（植物学专业论文）拟南芥γ分泌酶基因功能分析.pdf

摘要 十分泌酶是一种具有催化底物水解活性的蛋白复合体，p 分泌酶复合体主要有四个 蛋白组分组成，分别是p r e s e n e l i n ，n e e a s t r i n ，a p h - 1 和p e n - 2 。在人体和动物中，p 分 泌酶主要参与a p e ( 淀粉样前体蛋白) 和n o t c h 信号途径的转导，催化包括a p p 和n o t c h 受体在内的许多i 型膜蛋白的胞内水解。在a p p 信号途径中，丫分泌酶水解a p p 产生 一个由4 2 个氨基酸组成的8 淀粉样蛋白( a p 4 2 ) ，该物质具有神经毒性，从而导致阿尔茨 海默氏病( a d 病) 的发作，引起早衰。 虽然在人体和动物中人们对p 分泌酶的研究己较为深入，但目前在植物领域还未见 对十分泌酶的研究报道，其作用机制更是一个未解之谜。尽管如此，动植物中存在着许 多类似的信号转导机制，为我们的研究提供了一些有用的线索。为了探讨p 分泌酶复合 体各组分基因在植物生长发育中的作用及其可能的作用机制，我们着手开展此项研究工 作。 本文以拟南芥野生型( c o l u m b i a 生态型) 和t - d n a 插入诱发的突变体为材料，主 要运用反向遗传学的思路，对，p 分泌酶复合体的蛋白组分p e n 2 ( a t p e n 2 ) 进行了研究。 通过p c r 、r t - p c r 鉴定、表型分析、亚细胞定位分析、g u s 基因组织化学染色、卡那 抗性筛选、农杆菌介导的恒定转化等研究方法对突变体的形态结构和生长发育进行了较 为细致的观察分析，结果发现： 亚细胞定位分析结果显示a t p e n 2 蛋白特异地定位于细胞膜中；组织特异性表达分 析结果表明a t p e n 2 基因在根、茎顶端分生组织、叶脉、叶片气孔及花器官中均有表达； 对拟南芥中的a t p e n 2 突变体的表型观察发现，a t p e n 2 - 1 纯合突变体的根、茎、叶、花 均比野生型植株明显变小，但是突变体的细胞大小却与野生型的大小相似，且突变体的 花器官发育不全，导致a t p e n 2 - 1 纯合突变体不育。对t - d n a 插入拷贝数的鉴定结果表 明，突变体a t p e n 2 - 1 只有一个t - d n a 插入，且a t p e n 2 - 1 纯合突变体的表型与t - d n a 插入紧密连锁，这说明该突变体的表型是可能由a t p e n 2 突变引起的。 上述结果首次提供证据表明a t p e n 2 基因在植物的生长及发育过程中可能具有调控 细胞分裂的作用。 关键词：分泌酶，拟南芥，反向遗传学，细胞分裂 i i a b s t r a c t 7 - s e e r e t a s ei sam a c r o c o m p l e xp o s s e s s i n gp r o t e o l y t i ca c t i v i t yt oc a t a l y z et h es u b s t r a t e sh y d r o l y s i s ， 4 沁m a i n 8f o u rt o mc o m p o n e n t sw h i c ha ：p r e s e n i l i n , n i c a s t r i n , a p h - 1 ( a n t e r i o rp h a r y n xd e f e c t i v e ) a n d p e n - 2 ( p m s e n i l i ne n h a n c e r2 ) ? - s e c t e t a s em a i n l yp a r t i c i p a t e si na p p ( a m y p l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ) a n d n o t c hs i g n a l i n gp a t h w a y si nh u m a na n da n i m a l s , c a t a l y z i n gs u b s t r a t e si n c l u d e 3 - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ( b a p p ) n 吮i l ，a n dn u n i 盯o u so t h e rt y p eit r a n s m e m b r a u ep r o t e i n st oh y d r o l y z ew i t h i nt r a n s m e m b r a n e d o m a i n s i nt h ea p ps i g n a l l i n gp a t h w a y , t - s e c r g 血a s eh y d r o l y z e sa p pt og e n e r a t ea 3 4 2 ( p a m y l o i dp r o t e i n c o n t a i n i n g4 2a m i n oa c i