（植物学专业论文）鹅膏菌主要肽类毒素的检测分析、分离纯化与结构鉴定.pdf

摘要 利用反相高效液相色谱技术、质谱技术、核磁共振技术对鹅膏 菌主要肽类毒素进行了检测分析、分离纯化与结构鉴定。主要研究 内容有我国2 8 , e e 鹅膏菌与欧洲毒鹅膏主要肽类毒索的检测分析，四 种剧毒鹅膏菌不同组织部位的毒素分析，灰花纹鹅膏菌不同发育时 期、不同子实体大小的毒索分析，灰花纹鹅膏菌主要肽类毒素的分 离纯化，二种鹅膏毒肽的结构鉴定。研究结果如下： 1 通过高效液相色谱( h p l c ) 对我国2 8 种鹅膏菌与采集于德围的 毒鹅膏a m a n i t a p h a l l o i d e s 的主要毒素进行了比较分析，发现灰花纹 鹅膏菌( af u i i g i n e a ) ，致命鹅膏( a e x i t i a l i s ) ，黄盖鹅膏白色变 种( a j “b j u n q u i l l e av a t a l b a ) 和毒鹅膏( a p h a l l o i d e s ) 四种鹅膏菌 的毒素含量都较高，菌盖中其毒素含量依次为1 5 3 2 7 5 1 - i g g 、 7 7 8 0 3 “g g 、 1 0 1 3 9ug g 、7 6 3 2 4pg g 干子实体。另有1 0 个 种含有微量鹅膏毒肽，其含量在1 9 5 t ag g 1 5 1 2ug g 之间，其 它1 5 个种未检测到标样中的任何毒素。 2 对四种剧毒鹅膏菌不同部位的毒素分析表明：其毒素含量都 是菌盖中最高，在鹅膏毒肽与鬼笔毒肽两类毒素中，除a p h a l l o i d e s 外，在其它三种鹅膏菌中都是鹅膏毒肽类毒素的含量占优势，而鬼 笔毒肽类毒素的相对百分含量在这四种剧毒鹅膏菌中都是从菌盖到 菌柄到菌托依次增加。 3 灰花纹鹅膏菌不同发育时期的子实体毒素分析表明：以菌盖 尚未充分展开，内菌幕即将破裂时的毒索含量最高( 2 3 7 9 3 3 t g g ) ，在 凋萎时急剧降低( 4 6 7 4 9 b t g 9 1 ，只有最高时的1 9 6 5 。 4 灰花纹鹅膏菌不同大小子实体毒素分析表明：在子实体菌盖 直径不大于5 0 锄时，毒素含量随子实体菌盖直径的增大而增多。 但当子实体菌盖直径达7 。0c m 时，其总毒素含量反而有所下降。 5 对灰花纹鹅膏菌的四种主要肽类毒素进行了分离纯化，并 用质谱和核磁共振对两种鹅膏毒肽( c c a m a n i t i n 、1 3 - a m a n i t i n ) 进 行了结构鉴定。结果与文献报道的相一致。 关键词：鹅膏菌，肽类毒素，分离纯化，结构鉴定，核磁共振 a b s t r a c t t h e d e t e r m i n n a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n d c h e m i c a ls t r u c t u r eo f a m a t o x i n sf r o ma m a n i t aw e r es t u d i e d ，t h er e s u l t s ：r ef o ll o w 1 t h ea n a l y s i so fm a i np e p t i d et o x i nf r o m2 8s p e c i e sa m a n i t aw h i c h c o l l e c t e df r o mc h i n aa n da p h a l l o i d e sc o l l e c t e d f r o mg e r m a n ys h o w e d t h a ta m a n i t a f u i 7 i g i n e $ a e x i t i a i i s 。a s u b j u n q u i 7 7 e a s i m a i v a r a l b s ，e n d e m i c t oe a s ta s i a ，a n da p h a l l o i d e sc o n t a i n e dm a n y k i n d so ft o x i cp e p t i d e sa n dd i s p l a yav e r yh i g ha m o u n to ft o x i n s t h et o t a lc o n t e n to fp e p t i d et o x i n sa r e1 5 3 2 7 5ug g ，7 7 8 0 3ug g ， 1 0 1 3 9ug ga n d7 6 3 2 4ug gd r i e dw e i g h tc a r p o p h o r er e s p e c t i v e l y t h e s ef o u ra m a n i t a sm a yr e g a r da sl a t h e la m a n i t a s t h e r ea r en oa n y a m a t o x i n so fs t a r d a r ds a m p l e si no t h