（植物学专业论文）对基于同源序列候选基因法克隆r基因的探讨.pdf

摘要 以n b s l i l r 类r 基因中的几个保守序列为依据合成寡核苷酸引物，并组成不同 的引物组合，通过对两套玉米抗大斑病册基因近等基因系( 0 h 4 3 ，o h 4 3 h t - ，o h 4 3 h t t ； b 3 7 ，b 3 7h t 一，b 3 7 h t ：) 基因组d n a 进行扩增，对基于同源序列的候选基因法 | ( h o m o l o g y - b a s e dc a n d i d a t eg e n em e t h o d ) 克隆r 基因作进一步探讨。住要研究结果 ( 表明： l - 依据n b s l r r 类r 基因特有的两个保守序列g l p l 和c f l y ( 两者相距约7 0 个氨基酸) 合成所有可能的简并寡核苷酸引物( 左引物1 6 个，右引物8 个，共组成 1 2 8 个引物组合) 对玉米基因组d n a 进行扩增的结果表明：在6 个引物组合中得到 了扩增产物，产物长度在5 0 0 1 0 0 0 b p 之间；没有获得特异性扩增产物( 指仅从含 肌基因材料中得到，长度约2 1 0 b p 的d n a 片断) 说明玉米册基因不舍绝大多数r 基因特有的两个保守序列g l p l 和c f l y ，或者说册基因不属于n b s - l r r 类r 基因。 2 依据拟南芥r p s 2 和烟草 ，基因中的两个保守序列c v g k t t 和g l p l a l ( 两者 相距约5 0 0 b p ) 合成寡核苷酸引物( 左引物2 个，右引物2 个，组成4 个引物组合) ， 对玉米基因组d n a 进行扩增的结果表明：在2 个引物组合中获得了大约5 0 0 b p 的扩 增产物，但这两个扩增产物同样也存在与不含肌基因的玉米基因组中，说明这两个 5 0 0 b p 左右的d n a 片断并非肌基因的类似序列 3 r 基因类型的多样性 叼 可预测性，使基于同源序列的候选基因法克隆r 基因带 有一定的盲目性。 v ，l 。 关键词：抗病基因，玉米大斑病， 抗病基因类似序列 7 一 克隆，基于同源序列候选基因法，p c r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得i i 生生生盘鲎 或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明荠表示谢意a 学位论文作者签名：声l 量国 签字日期：劬筹f 月缈日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解! ! ! 盈丝整生煌有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权i 2 j 弛式遗乏可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文储签名：声怎国 导师签名：崭违氏1 2 v ，1 o 1 签字日期：动n 年月勋日签字日期：p 三年月参f 日 河北农业大学硕：e 论文 文献综述 植物受到病原物侵染后表现抗病还是感病取决于两者的相互作用。病原物与 植物的互作关系极其复杂，基因对基因的互作关系是其中的一种。f l o r 提出的基 因对基因( g e n ef o rg e n e ) 假说认为，相容病原带有“毒性基因”( v i rg e n e ) ， 不相容病原带有“无毒基因”( a v rg e n e ) ；不相容寄主带有“抗病基因” ( r e s i s t a n c eg e n e r ) 相容寄主带有“感病基因”( s u s c e p t i b l eg e n e ，s ) 。 病原的a v r 基因和寄主的r 基因是显性的，病原的v i r 基因和寄主的s 基因是隐 性的。只有含a v r 基因的病原物与含r 基因的寄主互作，植物才表现出抗病，其 他情况均表现为感病。r 基因的主要作用是通过其产物识别并结合a v r 基因产物， 启动植物体内的信号传导过程，引起防卫基因的表达，使植物表现抗病。 l 植物抗病基因的克隆 1 1 植物抗病基因的克隆方法 j o h a l 等于1 9 9 2 年克隆出第个植物抗病基因一玉米抗圆斑病基因m l ”1 ， 在随后的l o 年里，人们相继从玉米、拟南芥、烟草、番茄、水稻和亚麻等9 种植 物中克隆了2 0 多个抗病基因，这些抗病基因分别提供对细菌、真菌、线虫、病毒 的抗性。获得抗病基因的主要方法如下： 1 1 1 转座子标签法( t r a n s p o s o nt a g g i n g ) 是利用转座子或t - d n a 插入到r 基 因的内部或邻近位点，获得r 基因功能丧失的突变体，然后利用插入片段( 转座 子或t - d n a ) 作探针，通过s o u t h e r n 杂交或以转座子( 或t - d n a ) 两端的核苷酸 序列作引物，通过反向p c r 技术扩增其两侧的序列，并以此为探针筛选突变体基 因组文库克隆r 基因最后从野生型基因组中克隆r 基因运用该法克隆的r 基 因有玉米m l 、番茄c 卜“、c f - 4 “、c f - 5 “”、c 卜”、烟草“1 、亚麻 和”1 基因。