（微生物学专业论文）燃料油微生物催化脱硫的研究.pdf

南开大学硕士研究生毕业 ( 学位) 论文 摘 要 ab s t r a c t i n t h i s r e s e a r c h i s c r e e n e d o u t 3 s t r a i n s o f b a c t e r i a : d s - 1 , d s - 2 a n d d s - 3 t h a t c a n b i o d e g r a d e d ib e n z o t h i o p h e n e , a m o d e l c o m p o u n d i n b i o d e s u l f u r i z a t i o n r e s e a r c h w o r k . d s - 1 , a s t r a i n o f p s e u d o m o n as. s p , i s s c r e e n e d o u t f r o m m y l a b s s t r a i n s , d s - 2 a n d d s - 3 ， t w o r h o d o c o c c u s s p . s t r a i n s ， a r e s c r e e n e d o u t f r o m t h e s o i l s a m p l e o f g u d a o o i l f i e l d . a ft e r a n a l y s i s t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o f t h e s e s t r a i n s , i c o n f i r m e d t h e i r d e g r a d a t io n p a t h w a y . d s - 1 c a n b r e a k d o w n t h e m o l e c u l a r o f d i b e n z o t h i o p h e n e i n t o s o m e k i n d o f c o l o r e d c o m p o u n d . t h i s d e g r a d a t i o n m a n n e r i n d i c a t e d t h a t i t i s a k o d a m a d e g r a d a t i o n p a t h w a y . 2一h b p i s p r o d u c e d i n t h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o f d s - 2 a n d d s - 3 , s u g g e s t e d t h e y d e g r a d e d b t w i t h 4 s p a t h w a y . a ft e r c o m p a r e d t h e d e s u l f u r i z a i t o n a b i l i t y o f t h o s e s t r a i n s , i c h o o s e d s - 3 a s m y r e s e a r c h o b j e c t b e c a u s e o f g o o d c h a r a c t e r s . t h e n , i o p t im i z e t h e c u l t u r e c o n d i t i o n s o f t h i s s t r a i n s , s u c h as t h e s i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t s , a n d o r th o g o n a l e x p e r i m e n t s , f i n a l l y g e t a n e w m e d i u m r e c ip e . i a l s o g e t u v - 0 4 , a s t r a i n o f d s - 3 u v m u t a n t s t r a i n o f s t r o n g d e s u l f u r i z a t i o n a b i l i t y . u v - 0 4 s c a p a c it y o f b i o d e s u l f u r i z a t i o n i s 1 .2 t i m e o f t h e o r i g i n a l s t r a i n d s - 3 . r e s e a r c h e d o n t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e d e s u l f u r i z a t i o n e n z y m e o f u v - 0 4 s h o w e d th a t t h e e n z y m e s e x p r e s s