e rf i f t e e ns p e c i e s ，a n dt h e r e a r et r a c ea m a t o x i n si no t h e rt e ns p e c i e sa n dt h ec o n t e n t sw e r ea b o u t 1 9 5hg g 1 5 1 2ug gd r i e df r u i t b o d y 2 t h ec o n t e n ta n d d i s t r i b u t i o no ft h em a i na m a n i t o x i n sa n d p h a l l o t o x i n s i nt h r e et i s s u e s ( c a p ，s t i p ea n dv o l v a ) o ft h ef o u r l e t h e la m a n i t a sw e r ee v a l u a t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eh i g h e s t c o n t e n to ft o t a lt c x i n sw a sd i s p l a y e di nt h ep i l e u s t h et o t a lt o x i n s c o n t e n ti ns t i p ew a sl o w e r ，w h e r e a st h ev o l v ah a dt h el o w e s tc o n t e n t o ft o t a lt o x i n s t h ec o n t e n to fa m a n i t o x i n si sa l w a y sh i g h e rt h a n t h ec o n t e n to fp h a l l o t o x i n si na n yt i s s u e so ft h ef o u ra m a n i t a sb u t a p h a l l o i d e 量f u r t h e r m o r e ，t h er e l a t i v ec o n t e n to fp h a l l o t o x i n si s i n c e a s i n gf r o mc a pt os t i p et ov o l v a i ni nt h ef o u rl a t h e la m a n i t a s 3 t h et o t a la m a t o x i n sc o n c e n t r a t i o nf r o m c a r p o p h o r e o f a 。f u l i g i n e ac o l l e c t e di nd i f f e r e n td e v e l o p m e n ts t a g e sw e r es t u d i e d 。 t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e h i g h e s tc o n t e n to ft o t a la m a t o x i n s ( 2 3 7 9 3 3ug g ) w a sf o u n di nt h ec a r p o p h o r ew i t ht h ec a pf r e ef r o m v e i lb u tt h eg i l lc o n c e a l e db yv e i la n d t h el o w e s tc o n t e n to ft o t a l a m a t o x i n s ( 4 6 7 4 9ug g ) w a si nt h ec a r p o p h o r ew h i c hh a sw i t h e r e d t h ec o n t e n to fa m a t o x i n sd e c e n t r a p i d l yw h e n i ti s w i t h e r i n g 4 t h et o t a la m a t o x i n sf r o ma f u n g i n e ac a r p o p h o r ei nd i f f e r e n t si z ew o r est u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tw h e nt h ed i a m e t e ro ft h e c a r p o p h o r en om o r et h a n5 o c m ，t h eb i g g e rt h ec a r p o p h o r ei s ，t h e m o r em a i na m a t o x i n sc o n t e n ti s ，b u tw h e nd i a m e t e ro ft h ec a r p o