（水生生物学专业论文）米氏凯伦藻与环状异帽藻的分子鉴定研究.pdf

上海海洋大学2 0 0 9 届硕十学位论文 米氏凯伦藻与环状异帽藻的分子鉴定研究 摘，要 赤潮藻类的鉴定是治理赤潮的关键步骤。目前，利用分子生物学手段检测微 藻的方法日渐成熟，许多学者通过对核糖体r d n a 序列分析成功进行了分子鉴定。 据报道米氏凯伦藻( k a r e n i am i k i m o t o i ) 和环状异帽藻( h e t e r o c a p s ac i r c u l a r i s q u a m a ) 属于2 种外来入侵赤潮藻类，该两种藻入侵可能与船舶压舱水传播有关。本研究通 过对两种外来入侵赤潮藻的培养，结合传统鉴定方法和p c r 、环介导等温扩增 ( l a m p ) 法等方法进行定性分析，初步构建了这两种外来入侵赤潮藻的分子鉴定方 法，为控制外来入侵赤潮物种，赤潮的快速预报和治理提供技术支撑。 本文主要包括以下方面： 一、概述赤潮的产生、危害、分类、成因，我国赤潮状况及赤潮生物鉴定研 究历史和国内外研究现状。在利用分子生物学鉴定方面，概括了p c r 、l a m p 等鉴 定技术的研究概况。 二、对赤潮多发藻米氏凯伦藻核糖体1 8 sr d n a 及其转录间隔( i t s ) 区序列 p c r 扩增后测序，获得1 8 sr d n a 和i t s 基因序列。结合1 2 种甲藻和1 种硅藻作序列 比较分析，以寻找适宜设计特异性引物探针区域，并用邻接法构建系统进化树， 研究各藻种间亲缘关系。结果表明以1 8 sr d n a 与i t s 序列构建的进化树拓扑结构相 一致，1 8 sr d n a 序列相对保守，适合进行属以上关系的系统进化分析，而i t s 序列 变异较大，适合种属问鉴别分析，且i t s l 和i t s 2 是变异很大的区域，适合种间的 分子特异性鉴定。 三、利用核糖体转录间隔区( i t s ) 区分别设计出针对两种外来入侵赤潮藻米氏 凯伦藻和环状异帽藻的特异性p c r 扩增引物，通过筛选，选择最佳引物 k i l f 3 k i l b 3 、y i f 3 a y i b 3 a 。以链状亚历山大藻似l e x a n d r i u mc a t e n e l l a ) 、立玛原甲 藻( p r o r o c e n t r u ml i m a ) 、牟氏角毛藻( c h a e t o c e r o sm u e l l e r i i ) 、赤潮异弯藻( h e t e r o s i g m a a k a s h i w o ) 作为阴性对照，做进一步p c r 验证，为赤潮的预测预报提供分子鉴定基 础。 四、利用环介导恒温扩增( l a m p ) 技术成功检测了外来入侵赤潮藻米氏凯伦藻 t 上海海洋人学2 0 0 9 届硕士学位论文 基因，并对其反应程序和反应体系进行了优化，建立起一种简单快速的微藻检测 技术。利用本实验优化体系对米氏凯伦藻进行了l a m p 扩增，得到了理想的扩增 产物，同时与其他8 种藻类做阴性对照实验，只有米氏凯伦藻为特异性扩增，其 他藻类均呈现阴性反应。另外，对扩增终产物进一步进行酶切分析，并与以f 3 和 b 3 为引物的p c r 扩增的片段相比较，均与预期结果相吻合。采用2 种方法进行肉 眼检测阳性反应结果，阳性反应管内可见白色焦磷酸镁沉淀，与s y b rg r e e ni 反 应呈现绿色。本文首次将l a m p 技术应用于米氏凯伦藻的快速检测，初步建立了 外来入侵藻类的快速检测方法，有望应用到赤潮藻类的现场检测，在赤潮的预测 预报中发挥强大作用。 关键词：外来入侵赤潮藻类，分子鉴定，1 8 sr d n a ，i t s ，p c r ，l a m p 上海海洋人学2 0 0 9 届硕十学位论文 m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o no fk a r e n i am i k i m o t o za n d h e t e r o c a p s ac i r c u l a r i s q u a m a a b s t r a c t i d e n t i f y i n gs p e c i e so f r e dt i d ea l g a ew a sac r u c i a ls t e pi nt h ep r o c e s so f c o n t r o l l i n g r e dt i d e s a tp r e s e n t ，t h eu s eo fm o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d so n i d e n t i f y i n g t h e m i c r o a l g a ei sb e c o m i n gm a t u r e m a n ys c h o l a r sh a v ei d e n t i f i e dm i c r o a l g a es p e c i e s s u c c e s s f u l l yt h r o u g ha n a l y z i n gt h e i rr i b o s o m a lr d n as e q u e n c e k a r e n i am i k i m o t o ia n d h e t e r o c a p s ac i r c u l a r i s q u a m aw e r er e p o r t e da st w ok i n d so fi n v a s i v er e dt i d ea l g a e w h i c hw e r es p r e db ys h i pb a l l a s tw a t e r - b o r n e o u rl a b o r a t o r yh a dc o m b i n e dt h e t r a d i t i o n a li d e n t i f i c a t i o nm e t h o d sw i t hp c r ，l a m pm e t h o d st oa n a l y s i st h et w oa l g a e q u a l i t a t i v e l y w eh a di n i t i a l l yc o n s t r u c t e dt h em e t h o d so fm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o nf o r c o n t r o l l i n ga l i e ni n v a s i v es p e c i e sa n df o r e c a s t i n gr e dt i d e w ea l s oh a dp r o v i d e dt h e t e c h n i