（动物学专业论文）短蛸体表及粘液性免疫机制的研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：夏摇艳 导师签字 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂 圭l 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：王豇绝 签字日期：2 0 0 7 , 5 月多日 翮辩：迎彦 一 签字魄2 。7 年6 月加 山东师范大学硕士学位论文 短蛸体表及粘液性免疫机制的研究 摘要 自2 0 0 4 年3 月至2 0 0 7 年2 月，以我国南北沿海广泛分布的短蛸( o c t o p u s o c e l l a t u s ) 为研究对象，采用组织学、组织化学和生物化学技术，对短蛸外套膜、足、鳃和消化系 统等与外界海水密切接触的组织器官的免疫屏障机制进行了初步研究。 以阿新兰和过碘酸雪夫氏反应c a b - p a s ) 染色法显示了短蛸外套膜、足、鳃和消化 系统各器官中的粘液细胞，并对粘液细胞的类型和分布规律进行研究。根据a b p a s 显 色结果的不同，将其粘液细胞分为i - i v4 种类型，分别为p a s 反应阳性、a b 反应阴 性、呈红色、主要含中性粘多糖的i 型粘液细胞；a b 反应阳性、p a s 反应阴性、呈蓝 色、主要含酸性粘多糖的型粘液细胞；a b 和p a s 反应均为阳性、分别呈紫红色和蓝 紫色的型和型粘液细胞。 短蛸外套膜外上皮、腕外上皮和漏斗内外上皮均含有丰富的粘液细胞，外套膜4 种 粘液细胞均有，以和型为主，背面粘液细胞的密度小于腹面的。腕上皮皱褶处粘液 细胞密度较大，其它大部分区域密度较小，以n 型细胞为主，另有少量和型细胞； 吸盘外上皮有大量粘液细胞，也以型为主；漏斗内外上皮粘液细胞密度较大，基部以 型为主，其它部位以型为主。鳃丝上皮无粘液细胞，鳃轴上皮含少量i 型粘液细胞， 但整个鳃丝和鳃轴上皮均含a b 或p a s 反应阳性物质。短蛸食道、嗉囊和胃无粘液细胞 分布，但其中的护膜、粘膜层、粘膜下层及肌肉层中均含大量呈红色的中性粘多糖阳性 物质，肝胰脏腺管上皮也无粘液细胞，但上皮中及腺管腔中也有大量中性粘多糖阳性物 质。口膜、口球、胃盲囊、肠、直肠、肛f - j 俱u 瓣、前唾液腺和后唾液腺均有粘液细胞分 布，口膜外上皮内粘液细胞较多，多为n 型，胃盲囊侧褶基部粘液细胞较多，以i 型细 胞最多；侧褶中部小褶上的粘液细胞全为型；侧褶游离端粘液细胞则全为i 型；肠、 直肠和肛门侧瓣粘膜上皮内均有大量粘液细胞，多为型：前、后唾液腺内均存在大量 粘液细胞，其中前唾液腺中多为i 型和型，后唾液腺中型最多。粘液细胞的类型和 分布与其所在部位执行的功能有密切的联系。 采用组织化学方法显示了短蛸外套膜、足、消化系统和鳃等组织器官中2 种水解酶 酸性磷酸酶( a c p ) 和非特异性酯酶( n s e ) 及2 种氧化酶过氧化物酶( p o d ) 和酚氧化酶( p o ) 。2 种水解酶组化显示结果有许多共性，外套膜外上皮、腕外上皮、漏 斗内外上皮、鳃丝和鳃轴上皮、整个消化管粘膜上皮、唾液腺、肝脏腺小管和输出管上 皮均为a c p 和n s e 阳性或强阳性反应；各器官结缔组织阳性要弱一些，但其中均有阳性 或强阳性物质分散分布；各器官的肌肉组织也为阳性反应。p o d 在各器官的阳性要弱一 些，阳性物质的分布规律与2 种水解酶相似。p o 的分布规律明显不同，各器官的上皮几 乎均为阴性反应，阳性物质只在结缔组织中存在。食道、嗉囊和胃的护膜4 种酶显示结 山东师范大学硕士学位论文 果也不同，食道和嗦囊的护膜为n s e 极强阳性反应，胃护膜呈n s e 阳性；食道和嗉囊 的护膜星p o d 强阳性，而胃护膜为极弱阳性，但胃粘膜上皮细胞外有厚度约为7 1 5u m 的p o d 强阳性物质带；食道、嗦囊和胃的护膜为a c p 和p o 阴性反应。 采用生化方法检测了短蛸体表分泌的粘液及部分器官( 外套膜外上皮、鳃、食道、 嗉囊、胃、胃盲囊、肠) 匀浆液中的a c p 、n s e 和p o d 活力水平，在粘液和上述器官中 均检测到了3 种酶的活性，a c p 活力以鳃为最强，p o d 和n s e 活力水平以外套膜为最高； 酶活力最弱的器官在a c p 为胃盲囊、在n s e 为食道，在p o d 为鳃；粘液中3 种酶的活力 水平在8 种样品中均处于中等水平。 本实验结果表明，短蛸体表粘液和皮肤可通过a c p 和n s e 的水解作用、p o d - h 2 0 2 - 卤化物杀菌体系的作用及粘多糖的作用等多种途径水解和杀灭入侵的病原微生物而起 到很好的免疫屏障功能；与外界海水和病原微生物接触密切的鳃和消化系统各器官的上 皮等组织也均有很好的免疫防御功能；在体表免疫防御功能中，p o 应不起直接作用。 