io n i s r e s tr a in e d b y s 0 4 z + . t h e n i c o n d u c t t h e d e s u l fu r i z a i o n e x p e r i m e n t o n d i e s e l o i l a n d s u m m a r iz e d a n e ff e c t i v e b a t c h d e s u l fn r me t h o d s . u s e t h i s m e t h o d , t h e d i e s e l o i l s s u l f u r c o n t e n t d e c r e ase d 5 2 % a n d t h e d b t c o n d e n s e o f i t d e c re a s e d 8 7 %o f i n a l l y , i r e s e a r c h o n t h e i m m o b i l i z e d c e l l o f u v - 0 4 , f o u n d t h a t i t i s a l s o a n e ff e c t i v e t e c h n i q u e o f d e s u l f u r i z a t i o n . k e y w o r d s : b i o d e s u l f u r i z a t i o n ; d i b e n z o t h i o p h e n e ; r h o d o c o c c u s s p ., 4 s p a t h w a y , i mmo b i l i z e d c e l l 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第一部分前 言 第一部分 前言 1 .燃料油脱硫处理的必要性 随着全球工业化进程的迅猛发展， 矿物燃料的需求量剧增。 我们日常所用的燃料 油中的硫主要来自 所加工的原油， 而各类原油都含有不同浓度水平的含硫化合物。 不 同来源的燃料油中硫含量相差很大，其重量百分比大约在 0 .0 3 % - 1 0 %的范围内 变化 汇 。 组成原油中的硫大 致可分为无机硫和有机硫。 无机硫主要由 溶解或悬浮在油中的 元素硫、硫化氢、硫化物和硫铁矿等组成;而占含硫量的大部分的是石油中大约有 2 0 0 种左右之多的有机硫， 这些有机硫由 各种硫醇、 硫醚和唆吩及其衍生物组成。美 国 石油 协会 ( a p ”将它 们分为1 3 种2 1 ( 见图1 ) 。 这些 硫化物具有多方面的危害 性: 二班 化 . . 盼类 图1 . 石油中的含硫化合物 ( 1 ) 腐蚀作用:二硫化物稳定性较差，加热易分解成h 2 s ，与水共存时呈酸性， 会严重腐蚀设备。如果油品中 含有m 9 c 1 2 , c a c 1 2 等盐类， 会水解生成盐酸， 腐蚀更 为 严重 13 1温度达到3 5 0 - 4 0 0 左右时， 活泼的 元素 硫极易与 普通钢材生 成硫化亚 铁 4 1 ， 硫醇也能直接与铁作用生成硫醇铁而腐蚀设备1s 1 ( 2 )酸雨效应:含硫燃料燃烧后生成的 s 0 2 s 伪 极易与大气中的水蒸气化合 成h 2 s o 3 和h 2 s o 4 蒸汽， 含硫的烟气对人体和动、 植物都有很大的害处。此外， 燃 烧排放的二氧化硫在空气中一旦被氧化，就会与水蒸气生成酸硫雾，继而形成酸雨， 南开人学硕上 毕业( 学位) 论文 第一部分前 言 严重影响生态环境和人们的日 常生活6 ( 见表i ) . 表 1 酸雨造成的危害 影响方面 生态系统 主要危害 十壤 城市 破4陆生，毁坏森林和植被，使树木枯死，草原破坏; 影响植物生长，使农作物减产。 提高十壤的酸度和湿度，放出更多的甲烷，导致温室效应的加剧 。 使十壤中原有的有机c n 转化成游离的活性铝，破坏植物的根系。 抑制土壤中有机物的分解和氮的固定，淋洗出与土壤团粒结合的钙、 镁、 钾等营养成分，使土 壤贫疮化。 腐蚀建筑材料、金属结构、油漆等。有损人体健康。 酸雨使地面水和地 卜 水变酸 世界各国现在都己经逐步认识到了降低燃料油中硫含量的重要性， 因此出台了一 系列法规对燃料油的硫含量进行了控制。美国是对燃料油中的硫含量控制较严的国 家，美国柴油a s t m规定，低硫柴油硫含量不得大于0 .0 5 %.其实，美国从1 9 9 3 年 1 0月起就已 通过了 大气清洁法修正案，该 修正 案的实施， 对油制品的含硫量提出了 严 格的 限 制 。 新 配 方 汽 油 要 求 硫 含 量 不 大 于l 0 0 p p m ， 柴 油 硫 含 量 不 大 于5 0 0 p p m 7 l o 与此同时，这股限制油品含硫量的浪潮正波及美国以外的地区，欧洲在 1 9 % 年也将 柴 油 中 的 硫 含 量 从 原 来 的 不 大 于2 0 0 0 p p m降 低 到 不 大 于s o o p p m 。 而 亚 太 地 区比 起 欧 美来， 还存在一定的差距， 但随着环保意识的提高， 正在为低硫化努力，比如日 本在 1 9 9 7 年 就 将 硫 含 量 降 低 到5 0 0 p p m以 下 a l 目前我国柴油生产量已超过3 0 0 0 万吨，但作为车用燃料大约只占2 0 %左右。