d s ) , w h i c hs h o w e dg r e a tn e u r o t o x i c i t yt ob r a i nt i s s u ea n de a l l s e da l z h e m i e r s d i s e a s e t h o u g ht h e r eh a sb e e np r o f o u n ds t u d yo i l ? - s e c r e t a s ei nh u m a na n da n i m a l s ，n op u b l i s h e dr e p o r ta b o u t ? - s e c r e t a s ec o m p l e xi np l a n tr e a l mh a sb e e nf o u n d , a n dt h em e c h a n i s mi s s t i l la nu n s o l v e dm y s t e r y h o w e v e r , t h es i m i l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s me x i s t sb c t w na n i m a l sa n dp l a n t s p r o v i d i n gu ss o m e u s e f u lc u e s i no r d e rt oe x p l o r et h ep o s s i b l ef u n c t i o na n dt h em e c h a n i s mo f ? - s e c r e t a s ec o m p l e x c o m p o n e n t sd u r i n gt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to f p l a n t , t h i sr e s e a r c hw a sc a r d e do u t i nt h i sw o r k , c o l u m b i ae c o t y p ed r a b i d o p s 缸t h a l i a n ao fw i l dt y p ea n dt h et - d n ai n s e r t i o na l l e l e s w e r eu s e d 船m a t e r i a l s ，a n dr e v e r s eg e n e t i c sw a su s e di nt h er e s e a r c ho fo u eo ft h et - s e c r e t a s e c o m p l e x - p e n 2i n 4 r a b i d o p s i st h a l i a n n 似t p e n 2 ) i nt h ee x p e r i m e n t s t h em u t a a t s m o p h o l o g ya n dt h e g r o w t ha n dd e v e l o p m e n tw e r eo b v e x s e da n da n a l y z e dc a r e f u l l yv i ag a n u t y p oa n dt r a n s c r i p tc h a r a c t e r i z a t i o n , s u b c x l i n l a r l o c a l i z a t i o n a n a l y s i s , g u s h i s t e c h e m i c a l a s s a y ,k a n a m y c i n s e l e c t i o na n d a g r o b a e t e r i a m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n , a n dt h em a i nr e s u l t sw a sf o l l o w i n g s ： t h er e s u l to fs u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o ns h o w e dt h a ta t p e n 2w e ss p e c i a l l yl o c a l i z e di nt h em e m b r a n e ， w h i c hw e sc o n s i s t e n tw i t ht h ef u n c t i o no ft - s e c r e t e s ec o m p l e xi nt h em e m b r a n e t h er e s u l t so f g u s s t a i n i n ga s s a ys h o w e dt h a ta t p e n 2e x p r e s s e di nr o o t , s h o o ta p i c a