关键词：短蛸；粘液：外套膜；鳃；消化器官；免疫；头足类 分类号：q 2 6 2 山东师范大学硕士学位论文 s t u d i e so nt h ei m m u n em e c h a n i s mo fb o d ys u r f a c ea n dm u c u si n o c t o p u so c e l l a t u s a b s t r a c t f r o mm a r c h2 0 0 4t of e b r u a r y2 0 0 7 ，t h ei m m u n em e c h a n i s mo fo c t o p u so c e l l a t u s ， w h i c hd i s t r i b u t e de x t e n s i v e l yi nt h el i t t o r a lo fc h i n a , w a sp r i m a r i l ys t u d i e d t h ed e f e n c e b a r r i e rf u n c t i o no ft h em a n t l e f o o t , g i l la n dd i g e s t i v es y s t e mo fo c t o p u so c e l l a t u sw e 砖 s t u d i e dw i t ht h em e t h o d so fh i s t o l o g y , h i s t o c h c m i c a ll o c a l i z a t i o na n db i o c h e m i c a lt e c h n i q u e t h e s eo r g a n so i t i s s u e sw e r eo f t e nc o n t a c t e dt ot h es e a w a t e tc l o s e l y m u c o u sc e l l si nt h em a n t l e ，f 0 鸥百l la n dd i g e s t i v es y s t e mo fo c t o p u so c e l l a t u sw e r e o b s e r v e da n da n a l y z e db yt h em e t h o do fa b - p a s ( a l c i a nb l u ea n dp e r i o d i ca c i ds c h i f f r e a c t i o n ) c o m b i n e dp r o c e d u r e a c c o r d i n gt oc o l o r so f m u c o u sc e l l s ，t h em u c o u sc e l l sc o u l db e d i v i d e di n t of o u rt y p e s ：t y p ei ，p u r er e d , p r e s e n t e dp a sp o s i t i v er e a c t i o n , b u ta bn e g a t i v e r e a c t i o n , t h ec o n t e n to fn e u t r a lm u c o p l y s a c c h a r i d e sw a sa b u n d a n t ；t y p ei i ，p u r eb l u e ，p a s n e g a t i v er e a c t i o n , a bp o s i t i v er e a c t i o n , t h ec o m e n to f a c i dm u c o p l y s a e c h a f i d e sw a sr i c h ；t y p e ，p u r p l er e d d i s h ；t y p ei v ，b l u ep u r p l e t h cm u p - ，m l s c e l l so ft y p e a n dt y p ei v p r e s e n t e db o t hp a sa n da bp o s i t i v e l y t h em u c o u sc e i l sw e r er i c hi nt h eo u t e xe p i t h e l i ao f m a n t l ea n da l m s ，t h ei n n e ra n do u t e r e p i t h e l i ao ff u n n e l t h e r ew e r ef o u r 孵so fm u c o u sc e l l si nt h ee p i t h e l i ao fm a n t l e ，m o s to f t h c h nw e r et y p ema n dt y p ei v a n dt h ed e n s i t yo fm u c o u sc e l l si nt h em a n t l ee p i t h e l i ao f t h ev e n t r a lt r u c kw a s h i g h e rt h a ni nt h ed o r s a lt r u c k i na n