我 国柴油的现行标准对硫含量的规定为:优级品不大于 2 0 0 0 p p m，一级品不大于 5 0 0 0 p p m 。 总的 来看， 我国 生 产的 柴油 硫含量 基本上 都在规定 控制范围 之内， 然而随 着我国汽车工业的发展和对环保要求的提高， 以及我国加工进口高硫原油的数量逐渐 增加， 柴油硫含量的问题不能等闲视之， 尤其是我们与世界车用柴油低硫化的趋势相 比还有很大差距9 1 世界范围内日益严格的硫排放标准迫使炼厂生产低硫石油产品。 燃料油中硫的处 理将成为今后几十年石油加工工业所面临的迫切问题。 随着世界高含硫原油的不断增 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第一部分前 言 加，原油中的硫含量预计将从1 9 8 5 年的0 .9 %上升到2 0 1 0 年的1 .4 %， 炼油厂每年都 将投入巨大的 财力用来生产加工符合要求的低硫石油产品o o l 科技与环保己成为人类可持续发展的两大支柱， 从降低和消除环境污染， 维护生 态平衡出发的绿色化学与化工在全球范围内受到日益广泛的重视， 脱硫技术理所当然 地成为人们普遍关注的热点o u 2 .脱硫常用的手段 长期以来， 炼油工业一般采用碱洗的办法来脱除油品中的硫化物， 这一方法较为 简单， 但存在诸多问 题， 如环境污染严重， 脱硫效率低等等。 原油通过碱洗，可以除 去油品中的绝大部分硫化物， 但却产生大量的含硫废水， 如果不加以妥善处理， 对环 境的 危害会相当 严重 1 2 1 。 此外， 由 于碱洗对有机硫化物的脱除率不高， 油品中还含有 不同程度的有机硫化物。 加氢脱硫法 ( h d s ) 是从燃料油中脱硫的一种传统技术。 在加氢脱硫过程中， 石 油馏分在无机催化剂和氢的催化下进行高温高压处理。有机硫分子转化成 h 2 s , h 2 s 经过处 理生成元 素 硫 l 3 l 。 但是 要 想把 硫含 量降 低到很低的 水平， 加 氢脱 硫就十分昂 贵， 而且效率很低。 特别是它对脱除有机硫， 尤其是噬吩中的硫效果很差， 远远不能达到 含硫标准。 生物脱硫法 ( b d s ) ，又称生物催化剂脱硫，是一种在常温常压下利用需氧、厌 氧菌去除杂环化合物中结合的有机硫的一 种新技术。 脱硫细菌中的酶可以 有选择性地 氧化硫原子进而分开碳硫键， 而含硫化合物其烃类母体的骨架并不受到影响， 也就是 说并不影响烃的燃烧热值。 生物脱硫技术与以往炼油厂常用的加氢脱硫技术相比 有许 多 优点:生物脱硫能在常温常压下操作; 较低的 c o z 排放量和较少的能耗: 较少的 投资和操作费用。 人们期望生物脱硫可以为炼油厂提供一个低成本的有效方法， 既能 符合新的低硫标准，又可以降低耗能，并减少二氧化碳的生成量。最近的研究表明， 如果用生物脱硫代替加氢脱硫，可以 大幅度地降低能耗和二氧化碳的生成量1 1 4 , 1 5 j 在将硫含量降低到很低水平的情况下， 生物脱硫与加氢脱硫相比 在能耗和二氧化 碳生成量方面的占有很大的优势 ( 见表2 ) 0 由此可见， 油品生物脱硫具有较低的投资和操作费用、 低温抵压操作、 不需要氢 气、耗能少及排放二氧化碳少等优点，是一种新型的环保型生物技术。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第一部分前 言 表2 :生物脱硫与加氢脱硫的能耗及c o i 生成量的比较 脱硫工艺 柴油脱硫 0 . 2 0/ - 0 . 0 0 5 % 柴油脱硫 0 . 0 5 0/ o - 0 . 0 0 5 % 能耗 ( i )生成c o i ( l )能耗 ( j )生成c o z ( l ) hds bds h ds / b ds ( %) 3 . 生物脱硫的研究概况 3 . 1生物脱硫的模型化合物 燃料油中的无机硫化合物， 以及部分有机硫化合物可以经过加氢脱硫的除去。 而 噬吩类硫化合物， 尤其是二苯并唾吩( d i b e n z o t h i o p h e n e , d b t ) ， 则一直是加氢脱硫的 一 个难题。 这种化合物十分稳定， 在高温高压下也难以被催化加氢。 而且它与它的衍 尘物广泛存在于石油的有机硫组份中，占了燃料油中有机硫的重要部分。 因此， 燃料 油生物脱硫的研究，从某种意义上讲就是对二苯并唾吩中硫元素进行生物降解的研 究，d b t就成为了现代脱硫工业的模型化合物。 3 .2生物脱硫的主要模式 1 9 6 8 年， k o r k i k o d a m a等人在研究苯环化合物对农作物生长影响时发现假单胞 菌 属的p . a l c a l ig e n e s . 可以 将d b t 氧化成为几种不同的 水溶性产物。 他们通过进一步 研究发现这样氧化的结果是d b t苯环中的c -c键发生了断裂，使苯环分子最后变 成了水溶性较强的分子， 但硫并没有从分子中除去 ( 见图2 ) 。另外，k o d a m a 还在 刀 was卜 二 j 阵 架刹创 目陌谭囚二 、 洲凡，产 。 . 卜 月日田琅 c 目 . 日 . -. 图2 . 