（微生物学专业论文）pseudomonas+spm亚磷酸脱氢酶基因的克隆、表达和酶性质的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 亚磷酸脱氢酶参与生物体中亚磷酸的代谢，催化亚磷酸氧化成磷酸的同时 将n a d ( p ) + 还原为n a d ( p ) h 。在常见的各种辅酶再生系统中，亚磷酸脱氢酶具 有低值、基本无逆反应、产物磷酸高浓度下不抑制反应、较宽的p h 稳定性 等优点，这些特性决定其在工业生物催化的辅酶再生过程中具有较高的应用价 值和广阔的应用前景。 本论文从已报道的亚磷酸脱氢酶同源序列入手，以实验室保藏的若干细菌 为靶标，通过分子生物学方法从p s e u d o m o n a ss p m 菌株中克隆到亚磷酸脱氢 酶基因，构建亚磷酸脱氢酶基因重组表达质粒，通过诱导表达和亲和层析纯化， 获得重组亚磷酸脱氢酶，进而研究了该亚磷酸脱氢酶的性质。 该亚磷酸脱氢酶基因由1 0 1l b p 个核苷酸组成，编码3 3 6 个氨基酸残基序列。 分析基因的上下游序列发现，上游基因为p t x c 基因，下游基因为p t x e 基因， 这说明该亚磷酸脱氢酶基因位于和p s e u d o m o n a ss t u t z e r iw m 8 8 同源的 p t x a b c d e 操纵子中。 将重组亚磷酸脱氢酶通过n i - n t a 亲和层析纯化，获得了高纯度的酶液。 纯化后的亚磷酸脱氢酶在s d s p a g e 中显示为单一的条带。通过与标准蛋白的 比较计算，测定重组酶的分子量为3 5 k d a 。 系统研究了重组亚磷酸脱氢酶的各项性质，包括最适反应温度、最适反应 p h 、热稳定性、p h 稳定性和稳态动力学研究。结果发现：重组酶的最适反应 温度为4 0 0 c ，在p h7 0 的m o p s 缓冲液中不同温度处理3 0 r a i n 后，测定残余 酶活力，结果发现重组酶在4 0 0 c 以下稳定；重组酶的最适p h 值为7 o ，在不 同p h 条件下2 5 0 c 处理1 h 后测定残余酶活，结果发现该酶在p h7 0 处最稳定； 重组酶对亚磷酸钠的和如f 分别是0 6 3 3 士0 0 3 6m m 和2 0 5 74 - 0 0 1 8s 一，对 n a d 的和分别是o 1 7 14 - 0 0 1 3m m 和2 7 8 94 - 0 0 2 9s 一。 这些研究为工业生产提供了可靠的数据支撑，为进一步深入研究酶的催化 机理及酶蛋白三维结构研究奠定基础。 关键词：亚磷酸脱氢酶；辅酶再生；克隆；表达：重组蛋白；假单胞菌 浙江大学硕十学位论文 a b s t r a c t p h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s ei n v o l v e di nt h em e t a b o l i s mo fp h o s p h i t ei no r g a n i s m s ， i tc a t a l y z e do x i d a t i o no fp h o s p h i t ec o u p l e dw i t hr e d u c t i o no fn a d ( p ) + t og e n e r a t e n a d p h i nt h ec o m m o nu s e dc o e n z y m er e g e n e r a t i o ns y s t e m ，t h ep h o s p h i t e d e h y d r o g e n a s eh a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sl o wk m ，a l m o s tn or e v e r s er e a c t i o n ， h i g hc o n c e n t r a t i o no ft h ep r o d u c tp h o s p h a t ed o e sn o ti n h i b i tt h er e a c t i o n w i d ep h s t a b i l i t ye r e ，t h e s ep r o p e r t i e sb r i n ga b o u th i g h e ru s i n gv a l u ea n db r o a da p p l i c a t i o n p r o s p e c ti nc o e n z y m er e g e n e r a t i o np r o c e s so fi n d u s t r i a lb i o c a t a l y s i s i n t h i sd i s s e r t a t i o n ，w es t a r t e df r o mh o m o l o g o u ss e q u e n c e so fp h o s p h i t e d e h y d r o g e n a s e s ，u s i n gs o m eb a c t e