p h o r e p i l e u sr e a c h7 o c m t h et o t a la m a t o x i n sc o n t e n td e c e n ti n s o m e d e g r e e 5 i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ff o u rm a i np e p t i d et o x i n sf r o m a f u i i g i e aw e r eu n d e r g o n eb ym e a n so fr p h p l c a n di d e n f i c a t i o no f t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f q a m a n i t i na n db a m a n i t i nb yn u c l e a r m a g n e t i cr e s o n a n c e ( n m r ) s h o w e dt h a tt h et h ec h e m i c a ls t r u c t u r ew e r e t h es a m ea st h er e f e r e n c e k e yw o r d s ：a m a n i t a ，a m a t o x i n s ，p h a l l o t o x i n s ，p u r i f i c a t i o n ，n i l r 一、引言 鹅膏菌是属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、鹅膏菌 科、鹅膏菌属( a m a n i t a ) 的一类高等担子菌。据c a b i ( 2 0 0 1 ) “1 报 道，全世界已记录6 2 3 种，是一个世界性分布的大属，大多有毒， 主要分布于热带与亚热带，为共生真菌，多与壳斗科等植物共生， 常常生于针阔叶混交林中，单生或群生。世界上误食毒蘑菇中毒事 件多是由鹅膏菌引起的“。湖南1 9 9 0 2 0 0 2 年发生的3 6 起2 0 5 例 中毒事件中，死亡8 3 人，其中灰花纹鹅膏菌中毒1 3 起9 6 例，死4 4 人，死亡率4 5 3 6 h 1 。 对鹅膏菌中毒素的研究已有一百多年历史，最早由德国s c h i - m e d e b e r g0 和k o p p er ( 1 8 6 9 ) ”1 从毒蝇鹅膏菌中提取出毒蝇碱。 德国k o t e r tr ( 1 8 9 1 1 8 9 3 ) 睢1 从欧洲毒鹅膏彳脚a l l o i d e s 中用乙醇 抽提出具有溶血性的p h a l l i n ，但对其组分与结构都末能阐明。 上世纪初，美国h o p k i n s 大学f o r d ( 1 9 0 3 1 9 0 9 ) 盯1 用醋酸铅沉淀 非毒素成分，用磷酸钨沉淀毒性成分，但速度慢，很不完全，只抽 提出总毒素的约1 。 德国f r e i b e r g 大学h e i n r i c hw i e l a n d 指导其学生r a a b ，jr e n x ， l y n e n ，v r i c hw i e l a n d 在1 9 3 0 年开始研究慢作用毒素阳，至1 9 3 7 年，他们在毒理实验和抽提实验中注意到三类毒存在，但在定名上 只确定为快作用毒索和慢作用毒素，并获得了快作用毒素结晶。二 战以后，t h e o d o rw i e l a n d ( 1 9 4 9 ) “眦接着工作，取得了不少成果。此 后，鹅膏毒素的研究在各个方面展开，世界上许多实验室也加入到 了这个行列中。 1 1 鹅膏菌肽类毒素的抽提 最先f o r d ( 1 9 0 9 ) 口3 采用磷酸铅、磷酸钨进行盐析沉淀，但效率 很低，r e n z ( 1 9 3 4 ) 凹1 年改进磷酸钨沉淀法而提高了产量。他在工作 中发现正丁醇能从样品水溶液中抽提毒素。l y n e n 、u r i c h w i e l a n d ( 1 9 3 7 ) 在抽提法中加入甲醇和氯仿作抽提剂。几经发展成为现在 一般采用的用5 0 甲醇作抽提剂。 1 2 鹅膏菌肽类毒素的检测 1 2 1 显色反应最早由h e i n r i c hw i e l a n d 与h a l i m a g e r ( 1 9 4 1 ) “”用 p a u l y 试剂检测毒素，在弱碱性时，同a m a n i t a 配对呈红棕色。 t h e o d o rw i e l a n d ( 1 9 4 9 ) “0 1 发现一种简单的办法，在干后的鲜菇汁液 上滴加浓h c i ，与a m a t o x i n 反应产生蓝色。t h e o d o r 于1 9 5 2 年“踟又 报道了用1 肉桂醛甲醇溶液在浓h c i 存在下，几分钟后p h a l l o t o x i n 先显棕黄色，后显浅蓝色，a m a t o x i n 显深紫色；s u l l v a n 等( 1 9 6 5 ) 1 将此法运用到薄层层析对毒素进行检测，提高了检测的灵敏度。 