生物脱硫的k o d a m a 途径 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第一部分前 言 研究中发现除了 使d b t上苯环的c -c键断裂的途径外，这类细菌还有可能将d b t 氧化成水溶性的d b t亚 矾或矾， 但没有检测到进一步的氧化使硫从d b t 分子中 释放 出来。 这条氧化途径就被称之为k o d a m a 途径1 1 6 . 1 7 1 1 9 9 2年，美国天然气研究所 ( i g t )分离到一株玫瑰色红球菌 ( r h o d o c o c c u s r h o d o c h r o u s) i g t s 8 。与k o d a m a 途径不同的是， 这株菌可以 经过4 步反应将硫原 f 从d b t 上脱下来，生成硫酸 根和二轻联苯 ( 2 - h b p ) ， 称之为4 - s 途径【 “ ， 1 9 1 爷中 ;曲 cm 卜心 盆 月 至笨舀)华皿翻趁口 2 - ( 卜处乖若攀里. 二 ，2 ，口 二琴娜 l会 图3 .生物脱硫的4 s 途径 3 .3 生物脱硫技术的开发状况 1 9 7 4 年， v e b p e t r o c h e m i s c h e s k o m b i n a t s c h w e d t 公司用从含油土壤中 分离到的 混合菌， 在装有油的4 升发酵罐中 进行培养， 五天内脱去原油中5 5 %的硫， 但也损失 了 3 0 % 的 原 油 12 0 1 随后， u n o c a l 公司报道用假单胞菌将有机硫化物降解成为水溶性产物，并产生 表面活性剂， 有利于油水 接触， 但其 脱 硫效率较低， 仅为 传 统h d s 的1 / 1 0 12 0 1 0 以上研究工作都是建立在以k o d a m a 途径分解d b t的基础之上的。利用这些细 菌虽然能够降解有机硫化物， 但并没有真正的将硫原子从有机硫化物上脱除下来， 仅 仅是将之与油相分开， 也不可避免地对油中的芳香烃类造成破坏， 脱硫后燃油中的有 价值成分大为减少，使燃料的利用率大大下降。 v 型 迭 些 竺丝 4% )iq* 4 01i -lp生 一一 一 - 一一 - 一 “m - 0 s w 7 据此， 研究者们提出了经典的生物脱硫菌种筛选的十大原则t2 0 1 . ( 1 )培养物应对唾吩类硫化物及相关的有机硫化合物具有高度的特异性。并且 应能在短时间内起到作用。培养物不应被这些反应底物所抑制。 ( 2 ) 培养物应可以降解在燃料油中存在的其它结构相似的有机硫化合物。 ( 3 )脱硫微生物应可耐受燃料油中存在的各种重金属离子。其生长不应被这些 离子所抑制。 ( 4 ) 培养物不应降解不含硫的石油烃类物质，不应影响燃料油的热值。 ( 5 ) 培养物不应对脱硫处理过程中的p h及培养温度的细微变化敏感。 这样， 可以使脱硫过程更加简单易行。 ( 6 ) 微生物脱硫处理的培养基配方应简单，不应含有价格昂贵的碳源或氮源。 ( 7 )脱硫后的代谢产物应可以被进一步降解或代谢，不能产生新的环境问题。 ( 8 ) 所用微生物在脱硫处理后不能对环境有所危害。 ( 9 )基于以上原则分离出的脱硫微生物及基因工程菌株应该能够稳定遗传，长 期保持脱硫能力。 由此可见，玫瑰色红球菌 ( r h o d o c o c c u s r h o d o c h r o u s)i g t s 8以 4 s途径降解 d b t , 正是一株符合上述生物脱硫原则的理想菌株。 现在， 有许多学者分离到了 新的 可由4 - s 途径降解d b t的菌株。 如1 9 9 4 年i z u m i 等人从土壤中分离到红平红球菌( r . e r y t h r o p o l is ) d - 1 ， 可在4 8 小时内 通过4 - s 途径完全降 解浓度为0 . 1 2 5 m m 的d b t . 降 解能力十分高 12 11 0 1 9 9 5 年， o m o r i 等人还筛选到了 既可利用d b t ， 又可利用二甲 基 硫化 物 ( d m s ) ， 二甲 基亚 矾 ( d m s o ) 的 红 球 菌r h o d o c o c c u s s y 1 12 2 1 e 1 9 9 8 年， r h e e 等人分离到可用于柴油脱硫的戈登氏菌g o r d o n a c y k s 1 。利用这个菌株，可以 在十二 小时内 将中 馏分油的 含 硫量 从0 . 1 5 % 降 至。 . 0 6 0% 2 3 1 。自 此 生 物脱 硫技 术的 发 展进入了新的阶段， 有关国家和各石油厂家和公司投入巨额资金积极开发生物脱硫技 术。 1 9 8 9 年， 北达科他 ( n o r t h d a k o t a ) 大学y o u n g 等人在利用i g t s 8 菌株的d b t 分解过程中的 代谢中间体进行分离， 鉴定， 确认了与相应酶活性的 相关基因 2 4 1 ， 于是 于 1 9 9 0年对石油生物脱硫感兴趣的有关厂家和公司成立了能源生物系统公司 ( e b c ) ， 从i g t 购买了b d s 技术和专利， 专门 从事该技术的工业化开发。 