c a ls u p p o r ta f t e rc u l t i v a t i n gt h et w oa l i e ni n v a s i v er e dt i d ea l g a e t h ep a p e rc o n t a i nt h ef o l l o w i n ga s p e c t s ： 1 a no v e r v i e wo ft h ee m e r g e n c e ，d a m a g e ，t a x o n o m ya n dt h ec a u s e so fr e dt i d e ，t h e s i t u a t i o no fc h i n a sr e dt i d e s ，a l s ot h ei d e n t i f i c a t i o nh i s t o r yo fr e dt i d eo r g a n i s m sa n d t h er e s e a r c ha th o m ea n da b r o a d i ns o m ea s p e c t so ft h eu s eo fm o l e c u l a rb i o l o g y t e c h n o l o g yt oi d e n t i f i c a t i o n ，w es u m m a r i z e dt h ep c r ，l a m pi d e n t i f i c a t i o nt e c h n i q u e s 2 r i b o s o m a l18 sr d n aa n di n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e ( i t s ) s e q u e n c e so fk a r e n i a m i k i m o t o i ，am a j o rr e dt i d em i c r o a l g a ls p e c i e si ns o u t hc h i n as e aa r e a s ，w e r eo b t a i n e d b yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) i tc o m b i n e dw i t h12c o h n i ia n d1d i a t o mi n o r d e rt of i n das u i t a b l es p e c i f i cr e g i o nf o ra p r i m e r p r o b ed e s i g n n e i g h b o r - j i o n i n g ( n j ) p h y l o g e n e t i ct r e e sw e r ec o n s t r u c t e da n dw e r ee m p l o y e dt or e v e a lt h e s ea l g a ee v o l u t i o n r e l a t i o n s h i p s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et o p o l o g ys t r u c t u r eo fp h y l o g e n e t i ct r e e sb y t h e18 sr d n as e q u e n c e sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h a tb yi t ss e q u e n c e s 18 sr d n a s e q u e n c ew a sc o n s e r v a t i v ea n di tw a ss u i t a b l ef o rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i sa b o v eg e n u s l e v e l i t ss e q u e n c ew a sh i g hv a r i a b l ea n di tw a ss u i t a b l ef o ra n a l y s i su n d e rg e n u s l e v e l i t s1a n di t s 2w e r eh i g hv a r i a b l ew h i c hw e r es u i t a b l ef o rs p e c i e s - s p e c i f i c i i i 上海海洋大学2 0 0 9 届硕十学位论文 m o l e c u l a ri d e n t l f i c a t i o n 3 s e v e r a lg r o u p so fs p e c i a lp c ra m p l i f i e dp r i m e r st a r g e t e dr e s p e c t i v e l yb y r i b o s o m a li t sr e g i o n so ft w oa l i e ni n v a s i v es p e c i e so fr e dt i d ea l g a e sk a r e n i a m i k i m o t o ia n d h e t e r o c a p s ac i r c u l a r i s q u a m a w e c h o s et w ob e s t p r i m e r s o f k ilf 3 k ilb 3a n dy i f 3 a y i b 3 aa f t e rt h ee x c l u d i n ge x p e r i m e n t a st h ec o n t r a s ta l g a e s o fa l e x a n d r i u mc a t e n e l l a ，p r o r o c e n t r u mz i m a ，c h a e t o c e r o sm u e l l e r i i ，h e t e r o s i g m a a k a s h i w o ，t h et e r m i n a lp r i m e r ss e q u e n c e sw e r ec o m f i r m e db yf o l l o w i n g p c r i d e n t i f i c a t i o n t h er e s u l tw a sh e l p f u lt oc o n t r o lr e dt i d e 4 ar a p i d c o n v e n i e n ta n dr e l i a b l ek a r e n i am i m m o t o id e t e c t i o ns y s t e mw a s d e v e l o p e db yu s i n gt h el o o p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ( l a m p ) m e t h o d t h e a s s a yw a so p t i m i z e dt oa m p l i f ykm i k i m o t o id n ab yi n c u b a t i o na t6 3 。