此外还有其它一些显色反应也可用于检测，但采用者很少。 1 2 2 层析检测技术t h e o d o rw i e l a n d 等( 1 9 5 2 ) “副首次采用纸层析 法分离测定毒素，用正丁醇：丙酮：水( 2 0 ：2 ：5 ) 作层析溶剂， 用1 肉桂醛在浓h c l 存在下的显色反应来检测；b l o c k ( 1 9 5 5 ) “6 1 修 正了此系统，采用甲基乙基酮：丙酮：水：丁醇( 2 0 ：6 ：5 ：1 ) 作层展液；后来，t h e o d o rw i e l a n d ( 1 9 6 0 ) “刀又把这个上行相系统改 为正丁醇：丙酮：水( 3 0 ：3 ：5 ) 。 1 2 。3 色谱检测技术l y n e n ，u r i c hw i e l a n d ( 1 9 3 7 ) n 1 首次采用a 1 。0 。 吸附层析法分离测定毒素并获得了p h a l l o i d i n ；t h e o d o rw i e l a n d ( 1 9 5 2 ) 发展了纤维素层析柱，层析柱所用检测手段均为紫外光谱吸 收法，此法只能定性到类，不能定性到种，且费时；b e u t h e r 和 d e rm a r d e r o r s i n 在1 9 8 1 年“”首次采用h p l c 检测鹅膏菌肽类毒素；意 大利的p a s t o r e l l o ( 1 9 8 2 ) “叩等用h p l c 检测q - a m a n i t i n ；墨西哥的 s i i r a ( 1 9 8 3 ) 心0 1 用h p l c 检测中毒人体生物液中的- a m a n i t i n 和b a m a n i t i n ；荷兰的r i e c h 等( 1 9 8 8 ) 。“用r p h p l c 检测中毒人体生物 液中的毒素；意大利t a g l i a r o ( 1 9 9 1 ) ”列用改进的安培计检测到体细 胞原生质体中的q - a m a ；湖南师范大学生命科学学院真菌研究室张 志光教授领导的研究组用h p l c 对鹅膏菌肽类毒素进行了多方面的研 究，发现东亚( 中国和日本) 特有种灰花纹鹅膏菌( a f u l i g e n e a ) 的 毒素含量特别高，李东屏( 1 9 9 7 ) o ”用h p l c 对a f u l i g e n e a 的主要毒 素进行了检测，陈作红等。们用h p l c 对所我国的四种鹅膏菌进行了毒 素检测；张晓元( 1 9 9 8 ) 。5 3 用h p l c 比较系统地研究了a 而j g i n e a 主 要毒素的检测，同时对鳞柄白毒伞( a v i r o s a ) 与白毒伞( a ，v e 2 7 7 a ) 的主要毒素进行了检测。张志光等报道了用抑芽法简便、快速测定 鹅膏多肽毒素的方法。 1 2 4 其它检测技术f l u m e ( 1 9 7 5 ) o o 和f a u l s t i c h ( 1 9 7 5 ) 。7 1 最先建立 起a m a t o x i n 的放射免疫检测( r a d i o i m m u n s a s s a y ，r i a ) 法；依据 a m a t o x i n 能专一性地抑制r n a 聚合酶i i 活性的特点，p r e s t o n ( 1 9 7 5 ) 2 8 1 建立了a m a t o x i n 的r n a 聚合酶i i 抑制检测法；s c h a f e r ( 1 9 7 7 ) 口鲫 依据鬼笔毒肽能专一地与丝状肌动蛋白结合而建立了p h a l l a t o x i n 的肌动蛋白结合检测法；h e i n r i c h 、w i e l a n d 、h a l l e r m a y e r ( 1 9 4 1 ) ”o l 最早用紫外线吸收光谱来检测毒素，发现a m a t o x i n 和p h a l l o i t o x i n 的紫外吸收不同，a m a t o x i n 的最大吸收值在3 0 7 n m ，而p h a l l o i t o x i n 的最大吸收值在2 5 7 n m ，此后，紫外吸收光谱成了一个常用的检测 手段：此外，质谱技术、核磁共振技术、旋光色散技术都有用于检 测毒素代谢产物的报道h ”。3 “。 1 3 鹅膏菌肽类毒素的分离纯化 鹅膏菌肽类毒素的分离纯化方法主要是采用层析的方法。最早 由l y n e n 和u l r i c hw i e l a n d ( 1 9 3 8 ) “”建立了氧化铝作固定相的层析 柱系统，纯化得到了二羟鬼笔毒肽( p h a l l o i d i n ) 。此后，t h e o d o r w i e l a n d ( 1 9 5 2 ) “钉发展了用s e p h a d e x g 2 5 作固定相的纤维素层析系 统，后用s e p h a d e x g 2 0 作固定相。为了获得微量组分，他先用硫酸 铵沉淀而达到富集毒素的目的( 1 9 6 7 ) 船“。y o c u m 在1 9 7 8 年。