为此， 该 公司与下列5 各公司结成了进行b d s 研制与工业化的伙伴关系: p e t r o l it e 公司， 该公 南开人学硕上 毕业( 学位) 论文 第一部分前 言 司 拥有大型炼油企业， 提供科研经费和 b d s装置工业化的技术服务; m . w .k e l l o g g 公司提供工业化b d s 装置的基础工程和设计工作: t o t a l 公司，为中试装置提供柴油 原料; k o c h 炼制公司， 为汽油b d s 工艺研究提供炼厂装置操作， 产品质量装置提供 汽油原料:t e x a c o股份有限公司勘探开发技术公司，提供原油，研究原油的生物脱 硫t - 艺 2 5 1 e b c由m o n t i c e l l 。负责该技术的工业化开发工作，1 9 9 0 年以来已在生物脱硫催 化剂的活性， 稳定性和发酵产率等方面迈进了一大步， 论证了工艺的可行性， 获得了 多项专利。该公司 将催化剂的比活性由1 9 9 0 年的0 . 1 脱硫单位 ( d s u ) 提高到1 9 9 5 年的3 0 d s u ， 将催化剂活性提高到最初活性的3 -5 倍， 对红球菌进行基因改造， 在 以后的几年里还可以增至1 0 2 0 倍， 催化剂的稳定性己从6 - 1 0 小时提高到2 4 小时， 而催化剂发酵产率也由 最初 l g / l提高到 6 0 g / l 。由 于这些技术进展， e b c公司， p e t r o l i t e 公司， k e l l o g g 公司联合设计的连续生物脱硫先导试验装置于1 9 9 5 年3 月 起 在p e t r o l i t e 公司圣路易斯厂开始运转，其规模为5 桶旧 ， 投资 1 5 0 万美元，原料为 从法国运来的加氢中馏分油。中试研究的目的是完善工艺控制计算机模拟使其更合 理，并建立工艺设计基础。据报道，中试装置运转平稳，已达到预期效果，到达 4 5 %的计划脱硫率。中试负责人mo n t i c e l l o 认为， 这不过是初期实验目 标， 该工艺有能 力将硫脱除千净。e b c正在积极搜集中试数据，与t e x a c 。 公司共同开发实际装置， 如果成功，则在此基础上与t o t a l 公司合作将b d s 用于柴油脱硫作为首次商业应用， 在法国建一套5 0 万吨 / 年工业化生物脱硫装置，1 9 %年生产超低硫柴油 2 0 e 日 本是由 石油能源中心( p e c ) 得到资源能源厅的资助， 投入5 0 0 0 万美元于1 9 9 3 年 1 0 月开始进行了石油精制生物技术的研究开发。研究开发分3 个阶段:第一阶段 为9 3 年至9 5 年， 主要进行基础研究， 包括探索和改良 脱硫脱金属菌， 开发生物反应 器后分离技术等， 第二阶段为%年至9 8 年主要进行应用技术的开发， 包括进行中试 前的数百升规模的试验等; 第三阶段是根据第二阶段的进展情况， 在有良 好成效时建 中试装置进行实用化研究， 包括对工艺的补充完善和装置运转。 日 本当前生物脱硫主 要课题是柴油的超深度脱硫，开发高档次产品，减轻现行h d s的负荷，1 9 9 3 年主要 用己有的通性厌氧脱硫菌对代谢途径和变异菌株的制作进行了 试验和调查。 目 前已 筛 选出了多种可切断碳硫键的菌株， 并已开发了利用微好氧或厌氧微生物的生物脱硫技 术，并获三项专利2 6 . 2 7 1 南开人学硕 卜 毕业 学位) 论文 第一部分前 言 欧洲一些国家在煤的生物脱硫中已 获重点进展。1 9 8 8年由英德荷意四国共同 进 行了 细菌浸出( b a c t e ri a l e a c h i n g ) 型煤微生物脱硫计划， 近年来在意大利建成中型装 置，收集各种数据，以便建成商业装置，以进入最终阶段。 对石油的生物脱硫。德国 和意大利也己 制定开发 研究计划， 并 在进行 之中 (2 8 1 。 意 大利 注重 研究重油的生 物脱硫 过程， s e t t i 等在1 9 9 2 年就提出正 构烷烃通过好氧假单菌种( p s e u d o m n a s s p . ) 影响芳 烃硫化物的生物降解。 法国t o t a l 公司己于美国e b c结成合作关系开发生物脱硫技术， 并 在法国 建 5 0万吨 / 年工 业化装置 (2 9 1韩国 也在研究生 物脱 硫技术， 注重研究 采用 d e s u lf o v i b r i o d e s u lf u r i c a n s m 6 菌 进行 厌 氧脱 硫的工艺 过 程， 目 前 似乎也在进行基础 研 究，筛选菌株。 3 .4 4 s 途径脱硫分子机理的研究进展 d e n o m e等人(2 4 1 于 1 9 9 3年分离与确认了 脱硫基因。 他们发现革兰氏阳性细菌 r h o d o c o c c u s s p . i g t s 能 够将d b t 转化 成2 - h b p ， 从 而 脱去 其中 的 硫。 并以 粘性 质 粒p l a e r 5 为 载体， 构建了i g t s 8 菌株的 基因文 库。 i g t s 8 菌株通过进一步 诱变， 得到了一突变株u v 1 .该 菌株已失去脱硫能力。这时 将基因文库中带有i g t s 8 染色 体片断的重组质粒转入 u v 1 ，发现有脱硫能力的重组菌落，但是在菌落中却找不到 游离的重组质粒。