n s ，t h e r ew e r em a n ym u c o u sc e l l si n e p i t h e l i ao ff o l d s ，a n daf e wi nt h eo t h e rp a r t s ，m o s to ft h e mw e r et y p ei i ，af e wo ft h e m w e r et y p e a n dt y p ei v i ns u c k e r , t h e r ew e r em a n yt y p ei im u c o u sc e l l si nt h eo u t e r e p i t h e l i a t h em u c o u sc e l l sw e l er i c hi nt h ei n n e ra n do u t e re p i t h e l i ao f f u n n e l ，m o s to f t h e m w e r et y p ei ii nt h eb a s eo ft h ef u n n e la n dm o s to ft h e mw e r et y p e i no t h e rp a r t so ft h e f u n n e l t h e r ew e r en om u c o u sc e l l si nt h ee p i t h e l i ao fb r a n c h i a lf i l a m e n t s ，a n df e wi nt h e e p i t h e l i ao f b r a n c h i a la x i s ，b u ti n t h ew h o l ee p i t h e l i ao f b r a n c h i a la x i sa n db r a n c h i a lf i l a m e n t s t h e r ew e r es o m em a t e r i a l sw h i c hw e r ep o s i t i v er e a c t i o ni nb o t ha ba n dp a s t h em u c o u s c e l l sw e r en o to b s e r v e di ne s o p h a g u s ，c r o pa n ds t o m a c h , b u tt h e r ew e r ei a r g ca m o u n t so fr e d m a t e r i a l sw h i c hp r e s e n t e dn e u t r a lm u c o p l ) r s a c c h a r i d e sp o s i t i v i t yi nt h ec u t i c u l a , e p i t h e l i a l l i n i n g s u b m u c o s aa n ds t r a t u ms u b m u c o s u m 强l ei nh e p a t o p a n e r e a st h e r ew e r e1 1 0m u g o u s c e l l sy e t , b u tt h er e dm a t e r i a l sa r er i c hi nt h ee p i t h e l i aa n dt h eg l a n dd u c t t h e r ew e r em u c o u s c e l l si np e r i s t o m a lm e m b r a n e ，b u c c a lm a s s ，s t o m a c h i cc a e c u m ，i n t e s t i n e ，r e c t u m ，f l a n kv a l v a e o fa n u s a n t e r i o ra n dp o s t e r i o rs a l i v a r yg l a n d n l em u c o u sc e l l si no u t e re p i t h e l i u mo ft h e p e r i s t o m a lm e m b r a n ew e r ea b u n d a n t , a n dm o s to ft h e mw e r et y p e1 i ：t h em u c o u sc e l l si n 3 山东师范大学硕士学位论文 b a s a lp o r t i o no f s t o m a c h i cc a e c u ml a t e r a lf o l d sw e r er i c h ，a n dm o s to f t h e mw e l - et y p e i ；t h e t y p eo f m u c o u sc e l l si nt h em i d d l eo f l a t e r a lf o l d sw a so n l yi i ；i nt h