导的方法转 化到紫花苜蓿栽培种公农l 号中，获得了四个株系2 0 0 株再生苗。p c r 、s o u t h e r n 杂交结果 表明外源基因已经整合到苜蓿核基因组中，且2 9 a 2 ，2 9 a - 4 植株的外源基因整合方式为单 拷贝，外源基因在其后代中遗传等为稳定。n o r t h e r n 杂交表明在盐胁迫条件下，外源基因杂 交信号明显，而在非盐胁迫条件下，杂交信号很弱，无法检测到。且转基因植株在正常条 件下，并没有出现矮化、产量降低的现象，由此证明r d 2 9 a 启动子的作用如预期一致。对 再生植株的生理检测表明，g m d r e b l 转基因苜蓿对中度盐胁迫( 2 0 0 m mn a c l ) 具有很强的 耐受性。生理指标分析发现：在盐胁迫处理后，转基因植株的膜透性和光合系统i i 活性明 显好于对照，且累积了大量的游离脯氨酸和可溶糖，使得转基因植株能较好的应对盐胁迫 逆境。除此之外，我们确定g m d r e b l 通过提升转基因植株体内p 5 c s 基因的转录水平而 导致大量游离脯氨酸的累积。 总之，本研究首次将d r e b 类基因转入苜蓿中，证明转基因植株获得较好的耐盐能力。 同时确定以诱导型启动子r d 2 9 a 启动子驱动d r e b 基因表达是提高植物抗逆能力的一个有 效手段。这些研究结果为深入研究植物耐盐机制，培育耐盐转基因植株等方面的应用提供 了一定的基础和依据。进一步的筛选g m d r e b l 下游目的基因以及g m d r e b l 调控下游基 因的具体方式等工作正在进行中。 关键词：紫花苜蓿；g m d r e b i ；转基因苜蓿；耐盐性 a b s t r a c t s a l ts t r e s sa d v e r s e l ya f f e c t sc r o pp r o d u c t i v i t ya n df o r a g ey i e l d m li n g r a v e s c e n tf r e s h w a t e rs c a r c i t y , t h es i t u a t i o no fd r o u g h ta n ds o i ls a l i n i t yg e te v e nw o r s ei nt h ea r i da n ds e m i - a r i d a r e a so fc h i n a a l 脚f a ( m e d i c a g os a t i v a l ) i sap r o t e i n r i c h e dl e g u m ef o r a g e ，a c t i n ga n i m p o r t a n tr o l ei na g r i c u l t u r ea n da n i m a lh u s b a n d r ya n de c o l o g i c a lc o n s t r u c t i o ni na r i da n d s e m i a r i da r e a so fw e s t e r nj i l i np r o v i n c ea n dn o r t h e a s to fc h i n a h o w e v e r , s a l ts t r e s sa t5 0 2 0 0 m mn a c ls i g n i f i c a n t l yl i m i t st h ep r o d u c t i v i t yo fa l f a l f a t r a d i t i o n a lb r e e d i n gs t r a t e g i e sh a v e g e n e r a t e dv e r yf e wc r o pv a r i e t i e sw i t hi m p r o v e ds t r e s st o l e r a n c e c o n t r a r yt ot h ec l a s s i c a l b r e e d i n ga p p r o a c h e s ，d i r e c ti n t r o d u c t i o no fg e n e sb yg e n e t i ce n g i n e e r i n gs e e m sam o r ea t t r a c t i v e a n dq u i c ks o l u t i o nf o ri m p r o v i n gs t r e s st o l e r a n c e d e h y d r a t i o n - r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n