他们分离到这些外源 d n a片断，并以这些片断为探针来检测在 e . c o l i 中的原始的基因文库。 通过一系列的实验发现，某些带有外源d n a片断的粘 性重组质粒经电穿孔转入u v 1 菌株， 可使u v 1 恢复脱硫能力. 当把来自r h o d o c o c c u s 质粒的复制起点也转入时，这些克隆的转化效率随之提高2 0 - 5 0 倍，并且可以分离 到游离质粒。限制性酶切图谱和亚克隆表明该基因存在于一个 4 k b d n a的片段上。 最后， 通过转 化将表 现型 转移给了 一 株不 利 用 硫的 藤 黄红 球菌( r . f a s c i a n s ) d 1 8 8 - 5 和突变 株u v 1 ， 从而说明己 经 成功 地将i g t s 8 菌株的 脱 硫基因 分离出 来(3 0 . 3 1 1 紧 接 着在1 9 9 4 年， d e n o m e 等 人 ( 19 1 又 进 行了d s z 基因 的 鉴 定 及 产 物分 析 ， 缺失突变证实了3 个开放阅读框架是脱硫必需的 白表达结果表明s o x c是一个约4 5 k d的蛋白质， 将之分别命名为 o x a . b , 移码和 c。蛋 氧化d b t 成为d b t 0 2 . s o x a是一 个约5 0 k d的蛋白质，负责d b t o : 向一未知中间体的转化，s o x b是一个约4 0 k d的 蛋白质，同s o x a一起，完成d b t 0 2 向2 - h b p的转化。蛋白质序列分析表明 s o x c 和乙酞辅酶 a脱氢酶具有同源性，s o x a和 s o x b未找到类似的蛋白质。 南开大学硕卜 毕业( 学位) 论文 第一部分前 台 1 9 %年， b . l e i 等 3 4 将d s z c 基因 在e c o l i 中高 表达， 并且 发 展了 一 套表达产物 的分离纯化步骤， 他们将酶的特性和催化反应机制也研究的较清楚。 认为该酶是一个 分子量为 9 0 ,2 0 0 d的同型二聚体。 f m n h : 是必需的电 子供体。 利用不同有效量的 f m n h : 为 底物进行试验发 现， 该酶催化分阶段的d s t 转化过程， 即由d b t到d b t 亚枫，然后再到d b t - 讽。 利用同位素标记 底物发现d b t亚矾和d b t - 飒中的氧来自 分子氧. 进一步的实验发现该酶也利用苯甲 基硫化物和苯甲基亚矶， 因此作者把它确 定为硫化物/ 亚矾单加氧酶。这个单加氧酶类似于微粒体黄素单加氧酶，但是它不同 于其它微生物黄素单加氧酶，因为该酸催化两步连续的单加氧反应。 钱皿 九 翻t 万 班 澎 比 成c . q 二 润盛盯 妞3 怜5 -一. 一甲 血 7 . 亡 二甘井.扮 z.井.公y砚 场脚 自 幻 h 矛 挑 : s 二旅井 口 朋 血 . : 斑舀改琴 令二皿住.盆 图4 4 s 途径反应机理 由 此可见， 在红球菌中有三个酶与d b t的氧化降解相关， 分别为d s z c , d s z b和 d s z a 。其中， d s z c ( 4 5 k d a ) 是控制反应速度的关键酶，催化从d b t到d b t 0 2 的 反应。 它的催化反应需要f m n h 2 参加， 是一种单加氧酶o d s z a ( 5 0 k d a ) 催化d b t 0 2 向h p b s 的反应。 然后， 由d s z b ( 4 0 k d a ) 催化最后一步反应。 而其终产物中脱下来的 硫形成的亚硫酸盐 会对前面的关键酶d s z c 产生抑制作用 见图4 ) 。 因此， 从自 然筛 选到的野生型红球菌脱 硫能力 较低。 但如果通过基因 操作手段， 则 有可能会提高其脱 硫效力3 5 -4 2 1 3 . 5 4 s 途径的研究展望 m. e o d a m 。等构建的假单胞菌重组体，具有脱硫和分泌生物表面活性剂两种特 性， 从而能够增加硫水化合物在水相中的浓度， 也就提高了双液相生物反应的物质传 递 速率 4 3 。 然 而由 于 重 组 体p . a e r u g i n o s a p g 2 0 1 的 生 物 表 面 活 性剂 随 着一 定限 制 浓 度的氮和铁在对数生长期和稳定期分泌， 因此今后有关生物表面活性剂的产生对菌体 脱硫的影响的研究要继续进行。 设计合适的具有脱硫活性的重组体， 将会推动生物脱 南开大学硕 七 毕业( 学位) 论文 第一部分前 言 硫的商业化进程。 4 。生物脱硫实现工业化的关键技术 4 . 1生物催化剂性能的提高 生物脱硫技术至今还没有广泛应用的原因之一是在原生菌中的脱硫酶浓度太低 以至影响了反应速度和活性， 即: 脱硫酶的寿命、 选择性都还不能满足工业化催化反 应所需的基本要求。 为此e b c公司从 1 9 9 2 年开始对催化剂的活性、 寿命及选择性进 行了 研究并取得了长足的进步:通过基因化提高了脱硫酶的浓度，优化了反应条件， 将脱硫酶活性提高到原来的2 0 0 倍以上; 利用固定化细胞的方法， 结合再生了将催化 剂寿命由原有的2 4 - 4 8 小时提高到现在的 2 0 0 - - 4 0 0 小时。 4 . 