利用转座子标签法克隆r 基因的前提条件是被操作的植物有成熟的 转化系统，并能成功获得转座子或根癌农杆菌插入的r 基因突变体以及有效的大 规模突变体筛选的方法和手段。 1 1 2 图位克隆法( m a p - b a s e dc l o n i n g ) 图位克隆法是根据目标基因在染色体上 的位置进行基因克隆的一种方法。在目标基因定位到染色体的一定位置以后，运 对基于同源序列候选基因法克隆r 基因的探讨 用与目标基因紧密连锁的分子标记筛选含有目标基因的大片段基因组文库( b a c 或y a c ) ，再通过染色体步行筛选到含有目标基因的亚克隆，最后通过遗传转化和 功能互补试验进行验证。利用该法克隆的r 基因主要有番茄p t o “、拟南芥 兄飚矿“1 、r p m i “”、n p r l “”、水稻x a 2 1 “”和丹彬”1 。图位克隆法是以高密度的 分子标记图谱为基础，其关键是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记，核心任务 是染色体步行。但是对于基因组较大，重复序列较多的一些植物，采用该方法分 离克隆抗病基因不仅投资大而且效率低，因此，该方法也受到一定的限制。 2 抗病基因的结构特点 2 i 抗病基因的分类“” 首先根据是否符合基因对基因关系把i i 基因分为两类。第一类：不符合基因 对基因关系的r 基因，有玉米l l m l ，m ”1 和大麦# 1 0 t 基因( 表1 中5 ，6 类) 。 玉米h m l 编码依赖于n a d p h 的h c - 毒素还原酶，可使病原菌产生的h c 一毒素钝化从 而使植物表现抗病。大麦m l o 基因编码的蛋白中含有至少6 个跨膜结构域，不具 有其它r 基因的类似序列。m l o 基因的隐性突变体表现出对大麦白粉病的广谱抗 性。第二类：符合基因对基因模式的r 基因( 表i 中的l ，2 ，3 ，4 类) 。根据由 抗病基因推断出的蛋白质( 称r 蛋白) 的氨基酸序列特征，又可以把这类r 基因 分为n b s - l r r ，l r r t m ，l r r - 蛋白激酶，蛋白激酶4 种类型。n b s - l r r 类又可以根 据其r 蛋白的特征再分为3 个亚类( 表i 中i i ：i 2 ：i 3 ) 。从表中可以看到， n b s - l r r 类型的抗病基因约占5 0 以上。 2 2r 蛋白的结构特点 2 2 i 富含亮氨酸重复序列( l e u c i n e r i c hr e p e a t ，l r r ) 这一序列因亮氨酸的 规律性重复( 多以2 4 个氨基酸为重复单位) 而得名。在动植物中均发现含有l r r 序列的蛋白质，例如酵母的腺苷酸环化酶、果蝇t o l i 蛋白，人m 清中的az 一糖 蛋白等都含有l r r 结构，l r r 可能在蛋白质互作及信号传导中起作用。由于r 蛋 白在细胞中的定位不同，r 蛋白上的l r r 也有所不同首先，定位于质膜上的r 蛋白( 番茄c f - 2 、甜- 么c f - 5 、甜鸣水稻x a 2 1 、甜菜船”“踟) 其胞外的l r r 含有较高重复数，如c 卜口达3 8 个，而定位于胞质中的r 蛋白，其l r r 多数含有 1 4 个重复，只有个别含有2 1 或2 8 个重复，且重复数均为7 的倍数；其次，胞外 l r r 一般为2 4 个氨基酸的完整重复，而胞内l r r 多为2 4 个氨基酸的不完整重复； - 2 河北农业大学硕士论文 再次，胞外l r r 的共有序列可总结为x l x x l x l x x n x l x g x i p x x l x x l x ，其中第1 4 位氨基酸残基为甘氨酸，第1 7 位氨基酸残基是脯氨酸；胞内l r r 的共有序列可概 括为x l x x l x l x x ( x c ) x x x x x a x x x a x x x x ，其第l o 位上的氨基酸残基多为半胱 表1 已克隆的抚病基因分类 t i b l e1t h ec l a s s i f i c a t i o no f c l o n e dp l n n td i s e a s er e s i s t a n c eg e n e s 分类抗病植物病原菌无毒基因 产物结构参考文献 c l a s s 基因p l a n tp a t h o g e n a v r g e n c s t r u c t u r er e f e r e n c e 烟草t o b a c c o m o s a c7 m yt i r - n b s l r 1 4 1 5 v i r u s ( t m v ) r 1 1 脚5拟南芥p e r o n o s p o r aa v r p p 5 t i r - n b s - l r4 0 p a r a s i t i c a r l 6 亚麻 m e l a m p s o r ah n i a l 6t i r - n b s l r1 6 r 村 亚麻 m e l a m p s o r a l i n ta m t i r - n b s l r1 7 r