g p r o t e i n s ( d r e b ) ，s p e c i f i c a l l yi n t e r a c t i n g 、) v i t hd i 迮e l e m e n t , c o u l du p - r e g u l a t i o no faw h o l e a r r a yo fd o w n s t r e a mg e n e si nr e s p o n s et os t r e s sa n da r er e g a r d e da si m p o r t a n tg e n e t i cr e s o u r c e s f o ri m p r o v i n gp l a n t s t r e s st o l e r a n c e 一。i nt h ec u r r e n ts t u d y , as o y b c a nd r e bo r t h o l o g u e ：g 聊d 足e 8 j ，w a sa m p l i f i e db yu s i n g g e n e t i cm e t h o d s u b s e q u e n t l y , w ec o n s t r u c t e dt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r sr d 2 9 a ： g m d r e b1 ：g f pa n dt r a n s f o r m e di ti n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sl b a 4 4 0 4 w i t h a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d 。g m d r e b lw a si n t r o d u c e d ：l _ n t o a l f a l f ac u l t i v a , g o n g n o n g l ，a n dt h e r e a f t e r2 0 0r e g e n e r a t e dp l a n t sf r o m4l i n e sw e r eg a i n e d p c r a n ds o u t h r e nb l o ta n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ee x o g e n o u sg e n eh a db e e ni n t e g r a t e di n t ot h e c h r o m o s o m eo fa l lt h ef o u rt r a n s g e n i cl i n e s f u r t h e r m o r e p l a n t sf r o ml i n e2 9 a 2a n d2 9 a 4 c a r r i e das i n g l ea c t i v et - d n al o c u sa n dw e r ea p p l i e df o rf u r t h e ra n a l y s i s n o r t h e r nb l o ta n a l y s i s s h o w nt h a n tg m d r e b1t r a n s c r i p t sw e r es t a b l yd e t e c t e di ns a l t t r e a t e dl i n e2 9 a 2a n d2 9 a - 4 p l a n t s t o g e t h e rw i t ht h ef a c t st h a tu n d e rn o r m a lc o n d i t i o n sn om o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n c e sw e r e f o u n db e t w e e nt r a n s g e n i cp l a n t sa n dw i l d - t y p ep l a n t s ，r d 2 9 ap r o m o t e rw a sc o m f i r m e dt op l a y i t sr o l ea se x p e c t e d m o r e o v e r , g m d r e b1 t r a n s g e n i cp l a n t sd i s p l a y e ds t