r i ap r e s e r v e di no u rl a b o r a t o r ya st h et a r g e t ， c l o n e dp h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s eg e n ef r o mp s e u d o m o n a ss p ms t r a i nb ym o l e c u l a r b i o l o g ym e t h o d ，c o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i do fp h o s p h i t e d e h y d r o g e n a s eg e n e ，f i n a l l yg o tt h er e c o m b i n a n tp h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s eb y i n d u c i n ge x p r e s s i o na n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yp u r i f i c a t i o n ，a n dt h e nw es t u d i e d t h ed e t a i l e dp r o p e r t i e so ft h i sp h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e t h ep h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s eg e n ec o n s i s t so f101lb pn u c l e o t i d e se n c o d i n ga p e p t i d eo f3 3 6a m i n oa c i dr e s i d u e s t h eu p s t r e a mg e n ew a sp t x ca n dd o w n s t r e a m g e n ew a sp t x ei n d i c a t e dt h a tt h ep h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s eg e n ew a ss i t u a t e di n p t x a b c d eo p e r o n ，w h i c hi sh o m o l o g o u si np s e u d o m o n a ss t u t z e r iw m 8 8 r e c o m b i n a n tp h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s ew a sp u r f i e db yn i - n t aa f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i f i e dp h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s ed i s p l a y e das i n g l eb a n di n s d s - p a g e c o m p a r e dw i t ht h es t a n d a r dp r o t e i nm a r k e r , m o l e c u l a rw e i g h to ft h e r e c o m b i n a n te n z y m e sw a sc a l c u l a t e da s3 5 k d a t h ep r o p e r t i e so ft h i sr e c o m b i n a n tp h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s ew a si n t e n s i v e l y s t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s4 0o c ，a f t e rt r e a t i n g a td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sa tp h7 0i nm o p sb u f f e rf o r3 0 m i n ，r e s i d u a le n z y m e a c t i v i t yw a sm e a s u r e da n dw ef o u n dt h a tt h er e c o m b i n a n te n z y m ei sm o s ts t a b l e b e l o w4 0 。c ；i t so p t i m a lp hv a l u ei s7 0 ，a f t e rt r e a t e da td i f f e r e n tp ha t2 5 。