lm e r i s t e m ，l e a fv e i n s ，l e a fs t o m a s a n df l o w e ro r g a n s c o m p a r i n gw i t hw i l dt y p ep l a m , t h eh o m o z y g n u sm u t a n t o f a t p e n 2 - 1s h o w e d m a n yc h a n g e si np h e n o t y p es u c ha s ：m u c hs m a l l e rl e a v e sa n df l o w e r sa n dm u c hs h o r t e rr o o ta n ds h o o t t h e c e l ls i z eo f a t p e n 2 - 1h mw a st h es a m e 鹊o ft h a to fw i l dt y p e , w h i l et h ew h o l ep l a n tm u c hs m a l l e rt h a n w i l dt y p e a tt h es a m et i m e , t h e r ew e r ed e f e c t si nt h ef l o w e ro r g a n so fa t p e n 2 - 1h m t h er e s u l to f m i d e n t i f i c a t i o no ft - d n ai n s e r t i o nc o p yd e m o n s t r a t e dt h a tt h e r ew s so n l yo n ec o p yi nt h em u t a n to f a t p e n 2 - 1 ，e n dt h et - d n ai n s e r t i o nw a sl i n k e dw i t ht h ep h e n o t y p e st i g h t l y , w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a tt h e c h a n g e so f p h e n o t y p ew e r ep r o b a b l yc a l l s e db yt h et - d n a i n s e l t i o ni n a t p e n 2 o u r r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t a t p e n 2 w a s p r o b a b l y i n v o l v e d i n t h e c o n t r o l o f c e l ld i v i s i o n i n t h e g r o w t h a n dd e v e l o p m e n ti n a r a b d o p s st h a l i a n a k e y w o r d s ：s e f r e t a s e ，a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ，r e v e r s e g e n e t i c s ，c e l l d i v i s i o n i v 缩略词对照表 独创性声明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：j 丛- 盔j 均一日期：! 互l 二_ 丛l 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签名：上垒岫导师签名：耋址日期：建竺尹二生二生 前言 刖再 p 分泌酶是一种具有催化底物水解活性的蛋白复合体。在人体和动物中，r - 分泌酶 主要参与a p p ( a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i u ，a p p ) 和n o a h 信号途径的转导，催化包括n o a h 受体和a p p 在内的许多i 型膜蛋白的胞内水解。 早在1 9 9 5 年研究人员就发现r - 分泌酶与阿尔茨海默氏病( a l z h e i m e r sd i s e a s e , a d ， 又名老年性痴呆症) 有关。a d 大脑的主要病理性特征是产生老年斑、神经原纤维的缠结 和血管壁淀粉的样变。通过脑病理研究发现，a d 患者脑组织内争淀粉样蛋f j ( a m y l o i d p - p r o t e i n ，a 明显增多，并形成大量的老年斑，老年斑主要由包含4 0 4 2 个氨基酸的 a p 组成，a 1 3 主要有a 和a 陆两种形式，其中a b 4 2 具有更强的神经毒性，是导致阿 尔茨海默氏病的主要原因。研究表明，a p 是由其前体蛋白p 淀粉样前体蛋白( p a m y l o i d p r e c u r s o rp r o t e i n ，b a p p ) 经p - 和7 分泌酶水解产生的。