p v t o m a t o p s y r i n g a ep v m a c u l i c o l a a v r r p m l ，l z - n b s - l r r 2 0 a v r b 番茄p s y r i n g a ep v t o m a t oa v r p t ol z - n b s l r r4 7 13x a l 水稻x a n 肪o m o h o $ o r y 2 0 e a v r x a in b s - l r r4 3 p v o r y z a e m i 番茄m e l o i d o g y n e j a v a n l c a不详 n b s - l r r4 4 p i - b 水稻m a g n a p o r t h e g r i s e aa v r p i bn b s l r r2 3 2 4 o f 2番茄c l a d o s p o r i u m i v u ma v r 2l r r - t m8 , 9 0 4番茄c l a d o s p o r t u m f u i v u ma v r 4l r r - t m1 0 2 o f - 5番茄c l a d o s p o r i u m f u i v u m a v r 5l r r - t m 1 1 。1 2 ( 乒9番茄c l a d o s p o r i u m i v u m a v r 9l r r - t i v l1 3 胁j ” 水稻h e t e r o d e r a s c h a c h t a不详l r r - t m 3 7 1 p t o 番茄p s e u d o m o n a ss y i n a g ea v r p t o蛋白激酶 1 8 p m i o t n a t o 3r a r l 大麦黄矮病菌蛋白激酶4 5 4x a 2 1 水稻x a n t h o m o n a so r 弼a e不详l r r - 蛋白 2 2 p vo r y z a 激酶 5h m l 玉米 c o c h l i o b o l u j 无毒素还原酶 7 c a r b o n u m h m 2 玉米 c o c h l i o b o l g s 无毒素还原酶 4 2 塑生2 墅鲤 6m l o 大麦 b l u r n e r i ag e a m n g sf s p 无负调控因予 4 3 n o r d i c 注ll r r ：l e u c i n e - r i c hr e p e a t ；n b s ：n u c l e o t i d eb i n d i n gs i t c ：l z ：i c u c i n e z i p p e r ； t i r ：t o l l - i n t e r l c u k i n ir e c e p t o r , t m ：t r a n s m n m b r a n cd o m a i n - 3 一 对基于同源序列候选基因法克隆r 基因的探讨 氨酸( x 为任意氨基酸，a 为疏水氨基酸，g 为甘氨酸，p 为脯氨酸，c 为半胱氨 酸) 。对比这两个序列可以发现x l x x l x l x x 是它们的共同点。立体结构分析证 明，这一共有序列构成一个短的b 一折叠，其后的部分构成。一螺旋，所有重复的 b 一折叠平行于共同的轴心，形成一个马蹄形结构。在这一结构中，亮氨酸残基构 成疏水的核心，而其他非保守的氨基酸残基在结构表面形成配体的结合位点，预 示着r 蛋白中的l r r 可能参与对病原物a v r 产物的识别与结合。但这种保守结构 中也有例外，甜菜的凰”基因虽然含有l r r 结构域，但其缺少一些l r r 结构所 共有的特征，如特异的亮氨酸间隔和其他些特殊的氨基酸残基。 2 2 2 核苷酸结合位点( n u c l e o t i d eb i n d i n gs i t e ，n b s ) n b s 在真核生物的蛋 白质中广泛存在，如各种a t p 酶，g 一蛋白等。这些蛋白在细胞的生长、分化、细 胞骨架的形成、小泡运输和防御反应中起作用。r 蛋白中的n b s 由3 个主要的结 构域组成，第一个为磷酸结合环( p - l o o p ) ，又叫激酶l a ( k i n a s e l a ) ，作用是结 合a t p 或g t p 分子中的磷酸基团，其共有序列为g m ( g p ) g x g k t t ( a t ) 。第二 个为激酶2 a ( k i n a s e2 a ) 区，共有的特点是在4 个疏水氨基酸残基后紧跟一个 不变的带负电荷的天冬氮酸。这一区域的两边具有保守的氨基酸序列，其共有序 列为k ( k r ) x a a a a d d v ( w d ) 其中天冬氨酸( d ) 只在含有t i r 的n b s l r r 类r 蛋白的结构中出现，色氨酸( w ) 在其他情况下出现。