r o n g t o l e r a n c et o m o d e r a t e ds a l ts t r e s s ( 2 0 0 m mn a c i ) 1 1 1 ef o u rp h y s i o l o g i c a li n d i c e so ft r a n s g e n i cp l a n t sw e r ea l l b e t t e rt h a nt h o s eo fw i l dc o n t r o lu n d e rm o d e r a t e ds a l ts t r e s st r e a t m e n t s ( 2 0 0 m mn a c l ) n o r t h e r n b o l ta n a l y s i sf u r t h e mc o n f i r m e dt h a n tg m d r e bli n c r e a s e dp 5 c st r a n s c r i p tl e v e l st h u sl e dt o m o r ea c c u m u l a t i o no ff r e ep r o l i n ei nt r a n s g e n i cp l a n t s o v e r a l l ，w et h ef i r s tt oi n t r u d u c ead i 汪bg e n ei n t oa l f a l f aa n di m p r o v ei t ss a l tt o l e r a n c e a l s ow e m a k es u r et h a ti n c o r p o r a t i n gak e yr e g u l a t o rg e n es u c ha sd r e bg e n eu n d e rt h ec o n t r o l o fr ( 屹9 ap r o m o t e ri sa ne f f i c i e n ta p p r o a c ht om i n i m i z es t r e s sd a m a g et oc r o p s f u t h e rs t u d yo n s c r e e n i n gt h ed o w n s t r e a mg e n e so fg m d i 也b la n dt h ec o n c r e t ew a yo fg m d r e b1t oa f f e c ti t s d o w n s t r e a mg e n e sw i l lb ec a r r i e do u ts o o ni nt h ef u t u r e k e yw o r d s ：m e d i c a g os a t i v a l ；g m d r e b l ；t r a n s g e n i ca l 脚f a ；s a l tt o l e r a n c e h 目录 中文摘要0 00000 i 英文摘要i i 目录”i l l 弓l言“”“l 一、植物耐盐分子机制1 ( 一) 渗透调节2 ( 二) 抗逆功能蛋白的保护作用3 ( 三) 抗氧化防御系统3 ( 四) 脱落酸4 ( 五) 应答胁迫的植物转录因子4 二、d r e b 转录因子研究进展0 0 10 00 booo ooo ! 8 ( 一) 顺式作用元件d r e c r t 的确立8 ( 二) d r e b 转录因子的结构特点和功能8 ( 三) d r e b 转录因子的克隆、表达及对胁迫的响应8 ( 四) d r e b 转录因子的表达调控1 0 ( 五) d r e b 转录因子介导的植物抗逆性g ooo o m 1 0 三、苜蓿遗传转化研究进展o b ooua 00 0q 1 1 四、本论文研究目的0 00 1 2 大豆d r 髓基因饧删改良苜蓿耐盐性的研究1 3 一、材料与方法o o qo ob 00o o0000 1 3 ( 一) 实验材料0 0000 1 3 ( 二) 实验方法o oo 0q 00 00 00 1 4 二、结果与分析o oooo qo ooo bo o ogq i 2 5 ( 一) r d 2 9 a 启动子序列的克隆0 00qo oo oo io 00 2 5 ( 二) 大豆d r e b l 基因的克隆0 0 00 0 000 2 6 ( 三) 表达载体r d 2 9 a ：g m d r e b i ：g f p 和r d 2 9 a ：g m d r 髓1 - g f p 的构建2 8 ( 四) 苜蓿的遗传转化2 4 ( 五) 转基因植株的分子检测3 1 ( 六) 转基因植物g f p 观察0 00000 00booo 3 3 ( 七) 转基因植株的生理检测3 4 三、讨论g boo oo oo oo900 o oq do oo oo oo oo 3 8 结 论0 o oo bo oooo qb0o oo 0 4 2 参考文献4 3 附录5 0 致谢5 1 i v 东北师范大学博士学位论文 引言 干旱、盐碱以及低温等逆境严重影响了植物的生长和发育，是造成作物减产的重要因 素。