ef r e e - e n do f l a t e r a lf o l d s ， a l lm l l c o u $ c e l l sw e r et y p e i m a n ym u c o u sc e l l sw e r eo b s e r v e di ne p i t h e l i ao fi n t e s t i n e ， l c c r u na n df l a n kv a l v a eo f a n u s ，m o s to f t h e mw e r et y p ei i t h e r ew e r em a n ym b c o u sc e l l s i nt h ea n t e r i o ra n dp o s t e r i o rs a l i v a r y 舀锄d a n dm o s tm u c o u sc e l l si na n t e r i o rs a l i v a r yg l a n d w e r et y p ei ia n dt y p e 。i np o s t e r i o rs a l i v a r yg l a n d , t y p ei vw a st h em o s t t h et y p e sa n d d i s t r i b u t i o no f m u c o u sc e l l sa r ec l o s e l yr e l a t e dt ot h ef u n c t i o no f t h e s eo r g a n s t w ok i n d so f h y d r o l a s ei n c l u d i n ga c i dp h o s p h a t a s e ( a c p la n dn o n - s p e c i f i ce s i 嚣矗峪e ( n s e ) ，a sw e l la st w ok i n d so f o x i d a s ei n c l u d i n gp e r o x i d a s e ( p o d ) a n dp h e n o l o x i d a s e o ) i n t h em a n t l e , f o o t s ，d i g e s t i v es y s t e ma n dg i no f o c t o p u so c e l l a t u sw e r es t u d i e db y h i s t o c h e m i c a ll o c a l i s a t i o nt e c h n i q u e t h eh i s t o c h e m i c a lr e s u l t so f t w ok i n d so f h y d r o l n s e w f f r ev e r ys i m i l a rt oe a c ho t h e r a n dt h eo u t e re p i t h e l i ao f t h em a n t l e ，锄s b r a n c h i a la x i sa n d b r a n c h i a lf i l a m e n t s ，e p i t h e l i a ll i n i n go f w h o l ed i g e s t i v et u b e ，l o b u l e sa n dd u e t so f l i v e r p r e s e n t e da c pa n dn s ep o s i t i v er e a c t i o n so rv e r ys t r o n gp o s i t i v er e a c t i o n s ，a sw e l la st h e i n n e ra n do u t e re p i t h e l i ao f f u n n e l ；t h ec o n n e c t i v et i s s u e so f m o s to r g a n sp r e s e n t e dw e a k l y p o s i t i v er e a c t i o n , b u tt h e r ew e r es o m em a t e r i a l sw h i c hw e r ep r e s e n t e dp o s i t i v i t yo rv e r y s t r o n gp o s i t i v i t yd i s t r i b u t e dd i s p e r s e d l y ；t h em u s c l et i s s u e so f a l lk i n d so f o r g a n sp r e s e n t e d p o s i t i v i t yt o o a l lk i n d so f o r g a n sp r e s e n t e dw e a kp o dp o s i t i v er e