目前医学界中的一个热点目标就 是希望能够搞清r 分泌酶在a p p 和n o a h 信号转导中的确切作用，从而研制出y 一分泌 酶的抑制剂，用于a d 病和依赖n o t c h 途径的癌症。因此，卜分泌酶近年来日愈受到 人们的广泛关注。 在人体和动物中，t - 分泌酶复合体主要由p r e s e n e l i n ，n e c a s t r i n a n t e d o rp h a r y n x d e f e c t i v e ( a p h - 1 ) 和p r e s e n i l i ne n h a n c e r2 ( p e n - 2 ) 四个主要蛋白组分组成。通过对基因组序 列的比较分析，研究人员推测植物中也存在十分泌酶，也由上述四个蛋白组成。 虽然在人体和动物中人们对卜分泌酶研究的已较为深入，但目前在植物中国内外尚 未见深入的研究报道，其作用机制更是一个未解之谜。尽管如此，动植物中存在着许多 类似的信号转导机制，为我们的研究提供了一些有用的线索。为了探讨十分泌酶复合体 各组分基因在植物生长发育中的作用及其可能的作用机制，我们着手开展此项研究工 作。 本论文主要运用反向遗传学的思路以双子叶模式植物拟南芥为材料，主要运用 p c r 、r t - p c r 、亚细胞定位分析、组织化学染色、农杆菌介导的恒定转化等分子生物学 及生物化学试验手段，对a t p e n 2 的功能进行研究。 本论文旨在通过对t o d n a 插入突变体的鉴定、筛选，希望能得到有表型变化的相 关基因突变体，通过农杆菌介导的恒定转化，希望能够恢复由t - d n a 插入导致的突变 前言 体表型，进一步分析由该基因引起表型变化的可能原因，通过对中分泌酶复合体组分基 因的功能分析，进而揭示该蛋白在植物信号转导及发育过程中的作用。 本研究得到国家8 6 3 计划项1 e 1 ( 2 0 0 3 a a 2 1 0 1 2 0 ) 和河南省高校刨新人才培养工程基金资助 2 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 概述 生物体的生长发育主要受遗传信息及环境变化信息的调节控制。细胞作为生命体 的单元，其发生、增殖、分化主要受遗传信息时空表达的影响，同时外界各种环境因 子如光、温度、激素、重力以及病原等的刺激，包括多细胞生命体中细胞间的信息传 递也对其起着非常重要的调节作用。按照细胞信号学说，环境信号主要被位于细胞表 面的受体所接受，然后通过跨膜信号转导将细胞外信号转变为胞内信使，通过胞内信 号传递引起胞内生理生化反应和遗传性状的表达。信号的接收、转换及原初传递反应 均发生在细胞膜上，其中受体是这一过程中最重要的组分【旧。 在细胞信号传导( c e l ls i g n a l i n g ) 领域里，2 0 0 0 年开始研究人员就已经注意到一种新 的蛋白水解机制，即跨膜蛋自在膜面裂解并释放胞内的片段，这些片断再转移至细胞 核从而调控一系列特异基因的转录，这种机制被称为调节性膜内蛋白水解反应 ( r e g u l a t e di n t r a m e m b r a n ep r o t e o l y s i s ，r i p ) ，此概念最初由b r o w n 等于2 0 0 0 年提出口，4 】。 r i p 主要影响细胞分化、脂类代谢、及对伸展蛋白的反应等多种过程。r i p 除了在动物 细胞中存在外，在细菌和古生菌中也广泛存在，且其作用机制在进化上高度保守 3 1 。 具有r i p 特性的跨膜蛋白包括a p p ，n o t c h ，s r e b p ( s t e r o lr e g u l a t o r ye l e m e n t - b i n d i n g p r o t e i n s ) 和a t f 6 等，研究人员发现，细菌中存在的蛋白酶与动物细胞中的蛋白酶在进 化上具有相关性，多属于天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶家族【5 】。有关 这方面的研究已经成为近年来的热点课题，仅在2 0 0 0 年年初就有1 2 篇这方面的文章 6 , - 1 7 1 。 由于人体中阿尔茨海默氏病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ，又名老年性痴呆症) 的出现， 目前医学界已展开对人体及动物细胞中 分泌酶睁s e c r e t a s e ) 的广泛研究，因其参与 a p p ( a m y p l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，淀粉样前体蛋白) 信号途径和n o t c h 信号途径，介导 a lp 和n o t c h 受体在胞内的蛋白水解 3 a 8 - 2 2 。由p 分泌酶所介导的信号转导途径在生 物体内是一种较保守的跨膜信号转导机制【3 】，近年来在植物生长发育研究领域也开始 受到人们的重视。 第一章文献综述 1 2 研究概况 分泌酶因能专一性的从细胞表面催化蛋白质水解并释放其胞内部分而得名 2 3 1 。