由干旱及土壤盐碱化导致的作物产量减产是其他生物和非生物因素造成的产量损失的 总和【lj 。近年来，随着工业污染，农业灌溉等因素影响，耕地的盐碱化及次生盐碱化程度 日益加剧。据不完全统计，全球几乎一半的灌溉地都不同程度地受到盐碱化的影响，而且 这一比例逐年在增加1 2 j 。我国是世界上土壤盐碱化面积最大的国家之一，拥有约1 亿h m 2 的盐渍化土地，占世界盐碱地面积的1 0 左右【3 1 。我国盐碱地主要分布在东北滨海地区以 及西北干旱半干旱地斟4 1 。在吉林省西部，土壤盐渍化程度同样非常严峻。近年来，受气 候变化、人类农牧生产活动的影响，这种土壤盐渍化呈逐年扩大趋势。因此，综合治理盐 碱土，研究植物的耐盐机制，培育耐盐植物，已成为未来农业发展及环境治理的重要课题。 紫花苜蓿( m e t f i c a g os a t i v a l ) 的蛋白质含量丰富，素有“牧草之王 的美称。它是 世界上栽培最广，利用最早的一种优良豆科牧草【5 1 。在我国同样种植广泛，在农牧业发展 和生态建设中发挥重要作用【6 】。由于莒蓿耐盐能力不强【7 】 并不适合在盐碱地上长期种植。 因此，培育具有较强耐盐性的苜蓿新品系，对于利用广大的受盐渍威胁土地，改良土壤， 维持生态平衡具有重要的意义和应用价值。目前紫花苜蓿的抗性育种主要通过传统的选育 方法实现，但传统的育种方法费时费力且收效有限，效率很低【3 1 。随着分子生物技术的发 展，通过植物遗传工程将特异目的基因导入植物，可实现在不改变原有优良性状的前提下， 显著提高植物胁迫耐受性的要求【8 】。植物基因工程这一手段直接，周期短，且在很多植物 上取得了成功。自d e a k 等( 1 9 8 6 ) 报导首例转基因苜蓿成功以来1 9 1 ，已有大量不同功能的 外源基因被成功转化到紫花苜蓿。这使利用植物基因工程的方法将抗盐作用明显的外源基 因导入紫花苜蓿，从而改良苜蓿的耐盐能力成为可能。为实现应用基因工程技术对植物抗 逆性状进行遗传改良的目的，必须对植物耐盐分子机制有一个透彻的理解。 1 植物耐盐分子机制 盐胁迫对植物的伤害主要体现在以下几方面：一是离子伤害。在盐胁迫条件下，植物 被动吸收大量盐离子( n a + ) ，影响对k + 的吸收，打破细胞内离子平衡，损伤膜脂或膜蛋白， 破坏膜结构的完整性，从而使胞内物质外渗，植物表现盐害特征【i o 】。二是渗透胁迫。在盐 胁迫条件下会使土壤水势变低，作物吸水困难，影响植物各种生理活动。三是二级胁迫伤 害，即活性氧胁迫伤害l l 。盐胁迫导致的离子伤害和渗透胁迫会使植物体内活性氧大量累 积，这些活性氧自由基对植物伤害极大。为应对盐胁迫，植物体内形成了一套完整的机制， 包括生化机制和分子机制。在生化方面植物采取的策略包括选择性累积或外排盐离子；控 制根部对盐离子的吸收，将体内过量盐离子转移到叶片；将盐离子区域化隔离；合成大量 东北师范大学博士学位论文 渗透调节物质；改变光合途径；改变脂膜结构；诱导抗氧化酶和激素的合成【1 2 1 。植物体内 这些生化机制协同作用，共同应对逆境胁迫。为保证生化机制的有效运行，植物体内同样 形成一套分子机制，使许多抗逆相关基因按照有序的时空顺序表达。根据这些基因产物的 功能，可将上述逆境胁迫表达的基因分为两类【l 习：一类为直接抵御环境胁迫的基因，编码产 物包括：直接保护细胞免受盐胁迫伤害的功能蛋白( 如l e a 蛋白、n a 堋+ 逆向转运蛋白等) ， 渗透调节物质( 如脯氨酸、甜菜碱等) 的合成酶以及解毒酶( 如谷光甘肽s 转移酶、超氧化物 歧化酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶等) ，使细胞的各种生理生化代谢活动不受胁迫 条件的影响。另一类为调控基因表达和信号传导的基因，其编码的产物包括：转录因子( 如 b z i p 转录因子、m y b 转录因子、m y c 转录因子及d r e b 转录因子) ，蛋白激酶( 如m a p 激酶、c d p 激酶、受体蛋白激酶) 【1 4 】等。阐明这些基因的作用对于了解植物对盐胁迫的 反应和通过转基因提高植物的性有抗逆能力有重要作用。 1 1 渗透调节 、 渗透调节剂，也称渗透保护剂，存在于从古细菌到高等植物的所有生物体中。它们是 高度可溶的一类小分子有机化合物，浓度高时也没有毒性。