们制定了 一套分离纯化b a m a n i t i n 的柱层析程序，此程序中a m b e r l i t e a d - 4 作为一个脱盐的步骤；2 0 0 1 年曹福祥博士尝试用h p l c 来分离制备主 要鹅膏毒素获得成功口。 1 4 鹅膏菌肽类毒素的种类及分子结构 鹅膏菌肽类毒素包括鹅膏毒肽( a m a t o x i n ) 、鬼笔毒肽( p h a l l o t o x i n ) 和毒伞素类毒素( v i r o t o x i n ) 三类。其中a m a t o x i n 是一类双环八肽， 化学性质稳定，其基本结构如图卜1 。 重要鹅膏毒肽的化学式为： a - a m a n i t i n c 3 9 h 5 4 n 1 0 0 1 4 s4 h 2 0 ， 【w 9 9 0 ( 9 1 8 + 7 2 ) p a m a n i t i nc 3 9 h 5 3 0 1 。s3 h 2 0 ，m w 9 7 3 ( 9 1 9 + 5 4 ) y a m a n itin c 3 。h 5 4 n 1 0 0 l 。s4 h z 0 ，m w 9 7 4 ( 9 0 2 + 7 2 ) 天然a m a t o x i n s 共有9 神，各毒素的差别仅在于其侧链基团的 区别( 见表卜1 ) x 三 f f j 亨 卜0 卜c 。一n h c - - c o 阳 一一n i c 0 0 i 一一c o 一一n i f h 2 c c o 图i - 1 鹅膏毒肽的基本化学结构 表卜1 ：a m a t o x i n s 肽类毒素 【一a m a n i t i n “) b 一鹅膏毒肽 c h 。o h o h o ho ho h 0 5 ( b a m a n i t i n ) y 一鹅膏毒肽 c h 。o hn h 。o ho h 0 2 o 5 ( y a m a n i t i n ) e 鹅膏毒肽 c h 。o ho h o ho h 0 3 0 6 ( 一a m a n i t i n ) 三羟鹅膏毒肽 c h 。o h o h o hh o h 0 5 三羟鹅膏毒肽酰胺c h 。o ho h n h ：ho h ( a m a n i na m i d e 6 ) 二羟鹅膏毒肽酰胺c h 。h n h ： 0 h o h ( a m a n u l1i n ) 二羟鹅膏毒肽羧酸c ho ho h o h ( a m a n u n i ca c i d ) 0 5 2 0 2 0 二羟鹅膏毒肽酰胺原c h 。h n 儿 o hh 2 0 ( p r o a m a n u l1in ) “s y s t e m a t i c n a m e ：c l y c l i c ( l a s p a r a g i n y l t r a n s - 4 - h y d r o x y l p r o l y l 一( r ) 一4 ，5 - d i h y d r o x y l i s o l e u c y l 一6 - h y d r o x y 2 一m e r c a p t o l t r y p t o p h y l 9 1 y c y l l i s o l e u c y l 9 1 y c y l l c y s t e i n y l ) c y c l i c 一( 4 - 8 ) 一s u l f i d e 一( r ) - s - o x i d e “i n a v i r o s ao n l y 重要鬼笔毒肽的化学式为： p h a l l o i d i nc 。s 地批0 。s5 。0 m i v 8 7 8 ( 7 8 8 + 9 0 ) 7 叫 止ii 艮 p h a l o i nc 3 5 h 4 8 n 8 0 l 。s5 h 2 0 姗8 6 2 ( 7 7 2 + 9 0 ) p h a l lis i n c 3 5 h 4 8 n 8 0 】2 s5 h 2 0m w 8 9 4 ( 8 2 4 + 9 0 ) p h a l l a c i d i nc 3 7 h 5 d n 8 0 1 2 s j m w 8 3 1 p h a l l o t o x i n s 是一类双环七肽，该类毒素的基本结构式为： j c h r 3r 2 图1 2 鬼笔毒肽的基本化学结构 天然p h a l l o i d i n 目前已发现七种，同a m a t o x i n 一样，各毒素间 的差别仅在于其侧链基团的不同( 见表1 - 2 ) 。 v i r o t o x i n s 均为单环七肽，发现较迟，最早由f a u l s t i c h 在1 9 8 0 年。6 1 从鳞柄白毒伞中分离出来，其基本结构如图卜3 ： 氡叫篡篓： 图1 3毒伞素的基本化学结构 p p 叫 一叫 表1 2 ：p h a l l o t o x i n s 肽类毒素 目前已发现的毒伞类毒素共有6 种，同前两类一样，其区别仅是 侧链基团的不同( 见表卜3 ) 。 