第三个为激酶3 a ( k i n a s e 一3 a ) 区，它可能与d n a 的嘌呤或核糖的结合有关，通常含有一个精氨酸残基，其保守 序列为s r a a a t ( t s ) r 通过进一步研究发现在r 蛋白n b s 和l r r 之间有两个短 序列是高度保守的，一个是g l p l ( a t ) a x ( v s ) a a g ( s g ) a a 序列，另一个是距它 约7 0 个氨基酸的l ( r k ) x c f l y ( c i ) ( a i s ) x f 序列在这两个序列之间还存 在着一个保守序列l x ( i f l ) s y x x l ( n e ) p 。利用计算机对已知蛋白质中氨基 酸序列进行比较后认为，前两个序列为r 蛋白所特有( 尽管对这两个序列的功能 尚不了解) 2 2 3 亮氨酸拉链( l e u c i n ez i p p e r ，l z ) l z 在真核生物转录因子的同源及异源 二聚体形成中起作用。在l z 中每7 个氨基酸构成一个重复。且第7 位的残基为( 异) 亮氨酸。这些( 异) 亮氨酸在蛋白质二级结构中形成a 一螺旋的疏水脊，具有这种 结构的蛋白质，通过( 异) 亮氨酸的疏水相互作用形成= 聚体或三聚体，并促进 蛋白质之间相互作用。推测存在于r 蛋白中的l z 可能承担与病原物产生的配体特 异性结合的作用。 4 河北农业大学硕士论文 2 2 4 果蝇t o l l 蛋白和哺乳动物中的白细胞介素一1 受体( t o l 卜i n t e r l e u k i n 一1 r e c e p t o r ，t i r ) t i r 是果蝇t o l i 蛋白和哺乳动物白细胞介素一1 受体的胞质结构 域，在各自免疫系统的信号传导中起重要作用。通过与病原物结合，将信号传递 到细胞内，从而引发抗病反应。烟草的基因、拟南芥的r p p 5 基因、亚麻的占 基因和基因产物n _ 端的1 5 0 个氨基酸序列类似于果蝇t o l l 蛋白和哺乳动物白 细胞介索一1 受体的胞质结构域，故称为t i r ，可能在植物的抗病反应中起类似的 作用。 2 2 5 蛋白激酶结构域( s e r i n e t h r e o n i n ek i n a s ed o m a i n ) 在番茄的p t o 基因、 大麦的r a r l 基因和水稻的x a 2 1 基因编码的蛋白中都存在一个丝氨酸苏氨酸型蛋 白激酶结构域。p r o 基因的克隆表明，激酶介导的信号传导在基因对基因模式的 植物抗病反应中起核心作用，其中磷酸化作用的调节是普遍的机制。在丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶结构域中有两个保守的区域，分别为d a k x x n 和g t a g y x a p ( n e ) 。 3 抗病基因类似序列研究现状 抗病基因所编码r 蛋白的结构特征不仅预示了其在植物抗病反应中可能的作 用机制，而且为克隆植物r 基因提供了另外一条可能的途径，即基于同源序列的 候选基因法( h o m o l o g y b a s e dc a n d i d a t eg e n em e t h o d ) 。该法是根据不同生物中 相同基因间存在碱基序列的保守性，尤其是对蛋白质功能起着决定性作用的一些 区域保守性往往更强，所以，当从一种生物中克隆了某种基因后，即可用该基因 中的保守序列作为探针，去筛选其它生物的d n a 或e d n a 文库，来克隆与其相类似 的基因；也可以些保守序列为依据设计寡核苷酸引物，利用p c r 技术对基因组d n a 或c d n a 进行扩增，对得到的特异性产物测序并和已知的基因比较后，利用其中同 源性高的序列为探针进一步筛选d n a 或c d n a 文库，即可能获得目的基因。 该方法在许多基因的克隆中获得了成功，如：利用动物中已克隆的g t p 结合 蛋白基因中的保守序列，通过候选基因法成功地从拟南芥”中克隆出了g t p 结 合蛋白基因利用蛋白激酶中存在的保守序列合成寡核苷酸引物在不同植物中得 到了一些蛋白激酶基因”。另外，利用植物中已克隆的一些基因的保守序列， 通过该方法从n i c o t i a n aa a t a “，s o l a n u mc 施c d e 疗s “中克隆出自交不亲和基 因，从拟南芥1 等植物中克隆出细胞周期调节基因，从拟南芥m “、烟草 等植物中克隆出花形态建成相关基因 5 对基于同源序列候选基因法克隆r 基因的探讨 1 9 9 6 年，l e i s t e r ”“等开始利用候选基因法克隆r 基因，他们依据烟草n 基 因和拟南芥r p s 2 基因所编码r 蛋白的n b s 结构域中两个保守序列g g v g k t t 和 g l p l a l ( 两者相距1 6 0 个氨基酸) 台成寡核苷酸引物，对含有抗胞囊线虫基因g r o l 的马铃薯基因组d n a 进行扩增，对1 2 条扩增产物进行了序列分析，并与基因、 r p s 2 基因和疗基因所编码的r 蛋白相应区域进行了序列比较，结果发现，氨基 酸序列同源性达4 3 一8 2 。衍生多肽( 由1 2 条扩增产物推断而来) 的相应位置均 含r p s 2 、 ，基因所编码r 蛋白n b s 结构域内的z i n a s e 一2 a 和k i n a s e 一3 a 序列( 这 两个序列也是a t p 或g t p 结合蛋白n b s 结构域中所含有的序列) 。