它们的大量累积不会影响植物 体内正常的生化反应，甚至在某种程度上起到替代水分子的作用。渗透调节剂的主要作用 是维护细胞内的渗透平衡，促进细胞从土壤中吸收水分以及保持蛋白和细胞膜的稳定性。 植物体内的渗透调节物质主要包括甜菜碱、脯氨酸、可溶性糖以及多元醇等。 1 1 - 1 甜菜碱 甜菜碱是一种广泛而有效的渗透调节剂，属于四甲基胺类化合物。有些植物在受到非 生物逆境胁迫下，会积累大量的甜菜碱，以甘氨酸甜菜碱为主。甜菜碱作为渗调剂，可保 护膜的完整性，是无毒的细胞质渗调物质【1 5 】。甜菜碱在植物抗逆中有非常重要的作用。在 逆境条件下，植物体内积累的甜菜碱的水平与抗逆能力的高低关系密切【1 6 】。在各种逆境条 件下，外源甜菜碱可提高多种植物的生长速度和存活率【1 7 , 1 8 】。在高等植物体内甜菜碱的合 成分两步进行：胆碱在胆碱单加氧酶( c m o ) 的作用下生成甜菜碱醛，甜菜碱醛又在甜菜碱 醛脱氢酶( b a d h ) 作用下生成甜菜碱。这两种酶活性都受盐胁迫的诱导。近年来己经从许多 植物中分离得到c m o 和b a d h 基因并己用于转化经济作物以提高其抗逆性。如k u m a r 等( 2 0 0 4 ) 将b a d h 基因转入胡萝卜中，使转基因植株的甜菜碱含量增至对照的5 4 倍，并获 得了较好的耐盐性【1 9 1 。 1 1 2 脯氨酸 在盐胁迫条件下，脯氨酸可以作为渗调剂、氮源、酶和细胞结构保护剂，防止质膜通 透性的变化，保护质膜的完整性，稳定膜结构【2 啦! 3 2 1 。植物体内脯氨酸有两种合成途径：鸟 氨酸途径和谷氨酸途径，在逆境胁迫下后一种合成方式占优势。而p s c r ( 一二氢吡 咯一5 一羧酸还原酶) 和p 5 c s ( a7 一二氢吡咯一5 一羧酸合成酶) 是植物脯氨酸合成中 重要的两个酶，后者是限速酶。因而在过量表达脯氨酸一提高植物耐盐性的植物基因工程 中，p 5 c s 基因作为首选对象。1 9 9 5 年，k i s h o r 等人将p 5 c s 基因导入烟草，发现转基因烟 2 东北师范大学博士学位论文 草体内的脯氨酸含量比对照植株高1 0 一1 8 倍，转基因植株耐盐、抗旱性能高于对照植物 【2 3 】 o 1 1 3 多元醇 植物体内多元醇包括甘露醇、山梨醇、环状多元醇、肌醇和它的甲基化衍生物。多元 醇作为渗透调节物质除了能起到渗透调节和渗透保护的作用外，还能清除由盐胁迫诱导的 大量活性氧自由基【2 4 1 。多元醇可分为环状醇( 甘露醇) 和非环状醇( 松醇) 。实验证明将 芹菜中甘露醇合成所需的酶m 6 p r ( 甘露糖6 磷酸还原酶) 基因转化到拟南芥后，转基因 植株体内甘露醇含量增至0 5 6i | m o l g ，植株耐盐性也显著提高【2 5 】。 1 2 抗逆功能蛋白的保护作用 1 2 11 n a + r 逆向转运蛋白 在盐胁迫条件下，恢复植物细胞内的离子平衡十分重要。在植物体内存在维持离子平 衡作用的功能蛋白。n a + 矿逆向转运蛋白就是其中的一种且目前研究最为透彻。n 埘逆 向转运蛋白依赖脂膜内外不同的n a + 、旷梯度，以质膜上的h h a t p a s e 和液泡上的 w a t p a s e 以及跨膜质子梯度为驱动力【2 6 1 ，是一种电中性的蛋白质【2 7 1 。植物中n 棚逆向 转运蛋白分为两种：一种是质膜n 涮逆向转运蛋白，另一种是液泡膜n a + 矿逆向转运蛋 白。通过n a + 矿逆向转运蛋白植物可将细胞质内的过多的n a + 排出体外或转运与液泡中， 从而减轻盐胁迫对植物造成的离子毒害。植物中最先在大麦质膜上发现n a + 矿逆向转运蛋 白的存在【2 引，随后在很多盐生植物中陆续被检测出来。随着分子生物学的发展，多种植物 的n a + 矿逆向转运蛋白基因陆续被钓取、鉴定，如拟南芥的a t n h x l l 2 9 1 、水稻的o s n h x l l 3 0 1 、 碱蓬的s s n h x l ( a f 3 7 0 3 5 8 ) 等。将这些基因在不同植物上表达都获得了较好的耐盐效果。如 转a t n h x l 基因拟南芥能在2 0 0 m mn a c i 条件下正常生长发育1 3 l 】。 1 2 2l e a 蛋白 l e a 蛋白( l a t ee m b r v o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n ) 是植物胚胎发生后期种子中大量累积的 一类蛋白质，受发育阶段、高盐、低温以及外源a b a 诱导调节。l e a 类蛋白于1 9 8 1 年被 d u r e 等首先在棉花种子中发现【3 2 1 。根据l e a 蛋白的氨基酸组成可将l e a 类蛋白分为6 组。 