表1 3 ：v i r o t o x i n s 肽类毒素 毒伞素x r 1r 2 二羟毒伞素( v i r o i d i n )s 0 2c h ( c h 3 ) 2c h 3 脱氧二羟毒伞素d e s o x o v i r o i d i ns o c h ( c h 3 ) 2c h 3 丙氨酸羟毒伞素( a l a v i r o i d i n )s 0 2c h 3c h 3 丙氨酸脱氧二羟毒伞素s oc h 3c h ， ( a l a - d e s o x o v i r o i d i n ) 三羟毒伞素( v i r o i s i n )s o zc h ( c h 3 ) 2c h 2 0 h 脱氧羟毒伞素( d e s o x o v i r o i s i n )s o c h ( c h 3 ) 2 c h 2 0 h 重要毒伞素的化学式为： v i r o i s i n c 3 8 h 5 6 n 8 0 1 5 sm w 9 8 7 1 5 鹅膏菌肽类毒素的结构分析 a m a t o x i n 的化学结构和分子结构的研究，首先是通过研究这类多 肽的酸水解产物。“，测定其组成氨基酸，用阮内镍( r e n e yn i c k e l ) 处理毒素，确定了酚单元的存在( w i e l a n d1 9 5 2 ) “。线性次级多肽 9 可在滤纸上进行e d m a n 降解，这样取得的氨基酸可构建q a m a n i t a 具有一个2 一i n d o l e 硫醚横桥的分子结构式( w i e l a n dg e b e r t1 9 6 6 ) 口”，此结构式到1 9 6 8 年由f a u l s t i c h 完成。f a u l s t i c h 从紫外吸 收光谱出发，建议使用a m a t o x i n 亚砜结构。k o s t a n s e k 等f 1 9 7 7 1 9 7 8 ) 1 3 8 , 3 9 1 通过采用x 衍射分析进行了精确的校正。 p h a l l o t o x i n 类毒素中，由w i e l a n d ( 1 9 4 0 ) “”分离p h a l l o i d i n 的酸水解产物确定了其氨基酸组成。单环脱硫的p h a l l o i d i n 衍生物 可用弱酸水解p h a l l o i d i n 的一个肽键可获得。通过先水解p h a l l o i d i n 为线性多肽，然后再经e d r a a n 降解( w i e l a n d ，s e h o m1 9 5 5 ) “叩获 得结构式并稍作调整( w i e l a n d s c h n a k e l1 9 6 2 ) 4 1 1 ，此结构式为鬼 笔毒肽的结构式的基础。p h a l l o i d i n 及其衍生物的结晶非常薄，石棉 纤维形，不适于作x 衍射分析，故其三维结构分析只有采用 1 h n m r 分析和最少能量计算分析( p a t e l 等1 9 7 3 ) n ”。 i p e h k t 等( 1 9 8 9 ) 雎3 】用高场2 dn m r 技术分析了鹅膏毒肽( c 【。 b 一和y a m a n i t i n ) 的结构；p b s n z l i 和j t g e r i g ( 1 9 9 0 ) “”用1 h n m r 和分子动力约束分析了p h a l l a c i d i n 的构象；r b h a s k a r a n 和 c h i ny u ( 1 9 9 4 ) h 叫用2 dn m r 和分子动力约束分析了毒伞素的构象。 关于鹅膏毒素的结构分析以前大都是以欧洲的鹅膏菌a m a n n ap h a l l o i d e s 为材料进行分析而确定的，而国内对鹅膏菌肽类毒 索的种类测定只有不多的报道，都是通过与鹅膏菌毒素标样的p h l c 保留时间比较、作紫外吸收、打质谱分析其分子量和进行毒性毒理 实验同已有资料比较而确定m 。曹福祥博士( 2 0 0 1 ) 汹1 采用盐酸 水解法，氨基酸柱前衍生，r p p h l c 测定的方法对灰花鹅膏菌中的 几种主要肽类毒素进行过氨基酸组成的初步分析，但由于缺乏衍生 基酸的相应标样，没能对其氨基酸的组成作出全部确定。 1 6 该论文明究的目的和意义 由于误食毒蘑菇而引起的中毒事件大多数是由鹅膏菌所引起， 我国鹅膏菌种类相当丰富，迄今为止，我国鹅膏菌资源丰富，据杨 祝良统计达1 0 0 余种 5 1 , 5 2 但很多种类沿用了欧洲、北美的鹅膏菌 名称，如一些很重要的有毒鹅膏菌沿用了欧洲的毒鹅膏( a p h a l t o i d e s ) 、自毒伞( a v e r n a ) 、鳞柄自毒伞( a v i r o s a ) 等。 对于我国的鹅膏菌，哪些鹅膏菌有毒，哪些没毒，尚缺乏科学依 据。为此，本研究拟利用高效液相色谱技术对近年来采集于我国的 2 8 种鹅膏菌和采集于德国的毒鹅膏( a p h a l l o i d e s ) 中的肽类毒素 及其含量进行检测分析，对于摸清我国的有毒鹅膏菌资源、有毒蘑 菇中毒的预防和治疗具有很重要的意义。 