cf o rlh ， w em e a s u r e dt h er e s i d u a le n z y m ea c t i v i t ya n df o u n dt h a tt h ee n z y m ei sm o s ts t a b l e i i 浙江大学硕十学位论文 a tp h7 o ；t h ek ma n dk c a tf o rp h o s p h i t eo ft h er e c o m b i n a n te n z y m ew e r eo 6 3 34 - 0 0 3 6m ma n d2 0 5 74 - 0 0 1 8s - 1 ，t h ek ma n dk c a tf o rn a dw e r e0 1 7 14 - 0 0 1 3 m ma n d2 7 8 9 - 4 - 0 0 2 9s - lr e s p e c t i v e l y t h e s es t u d i e sh a v ep r o v i d e dar e l i a b l ed a t as u p p o r tf o rt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n ， a n dh a sl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d yo ft h ec a t a l y t i cm e c h a n i s ma n d t h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo ft h i se n z y m e k e y w o r d s ：p h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e ，c o e n z y m er e g e n e r a t i o n ，c l o n i n g ，e x p r e s s i o n ， r e c o m b i n a n tp r o t e i n ，p s e u d o m o n a ss p 。一1 1 1 。一 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期yf 。年岁月7 学位论文版权使用授权书 日 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘鲎 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 争h 亳 导师签名： 止 j 签字日期：沙( o 年 弓月7 日签字r 期：义pc 吣年弓 气p 以 j 月驴日 浙江大学硕士学位论文 第1 章文献综述 2 0 0 3 年伊始，我国的工业化进程己进入重化工业阶段，化工行业己成为我国 的主导产业。化工行业在取得长足进步的同时，仍存在不少问题和障碍，严重制 约着我国化学工业的发展。目前我国大多数化工产品的生产采用的都是化学催化 过程，催化剂在化学工业中占有重要的地位，以催化作用为基础的化学合成品占 化工产品的6 0 。但是，催化过程中的有机溶剂和废弃催化剂都会带来环境问题。 而采用生物酶作为催化剂的生物催化过程，相比较于化学催化过程来说，具有更 高的效率和更少的污染。美国2l 世纪发展规划中预计，至u 2 0 2 0 年，通过生物催化 技术，将降低化学工业的原料、水资源和能量消耗3 0 ，减少污染物的排放 3 0 【1 1 。 工业生物催化技术己得到越来越多的关注。其中新型生物催化剂的开发是工 业生物催化研究的重点领域。很多化学反应中都涉及到价态的转变，这些价态的 转换离不开氧化还原酶类。在已知的5 0 0 0 多种六大类酶中，氧化还原酶占到了 2 7 ( h t t p ：w w w b r e n d a - e n z y m e s o r 曲。约9 0 的氧化还原酶催化时需要n a d ( p ) 或n a d ( p ) h 作为辅酶【2 3 】，辅酶价格较为昂贵，如果在生物催化过程中持续补充 辅酶，势必会带来生产成本的大幅度上升，甚至可能会超过最终产品的价格。因 此，氧化还原酶类的实际工业生产大规模应用，必须首先解决辅酶的供应问题。 1 1 烟酰胺辅酶再生研究进展 辅酶再生，即是通过辅酶的氧化态和还原态之间相互转变，使得生物催化体 系中氧化还原酶所需氧化或还原态的辅酶浓度保持恒定。烟酰胺辅酶再生的方法 主要有化学方法、电化学方法、光化学方法、酶法再生等。目前研究较多的是电 化学方法和酶法，最有应用前景的是酶法再生【4 ，5 1 。 在酶法再生中，辅酶再生系统的应用价值通过再生用酶及其底物的成本、再 生用酶的稳定性、再生用酶的催化效率、目标产物分离的难易程度等方面进行评 价【6 1 。其中再生用酶的催化效率通过t n ( m m o v e rn u m b e r ，单位时间内每摩尔辅 酶所能得到的目的产物的摩尔数) 和t t n ( t o t a lt u r n o v e rn u m b e r ，每摩尔辅酶所能 得到的目的产物的摩尔数) 进行评价【3 ，7 1 。