2生物反应器设计问题 反应器的设计应以在保持生物催化剂脱硫能力不变的前提下， 以最大限度地提高 油品的脱硫速度， 降低反应器的制造、 操作、 维修成本为目 标。图5 给出了一个设想 中的 连续搅拌罐式反应器的构造44 l 从该反应器可以 看出: 将高含硫油，工艺化学试剂和生物催化剂都投入到反应器 中，反应后，脱硫油、含硫水和生物催化剂的混合物连续从反应器中移出。油一 生物 催化剂一 水的混合物进行两步分离操作: 第一步， 生物催化剂和水从脱硫油中分离出 来;第二步，把硫副产品 ( 呈水样) 从生物催化剂中分离出来， 生物催化剂再返回 到反应器中继续使用. 彗物侄化封和水 脱珑油 二艺i j 拿试，.l 高含破汕 和试荆 坟 i; i 产片 图5 生物脱硫反应皓 . 1 2 . 南开大学硕士毕 业( 学位) 论文 第一部分前 言 5 .脱硫工艺的探索 近年来， 国外生物催化处理工艺发展得很快， 下面是几个由ebc公司研制运行 的处理工艺， 从中可以 看出生物脱硫技术的一些优点 fa s t 5 . 1 h d s 顺流连接b d s 图6 为h d s 顺流连接b d s 脱硫工艺。 在处理含2 0 % 轻质催化循环油的进料混合 物时， 通过在h d s 装置后串接b d s 装置不仅大大减少了 深度脱硫所需的氢气、 避免 了 过饱和芳香族化合物同加氢脱硫后产生的沸腾燃料混合物相结合， 而且减少了 燃料 的损耗和c 仇的排放量。该工艺可使柴油脱硫率达6 5 % -7 0 1/ o , 硫排放含量低于 5 0 u/ m l。 ， 岁 川 。 0， ， 场5*. 一h = y , 空 气 生抽 脱砍 装丈 s c 5 0 fi s . n i l n ( 5 ) 念 5 w ! k - i n l 从酸性副产品 图6 h d s r流连接 b d s 5 .2 b d s 代替h d s 图7 为b d s 代替h d s 直接脱硫工艺。使用该工艺处理中度含硫燃料，其脱硫率 在4 0 % 7 0 % 之间。 该工艺不仅节省了氢气、 减少了 燃料的损耗和c o : 的排放量， 而 且不需要二段脱硫和尾气处理装置，大大降低了成本，适用于小型炼厂使用。 图7 b d s 直接脱硫 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第一部分前 言 上述的2 种工艺代表了国外bds 工艺目 前研究发展的基本情况， 对b d s 在炼 厂的工艺组合及最优化的设计研究还在进行之中。 5 .3脱硫后生物催化剂分离和对硫副产品的处理 用传统的油水分离技术诸如静电沉降和离心分离就可以从油中将生物催化剂分 离出来。 产品的处理是生物脱硫技术的一个种要环节， 从油中分离出来的硫最后大多 转变为 硫酸盐离子， 这些硫酸盐离子可以 跟不同的阳离子结合生成盐 例如: 与n h 4 十 、 n a + , c a z + 结 合生 成了 不同 的 硫酸 盐， 而 后 干 燥以 副 产 品的 型 式出 售 4 6 1 6 . 国内 进展情况 国内这方面的工作开展的很晚，目前还处于刚刚起步的阶段。1 9 9 5年，中国科 学 院 微生 物 研究 所的 钟慧 芳 4 7 1等 人 在进 行 煤炭 脱 硫的 研究 工 作中 筛 选 到了3株 假单 胞菌， 就是可以这样利用d b t 作为碳源， 达到对煤炭脱硫的目 的。 利用他们的菌种， 最终可脱除煤炭有机硫的 3 4 %，而产物分析表明他们并没有找到专一切断 c - s键的 细菌。 1 9 9 9年， 生 态 环境 研 究中 心的 闰 海 4 s 等 人 研究了 乙 醇 对 红 平 红 球 菌 脱 硫酶活 力的影响， 通过研究发现乙 醇可以 促进辅酶f m n h z 的生 物合成量。同 年，中国石化 集团 公司 信息中 心的 廖 健 1 3 等 人 综 述了“ 柴油 生 物 脱 硫 技 术的 进 展” ， 介 绍了 柴油生 物脱硫的工艺流程， 生物催化剂的开发以 及反应与分离工程， 对美国能量生物系统公 司柴油生物脱硫工艺技术和工业化现状作了分析和展望， 并提出了生物技术在我国炼 油工业中的应用方向。到目 前为止国内还没有发现应用细菌进行4 s 途径脱硫处理的 报道。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文第一部分前 言 7 . 本题目的研究意义 综上所述， 生物脱硫由于其固有的优势， 在国内外有着广泛的应用前景， 尤其是 随着国内进口高硫原油比例不断上升， 以及国内含硫排放标准的国际化进程， 生物脱 硫及其相应的辅助脱硫途径必将占 据重要地位。本课题是天津市自 然科学基金项目， 课题的重要指标是柴油脱硫效率的下降指标， 低含硫的柴油为今后应用的环保化， 经 济化和国际化奠定了雄厚的基础。 进行生物脱硫， 关键是先要有好的菌种。 本文从菌种的分离与筛选入手， 首先要 得到了以不同途径降解二苯并咪吩的菌株，对它们的生理特性以及脱硫方式进行研 究，然后比较它们对柴油的作用效果，以确定适于脱硫研究的理想菌株。然后， 对此 菌株的培养条件进行探索， 以各种方法尝试提高其脱硫效率， 如紫外诱变、 培养基优 化、固定化细胞等，最终作用柴油，检验其脱硫效果。 