在盐胁迫条件下，l e a 蛋白作为一种脱水保护剂能够使植物较好应对渗透胁迫、保持细胞 膜系统及生物大分子完整性。目前己先后从棉花、大麦、水稻、番茄、大豆等多种植物中 克隆了l e a 基因，并进行了基因转化研究。1 9 9 6 年x u 等将大麦l e a 蛋白基因h v a l 导 入水稻，转基因水稻获得了较高的耐盐性【3 3 】。k a s u g a 等发现拟南芥a t d r e b l a 在盐胁迫条 件下的过表达可以提升l e a 基因的表达，增强转基因植株的抗逆能力【3 4 】。 1 3 抗氧化防御系统 盐胁迫会诱导植物体内产生大量的活性氧物质，如过氧化氢、羟基自由基、过氧化物 等。植物体内过多的活性氧会能破坏细胞膜系统、损害蛋白质和d n a 分子结构【3 5 3 6 1 。植 物体内清除过多活性氧自由基的酶类主要包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、 过氧化物酶( p o d ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 、谷胱甘肽转移酶( g r ) 等。这些酶对于保 东北师范大学博士学位论文 护植物免受过剩自由基伤害起重要作用。目前己知的编码以上酶类的关键基因有：编码谷胱 甘肽转移酶的拟南芥e r d l l 、e r d l 3 、p a r b 基因等，编码过氧化氢酶的拟南芥c a t l 、c a t 2 、 c a t 3 基因等。在胁迫条件下，提高这类基因的表达水平可减少植物细胞受到的氧化伤害， 从而提高植物抗逆能力。m c k e r s i e 等( 1 9 9 3 ) 将烟草m n s o d e d n a 转入苜蓿，提高了植株总 s o d 酶活性，改善了转基因苜蓿对逆境的耐受性【3 7 1 。 1 4 脱落酸 脱落酸是植物体内一种重要的内源激素，在植物生长发育及逆境信号传导过程中发挥 重要作用。植物在受到干旱、盐渍、冷害等胁迫后，植物体内脱落酸水平显著提制3 8 】。许 多逆境应答基因的表达需要内源a b a 的积累，而外源a b a 也可诱导这些基因表达p 引，说 明a b a 与植物抗逆性有密切关系，既逆境诱导a b a 的累积，而a b a 又可通过诱导相关 基因表达从而提高植物抗逆性。 1 5 应答胁迫的植物转录因子、一 植物逆境应答基因的调控可分为转录水平调控和转录后调控两个不同阶段。转录水平 调控是指反式作用蛋白与逆境胁迫相关的顺式作用元件相互作用，从而控制相关逆境基因 表达。转录后调控则包括r n a 的拼接、加工及转移；蛋白质翻译后修饰、酶活性调节等 方面。在这两方面调控中基因转录水平的调控起主导作用，参与这一过程的多是各种植物 转录因子。转录因子，又称为反式作用因子，是一类能与真核基因启动子区特异结合的d n a 结合蛋白质。其自身的d n a 结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性；转录调控区 决定了转录因子是激活还是抑制目的基因表达。植物转录因子首先由p a z a r e s 等于1 9 8 7 年在玉米中发现【删，后来又在其他植物中陆续发现许多不同类型的转录因子。研究表明， 植物体内存有大量的转录因子，仅拟南芥中就包含3 0 多种b z p 类转录因子和1 4 5 种 a p 2 e r e b p 类转录因子【4 l 】。植物在面对干旱、高盐、低温等外界环境刺激时会产生大量相 关转录因子，激活响应抗逆相关基因表达，最后通过基因产物的作用对外界环境做出生理 生化方面适当的调节反应。目前，与非生物逆境诱导相关的转录因子主要有：具有色氨酸 簇结构域的m y b 转录因子、含有碱性螺旋一环一螺旋( b h l h ) 和亮氨酸拉链的m y c 转 录因子、含有碱性区域和亮氨酸拉链的b z i p 转录因子以及具有a p 2 结构域的a p 2 e r e b p 类转录因子1 4 2 j 。 1 5 1 转录因子的结构 典型的转录因子会包含核定位信号区、d n a 结合区、寡聚化位点和转录调控区四个部 分。 核定位信号区：核定位信号区是富含精氨酸和赖氨酸将转录因子定位于细胞核中的一 段区域【4 3 1 。不同转录因子的核定位信号在序列、结构和数量上存在差异，有的转录因子只 有一个核定位信号区，有的则有3 5 个。 d n a 结合区：是指转录因子识别d n a 顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列。 相同类型转录因子d n a 结合区的氨基酸序列较为保守。 4 东北师范大学博士学位论文 转录调控区( 包括激活区或抑制区) ：是转录因子调节目的基因表达的区域，数量一般 可为1 个或多个。