通常，t n 值要达至l j l 0 2 1 0 5 时才能满足 一6 一 浙江大学硕十学位论文 实际工业应用的成本控制要求3 1 。 1 1 1 化学方法 n a d ( p ) h 的化学方法再生首选的还原剂是氢气，因为氢气价格便宜且在再 生过程中不会产生副产物。在由来源于t h e r m o a n a e r o b i u mb r o c l d i 的乙醇脱氢酶 催化的2 一庚酮还原为2 一庚醇的反应中， r u c l 2 ( t p p t s ) 2 2 被用于n a d p + 的再生。 研究表明，钉( i i ) 和铑( i i i ) 复合物对于利用氧气再生n a d p h 是有效果的，但是辅 酶的总转换数( t o t a lt u r n o v e rn u m b e r ，t 1 n ) 只有1 0 8 】。b h a d u r i 和m a t h u r 等人 9 】设计了一个水二氯甲烷的两相反应系统将铂羰基簇合物 s a f 】2 p t l 2 ( c o ) 2 4 】和l 一 乳酸脱氢酶催化的反应耦联，当丙酮酸：n a d + ： s a f 2 p t l 2 ( c o ) 2 4 】比例为6 0 0 ：1 0 ：1 时，经过4 8 h 反应后，反应体系中的丙酮酸叮以完全转化为l 哥l 酸。 目前来说，化学法再生烟酰胺辅酶所需的催化剂往往制备价格昂贵、方法复 杂，并且反应过程中有难于分离的副产物生成，因此化学方法较难应用于实际生 产中。 1 1 2 光化学方法 用可见光照射感光染料如亚甲基蓝、n 甲基吩嗪硫酸盐等可引起还原性辅酶 n a d ( p ) h 的氧化，这一反应可用于氧化型辅酶的再生。采用n a d 依赖的乙醇 脱氢酶和亚甲基蓝构建了一个n a d + 的催化循环系统，最终得到的1 n 为 1 1 2 5 1 0 1 。 可进行光合作用的生物如藻类和植物等，通过光合电子转移反应捕获光能， 催化n a d ( p ) 生成n a d ( p ) h 。有研究者提出，通过光合作用可不断产生n a d ( p ) h ， 那么就可以将其用于催化各种外源底物，以得到想要的物质。这样一来，太阳能 就可以直接用于生物转化人工底物。n a k a m u r a 和y 锄a j l a l ( a 【】发现，用日光灯照 射蓝藻s y n e c h o c o c c u se l o n g a m sp c c7 9 4 2 还原0 【，。【一二氟苯乙酮具有对映体选 择性。此外，光合作用抑制剂可以降低这种选择性。 一7 一 浙江大学硕上学位论文 1 1 3 电化学方法 电化学方法是通过电极超电势作用把辅酶氧化或还原到需要的状态。电化学 法再生辅酶最大的优势就是成本低，但是电极对辅酶的吸附作用会抑制氧化或 还原过程。选择合适的电极材料或进行预处理，可以降低吸附，从而有效地再生 辅酶【2 1 。 电化学法又分为直接电化学法和间接电化学法。直接电化学法是电子直接在 电极和辅酶间进行传递，直接法反应速度慢，选择性差，需要很高的超电势或负 超电势，容易导致电极污染，高电势也易使酶失活从而降低t 1 n 值眩】。为了使辅 酶的电化学再生能够在较低电势下进行，目前普遍采用间接电化学法，通过电子 媒介物在电极和辅酶间传递电子【l 引。 1 1 4 酶法 烟酰胺辅酶的酶法再生分为底物耦联法和酶耦联法。 底物耦联法( 图1 1 a ) 是在反应过程中添加氧化还原酶的另一辅助底物，前提 是酶催化目标底物和辅助底物所需辅酶的氧化还原态正好相反，在相同酶的催化 下实现目标底物转化所需辅酶的循环再生。这种再生系统使用简单，但是要求酶 能够同时作用于目标底物和辅助底物，通常会降低酶催化效率，而且辅助底物产 生的副产物也增加了目标产物的分离难度。此外，底物耦联的辅酶再生法不具有 普遍适用性，并不是所有的氧化还原酶都能找到合适的辅助底物。底物耦联的方 法进行辅酶再生主要应用在非常规的反应相中，如在气固相中酵母醇脱氢酶的 活性和稳定性比在水中耐1 4 1 ，或在有机相中使用n a d ( h ) 依赖的马肝醇脱氢酶【1 5 】 和来源于p y r o c o c c u s f u r i o s u s 的n a d p ( h ) 依赖的乙醇脱氢酣1 6 】。 酶耦联法( 图1 1 b ) 是利用两个氧化还原酶反应体系，其中一个酶催化底物转 化的同时消耗还原态或氧化态辅酶，另一个酶利用的辅酶形式和第一个酶相反。 在体系中，两个酶的底物应相对独立，以避免两个底物竞争同一酶的活性中心， 降低催化效率。酶耦联法再生的优点在于再生效率高，再生系统与合成系统比较 容易耦联，但由于整个反应体系复杂，中间过程较难控制【2 1 。 1 1 4 1n a d ( p ) h 的再生 再生还原性烟酰胺辅酶最方便和最有效的方法即是酶耦联法再生。 