a c t i o n , b u tt h ed i s t r i b u t i o n r u l eo f t h ep o s i t i v em a t e r i a l sw a ss i m i l a r t ot h a to f t w ok i n d so f h y d r o l a s c b u tt h e d i s t r i b u t i o nr u l eo f t h ep ow a sv e r yd i f f e r e n t , t h ee p i t h e l i ao f a l lk i n d so f o r g a n s p r e s e n t e d n e a r l yn e g a t i v i t y , a n dt h ep o s i t i v em a t e r i a l sw a so n l yo b s e r v e di nt h ec o n n e c t i v et i s s u e s 1 1 把 r e a c t i o n sr e s u l t so f f o u re n z y m e si n t h ee u t i c n l ao f e s o p h a g u s ，c r o pa n ds t o m a c hw e r e d i f f e r e r tt oe a c ho t h e rt o o 豇圮c u t i c n l ao f e s o p h a g u sa n dc r o pp r e s e n t e dv e r ys t r o n gn s e p o s i t i v i t y , s t r o n gp o dp o s i t i v i t y w e l l a n dt h ec u t i c u l ao f s t o m a c hp r e s e n t e dn s e p o s i t i v i t y , b u tp o dp o s i t i v i t yw a sv e r yw e a k h o w e v e r , t h e r ew c l c7 - 1 5t i mt h i c km a t e r i a l s s t r i po f p o dp o s i t i v i t yb d l c w e e nt h ee p i t h e l i a lc e l l so f s t o m a c ha n dc u t i c u l a t h ee u t i c u l ao f e s o p h a g u s ，c r o pa n ds t o m a c hp r e s e n t e da c pn e g a t i v i t y , p oa sw e l l 1 1 砖p o d n s ea n dp o da c t i v i t yl e v e l sw e r ea s s a y e di nt h em u c u ss e c r e t e db yt h e m u c o u sc e l l so f b o d ys u f f j a c ca n dh o m o g e n a t es u p e r n a t a n to f s o m e p a r t so f o r g a n s ( t h eo u t e r e p i t h e l i ao f m a n t l e , g i l l ，e s o p h a g u s ，c r o p , s t o m a c h , s t o m a c h i cc a e c b l na n di n t e s t i n e ) t h e a c t i v i t i e so f t h et h r e ec i i z y l u e sw e r ed e t e c t e di nt h em u c u sa n da f o r e s a i do r g a n s t h ea c t i v i t y l e v e l so f a c pw e r et h eh i g h e s ti nt h eg i l l t h ea c t i v i t i e so f p o da n dn s ew e r et h eh i g h e s ti n t h em a n t l e ；b u tt h ew e a k e s ta c t i v i t i e so f a c pw e r es t o m a c h i cc a e c u m , o f n s ew e r e e s o p h a g u sa n do f p o dw e r eg i l l ；b u tt h et h et h r e ea l z y m e sa c t i v i t i e sl e v e l so f m u c u sw e r e m e