该区决定转录因子是激活还是抑制目的基因的表达，因此转录调控区可 分为转录激活和转录抑制两种。它们决定转录因子功能的差异。 寡聚化位点：是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列相对保 守且大多与d n a 结合区相连。 1 5 2 植物抗逆信号传导途径中的转录因子及其调控作用 植物在复杂的自然环境中要维持正常生长，需要要对感受到的内外界刺激因子及时作 出相应的反应，对植物自身各种功能基因作出精确的调控。目前已知，植物在抵抗干旱、 高盐和低温等环境胁迫时存在4 条信号传导途径m 】。其中2 种属于依赖a b a 信号传递系 统，而另外2 中则不属于a b a 信号传递系统。在依赖a b a 信号途径i 中需要m y c 和m y b 转录因子的生物合成从而激活下游抗逆基因表达。另一个依赖a b a 信号途径i i 则是激活 b z i p 类转录因子，由b z i p 类转录因子与目的基因启动子中的a b a 反应调节元件( a b r e p y c g t g g c ) 结合，从而调控下游抗逆基因表达。对于不依赖a b a 信号传导途径i i i 则通 过激活d r e b 类转录因子，通过它识别下游基因启动子区的d r e 顺式反应元件从而调控 下游目的基因表达。此外，在植物中还发现有些基因如r d l 9 和r d 2 1 等既不受外源a b a 诱 导又不存在d r e 顺式元件。人们由此推测植物中存在应对逆境胁迫的第四个信号途。 对于这个途径的具体机制还正在研究中。这四条途径存在许多交叉和重叠，成为一个有机 的网络共同应对不利环境的危害。而在植物对逆境胁迫的反应机制中，转录因子发挥了重 要的作用，现将已明确的植物逆境信号传导途径绘于图l 中，并将各种重要的抗逆转录因 子的特征、作用分述如下： 檀物抗逆能力 图l 植物逆境信号传导途径 5 东北师范大学博士学位论文 m y b m y c 类转录因子：m y b 类转录因子是指含有1 3 个由5 1 5 3 左右个氨基酸残 基组成的螺旋一转角螺旋构象的不完全重复序列( r 1 ，r 2 ，r 3 ) ，并且每个重复序列中都含有 3 个保守的色氨酸残基【4 5 】。在植物中所有的m y b 类转录因子都没有第一个m y b 重复序列 ( r 1 ) 。m y b 蛋白在苯丙酸类物质代谢、控制细胞形态、植物生长调控途径以及应对逆境 胁迫等过程中发挥重要作用m 】。如拟南芥中的m y b 蛋白a t m y b 2 在对干旱、高盐以及a b a 应答过程中起转录调控作用【4 7 1 。m y c 类转录因子含有两个相连的基本亚区，螺旋环螺旋 区和亮氨酸拉链区m l 。亮氨酸拉链区与d n a 结合功能相关，螺旋环螺旋区与二聚体形成 相关。与m y b 蛋白相似，m y c 类转录因子也在植物逆境应答过程中发挥作用。如拟南芥 a t m y c 2 转录因子与a t m y b 2 一样可在干旱胁迫下可增强抗逆相关基因r d 2 2 和a t a t h l 的 表达【4 7 1 。 b z i p 类转录因子：b z i p 类转录因子普遍存在于动植物及微生物中。b z i p 类转录因 子在结构上的特点为：含有与特异d n a 序列结合的碱性结构域；参与寡聚化作用的亮氨 酸拉链区与碱性结构域相连：转录因子的n 端含有酸性激活区；以二聚体的形式结合 d n a 4 0 1 。b z i p 类转录因子特异识别核心序列为a c g t 的顺式作用元件，包括 c a c g t g ( g b o x ) 、g a c g t c ( c b o x ) 及t a c g t a ( a b o x ) 等。许多与干旱、低温胁迫相关的 基因的启动子区域中都含有脱落酸响应元件( a b r e ) 1 3 9 ，a b r e 顺式作用元件序列 p y a c g t g g c f 4 9 1 a c g t 是核心序列。而与a b r e 顺式元件相结合的反式作用因子也已被大 量分离。这些因子含有保守的亮氨酸拉链结构，在该结构外联有一个碱性区域，证明该种 转录因子属于b z i p 类转录因子。在干旱、高盐等逆境刺激下，植物内源a b a 激活b z i p 类 转录因子，使其结合于a b r e 顺式作用元件，启动下游耐盐、抗旱相关基因的表达【5 0 j 。 a p 2 e r e b p 类转录因子：该类转录因子属特异存在于植物中，与植物生长发育调控 ( 如花的发育、细胞增殖等) 和植物对逆境胁迫应答相关。a p 2 e r e b p 类转录因子可特异 地结合于核心序列为g c c g c c 的g c c b o x 的顺式元件上【”】，该顺式元件存在于很多乙烯 诱导的编码与致病相关的基因的启动子区域。