一8 一 浙江大学硕上学位论文 n a d ( p ) h 再生过程常用的的酶有醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e i l a s e ，a d h ) 1 7 1 、 甲酸脱氢酶( f o m a t ed e h y d r o g e n a s e ，f d h ) 1 8 ，19 1 、葡萄糖脱氢酶( 西u c o s e d e h y d r o g e n a s e ，g d h ) t 2 0 , 2 1 】、葡萄糖6 磷酸脱氢酶( g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e d e h y d m g e l l a s e ，g 6 p d h ) t ：2 2 1 、亚磷酸脱氢酶( p h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e ，p t d h ) ：2 3 之5 】 等。 底物in a d ( p ) h 副产物 底物in a d ( p ) h 副产物 1 4 标产物n a d ( p ) +底物1 1 日杯产物 n a d ( p ) +底物l l 合成系统 再生系统合成系统再生系统 ( 舢( b ) 图1 1 烟酰胺辅酶酶法再生示意图( a ) 底物耦联的辅酶再生( b ) 酶耦联的辅酶再生 f i g 1 - 1s c h e m a t i cd i a 蓼a mo fn i c o t i n a m i d ec o f a c t o rr e g e n e r a t i o n ( a ) c o f a c t o rr e g e n e r a t i o n b ys u b s t r a t ec o u p l i n gm e t h c d ( b ) c o f a c t o rr e g e n e r a t i o nb y 即z y m ec o u p l i n g 埘e t h o d 以上几种再生体系各有其优势和不足之处，可根据不同的用途选用不同的辅 酶再生体系( 表1 1 ) 。亚磷酸盐脱氢酶是近年来新发现的一种酶，在常见的各种 辅酶再生系统中，亚磷酸脱氢酶具有低值、基本无逆反应、产物磷酸高浓度 下不抑制反应、较宽的p h 稳定性等优点，这些特性决定其在工业生物催化的辅 酶再生过程中具有较高的应用价值和广阔的应用前景。 1 1 4 2 n a d ( p ) + 的再生 氧化型辅酶n a d ( p ) + 的再生常用的酶有醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ， a d h ) 【2 6 1 、谷氨酸脱氢酶( g l u t 锄a t ed e h y d r o g e n a s e ，g l u d h ) ：2 7 1 、乳酸脱氢酶( 1 a c t a t e d e h y d x o g e n a s e ，l d r i ) t 2 8 】和n a d h 氧化酶( n a d ho x i d a s e ) 【2 9 1 。 a d h 和l d h 尽管酶和氧化剂价格便宜，但两者的氧化电势较低，反应速度 慢，在a d h 体系中，没有及时排出的乙醛会干扰酶活性。在三种脱氢酶再生系 统中，谷氨酸脱氢酶再生体系被认为是相对较好的，具有较高的氧化电势且稳定 一9 一 浙江大学硕十学位论文 性好，底物和产物对酶活性无影响。但是总体来说，这三种脱氢酶系统的再生效 率都很低，达不到实际应用的要求。 表1 1n a d ( p ) h 再q t ：常用的酶体系2 1 3 】 t a b l e1 - 1c o m m o n r e g e n e r a t i o ns y s t e m so f n a d ( p ) h 1 0 一 浙江大学硕士学位论文 1 2 亚磷酸脱氢酶研究现状 亚磷酸脱氢酶( e c1 2 0 1 1 ) ，原命名p h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e ，现己被改名 为p h o s p h o n a t ed e h y d r o g e n a s e ，属于d - 2 - 羟酸脱氢酶家族( d 一2 - h y d r o x ya c i d d e h y d r o g e n a s e ) 2 6 】，是d 2 羟酸脱氢酶家族中唯一可以以无机物作为底物的成 员。亚磷酸脱氢酶在氧化亚磷酸生成磷酸的同时可再生n a d ( p ) h ( 图1 2 ) 。 k + 删p 广一一o | i | 一十一h n p h o s p h i t ep h o s p h a t e 图1 - 2 亚磷酸脱氢酶催化的反应 f i g 1 - 2t h er e a c t i o nc a t a l y s e db yp h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e 1 2 1 亚磷酸脱氢酶的发现 自然界中，还原性磷化合物广泛存在于许多生物体中，也有许多可以氧化低 价态磷的微生物被报道【2 7 1 ，但是人们对于还原态磷化合物的氧化代谢的遗传和 生化机制知之甚少。 