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位) 论文 第二部分 材料与 方法 第二部分 材料与方法 1 。实验材料 1 . 1菌种:d s - 1筛选自 本室保藏 3 0 7 株菌种。 d s - 2分离自 孤岛油田炼油厂土样。 d s - 3分离自 孤岛油田油浸土样。 1 .2零号柴油:购于南开大学加油站， 含硫量为9 8 6 n g / u l o 1 . 3培养基: ( 1 ) b s m培养基: 磷酸二氢钾: 2 .4 4 克磷酸氢二钠:5 .5 7 克 氯化按:2 .0 0 克; 氯化镁: 0 .2 0 克氯化钙: 0 .0 2 克;三氯化铁:0 .0 1 克; 无离子水: 1 0 0 0 m l p h : 7 .2 ( 2 ) b s m 2 培 养基: 根 据正 交实 验结果 优化而 得。 磷酸二氢钾: 2 .4 4 克 磷酸氢二钠:5 . 5 7 克硝酸钱:4 .0 0 克; 氯化镁: 0 . 1 0 克氯化钙: 0 .0 2 克;三氯化铁: 0 . 0 1 克; 葡萄糖:5 克乙 醇:2 克无离子水: 1 0 0 0 m l p h : 8 . 2 ( 3 ) n b培养基: 牛肉 青: 0 .4 克; 蛋白 陈: 1 .0 克; 氯化 钠: 0 . 5 克 水1 0 0 m l p h : 7 . 2 . ( 4 ) l b培养基: 胰蛋白 膝:1 克; 酵母粉: 0 .5 克; n a c l : 1 克;水1 0 0 m l p h 7 .2 - 7 .4 1 . 4主要试剂 ( 1 ) 二苯并唾吩、二轻基联苯、二苯并唾吩矾购自a c r o s 公司， g ib b s 试 剂 购自s ig m a 公 司 ( 2 ) 薄层层析试剂: 环己 烷，正己 烷 ，无水甲 醇， 无水乙醚， 无水乙醇 ，氯仿， 石油醚。 ( 3 ) 蛋白电泳试剂: 03 0 %丙烯酞胺储备液 ( 丙烯酞胺:n , n 一 甲叉双丙烯酞胺丙烯酞胺=2 9 : 1 ) 1 5 .5 5 g 丙 烯酞 胺 + 0 .4 5 g n , n 一 甲 叉双丙 烯酞 胺丙 烯酞胺溶于5 0 m l d d h z 0中。 .浓缩胶缓冲液储液 ( 1 m t ri s - h c i , p h 6 . 8 ) .分离胶缓冲液储液 ( l s mt ri s - h c i , p h 8 . 8 ) 南开大学硕 卜 研究生毕 业 ( 学位) 论文 第二部分材料与方法 ( 4 )固定化细胞试剂: r t v二甲基硅橡胶，二甲基轻基硅油 辛酸亚锡，正硅酸乙e 3 6 主要仪器与设备 z f - i 型三用紫外分析仪 旋转薄膜蒸发器 ( z f q - i o l ) 7 2 1 分光光度计 微量注射器 ( l o u l ) 高速离心机 t g l - 1 6 型台式离心机 真空冷冻干燥器 光学显微镜 电子显微镜 笔式酸度计 a n a s t a r色谱工作站 s h i m a d z u g c - 7 a气相色谱仪 凝固点测定仪 磁力搅拌器 wk - 2 b微库仑测硫仪 上海顾村电光仪器厂 天津玻璃仪器厂 上海第三分析仪器厂 上海医用激光仪器厂 美国b e c k m a n j 2 - m c 上海安亭实验设备厂 美国 l a b c o n c o 日 本 o l y m p u s p h i l i p s e m 4 0 0 - s t 葡萄牙h a n n a公司 美国b e c k m a n 日本岛津 天津分析玻璃仪器厂 常州国华电器有限公司 江苏电分析仪器厂 2 . 1 实验方法 菌种分离 、. l，山 ( 1 ) 取 1 克土样， 置于l 0 0 m l b s m - d b t培养基中， 进行富集培养。 培养条件: 旋转摇床2 5 0 转/ 分钟， 3 0 培养4 8 小时。 ( 2 )富集培养基中吸取1 m l 菌液转移至新的5 0 m l b s m - d b t 培养基中，进行发 酵培养。培养条件同上。 ( 3 ) 进行d b t 平板划线，初步分离纯种。 ( 4 ) 挑取单菌落接入装有5 m l 营养肉汤培养基的试管内， 3 0 c 震荡培养2 4小时， 作为种子液。 ( 5 )取1 m l种子液接入装有5 0 m l b s m- d b t培养基的2 5 0 m l三角瓶中，3 0 c 震 荡培养7 2 小时，对发酵液进行检测，以确定菌株是否对二苯并唾吩有降解作用。 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位)论文 第三部分 结果与讨论 3 . 菌种降解d b t途径的确定: 3 . 1 d s - 1 降解二苯并唾吩的代谢途径 ( 1 ) 发酵液的颜色变化: d s - 1 菌被分离筛选出来的标志之一就是它在 b s m - d b t培养基中培养时，发 酵也会成为红棕色。这正与文献中所报道的以k o d a m a 途径降解d b t的菌的培养 特征类似。因此， 对它的进行了进一步研究，以确定这种红棕色物质是否是它降解 二苯并唆吩得到的。因此进行了以下实验。 表4 d s - i 作用d b t 发酵液上清颜色变化趋势 培养时间2 4小时3 6小时 实验组