y u “”等( 1 9 9 6 ) 根据烟草和拟南芥r p s 2 基因的n b s 区氨基酸同源序列g ( m p ) g g v g k t 、s p i i i t t r ( n 基因) 和c k c v m f t t r ( r p s 2 基因) 设计简并引物，从大豆基因组中扩增并克 隆出1 1 条含n b s 序列的片段，其中5 个定位于大豆抗病基因 胎儿r p v , 励s l , r p s 2 , r p s 3 和r m d 附近。f e u i l l e t “等( 1 9 9 7 ) 利用丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶结构域中的两个保守序列d v k p e n 和g t p e y i a p e 设计合成简并引 物，通过反转录p c r 扩增克隆到的一个具有丝氨酸苏氨酸结构特征的蛋白激酶片 断，利用近等基因系进行r f l p 分析，定位到小麦抗叶锈基因l r l o 位点上，被认 为是l r l o 的候选基因。c o l l i n s “等( 1 9 9 8 ) 利用已知r 蛋白的n b s 区保守序列 g v g k t t ，l ( i v l ) v l d d v ，g l p l a l ，k q c f a c s i ，w m a x 6 ( f i ) v ，和删d6 个不同 的位点设计简并引物，利用巢式- - p c r 技术从玉米中扩增并克隆到1 1 条r g a ，经 序列分析，r f l p 分析、作图、筛选到玉米抗锈病基因r p l 和r p 3 的候选基因。 薛勇彪”等利用l q b s 中的保守序列g g y g k t t 和g l p l a l 合成简并引物。通过 p c r 扩增获得6 个r g a ，并应用其中的两个同水稻基因组d n a 做杂交分析后认为， 水稻的抗病基因中有属于包含n b s 结构域的类型。王石平“”等利用8 对引物( 5 对引物选自已克隆r g a 两侧的序列，2 对引物根据蛋白激酶和硫氧还原蛋白氨基 酸序列中的高保守区域合成的简并引物，l 对引物可以扩增x a 2 1 基因的部分d n a 序列以及该基因3 端下游的序列) 对水稻基因组进行扩增，共获得约1 0 0 个克隆， 将2 6 个克隆定位在水稻分子标记连锁图1 2 条染色体的3 4 个位点上，有1 0 个克 隆与已知的8 个抗病基因在染色体上的位置相对应，这8 个r 基因包括5 个抗稻 瘟病基因，2 个抗自叶枯病基因，1 个抗东格鲁病基因。李子银”和贺超英“”等 利用拟南芥r p s 2 和烟草基因中保守的p - 环( g g v g k t t ) 和跨模结构域( g l p l a l ) 设计引物对水稻c d n 和大豆基因组d n 进行扩增，分别得到3 个和4 个与已知r - 6 - 河北农业大学硕士论文 基因同源性不同的片断( 同源性分别在4 5 一6 0 ) 。 但是，利用候选基因法获得的基因片段，无论与已知r 基因的同源性如何高， 也不能断言该片段就是r 基因的一个组成部分，而只能命名为r 基因类似序列( r g a ， r e s i s t a n c eg e n ea n a l o g ) 。因为r g a 和r 基因主要有三种关系，即：( 1 ) r g a 与目的r 基因无关，例如在玉米中，有的r g a 并不与已定位的r 基因连锁，如 t o l l i n s 的结果中没有能够将其获得的r g a 与已经定位的玉米抗大斑病肌基因联 系起来；( 2 ) r g a 与目的r 基因紧密连锁，如玉米中的一个r g a 与第四染色体上 抗杆腐真菌病的q t l 基因连锁，而在大豆中发现一个r g a 与抗大豆胞囊线虫的o t l 基因紧密连锁：( 3 ) r g a 本身就是r 基因或其假基因的一部分，如莴苣1 中的两 个r g a 被同时定位到含有r 基因d m l ，d m 3 的基因簇附近，并被证明可能是d m 3 的 一部分。因此应用候选基因法应考虑如下问题，首先，在设计引物时应考虑到目 的r 基因可能的类别；其次，r 基因在植物中多成簇或以基因家族的形式存在， 难以判断克隆产物是否为目的基因片段；再次，植物中有一些蛋白含l r r 或n b s 结构，如a t p 或g t p 结合蛋白：最后，获得的r g a 必须进行转基因的检验，以最 终确定是否为真正的r 基因 4 植物抗病基因的起源与进化 植物抗病基因可能起源于植物正常发育所必需的基因，这些基因编码的蛋白 参与细胞内的分子识别和信号传递系统。在哺乳动物、酵母和昆中已经发现许多 蛋白质与植物r 蛋白相关，这些蛋白控制内源信号传递、生长发育和细胞间粘连。 植物抗病基因也可能与哺乳动物免疫基因有共同的进化来源，因为n b s l r r 类型 的r 蛋白和人组织不亲和性复合因子类型i i 的转录活化因子之间以及胞外l r r 类 型的r 蛋白与老鼠b 细胞繁殖和抵抗编程死亡的r p l 0 5 蛋白之间都存在相当高的 同源性，所以它们可能是从共同的祖先基因进化而来的。 大多数r 基因属于多基因家族成员，它们成串捧列，形成复杂位点，从而为 反复重组提供基础。