m e t c a l f 和w o l f e 【2 8 】予19 9 8 年在假单胞菌p s e u d o m o n a ss t u t z e r iw m 8 8 中首 次发现了生物体中还原态磷化合物的氧化代谢途径，并克隆出次磷酸和亚磷酸代 谢的相关基因。将p s e u d o m o n a ss t u t z e r iw m 8 8 中涉及到亚磷酸氧化的基因簇敲 除后，p s e u d o m o n a ss t u t z e r iw m 8 8 既不能氧化次磷酸，也无法氧化亚磷酸；将次 磷酸氧化的基因簇敲除后，不影响菌体氧化亚磷酸。这表明，p s e u d o m o n a ss t u t z e r i w m 8 8 中还原态磷化合物的代谢分两步走，首先从次磷酸开始，中间经历了亚磷 酸，最终产物是磷酸。 参与亚磷酸代谢的基因由p t x a b c d e 五个基因组成，形成一个独立的操纵 子( 图1 3 ) 。p t x a ，p t x b 和p t x c 可能编码一个结合蛋白依赖的亚磷酸转运蛋白， p t x a b c 转运蛋白和大肠杆菌中的膦酸转运蛋白p h n c d e 具有同源性。p t x d 编码 的亚磷酸脱氢酶氧化亚磷酸生成磷酸，p t x d 和d 2 羟酸脱氢酶家族的其他成员 大约有2 7 3 3 的序列一致性，具有保守的n a d 结合位点和催化活性中心。 浙江大学硕士学位论文 p t x e 可能编码一个l y s r 家族的转录调控因子【2 8 1 。p t x a 和p t x b 、p t x d 和p t x e 之 间有几个碱基重叠。 图1 - 3p t x a b c d e 操纵子基因结构 f i g 1 - 3g e n eo r g a n i z a t i o no f p t x a b c d eo p e r o n w i l s o n 和m e t c a l f 2 9 j 于2 0 0 5 年报道了另一株具有还原性磷化合物氧化途径的 细菌，鉴定为粪产碱杆菌a l c a l i g e n e s f a e c a l i sw m 2 0 7 2 。通过转座子突变技术确定 t a l c a l i g e n e s f a e c a l i sw m 2 0 7 2 中参与氧化次磷酸和亚磷酸的基因，其中编码次磷 酸双加氧酶的h t x a 基因与p s e u d o m o n a ss t u t z e r iw m 8 8 中的h t x a 基因核酸序列 1 0 0 一致，而编码磷酸次磷酸转运蛋白h t x b c d 基因和来自于p s e u d o m o n a s s t u t z e r iw m 8 8 中的同源基因在核酸水平上具有9 8 的一致性，这表明了基因水平 转移的发生。p t x d 和h t x a 基因分别编码辅酶n a d 依赖的亚磷酸脱氢酶( p t x d ) 和2 酮戊二酸依赖的次磷酸双加氧酶( h t x a ) 。但是两株菌之间的p t x d 和p 饮e 在 氨基酸水平上分别只有5 2 和3 4 的一致性。a l c a l i g e n e s f a e c a l i sw m 2 0 7 2 中的亚 磷酸脱氢酶可能代表了另一条新i 拘p t x d 进化途径。 1 2 2 亚磷酸脱氢酶的理化性质 c o s t a s 和m e t c a l f 等【2 5 】与2 0 0 1 年首次对p s e u d o m o n a ss t u t z e r iw m 8 8 中亚 磷酸脱氢酶进行了详细的生化性质的研究。他们将p t x d 基因克隆至表达载体后 于大肠杆菌中异源表达，异源表达的酶和直接从野生菌中纯化的酶分别用质谱、 氨基酸末端测序和酶性质分析检测并没有明显区别，纯化后的重组酶和野生型酶 经排阻层析分析都是同源二聚体。亚磷酸脱氢酶对底物有较高的亲和力，其对亚 磷酸和n a d 的值分别是5 3 14 - 6 71 t m 和5 4 64 - 6 7l x m 。以6m m 浓度的 n a d p 作为辅酶的活性只有以1m mn a d 作为辅酶活性的7 1 ，这表明该亚磷 酸脱氢酶对于n a d p 的亲和力很低。 一1 2 浙江大学硕十学位论文 亚硝酸、甲酸、甘油酸、d 2 羟基4 戊酸甲酯、d 3 磷酸甘油酸、羟基异己 酸、甲基膦酸酯、氨乙基膦酸酯、乳酸、亚砷酸、次磷酸、亚硫酸等都不能作为 亚磷酸脱氢酶的底物。其中亚硫酸是酶的强抑制剂；亚硝酸、甲酸、甘油酸、 d 2 羟基4 戊酸甲酯、羟基异己酸和亚砷酸部分抑制酶活；辅酶的结构类似物 a t p 、a d p 、a d p 核糖和n a d p 是弱抑制剂；a m p 和反应产物磷酸不抑制酶活 性【2 5 1 。 和其他的n a d 依赖的脱氢酶不同的是，在亚磷酸脱氢酶整个催化过程中， 没有观测到逆反应。从热力学的角度分析，在p h7 0 的条件下，磷酸亚磷酸的 还原电势为6 5 0 m v ，n a d h n a d 的还原电势为3 2 0m v ，由此计算出的a g o ，= 6 3 3 2k j m o l ，可见由亚磷酸脱氢酶催化的反应是一个明显的放能反应。