d i u mi nt h ee i g h ts a m p l e s 4 山东师范大学硕士学位论文 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em u c u so f b o d ys u r f a c ea n ds k i n sc o u l dh y d r o l y z ea n dk i l l t h ei n v a s i v em i c r o b a c t e r i u mt op e r f o r mb a r r i e rf u n c t i o no f i m m u n i t yt h r o u g ht h eh y d r o l y t i c f u n c t i o no f a c pa n dn s e ，t h eb a c t e r i c i d a ls y s t e mo f p o d - h z 0 2 - h a l i d ea n dt h ef u n c t i o n so f m u c o p l y s a e e h a r i d e sa n ds oo n s o m et i s s u e si n c l u d i n gt h ee p i t h e l i ao fg i l l a sw e l l d i g e s t i v es y s t e m sa n d o n , w h i c hw e r eo f t e nc o n t a c t e dt ot h es e a w a t e rc l o s e l y , c o u l da l s o p l a yi m p o r t a n tr o l e so f i m m u n ed e f e n s i v ef u n c t i o n s ；b u tp os h o u l dn o tp l a yt h ed i r e c tr o l e so f i m m u n ed e f e n s i v ef u n c t i o n sa b o u tb o d ys u r f a c e k e yw o r d s ：o c t o p u so c e l l a t u s ；m u c u s ；m a n t l e ；g i l l ；d i g e s t i v eo r g a n ；i m m u n e ；c e p h a l o p o d 山东师范大学硕士学位论文 a b p a s a c p d a b d w h c s d o p a n s e p b p b s p o p o d p r 0 p o 6 符号说明 a l c i a nb l u e p e r i o d i ca c i ds c h i f f r e a c t i o n阿新蓝高碘酸希夫反应 a c i dp h o s p h a t a s e酸性磷酸酶 d i a m i n o b e n z i d i n e3 3 一二氨基联苯胺 d i s t i l l e dw a t e r 蒸馏水 h e m o c y a n i n s 血蓝蛋白 d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e 多巴 n o n - s p e c i f i ce b t e l a , 非特异性酯酶 p h o s p h a t eb u f f e r 磷酸缓冲液 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸缓冲盐溶液 p h e n o l o x i d a s e酚氧化酶 p e r o x i d a s e过氧化物酶 p r o p h e n o l o x i d a s e 酚氧化酶原 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 头足类软体动物宿主防御机制研究进展 头足类软体动物和其他无脊椎动物一样缺乏适应性免疫反应( a d a p t i v ei l n m 啪e r e s p o n s e ) ，免疫系统明显缺乏免疫球蛋白、相互作用的淋巴细胞亚群和淋巴器官【1 1 。但 头足类仍有高效的宿主防御功能，其防御机制与脊椎动物有相似之处，首先依赖抗感染 的外部屏障来阻止病原微生物接近或侵入身体，如皮肤及体表或某些腔隙表面分泌的粘 液等的阻挡和保护作用 2 1 ；当屏障被破坏、病原体侵入其体内时，会遭遇一系列细胞的 ( c e l l u l a r ) 和体液的( h u m o r a l ) 免疫防御反应【3 卅。 1 血液的生成 头足类的血液循环方式为闭管式，血液在心脏、鳃心和可收缩的血管的推动下循环 流动。血液由血浆( p l a s m a 0 1 1 1 a c m o l y m p h ) 和血细胞( h a e m o c y t e s ) 组成。 