此术 语几年前第一次被h o o p e r 等人 2 4 1 用来描述能够释放可溶性形式膜蛋白的膜蛋白酶，此 命名主要是根据它能降解细胞表面的血管紧张肽酶从而使其获得完整的蛋白酶活性而 得来的。分泌酶参与释放各种膜蛋白的胞外区，这些蛋白带有i 型和i i 型结构，其水解 位点紧紧位于细胞膜区域。其中，i 型结构蛋白包括i r e l ，n o t c h ，和a p p 在内的至少 3 0 种跨膜蛋白，此类蛋白的结构特点是氨基端位于胞外区，羧基端位于胞质内。型结 构只有一种蛋白：a t f 6 ，其氨基端位于胞质内，而羧基端位于胞质外 3 , 2 5 1 。 国外医学界对p 分泌酶的研究较多，早在1 9 9 5 年m a r x 等就已证明其与a d 病有 关 2 6 , 2 7 1 ，a d 病是引起痴呆最常见的一种类型，它是一种脑退行性疾息；患者的智力，记 忆、感觉、定向、推理和判断能力都产生不可逆性的退化，严重危害人类健康，影响老 年时期生活质量，对社会、经济造成巨大影响。其相关研究所获资助仅次于爱滋病而排 列第- - 2 8 捌。国内近几年也展开了a d 病的研究，对a d 病进行的研究主要集中在人体上 3 0 - 3 5 1 ，且研究还处于起步阶段。 研究表明，p 淀粉样蛋白( p - a m y l o i d ，a p ) 是导致人类罹患阿尔茨海默氏症的“罪魁祸 首”。a p 是由其前体蛋白p 淀粉样前体蛋白( p a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，a p p ) 经酶促剪 切后产生的。神经细胞异常产生的大量a b ，不仅会在大脑中沉淀形成老年斑，而且会 引起大脑神经纤维丝缠结和神经细胞死亡等病理变化，从而导致阿尔茨海默氏症。a 3 沉积是阿尔茨海默病的主要病理特征之一【3 6 l ，a p 是经p 和丫分泌酶水解 3 a p p 而产生 的由4 0 4 2 个氨基酸组成的具有神经毒性的蛋白肽，故p 和p 分泌酶是 3 a p p 代谢的关 键性酶吲。 1 2 1p 分泌酶组分的蛋白序列特征 越来越多的研究报道表明：在动物中，p 分泌酶参与a p p 及n o t c h 信号途径的转导 0 0 - 。1 4 1 ，但均集中于对人体及哺乳动物的研究。h a o 等人口5 1 以绿藻为材料展开了对r 分泌 酶的研究，并对莱茵衣藻( c f ) 、痢疾变形虫( e h ) 、克氏锥虫( ，r c ) 、布氏锥虫f i b ) 、盘基网 柄菌( d ”、拟南芥、水稻( 0 s ) 、线虫( c e ) 、果蝇( d n l ) 、智人( h s ) 1 0 个物种中的丫- 分 泌酶各组分基因进行了序列比较及系统树分析( 图1 1 ) 。发现丫分泌酶各组分在进化过程 中高度保守，各物种中的p s l ( p r e s e n i l i n ，又称早老素) 均含有y d 和g x g d 催化基序( 图 4 兰二童塑堡堕 l l ，舢，n i c a s t r i n ( n c t ) 均含有d y i g sa n d 婵p t i d a s e l i k e ( d a p ) 区域，另外还包括一个在 识别底物中具有重要关键作用的谷氨酸残基网( 图1 - l ，b ) ，作为a p h - 1 的保守基序 g ) ( g 对p 分泌酶复合体的组装和活性发挥起着重要作用【2 5 芦4 1 1 ( 图1 - 1c ) 。虽然p e n - 2 在众多物种中没有完全一致的基序，但比较不同物种中的p e n - 2 时发现p e n - 2 有两个跨 膜域比较保守( 图1 1d ) 。 ac rp 0 z hp s 絮cp 8 ，2 bp s d d p s l d dp $ 2 a ：p s l a ：p s 2 o o p s i o sp s 2 c es e i - 1 2 c e _ h o p 一1 d 皿p 8 h o p s i h j 夸8 2 b c ”w t l ”i i “g m a j ： w c l l v a v a ：e 船工二3 z v s 二i w l w z “二i 焉焉釜麓 * k w a m r t 黑篆臻囊 w m a l t a z 3 w a v i a a i s 二： 霄l i “w 3 1 w v i l g a z $ + t c rn c t 2 cn c t t bn c 乞 d dn c 乞 五七n o 乞 0 5n c c c en c 乞 d mn c # h 3n c 乞 c r _ a p h 一1 嬲j p h 。1 a e j 啦h 。1 o sa p h 。1 c ea p h 一1 d ma p h l h ba p h l - m s a p h i b 隰黧 t y a r q l a f 五a l p d d 3 r d 订a f f f p a p s r d v y a f f f p k 辩0 k v 工f a m 嚣嚣 n l f , k o l v f 工v l ： n l f k q 乙v f w f 嚣 2 s x r n v ? f a f f n i l h n 珏。