新的r 基因可以通过错配、基因内或基因间重组以及基因复 制等机制产生。基因重组使植物恧对迅速进化的病原菌群体具有选择优势。玉米 肋基因位点的遗传分析表明新抗病专化型的发生与旁侧标记基因重组有关。序 列分析指出，x a 2 1 基因家族的进化可能与重组、复制和移位事件有关。番茄的c f 2 、 c f 9 基因是由一串5 个或更多的基因组成的，两个几乎一样的c f 2 基因编码c f 2 ， 对基于同源序列候选基因法克隆r 基因的探讨 的抗性专化型。对t m v 抗性的分析认为在n 座位上有一串相关基因。番茄的p t o 基因座位含有5 个p r o 同源基因和一个n ，基因。在亚麻中和基因座位是不 连锁的，但由密切相关的t i r n b s l r r 类型r 基因组成。基因座位是单拷贝 的，有1 3 个不同的等位基因，基因座位是多拷贝的，有1 5 个连锁成员。通过 对3 个自然发生的突变体特征的分析表明，这些突变体是由于重复的l r r 结构 区域发生重组而产生的。 5 植物抗病基因的应用 随着越来越多的抗病基因被克隆和植物转基因技术的不断完善，人们可以从 容地进行抗病基因工程操作 7 = - 1 2 1o 通过转基因技术已经将烟草的基因转入番茄， 将番茄的p r o 基因转入烟草，分别获得了抗烟草花叶病毒的番茄和抗丁香假单孢 杆菌的烟草。将番茄c f - 9 基因分别转入烟草和马铃薯，获得的转基因植物用 c l a d o s p o l - i u mf u v u i i 的a v r 9 多肽处理时，在叶片上形成坏死斑。这些结果表明 不同植物问r 基因介导的信号传导途径( 或其成员) 是保守的。最近研究表明，n p r l 基因是拟南芥抗病反应中的一个关键基因，通过诱导该基因的大量表达可以引发 一系列的防卫反应，且对植物本身并不产生不良的影响。但是，单个基因的转移 可能不会完全适应异种植物中的新环境，因此较好的方法是大片段d n a ( 1 5 0 2 0 0 k b ) 的转移，大片段转基因技术的发展为抗病基因工程展示了美好的前 景。 8 一 河北农业大学硕士论文 引言 植物抗病基因( r 基因) 是植物与病原物相互作用的基础。植物抗病基因克 隆及结构研究对于深入理解植物与病原物的互作有着重要意义，同时也为利用基 因工程技术培育抗病的转基因植物提供可利用的基因。 转座子标签法和图位克隆法被证实是克隆r 基因的成功方法。自1 9 9 2 年以来， 研究者利用这两种方法从玉米、拟南芥、烟草、番茄、水稻和亚麻等9 种植物中 陆续克隆了2 0 多个r 基因。通过对这些r 基因编码的蛋白质( r 蛋白) 结构研究 发现，符合基因对基因关系的r 基因可分为n b s l r r ，l r r t m ，l r r 一蛋白激酶和蛋 白激酶4 种类型( 其中n b s - l r r 类占已克隆r 基因的5 0 以上) 。在n b s l r r 类r 基因中具有一些相对保守的序列，这为基于同源序列的候选基因法 ( h 0 m 0 1 0 9 y _ b a s e dc a n d i d a t eg e n em e t h o d ) 克隆r 基因提供了基础。 1 9 9 6 年，研究者开始试图利用该方法克隆r 基因。l e i s t e r ( 1 9 9 6 ) 根据拟南 芥r p s 2 和烟草基因编码蛋白质中n b s 区域共有的保守序列g g v g k t t 和g l p l a l 合成寡核苷酸引物对马铃薯基因组d n a 进行扩增，得到的抗病基因类似序列r g a 被定位到马铃薯抗线虫基因g r 0 2 抗晚疫病基因亓，位点附近；同年y u 根据拟南 芥r p s 2 和烟草 ，基因编码蛋白质中n b s 区域共有的保守序列g ( m p ) g g v g k t 、 s p i i i t t r ( n 基因) 和c k c v l a f t t r ( 肥馏基因) 合成引物，对大豆基因组d n a 扩 增，得到“个r g a ，其中5 个定位于大豆抗病基因r s v l r p v , r p s l , r p s 2 , e p s 3 和 r m d 附近。1 9 9 8 年c o l l i n s 又利用r 蛋白中n b s 区的保守序列g v g k t t ，g l p l a l ， k q c f h c s i 等6 个不同的位点设计合成引物，利用巢式一p c r 技术扩增玉米基因组 d n a ，得到了1 1 个r g a ，其中两个被定位到玉米抗锈病基因r p 2 和r p 3 位点附近。 李子银利用r 基因中的保守序列g g v g k t t 和g l p l a l 合成引物，在水稻c d n a 中扩 增并获得了3 个r g a 这些r g a 和已克隆的一些抗病基因( c 肋lr p $ 2 , r p m l 等) 的同源性在4 5 6 0 之间。薛勇彪利用同样的保守序列合成简并引物。从水稻基 因组d n a 中扩增得到了6 个r g a ，这些r g a 和r p s 2 , c r p m l 的同源性都在3 5 以 上。近6 年的研究结果表明，利用该方法从玉米、大豆、水稻等植物中获得了相 当多的r o a ，且部分r g a 被定位在已知r 基因的附近或与已知r 基因共分离但是 还没有克隆出一个真正的r 基因或r 基因片段。