1 1 血细胞的发生 头足类血细胞发生部位的研究开始较早，通过细胞学和细胞化学等研究方法，在2 0 世纪7 0 年代已有明确的结论，认为二鳃类头足动物的血细胞在白体( 1 e u c o p o i e t i co r g a n s o rw h i t eb o d i e s ) 发育成熟并释放到循环系统中。 1 2 血蓝蛋白的合成和分解 血蓝蛋白( h e m o c y a n i n s ，h c s ) 是在软体动物和节肢动物血淋巴中普遍存在的含铜 的大蛋白分子，其基本功能是运输氧气。已有研究表明，头足类h c s 的合成是在鳃腺 ( b r a n c h i a lg l a n d ) 【1 0 川l 。而h c s 的分解部位尚不清楚，b e u e r l e i n 等( 1 9 9 8 ，2 0 0 2 ) 用 免疫细胞化学、放射自显影术等方法显示商乌贼( s e p i ao f f i c i n a l i s ) 鳃心复合体( b r a n c h i a l h e a r tc o m p l e x ) 中粘附的卵圆细胞( o v o i dc e l l so rr h o g o c y t e s ) 和流动的血细胞的溶酶体 系统中存在h c s ，推论这些细胞可吞噬血淋巴中的h c s ，但不认为在此参与h e s 的分解 转化，而是识别和处理结合了外来物的h c s 【惦1 3 1 。b e u e r l e i n 等( 2 0 0 0 ) 还显示商乌贼 的肾和鳃心附属物的上皮细胞可以将滤进细胞内的h c s 重新转运至血液循环系统中，认 为肾和鳃心附属物的上皮细胞可以临时贮存h e s 并在维持h c s 量的稳定水平中起作用 【1 4 】。 2 血细胞防御 2 1 血细胞的形态和类型 有关软体动物血细胞类型的研究报道许多，且多集中在双壳类，不同作者对血细胞 分类的方法有所不同，血细胞的类型也存在着种的差异，得到公认的是无颗粒细胞或透 明细胞( a g r a n u l o c y t eo rh y a l i n o c y t e ) 和颗粒细胞( g r a n u l o c y t e ) 是2 种主要血细胞类型 7 些奎墅蔓查兰婴主堂垒丝兰 1 1 5 - 2 1 1 。很少有头足类衄细胞形态结构和类型的研究报道，m a l h a m ( 1 9 9 8 ) 认为，头足 类麝香蛸属的e l e d o n ec i r r h o s a 循环中的血细胞只有一种类型【5 r 捌。c o w d e n ( 1 9 7 2 ) 用 细胞学和细胞化学的方法显示白体中有3 种类型的前体细胞，分别为初级、二级和三级 成白细胞，其中二级和三级成白细胞常处于活跃的细胞分裂中，在白体中只有一种与脊 椎动物单核细胞相似的自细胞( 1 e u k o c y t e ) 产生，在白体窦状结构中的这种血细胞在循 环中的血液中也被发现1 6 】。c l a e s ( 1 9 9 6 ) 指出自体中细胞类型的差异代表着一个单一细 胞系的不同发育阶段 9 1 。但认为头足类不仅有循环的血细胞，在鳃心中还有粘附的血细 胞( a d h e s i v eh e m o c y t e s ) ，主要是一些称为卵圆细胞的细胞脚2 3 1 。 2 2 血细胞在宿主防御中的功能 有关软体动物血细胞宿主防御功能的研究在双壳类较多，主要集中在不同动物血细 胞对异物的吞噬功能 1 6 , 1 s 2 0 2 4 1 、血细胞参与免疫防御反应相关酶 2 5 之_ 7 】、异生素、病原菌 及免疫促进剂等对血细胞功能的影响 2 8 - 3 2 等方面。与双壳类相比较，头足类的相关研究 报道很少，研究的也不够深入。m a l h a m 等( 1 9 9 7 ) 研究证实了巨c i r r h o s a 的血细胞有 吞噬作用 2 3 】；d o m i n g u e z 等( 2 0 0 6 ) 报道了世界上重要的增养殖种类真蛸( o c t o p u s v u l g a r i s ) 血细胞在体外对酵母的吞噬作用，并且证实其血细胞在体外的吞噬作用不仅可 以在无血淋巴存在下进行，而且血淋巴的存在能干扰血细胞的吞噬作用p 3 】。b e u e r l c i n 等( 1 9 9 8 ，2 0 0 2 ) 采用注射和灌注异生素、同种异体物质及细菌的方法，证实了商乌贼 鳃心中粘附的卵圆细胞和流动的血细胞均可通过胞吞或吞噬作用清除上述异物，并且认 为鳃心中粘附的卵圆细胞是迁移来的定居的血细胞p 洲。有关血细胞免疫相关酶及在异 生素、病原菌及免疫促迸剂作用下的变化研究很少，m a l h a m 等( 1 9 9 8 ) 研究报道了 e c i r r h o s a 在注射一种活的弧菌后其血细胞及其他组织中溶菌酶和抗蛋白酶的活力变化 翻。伴随血细胞吞噬作用而产生的呼吸暴发的研究未见报道，而相关研究在双壳类较多 1 3 5 - 3 7 1 0 m a l h a m 等( 2 0 0 2 ) 给予ec i r r h o s a5 m i n 的空气暴露，测得应激状态下ec i r r h o s a 血 液中去甲肾上腺素和多巴胺的水平增高、循环血细胞的数目明显降低、血细胞的吞噬活 性和超氧阴离子的产生量增加，表明了应激状态下儿茶酚胺水平和免疫功能的变化及二 者间存在相关性p g 】。 