a p 2 e r e b p 类转录因子家族的典型特征是都 含有由5 7 7 0 个氨基酸残基组成的非常保守的d n a 结合区( a p 2 e i 砸b p 结构域) ，除了 这个结构域以外，家族中的基因序列没有相似性，其转录激活区差异较大【5 2 1 。a p 2 e r e b p 结构域主要包括两个区域，y r g 区和r a y d 区。y r g 区位于a p 2 e r e b p 结构域的n 端， 2 0 个亲水性的氨基酸残基形成三个反向平行的b 一折叠，对与各类顺式作用元件相互识别、 结合起关键作用。r a y d 区位于a p 2 e r e b p 结构域的c 末端，其中约1 8 个氨基酸残基组 成的核心区可形成双亲性的a 螺旋。r a y d 区元件并不直接参与同顺式作用元件的特异识 别，而通过影响y r g 区构象或通过与其他蛋白质发生作用而间接发挥其作用【5 2 1 。 a p 2 e r e b p 类转录因子的结构如图2 所示： 6 东北师范大学博士学位论文 = 孤爿瑟= 防 分惭石n 函f 面丽矿p 泌坷_ = 研 i 必p 洌苎= 竺黔列堡垒i 坠翌i 婴i 坠翌p 吲生丛l_一-_一-_-_oo_o 王lj j 棱定位信号转景-鼯壤dnat 青合域转录潮舌壤 图2a p 2 e r e b p 转录因子结构示意 根据a p 2 e r e b p 结构域的数目不同，刘强等( 2 0 0 0 ) 将a p 2 e r e b p 类转录因子基因 家族分为a p 2 和e r e b p 两个亚族【4 0 i 。a p 2 型转录因子含有2 个a p 2 e r e b p 结构域，调控 植物的生长发育。e r e b p 型转录因子含有1 个a p 2 e r e b p 结构域，调控植物对激素( 乙 烯) 、病源、低温、高盐及干旱等胁迫的应答反应。s a k u m a 等( 2 0 0 2 ) 分析拟南芥基因组全 序列时，发现有共1 4 5 个a p 2 e r f 相关蛋白，根据d n a 结合区保守结构域特征，将其细 分为5 个亚族：a p 2 亚族，r a v 亚族，d r e b 亚族，e r f 亚族和a l 0 7 9 3 4 9 t 5 1 1 。这些基因的 分类、代表基因及基因功能的描述见表l 【5 3 1 。其中，e r f 亚家族转录因子的a p 2 e r e b p 结 构域中第1 4 位和1 9 位为保守的丙氨酸( a ) 和天冬氨酸( d ) ，d r e b 亚家族转录因子的 a p 2 e r e b p 结构域中第1 4 位和1 9 位为保守的颉氨酸( v ) 和谷氨酸( e ) ，这两个位点的氨基 酸残基决定了转录因子与顺式作用元件的结合性质1 5 4 , 5 5 1 。 表1 拟南芥中数据库榆索的1 4 5 个含有a p 2 圆p 转录因子 跳结编掏域烛亚家族 蜊姜蠹篙甏湍 代表基因描述 2 个i n t f a i 】2a p 咧 2 亚家族 碌d ：a p 2 + 硇 r a v 妪家族 詹l64 膏2l2 姗亚家族 竺二： 膏5 1 6 9 躺95 1 个日瓯a 乾 b - i1 5 墨 争253 阱燃 ：了： 争5l2 7 a p e t n 址a c l e i x i d 毯 t a 与记和胚的发肖囱关 t a v i ， i a v 2生长发育的负调节因子 d r i l l 佃f与植物抗冷相关 d r i p 2 与植物抗r 早高盐胁迫相关 a b g 与旭a 信号转导有关 t i n y 细胞的分裂延迟 r a p 2 i 9 1 0m h r a 乾4u n k l n w a t e e l 圆4 7 8 9 1 0 l e b p r a p 22 缸e r f i2 ，6 碌f l 涉及乙嚣反应基因表达与抗瘸 r a 舵6 性有关 东北师范大学博士学位论文 2d r e b 转录因子研究进展 2 1 顺式作用元件d r e c r t 的确立 y a m a g u c h i s h i n o z a k i 等( 1 9 9 2 ) 利用示差筛选法，从经干旱处理的模式植物拟南芥中克 隆了9 个受干旱诱导的基因，定名为r d ( r e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n ) 基因群嗍。研究发现，r d 2 9 a 基因的表达不仅受干旱、高盐和低温的诱导，也受外源脱落酸( a b a ) 的诱导。通过对其 启动子区域分析发现，它的启动子区域含有a b a 应答顺式元件a b r e ( a b ar e s p o n s i v e e l e m e n t ) ；但在敲除掉a b r e 元件后，r d 2 9 a 基因依旧可以被干