我们调查发现，最近几年在我国南方发生的误食毒蘑菇引起的 中毒死亡事件主要是由灰花纹鹅膏菌口血，i g i n e a ) 、致命鹅膏 e x i t i a l i s ) 、黄盖鹅膏白色变种( a s u b j u n q u i l l e av a t a 舾a ) 所引 起，为此本研究拟对这3 种剧毒鹅膏与欧洲毒鹅膏( a p h a l l o i d e s ) 子 实体不同部位中的肽类毒素进行测定，进一步了解鹅膏毒肽和鬼笔 毒肽在子实体不同部位中的分布情况。 湖南师范大学生命科学学院真菌研究室已从灰花纹鹅膏菌中分 离纯化出了多种毒素，并通过标样毒素、质谱和氨基酸组成、毒性 毒理进行了确定，但未进行结构测定，为此本研究拟利用核磁共振 技术进行结构解析，进一步确定其化学结构。 二、材料与方法 2 1 材料 2 1 1 供试材料 表4 ：供试鹅膏菌的来源 编号鹅膏菌采集地点采集时间 n o + a m a n i t a s p e c i e s l o c a t i o n c o l l e c t i n gd a t a l 灰花纹鹅膏a m a n i t a f u l i g i n e ah o n g o 湖南长沙2 0 0 1 6 1 8 2致命鹅膏a e x i t i a l i sz h ul y a n g 一h l i广东广州2 0 0 1 3 3 0 3黄盖鹅膏白色变种as u b j u n q u i l l e as 1 m a iv a ta l b a z h u l y a n g湖南莽山1 9 9 7 7 2 5 4欧氏鹅膏a o b e r w i n k t e r a n az h uly a n g vd o i湖南莽山1 9 9 7 7 2 8 5欧氏鹅膏ao b e r w i n k l e r a n az h uly a n g yd o i广东广州1 9 9 8 9 0 2 6杵柄鹅膏a s i n o c i t r i n az h ul y a n g zhc h e n湖南莽山1 9 9 7 6 2 4 7异味鹅青a k o t o h i r a e n s i sn a g a s & m i t a n i湖南莽山1 9 9 7 7 2 4 8赤脚鹅啬a g y m n o p u s c o r n e r b a s湖南莽山1 9 9 6 7 1 5 9 狄疣鹅膏a g r i s e o v e r r u c o s a ，n o r ap r o v 湖南莽山1 9 9 7 7 2 1 1 0 格纹鹅膏a f r i t r i l l a r i a ( b e r k ) s a c c ， 湖南睦沙2 0 0 0 6 1 8 1 1 十红鹅膏a r u f o e r r u g i n c ah o n g o 湖南长沙2 0 0 0 6 1 9 1 2 锥鳞白鹅膏a v i r g i n e o i d e s b a s 湖南葬山 1 9 9 6 7 2 4 1 3 假褐云斑鹅膏a p s e u d 叩o r p h y r i ah o n g o 湖南长沙 2 0 0 0 6 1 8 1 4 隐花青鹅膏a m a n g i n i a n a s c n s b w fc h i u湖南莽山1 9 9 7 7 0 8 1 5变红鹅膏a r u b s c e n sp e r s ：f n湖南莽山1 9 9 6 ，7 ，2 1 i 6 残托鹅膏有环交种a s y c h n o p y r a m i sf s u b a n n u l a t ah o n g o 湖南莽山1 9 9 6 7 2 l 1 7 雀斑鳞鹅膏a a v e l l a n e 0 5 q u a m o s a ( a i m a i ) i m a i湖南莽山 1 9 9 7 7 2 8 1 8 白条盖鹅膏a c h e p a n g i a n a t u l l o s s & b h a n d a r y 湖南莽山 1 9 9 7 7 2 5 1 9 红黄鹅膏赫褐变种a h e m i b a p h av a r o c h r a c e az h u ly a n g 湖南莽山 2 0 0 0 7 0 7 2 0拟卵盖鹅膏a n e o o v o i d c ah o n g o湖南新邵2 0 0 0 6 2 0 2 1k 棱鹅膏al o n g i s t r i a t as m a i湖南莽山2 0 0 0 7 0 7 2 2 v i 本鹅膏a o a p o n i c a b a s 湖南莽山1 9 9 7 7 2 4 2 3本乡鹅膏近似种a c h o n g ob a s 、抛南莽山1 9 9 7 7 1 4 2 4 毒鹅膏a p h a l l o i d e s ( f n ) l i n k ， 德国帝宾根1 9 9 4 9 1 0 2 5粉褶鹅膏a i n c a m a t i f o l i az h ul y a n g删川西晶1 9 9 9 9 2 1 2 6 蚓托鹅膏ac c c i l i a c ( b c r t b l ) b a s湖南莽山 2 0 0 