3 体液防御 有关头足类血淋巴中体液免疫因子的研究报道很少，目前已有的主要在凝集素和 h c s 。 3 1 凝集素 已经证实头足类血淋巴中存在凝集素并参与体液免疫嘲，f i s h e r 等( 2 0 0 4 ) 测定了 包括3 种头足类在内的6 种海产软体动物的血清对1 5 属3 6 种细菌和7 种脊椎动物红细 胞的凝集作用，证明了凝集作用的存在及其特异性网。 3 2 血蓝蛋白 h c s 除了具有运输氧气的功能外还有多种生理功能，已发现h c s 具有酚氧化酶( p o ) 山东师范大学硕士学位论文 活性和抗菌特性而参与到宿主防御功能中l ”“j 。 p o 为含铜的蛋白质，在生物界广泛存在，无脊椎动物p o 的研究报道在节肢动物 和软体动物较多，在这两类动物体内，p o 常以酶原( p r o p h e n o l o x i d a s e ，p r o p o ) 的形 式存在1 4 5 4 8 1 ，当有微生物成分如脂多糖等存在时，p r o p o 可被丝氨酸蛋白酶引发的级联 反应活化，活化后的p o 可催化酚转化成醌，醌进一步会变成黑色素。黑色素是形成隔 绝入侵的病原体的荚膜或被囊( c a p s u l e ) 的重要成分，同时在p r o p o 活化和p o 催化的 一系列级联反应中能产生抗菌剂和媒介细胞吞噬、创伤愈合、结节形成等作用的产生， 因此p o 在非特异性体液免疫中起重要作 4 9 - 5 1 。 已经发现头足类动物血淋巴中的h e s 也存在p o 活性，s i d d i q u i 等比较研究了腹足 类的盖罩大蜗牛( h e l i xp o m a t i a ) 和头足类的商乌贼h e s 固有的和诱导的p o 活性1 4 2 1 ； 在真蛸的h e s 也发现了p 0 活性 5 2 一孤。由此可见，头足类动物血淋巴中的h e s 在体液防 御中也有重要作用。有关头足类h c s 抗菌肽的研究还未见研究报道。 s e n o z a n 等( 1 9 8 8 ) 对真蛸和商乌贼血淋巴中h c s 的浓度进行了测定，h e s 的浓度 存在种间和个体间差异，但不同于腹足类和甲壳类动物，具有闭管式循环的高度需氧的 头足类血淋巴中h e s 的浓度要稳定得多睁4 】。 4 病原体检测及其致病性 头足类在世界渔业中占有重要地位，2 0 0 0 年头足类的渔获量达3 6 0 万吨，主要种类 为枪乌贼( s q u i d ) 和乌贼( c u t t l e f i s h ) ，蛸的捕获量较少嗍，但近几年己开始开展蛸类 的人工增养殖 5 6 4 9 1 。对于野生和养殖头足类病害的研究也相继开展。p a s e u a l 等( 1 9 9 6 ) 采用了多种实验方法检测了西班牙已商业开发的野生头足类中的寄生物，共检测了头足 类中3 属1 0 种近1 6 0 0 个个体，其中有5 种既有原生动物也有后生动物的寄生，同时对 西班牙头足类中的寄生物进行了综述，已发现的寄生虫有2 0 多种嗍。g e s t a l 等( 2 0 0 2 ) 、 p a s e u a l 等( 2 0 0 6 ) 对真蛸感染艾美球虫的病理进行了研究探讨f 6 1 删。对头足类皮肤溃 疡病原体的检测和致病性研究受到关注，h a n l o n 等( 1 9 8 4 ) 即从患病的蛸体中分离了多 种弧菌和寄生虫【删；f o r d 等( 1 9 8 6 ) 比较研究了野生的和实验室暂养的正常的和患皮肤 溃疡的枪乌贼l o l l i g u n c u l ab r e v i s 中细菌种类和数目，结果显示溃疡的形成可能与细菌 感染有关，但也可能与机械损伤及应激反应有关，对几种抗生素的抗菌效果也进行了测 试 6 5 】；f a r t o 等( 2 0 0 3 ) 发现当蛸捕获及在实验室中饲养时外套膜易损伤并导致死亡， 从野生的真蛸中分离弧菌并感染健康的个体，弧菌h b r i ol e n t u s 能导致实验蛸皮肤损伤、 菌移生内部器官及蛸的死亡，说明此弧菌与这种疾病的发生密切相关嘲。 9 山东师范大学硕士学位论文 第二部分实验研究 引言 头足类动物隶属软体动物门，其头部和足部都很发达，足环生于头部前方，由此得 名“头足类”。头足类拥有发达的神经系统和感觉器官，血液循环为闭管式，是软体动 物门中最高等的类群。现生的头足类约有5 0 0 余种，大多数种类能在海洋中快速游泳 6 7 】。 头足类作为多种不同种类动物的捕食者和作为大型鱼类、鸟类和哺乳类的捕食对象，在 海洋生态系统营养结构中有重要作用，同时，它又是人类优质的食物来源，在世界渔业 中占有重要地位。 但对于软体动物门中这样一个结构和功能高等、具有重要经济价值的类群，有关其 免疫防御机制却所知甚少。贝类免疫的研究在双壳纲和腹足纲开展的较早，国外在2 0 世纪5 0 年代即有部分工作，国内9 0 年代开始有较多的研究报道；国外头足类的相关研 究报道不多，国内几乎为空白。已有头足类的研究仅涉及血细胞的吞噬作用、血蓝蛋白、 血量