根据 a g o 可计算出正反应的反应平衡常数为1 3 4 x1 0 ，在生理条件下，这个反应基 本上是不可逆的。而工业上辅酶再生常用的来源于c a n d i d ab o i d i n i i 的甲酸脱氢 酶平衡常数为7 x 1 0 5 ，远远低于亚磷酸脱氢酣6 1 。 氨基酸序列比对显示亚磷酸脱氢酶属于d 2 羟酸脱氢酶家族，这一家族中活 性中心的h i s 2 9 2 、g l u 2 6 6 和m 四3 7 对于催化活性是必需1 拘 3 0 , 3 1 】。这三个位点的氨 基酸在所有的家族成员中都是保守的，只有一个酶例外，甲酸脱氢酶的g l u 对应 位点的氨基酸由g l n 代替【3 2 1 。 1 2 3 亚磷酸脱氢酶的催化机理 将亚磷酸脱氢酶h i s 2 9 2 定点突变后的突变体均完全失活，h i s 2 9 2 的作用可能 是使作为亲核试剂的水去质子化。g l u 2 6 6 并没有明显增力h h i s 2 9 2 的p k a 来增强 h i s 2 9 2 与底物结合和催化效率；与野生型相比，g l u 2 6 6 g l n 突变体的如，增加，但 不同p h 下反应速度趋势不变。在亚磷酸脱氢酶中，g l u 2 6 6 的作用有可能是通过 与h i s 2 9 2 和a r 9 2 3 7 形成氢键后，正确定位h i s 2 9 2 和a r 9 2 3 7 。对a r 9 2 3 7 突变为l e u , l y s ，h i s ，a n dg i n 的突变体进行动力学分析，结果显示a r 9 2 3 7 的作用与其在其他 d 2 羟酸脱氢酶的作用相同，都是参与底物的结合，a r 9 2 3 7 可能和亚磷酸上离子 化的羟基基团相结合。同源建模结果显示出可能l y s 7 6 也参与底物的结合【3 3 】。后 续的研究结果显示，a s p 7 9 和a 玛2 3 7 形成的氢键可能有助刁：a r 9 2 3 7 和亚磷酸的结 z k 3 4 1 口 。 一13 浙江大学硕士学位论文 对亚磷酸脱氢酶初始反应速度的研究表明，p t x d 催化的反应属于连续有序反 应机制( s e q u e n t i a lo r d e r e dm e c h a n i s m ) ，即酶首先和辅酶n a d 结合后才和底物亚 磷酸结合，而产物的释放则是先释放磷酸，后释放n a d h 2 5 1 。停流动力学和预稳 态动力学同位素效应实验都表明，氢转移的速度决定了亚磷酸脱氢酶反应的速 度，是整个反应的完全限速步骤 3 4 , 3 5 】。 1 3 未知序列基因的克隆策略 克隆已知序列基因，方法比较简单，只需要根据基因的开放阅读框，于起始 密码子和终止密码子的位置各设计一对引物，即可通过p c r 将全基因扩增出来。 而未知序列基因的克隆，目前的方法主要分为两大类：1 ) 基于表型或功能的筛选 方法，如转座子插入突型3 6 1 、构建基因文库进行筛选【3 7 1 、酵母双杂型3 8 1 等；2 ) 基于序列的筛选方法，如差异显示m r n a 3 9 1 、抑制消减杂交p c r t 矧、简并p c r 4 1 1 、 外显子捕获p c r 4 2 】等。这两类方法的选择各有利弊，第一类方法很容易得到目 的基因的全部序列，但是在操作时较为复杂，消耗时问较多，而且需要有高通量 的对功能或表型的筛选方法；而第二类方法操作简单，省时省力，但是大多数时 候很难一次性获得未知基因的全长。目前来说，大多数实验室都不具备第一类方 法所需的高通量筛选的条件，因此第二类方法更受欢迎。 通过基于序列的筛选方法得到目的基因的部分序列之后，可以根据这段设计 探针与文库杂交得到目的基因的侧翼序列，也可以通过各种基于p c r 技术的各 种染色体步移方法，如反向p c r 4 3 1 、锚定p c r 4 4 1 、c d n a 末端快速扩增技术 r a c e 4 5 1 、热不对称交错p c r 【4 6 ，4 7 1 等。随着各种p c r 技术的成熟和完善，倾向 于使用p c r 技术来获得未知基因的侧翼序列的研究者越来越多。 现在流行的一种未知基因克隆的基本流程为：首先根据已知的同源基因编码 蛋白的氨基酸保守区设计简并引物，利用简并引物克隆目的基因的部分序列，然 后再通过反向p c r 或者t a i l p c r 方法得到目的基因的侧翼序列。 在本研究中我们即是采用先通过简并p c r 获得亚磷酸脱氢酶基因的保守序 列，然后通过t a i l p c r 获得其两段侧翼序列。 _ 1 4 浙江大学硕士学位论文 1 3 1 简并p c r 随着越来越多的物种基因组测序完成，人们对基因的认识也不断深入，人们 发现不同物种中起源于同一个共同的祖先基因的一些基因通常保持相同的或相 似的功能，这些基因称为种间同源基因。这些基因的序列之间存在着高度同源区 域。通过比较很多同源蛋白的氨基酸序列，就会找到蛋白质的保守序列和可变序 列。根据保守氨基酸序列，就可以设计引物克隆其他的同源基因。 简并p c r 的基本原理就是在不知道目的基因序列的情况下，根据已知的氨 基酸或者是同源氨基酸的保守区序列设计的一对带有简并性的引物。由于简并 p c r 事先不需知道待扩增基因片段的核酸序列，因此该项技术在新基因克隆、 基因表达检测、病毒检测等多个领域都有广泛的应用。 