f v t f n t 玉p r n 硼f v f p 0 o 救p e n - 2 鳃粼嬲f c 字二拳毪黼瓣v i l 阿p d 强轻一罩 g 参p i i 删：醒s a z g 嚣张剪z 扎2 他五m i a e hp e n - 2c 瓤工f i c g 亨蹋戮瑚吼i 管托强一y 粥p - n s y r n 蛊y 工i l 3 a v l l z z e p 3 工l l l 旃i z 咒强 d d p e n - 2、翻搿：n r l y 聪亨一y r k 3 埘孙臻i 吼再? 3 五i g 乳g y 8 t i 翳五g 再m g r y 瑚 a tp e a - 2 聪对y 粥亨越：p 溉箨蝌c 搿f 盼一删一8 r a 堂p 口i 船y v v r 3 a l g 8 v ? 2 l l 8 涮虬t f 8 l g 0 3p e n - 2 勰解n 辩豫c 二p 扎融：瑶c c ? 跚拿- 删p a 警零邓8 a a 芋0 袁：交拿y v 豫3 a l g 鞭z 雾奉w l 乙翱撇亨z i g c e o e n - 2 穗科乳z g w 扎 工张粼t 掰f 于8 强p p 一：n a e 粼：慕嚣盯z a 3 ：v g $ z 掰n 孔3 矗就l f 鞠嚣y d 臻p e n - 2c 鳓y f 器喀e a f 盈事懒：n v e 嚣f 段z a ? 疆滢- p s e o s 0 ：托州y s a 粥蜀掰乙l v l 魏嚣z i i p o t 搀 基$ 拿e n - 2 媳再y y 黼觳爹二p 扎掰辑l 雅f 孙黯毒铆一a y 警e 0 8 q z 硒y 蝴a w 瞄黼l 张t s w i t i 强x y ：l ：。；：；： ： o ； 第一章文献综述 圈1 - 1 不同物种中y 一分泌酶组分的序列及系统树分析( 自y i - h e n g h a o ，2 0 0 6 ) a d ：p r e s e n i l i n , n i c a s t d n ，a p h - 1 ，a n dp e n - 2 的蛋白序列的分析 e - h ：四个y 一分泌酶组分的系统树分析 c r ：莱茵衣藻：e h ：痢疾变形虫；t e ：克氏锥虫；t b ：布氏锥虫；d b ：盘基网柄菌；a t ：拟南芥； 0 s s 水稻：c e ：线虫；d m ：果蝇；h s ：智人 f i g 1 - 1s e q u e n c ea n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f y - s e c r e t a s ec o m p o n e n t sf i o mv a r i o u ss p e c i e s ( f r o my i - h e n gh a o ，2 0 0 6 ) a - d ：p r o t e i ns e q u e n c ea n a l y s i so f s i g n a t u r em o t i f so f p r e s e n i l i n ，n i c a s u i n , a p h - i ，a n dp e r u 2 e - h ：p h y l o g e n e t i ea n a l y s i so f t h ef o u rc o r t ! t - s e c r e t a s ec o m p o n e n t s c r ：c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ；e h ：e n t a m o e b ah i s t o l y t i c a ；t e ：t r y p a n o s o m ac r u z i ；t b ，t l y p 拥o m a b r u c e i ；d d ：d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ；a t ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；o s ：o r y z as a l i v a ；c e ：c a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s ；d m d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r , h s ：h o m os a p i e n s 1 2 2 十分泌酶的功能 p 分泌酶的发现源于对早发性的a d 病的研究。p 分泌酶是一类跨膜蛋白酶嗍，能 催化底物的胞内片断在跨膜区域的水解，释放细胞质中的蛋白质片段进入细胞核后调节 基因的转剥1 s l 。丫_ 分泌酶主要参与a p p 和n o t c h 信号途径的转导【3 ，1 1 螂】，主要剪切a p p 、 n o a h 、e - c a d h e r i n 、e r b b - 4 受体酪氨酸激酶等膜蛋白。 6 第一章文献综述 在人体和小鼠的大脑中，t 分泌酶、小分泌酶及p 分泌酶共同起作用，水解a p p 的 胞外跨膜区产生b 4 2 肽，此肽具有较强的神经毒性，这种肽能够形成淀粉体斑块，阻断 身体的神经突触途径，引发a d 病。