0 7 0 6 2 7扶托鹅膏av a g i n a t a ( b u l l ：f l ) l a m a r k湖南莽山2 0 0 0 7 0 7 2 8 锥鳞白鹅膏近似种a c ：f v i r g i n e o i d i sb a s 湖南莽山 1 9 9 6 7 2 9 2 9 褐盖鹅膏近似种a c f f i l v a ( jcs c h a e f f 】f r 湖南莽山2 0 0 0 7 0 8 3 0 小毒蝇鹅膏近似种a c f m e l l c i c e p sh o n g o 湖南莽山 1 9 9 7 7 0 3 灰花纹鹅膏菌于2 0 0 1 年、2 0 0 2 年6 7 月在长沙灰埠、福临铺 2 等地采集，采集后即进行冷冻干燥，贮存在冰箱中备用。a m a n i t a o b e r w i n k l e r a n a ( 广东广州) ，a i n c a v n a t i f o l i a 和欧洲的毒鹅膏 a p h a l l o i d e s 由杨祝良博士提供，其余由陈作红、张平、胡劲松等采 集，所有标本分别保存于湖南师范大学标本馆和中国科学院昆明植 物所标本馆。 2 1 2 毒素标样 q a m a n i t i n ，b a m a n i t i n ，p h a l l o i d i n ( p h d ) 购自美国s i g m a 公司，p h a l l a c i d i n ( p c d ) ，p h a l l i s i n ( p h s ) 和p h a l l o i n ( p h n ) 由德 国m a x p l a n ki n s t i t u tf u e rm e d i z i n i s c h ef o r s e h u n g 的h f a u l s t i c h 教授惠赠。 2 1 3 试剂 冰醋酸，醋酸铵、正丁醇为分析纯，甲醇，乙腈为色谱纯。 2 1 4 主要仪器 高效液相色谱仪为w a t e r sd e l t a6 0 0 ，填料为y e g c l 8 ，1 0 u m 的 反相柱，半制备柱为l o x 2 5 0 m m ，分析柱为4 0 3 0 0 o r m 。w a t e r s 2 4 8 7 紫外检测器，杭州英谱公司色谱工作站。 核磁共振仪为b r u k e ra m 一4 0 0 或d r x 5 0 0m r 型，t m s 为内 标。 质谱仪为v ga u t o s p e c 3 0 0 0 型。 2 2方法 2 2 1 鹅膏菌粗毒的提取 把鹅膏菌干子实体在烤箱中于6 0 7 0 烤干到恒重后粉碎。按 1 ：1 5 ( 克干子实体：m 1 ) 甲醇置于摇床上在室温下1 2 0 r m i n 抽提 1 2 小时，悬浊液4 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，取上清液保存于冰箱中， 沉淀同样再抽提一次，两次上清液合并，用航空汽油去脂二次，然 后进行冷冻干燥，冻干的样品用适量超纯水溶解，再用0 2 2um 的 微孔滤膜过滤，得不同鹅膏菌的粗毒抽提液。保存于冰箱中备用。 2 2 2 鹅膏菌肽类毒素的h p l c 检测分析、分离纯化 粗毒抽提液经反相h p l c 分析，采用分析柱进行检测分析，用半 制各柱进行分离纯化。洗脱液由a 、b 两相混合，a 相为1 0 的乙 腈+ 9 0 0 0 2 m 的醋酸铵：b 液为2 4 的乙腈+ 7 6 0 0 2 m 的醋酸铵。 用冰醋酸调节p h 值至5 0 。 检测分析的洗脱梯度为：0 1 5 m i n ，b0 5 ：1 5 3 5m i n ，b 5 - - 8 0 ，并保持5 m i n ：4 0 4 5 m i n ，b8 0 1 0 0 并保持5m i n ：5 0 5 5 m i n ，b1 0 0 一o ，并保持l o m i n ：流速为l - 0 m l m i n 。进样量 2 0u1 。 分离的洗脱梯度为：0 1 5 m i n ，b0 5 ：1 5 3 5m i n ，b5 8 0 ，并保持5 m i n ：4 0 4 5 m i n ，b8 0 1 0 0 并保持5 m i n ：5 0 5 5 m i n ， b1 0 0 0 ，并保持l o m i n ：流速为2 0 m l m i n 。进样量1 0 m l 3 5 】 为纯化用从下述洗脱梯度中筛选出综合效果比较好的方案。 方案一：采用分离粗毒抽提液的洗脱梯度； 方案二：0 2 0 m i n ，b0 2 0 ：2 0 3 0 m i n ，b9 0 5 0 ：3 0 4 0 m i n ，b5 0 8 0 ：4 0 - - - - * 4 5 m i n ，b8 0 一1 0 0 ，并保持5 m i n ：5 0 5 5 m i n ，b1 0 0 一o ，并保持l o m i n 流速为2 o m l m i n 。 方案三：0 1 0 m i n ，b0 2 0 ：1 0 - - * 2 0 m i n ，b2 0 5 0 ：2 0 3 0 m i n ，b5 0 6 0 ：3