分析其原因可能有以下几个方面： 9 对基于间源序列候选基因法克隆r 基因的探讨 1 研究者所选保守序列多位于n b s 结构域中，使扩增结果受到其它编码含 n b s 结构域蛋白质基因的影响； 2 r 基因多以基因家族形式在基因组中成簇存在在没采用近等基因系获得 r g a 的情况下，即使一些r g a 已被定位在已知r 基因的附近或和已知r 基因共分 离，但仍不能断言它就是要克隆r 基因的片断，因为r g a 也可能是要克隆r 基因 附近其它未知基因的一部分。 最近研究指出，g l p l 和c f l y ( 两者相距约7 0 个氨基酸) 是n b s l r r 类r 基 因所编码蛋白质特有的两个保守序列因此，针对上述情况，我们采用两套玉米 抗大斑病肌基因近等基因系为材料，在假设t 基因属于n b s l r r 类r 基因的前 提下，以保守序列g l p l 和c f l y 为依据设计合成所有可能的简并寡核苷酸引物( 正 义引物1 6 个，反义引物8 个，组成1 2 8 个组合) ，对基于同源序列的候选基因法 克隆r 基因作进一步的探讨。 i o 河北农业大学硕士论文 材料和方法 1 材料 1 1 材料 玉米自交系0 h 4 3 ，o h 4 3 h t ，o h 4 3 h t z ；b 3 7 ，b 3 7 h t ，b 3 7 h t 2 ，由河北农业大学 植物保护学院真菌毒素实验室提供。 1 2 供试试剂及引物 1 2 i 试剂 玉米基因组d n a 提取所用试剂e d t a ，n a a c ，异丙醇由北京化工厂生产，n a c l ， 硼酸，冰乙酸由保定化学试剂厂生产，s d s 由天津化学试剂二厂生产，氯仿由天 津( 香港) 新通精细化工有限公司生产，t r i s 一饱和苯酚由经科试剂公生产，无水 乙醇由天津津沽工商实业公司生产，t r i s 由上海生工生物工程有限公司生产。 p c r 所用的t a qd n a 聚合酶，1 0 b u f f e r ，m g ”，d n t p ，m a r k e r 购自上海生 工生物工程有限公司，特异引物由上海生工生物工程有限公司合成。 1 2 2 引物 表2 随机引物 t a b l e2 s e q u e n c eo f t h er a n d o mp r i m e r u s e d 将上海生工合成的5 0 d 的引物每一管加适量无菌水，配制成5 0 p g p l 的贮存 液，用时稀释至l o p g 1 1 l 。 翌苎王旦塑生型堡垄茔里鲨塞堕垦苎里塑堡塑 表3 特异引物序列 t a b l e 3 s e q u e n c eo f t h es p e c i a l i z e dp r i m e r u s e d 氯端 注：i 为次黄嘌呤核苷酸 表4 特异引物序列 t a b l e4 s e q u e n c eo ft h es p e c i a l i z e dp r i m e u s e d 肽序列 引物1 4 6 9 7 1 4 6 9 8 1 4 6 9 9 1 4 7 0 0 1 4 7 0 l 1 4 7 0 2 1 4 7 0 3 1 4 7 0 4 1 4 7 0 5 1 4 7 0 6 1 4 7 0 7 1 4 7 0 8 1 4 7 0 9 1 4 7 1 0 1 4 7 1 1 1 4 7 1 2 肽序列cf ly 引物1 4 7 1 3 5 - a c aa a a a a ia t - 3 1 4 7 1 45 a c a 从a g a ia 1 ：3 1 4 7 1 5 5 - t a ia a ga 从 c a - 3 1 4 7 1 65 - t a i a g ga 从 c a 3 1 4 7 1 75 - t a ia 从 a a gc a 3 1 4 7 1 85 - t a i a g aa a g c a - 3 。 1 4 7 1 95 - t a i a a ga a g c a 一3 ! 2 ：!：兰些 垒q q丛鱼 曼垒2 ： 一 注：i 为次黄嘌呤核苷酸 1 3 主要仪器 1 2 河北农业大学硕士论文 e p p e n d o r fc e n t r i f u g e5 8 0 4 r 高速冷冻离心机( 德国e p p e n d o r f 公司生产) b i o m e t r ap c r 扩增仪( 德国b i o m e t r a 公司生产) 电热恒温水浴锅t d a 一8 0 0 2 ( 天津市中环科技开发公司) p h s 一2 5 型精密p h 计( 上海雷磁仪器厂) d y y r 1 3 3 a 型琼脂糖水平电泳槽( 北京六一仪器厂) d y y h 1 2 型电泳仪( 北京六一仪器厂) 7 5 2 型紫外光栅分光光度计( 上海分析仪器总厂) 电子天平( 精度1 1 0 0 0 ) ( 上海天平仪器厂) 紫外检测仪( 北京六一仪器厂，北京沃德生物医学仪器公司) 双蒸水发生器( 上海亚荣生化仪器厂) 2 方法 2 1 玉米苗的培养 将玉米自交系种子分别播种于直径l o c m 的花盆中( 每盆中1 0 - 1 5 粒种子) ， 在2 8 c 温室中培养1 0 天到玉米三叶期，待用。 