如果人们能够中止这些酶的工作，那么将能够中止 它们在大脑中制造毒性分子。但是，这种p 分泌酶还与其他组织的健康功熊有关，因此 人们需要创造出一些能够抑制它的负面作用而保持其他细胞的正常功能的治疗方法，这 让研究人员相当头痛。 近年来，首先在果蝇发育的研究中【培o n ，发现了一条在多种细胞的特化( s p e c i f i c a t i o n ) 中起关键作用的传导细胞间相互作用信号的途径，即n o a h 信号途径m ；该途径广泛存 在于多种无脊椎动物和脊椎动物体内，且在进化过程中高度保守，此途径主要介导由局 部细胞间相互作用而产生的、对多种不成熟细胞分化的抑制信号，在胚胎发育中起重要 作用。哺乳类动物中n o a h 途径的功能复杂多样，参与造血、t 细胞发育及血管生成等 重要生理过程，并与肿瘤形成和某些神经系统疾病有密切关系 4 5 4 7 1 。目前对n o a h 信号 途径的研究已不再局限于发育生物学领域，而成为一个涉及多个基础医学学科的热门课 题。然而，w i g g e 和w e i g e l 却发现植物中缺乏广泛存在于脊椎动物、果蝇及涡虫中的 n o t c h 信号通路娜l 。 丫分泌酶活性还与e r b b - 4 、c d 4 4 ( c e l l a d h e n s i o n ) 、l r p ( 低密度脂蛋白关联受体蛋白) 、 b 钙粘连蛋白( e c a d 胁n ) 及柄蛋白1 n e c 如1 a ) 的跨膜水解的调控有关n s , 4 9 。 1 2 3p 分泌酶的结构 p 分泌酶是一个巨大的膜蛋白复合体，研究人员 i s j o , s l l 推测它有四种组分构成： 即p r e s e n i l i n 二聚体，n i c a s t r i n ，a p h - i 和p e n - 2 ( 见图1 - 2 ) 。同时，s t c i n e r 等人采用过 表达( o v e r e x p r e s s i o n ) g 敲减( k n o c k d o w n ) 等试验提供强有力的证据表明这四种蛋白对 p 分泌酶的活性是必需的【5 2 5 q 。e d b a u e r 等人通过对非哺乳动物的重建试验的研究结 果表明，这四种蛋白是维系卜分泌酶活性所必需的全部成分【洲“。 在r - 分泌酶的四种组分中，对p r e s e n i l i n ( p s ，又称早老素) 的研究较为深入，早在 1 9 9 5 年，m a r x 和d u f f 等研究人员【2 6 2 刀就发现突变型早老素与a i z h e i m e r 病有关。p s 主 要存在于胞内包括质膜、内质网和高尔基体系的膜系统中【5 2 蛳3 1 ，在发育过程中p s 几 乎在所有的细胞类型中均表达【5 2 l 。在哺乳动物中有两类p s 基因：即p s i 和p s 2 ，属进 化保守基因家族成员，其中p s i 较p s 2 活跃, 6 4 , 6 5 。x i a 和w o l f e t 2 1 1 对哺乳动物( 老鼠和 人) 的研究发现：p s i 和p s 2 各有4 6 7 和4 4 8 个氨基酸，具有大约6 0 的序列相似性 2 0 ，s z 。 7 第一章文献综述 p s im r n a 编码的蛋白质类似一个跨膜蛋白，相对分子质量为3 2 0 0 0d a ；针对体有几 个跨膜域的问题，研究人员提出了不同的观点，有提出六个、七个、八个跨膜域的 6 s l ， 也有提出九个跨膜域的唧，但是目前大多数研究者支持p s 八次跨膜的观点 6 8 - 7 。其中 又以f o r t i n i l l 规提出的有关p s 的结构图较为经典( 见图1 - 2 ) ，f o r t i n i 指出：p s 有3 个跨膜 域，在第6 和第7 个跨膜域中，各有一天冬氨酸残基( a s p ) ，它们对t 分泌酶裂解a p p 起着关键作用。同时，在第6 和第7 个跨膜域之间有一个大的亲水环，此环中有一水解 位点，p s 在胞内水解后能产生保持着稳定联系的氨基端片段0 q - t e r m i n a lf r a g m e n t ，n t f ) 和羧基端片段( c - t e r m i n a lf r a g m e n t ，c t l 9 ，t - 分泌酶的活性位点就位于这两个相关联的 片段之间( 1 & t 2 - 7 q 。d es t r o o p c r 等，习和n a r u s c 等人r 嗡过对p s i 缺失的动物的研究发 现p s i 对t - 分泌酶对a p p 的水解是必需的 图1 2t - 分泌酶复合体成分的结构图( 自f o n i n l , m e 胍咖隅2 0 0 2 ) f i s u r c - 2s h u c h 雌o f t h ep u t a t i v e r - s e c r e t a s ec o m p l e xc m n p o n e n t s 旺舢f o r t i n i , 5 4 e n a t m e , 2 0 0 2 ) n i c a s t r i n ( n c t ) 是一种高度糖基化的吲单跨膜的1 型膜蛋白l l s l ，最初由y u 等嗍于 2 0 0 0 年通过与p s i 的免疫共沉淀方法鉴定出来的，分子量为1 2 0 - 1 4 0 k d a ，其胞外域含 有保守的半胱氨酸( c y s ) 和d y i g s 结构域，还含有其它的在n c t 家族中序列高度保守的 区域( 图1 2 中粉红色的方框区) 。