简并p c r 所用的引物与常规p c r 的不同之处在于其引物实质上是由多条寡 聚核苷酸组成的混合引物库。简并p c r 成功的关键就在于引物简并性的选择， 一般来说，选择的同源氨基酸序列的简并度要尽量的低，最好不要高于1 0 0 0 0 。 减少引物简并性的方法主要有：在最保守区简并度高和次保守区简并度低的氨 基酸序列两者之问选择后者；用次黄嘌呤代替d n t p ，次黄嘌呤可以任意核苷 酸配对，一个次黄嘌呤可以将引物库简并性降低3 4 ，缺点是引物合成价格高； 同一保守区使用多条简并引物；保守区最后一个氨基酸只取f j 两个密码子： 考虑目的基因来源物种的密码子偏好性来降低简并度。 1 3 2 热不对称交错p c r ( t a i l p c r ) t a i l p c r ( t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r ) 技术是一种可以用来高效 克隆已知序列侧翼的未矢i d n a 序列的技术。该技术f l 了l i uy a o g u a n g 等j k 4 7 1 于 19 9 5 年首次应用于分离粘粒载体和酵母人工染色体插入片段末端序列。 t a i l p c r 是利用一系列特异性的巢氏引物和一个短的随机引物( a r b i t r a r y p r i m e r ) 引导扩增已知序列侧翼序列的反应，它是一种半特异性的p c r ，由于两 类引物的退火温度不同从而可以通过控制反应过程的退火温度，从而有效地控制 特异性和非特异性产物的扩增。 在t a i l p c r 中，特异性引物的退火温度高，因此在p c r 反应中退火温度 的高低对其没有影响，而非特异的引物仅能在退火温度较低时才能与模板发生退 一15 浙江大学硕士学位论文 火，通过高低退火温度交替进行，使目的基因得到有效扩增。 t a i l p c r 一般可分为三轮p c r 反应( 图1 4 ) 。第1 轮p c r 反应由5 次高退火温 度、1 次低退火温度由低至高、1 0 次低退火温度和1 2 次热不对称的超级循环构成。 首先通过5 次高温退火的反应，使特异性引物s p l 与已知的序列退火配对并延伸， 通过单引物扩增提高目标序列的浓度。1 次退火温度由低逐渐升高的反应使简并 引物结合到较多的目标序列上，l o 次低温退火使两种引物均能与模板退火。然后 经过1 2 次超级循环后，可得到三种类型的产物：由特异性引物和简并引物扩增 出的产物；由同一特异性引物扩增出的产物；由同一简并引物扩增出的产物。 三种产物中，只有产物是我们所需要的特异性产物，产物和都是非特异扩 增产物。第2 轮p c r 反应通过将第一轮反应的产物稀释10 0 0 倍作为模板，用特异 性引物s p 2 和i 随机引物a d 进行扩增，通过l0 次热不对称的超级循环，使特异性的 产物被选择性地扩增，而非特异性扩增产物被削减至极低的含量。第3 轮反应则 是将第2 轮反应的产物稀释1 0 0 0 倍作为模板，用特异性引物s p 3 和随机引物a d 进 行p c r 扩增，一般为普通p c r 的条件。通过上述3 轮p c r 反应可获得已知基因序 列侧翼的d n a 序列，产物可直接用于测序或作为探针进行杂交。 t a i l p c r 方法和其他的染色体步移方法相比，具有7 个很明显的优点：简单 性、高特异性、高效性、高速性、无连接导致的假阳性、产物直接测序和高敏感 性【4 7 1 。 一1 6 浙江大学硕士学位论文 特异性 f 物 s p ls p 2 s p 3 弓两西 第一轮p c r 第：轮p c r l o 次超级循环 已知序列 5 次商退火温度 i 1 次退火温度从低虿离 1 0 冼低_ i i l 火溢度 i 1 2 次超毫! i 德环 舳 随帆弓i 物 争 未船序列 p c r 产物检测 i- j 一旷恻 特计忭产物i j 毽 产釜：商或中等( 不定检溅刊) | 特”怍产物i l 犁 产量：商i l i r 以检测到) 替铸肄性，弦物t it 帮 广日：诋( 小睦捡测剑) 特异竹：产物t 邳 产毋：商( 可以 c j ! 捌列) 1 f 特拧性产物l it 型 产置：报祗( 不能检测到) 销8 一p c r 产物拎测一笠蓑，篙絮晶榆一亢接胬删懈椿针 图l _ 4t a i l p c r 流程示意图 f i g 1 - 4s c h e m a t i cd i a g r a mo f t a i l - p c rm e t h o d 1 4 本研究的目的和策略 1 4 1 研究目的 亚磷酸脱氢酶可用于氧化还原酶生物催化过程中所需的还原型烟酰胺辅酶 的再生，具有广阔的工业应用前景。 本研究主要是以已鉴定的亚磷酸脱氢酶氨基酸序列设计保守区简并引物，从 p s e u d o m o n a ss p m 菌株中克隆到亚磷酸脱氢酶基因部分d n a 序列，然后通过染 色体步移获得其全长。进而在大肠杆菌e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) d ? 高效表达重组蛋白， 一1 7 一 _ 度 度 姐 ；荟 火 火 退