2 2d n a 提取及检测 2 2 id n a 的提取 按照s h a r p ”3 1 等人提供的方法，并做适当的调整，具体步骤如下： ( 1 ) 称取玉米叶片4 5 9 ，在液氮中迅速研成粉末，转入5 0 m l 离心管中。 ( 2 ) 加入1 5 m i 的抽提缓冲液，1 0 的s d s 溶液。充分混匀，6 5 c 水浴中保 温3 0 分钟，期间数次振荡混匀。 ( 3 ) 加入5 m o l 1 的j ( a c 溶液5m l ，冰浴中放置3 0 分钟。4 c ，1 0 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟，转移上清液至另一离心管中 ( 4 ) 上清液中加入0 6 倍体积的异丙醇，混匀，冰浴中放置3 0 分钟，4 ， 1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清液，沉淀用乙醇洗涤后晾干，溶于5 0 0 ul 的t e 中， 加入8m o l l 的l i c l l 5 0 u1 混匀，冰浴中放置3 0 分钟，4 ，1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，转移上清液至另一离心管中。 ( 5 ) 上清液中加入1 0 m g m l 的r n a s ei3p1 ，3 7 c 水浴中放置2 小时。 ( 6 ) 依次加入等体积的苯酚，1 1 苯酚氯仿( v v ) ，氯仿抽提三次，以去除 蛋白质。 一1 3 一 对基于同源序列候选基因法克隆r 基因的探讨 ( 7 ) 上清液中加入两倍体积的无水乙醇， 分钟，弃上清，沉淀晾干后溶于适量的t e 中。 2 2 2d n a 的质量和浓度测定 在紫外分光光度计上测定o d z ”和0 d z ”值， o d ：。o d 2 ”值在1 7 2 0 之间符合要求。 沉淀d n a ，4 c ，1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 以0 d 。”o d m 比值检测d n a 纯度 核酸浓度按以下公式计算：d n a 浓度( g g 9 1 ) = o d 2 m 5 0 稀释倍数1 0 0 0 。 溶液配制均按分子克隆实验指南”“，精编分子生物学实验指南”，现 代分子生物学实验技术1 等著作中”有关章节进行。 2 3p e r 扩增体系及程序 2 3 1 扩增体系 反应总体系为2 5 9 l ，包括 无菌水1 7 7 9 l b u f f e r ( 1 0 ) 2 5 1 1 1 m 9 2 + ( 2 5 m m o l 1 )2 0 u l d n t p ( 1 0m me a c h ) 0 5 u 1 引物l ( 1 0m m o 1 ) 0 5 b i 引物2 ( 1 0m m o l 1 ) 0 5 l t a qd n a 聚合酶( 5 u i j _ 1 ) 0 3 | 1 1 模板d n a5 0 n g 若为随机引物的扩增，只有一个引物，即引物1 与引物2 相同。 2 3 2 扩增程序 ( 1 ) 随机引物( 表2 ) 扩增时采用常规的r a p d 反应程序( 见表5 ) ， 表sr a p d 扩增程序 t a b l e5 p r o g r a m o f r a p d ( 2 ) 特异引物( 表3 ) 扩增时采用l e i s t e r 所使用的反应程序( 见表6 ) 1 4 - 河北农业大学硕士论文 ( 3 ) 特异引物( 表4 ) 扩增采用的反应程序( 见表7 ) 。 表7 特异性引物p c r 扩增程序 t a b l e7p c r p r o g r a mo f t h es p e c i a l i z e dp r i m e r 2 4 扩增产物的电泳检测 2 4 i 琼脂糖凝胶的制备 ( 1 ) 取0 5 t b e 缓冲液，加入琼脂糖，使琼脂糖浓度为0 8 ，在水浴中 加热至琼脂糖完全溶解。 ( 2 ) 溶液冷却至6 0 c 左右，加入1 0 m g m l 的溴化乙锭( e b ) 2 p 1 充分混匀。 ( 3 ) 用吸管取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘后，放置梳子，梳子距底板0 5 1 o m m 。 ( 4 ) 将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中，避免出现气泡，在凝胶完全凝 固后，小心移去梳子和隔板。 2 4 2d n a 样品的检测 将凝胶放入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶约5 m m 。 d n a 样品( 2 5 p 1 ) 中加入l o p l 的上样缓冲液，用微量移液器充分混匀后 加1 5 2 0 p i 到样品槽中。 采用不高于5 v c m 的电压进行电泳，待溴酚蓝迁移到距凝胶前沿约l c m 时， - 1 5 对基于同源序列候选基因法克隆r 基因的探讨 停止电泳。 在紫外检测仪下检测扩增产物，记载试验结果，