f o r l l n i 等【1 s l 的研究表明，在哺乳动物细胞中，d y i g s 区域对n e t 的活性起着重要的作用。n c t 被称为t 分泌酶的。守卫者主要与p s 的n - i t 及c t f 相结合。其小的胞内片断功能尚不明确，但其n 端跨膜区对复合体的装配是必 需的嗍，且其大的n 端胞外域对卜分泌酶在底物的识别过程中起着重要的作用1 7 例 3 第一章文献综述 研究证明，a p h - i i s l 】和p e n - 2 犯1 也是t 分泌酶复合体的组成成分，早在2 0 0 2 年已在 线虫中得到验证【l 羽。它们都是多跨膜蛋白，被预测分别含有7 个和2 个跨膜域。虽然 f o r t i n i 和s h a h 的研究“8 阗已经表明a p h - 1 是一个七次跨膜的膜整合蛋白，但未指明其 在细胞膜上的定位。2 0 0 6 年w o l f e 7 7 1 和s t e i n e r 等旧对a p h 1 的拓扑结构的研究表明， 其n i t 朝向胞外侧，c t f 朝向胞内侧，但是目前仍对a p h - 1 的分子量及其起稳定效应 的分子基础和g x x x g 的分子机制不太清楚 6 8 1 。a d a ms 等人i s 2 对p e n - 2 的拓扑结构的 研究表明，p e n - 2 的n t f 和c t f 均朝向胞外侧，而其两个跨膜区间的亲水环位于胞内 侧，这种构象有利于p e n - 2 与p s 结合，从而有效地发挥其生物功能。 n a o t o 等 s 3 l 研究发现p e n - 2 通过与p s i 的第四个跨膜域结合而构成哥分泌酶复合体 的一部分，在形成t _ 分泌酶复合体的过程中，n c t 和a p h - 1 形成一异源二聚体而与p s 的c 端结合，对十分泌酶复合体起着稳定作用，随后，p e n - 2 被招募至这一异源三聚体 触发p s 的内切蛋白酶解的作用，赋予十分泌酶复合体活性。 人们狮分泌酶复合体的晶体结构也进行了研究，t i a n 等网报道丫分泌酶上分别有 结合底物及催化底物的位点，o g u r a 掣8 习纯化了在s f 9 细胞中表达的t 分泌酶，并经负染 电子显微镜和3 d 重组技术( n e g a t i v es t a i ne l e c t r o nm i c r o s c o p ya n d3 dr e c o n s t r u c t i o n t e c h n i q u e s ) 分析卜分泌酶的3 d 结构发现：它的体积是5 6 0 3 2 0 x 2 4 0a ，具有一个平坦的核 心，由两个相对的、凹陷的( d i m p l e d ) 结构域组成，而一些在跨膜结构域中的凹陷区域有 可能就是催化活性位点。 1 2 4 丫- 分泌酶复合体的装配 作为丫_ 分泌酶复合体四组分的p s ，n c t ，a p h - 1 和p e n - 2 相互关联，相互协作，共 同调节丫分泌酶复合体的活性。n e t ，a p h - i 和p e n - 2 作为p s 的辅助因子对p s 的稳定 起着重要作用。它们只有在结合成一个复合体的时候，才能赋予t 分泌酶复合体活性 b o 筇- 2 s l 。 研究表明，p s 与辅助因子n e t ，a p h - l 和p e n - 2 组合能够完全重现p 分泌酶活性， 通过自身水解激活网。t a k a s u g i 等f 5 0 l 通过果蝇s 2 ( s c l l n e i d e rc e h s ) 细胞系的研究阐明了 p s 辅助因子在十分泌酶复合物形成中的作用。最初形成的p s 全蛋白为一低分子量、易 被降解的不稳定复合体。当a p h 一1 和n c t 与p s 的一部分片段结合上形成一个三聚体的 亚复合体时，就能使p s 全蛋白稳定下来，但此时的y 一分泌酶仍不具有活性。只有p e n - 2 9 第一章文献综述 与三聚体结合后，才能促使y 一分泌酶复合体的“成熟”，使之具有活性，从而促进p s 的内源性水解【2 5 1 ，从而激活卜分泌酶复合物( 见图1 - 3 ) 。 图卜3 果蝇细胞中y 一分泌酶的逐步组装与激活示意图( 自t a k a s u g i nn a t u r e , 2 0 0 3 1 f i g 1 - 3s c h e m a t i cd e p i c t i o no f t h es t e p w i s ea s s e m b l ya n da c t i v a t i o no f t h e7 - s c c r e t a s ec o m p l e x i nd r o s o p h i l ac e l l s ( f r o mt a k a s u g i nn a t u r e