cf o r1h t h e l a m pp r o d u c t sh a dal a d d e v l i k ep a n e mo fb a n d sf r o m188b pw h e ne l e c t r o p h o r e s e d o na na g a r o s eg e la n di t ss p e c i f i c i t yw a sc o n f i r m e db yd i g e s t i o nw i t hh c oie n z y m ea n d p c ra m p l i f i c a t i o np r o d u c t su s i n gt h ep r i m e r sf 3a n db 3 t w on a k e d e y ed e t e c t i o n m e t h o d sw e r ed e v e l o p e df o ru s ei nt h ef i e l d b yu s i n gd n as a m p l e se x t r a c t e df r o m e i g h td i f f e r e n ta l g as t r a i n s t h es y s t e mw a si d e n t i f i e dt oa m p l i f yo n l yt h ek m i k i m o t o i d n a b u to t h e ra l g ad n aw e r et e s t e dn e g a t i v e t h u s ，w ec o n c l u d et h a tt h i se s t a b l i s h e d l a m pa s s a yh a sp o t e n t i a lu s e f u l n e s sf o ra u t o p t i cd e t e c t i o no f 足m i k i m o t o i a n d p o w e r f u lp r o s p e c ti nf o r e c a s to f r e dt i d ei nt h ef u t u r e k e yw o r d s ：a l i e ni n v a s i v er e dt i d ea l g a e ，m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n ，18 sr d n a ， i t s ，p c r ，l a m p i v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导 师的指导f ，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和弓l 用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人 亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：新俊兢 聃：垆 冠i | ， 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海 海洋人学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采j h j 影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 不保密 学位论文作者签名：撒；商 嗍砷年彭月日 指导教师虢多座设 日期：卅年月乡日 上海海洋人学2 0 0 9 届硕十学位论文 第一章引言 1 1 赤潮的概念、分类、成因 赤潮又称为有害藻华( h 锄觚a l g a lb l o o m ) ，是海洋中某些微小的浮游生物( 浮 游植物、原生动物或细菌) 在一定条件下爆发性增殖和聚集，而引起海水变色的 一种有害的海洋生态异常现象。因形成赤潮的生物种类不同而呈现出不同的海色， 如甲藻类容易呈现黄色、茶色赤潮；硅藻类则多呈现黄色、褐色赤潮。 根据赤潮对生物的危害性可以分为无毒赤潮和有毒赤潮。无毒赤潮一般是无 害的，其原因藻种不具有直接引起虾、蟹、鱼、贝类死亡的毒害物质，般不会 对海水养殖业造成大的破坏。但如果这类赤潮藻的数量过高，它们死亡分解时会 造成海水缺氧并伴有大量厌氧菌滋生，这会造成鱼类和无脊椎动物死亡，我国海 域频发的夜光藻赤潮即属于这一类型。有毒赤潮主要是由产毒微藻引起的，其孢 囊分泌的毒素能造成鱼类及无脊椎动物的大量死亡。目前，已发现能够产生毒素 的微藻有7 0 多种，在我国约有2 0 余种。研究发现引起赤潮的藻种基本属于硅藻f _ 3 、 甲藻门、黄藻门、蓝藻门、金藻门等，其中又以硅藻门和甲藻门为多。正常海洋 环境下，生物多样性水平较高，多种藻类伴随着各种微生物共同生活，赤潮生物 在其中所占比重不大。但在赤潮发生时，藻细胞分裂速度明显加快，某种或少数 几种藻类急剧增殖并成为优势种，继而形成单一或混合型赤潮【2 ，3 j 。不同藻种生长 速度不同，如1 9 9 8 年暴发的胶州湾赤潮，原因种浮动弯角藻( e u c a m p i az o o d i a c u s ) 生长率为0 9 4 d ，赤潮异弯藻( h e t e r o s i g m aa k a s h i w o ) 生长率为0 8 5 d ，中肋骨条藻 ( s k e l e t o n e m a s 尬触掰) 生长率高达6 d 1 2 4 5 l 。赤潮的爆发往往由多个原因藻种共同引 起，如2 0 0 6 年广东大亚湾海域爆发的赤潮监测结果显示海域内存在失刺拟菱形藻 ( p s e u d o n t z s c h i ap u n g e n s ) 、中肋骨条藻、柔弱拟菱形藻( p s e u d o n i t z s c h i a 。d e l i c a t i s s i m a ) 、束毛藻( t r i c h o d e s m i u m s p ) 等多种原因测4 1 。赤潮爆发时，同一 海区不同地理位置的赤潮优势藻种不尽相同。如1 9 9 8 年珠江口附近水域赤潮藻虽 然都为裸甲藻属，但不同采样点得到的具体种却不一样【副，有毒赤潮藻种 p f i e s t e r i a p i s c i c i d a 在美国北卡罗莱那州、佛罗里达州等不同海域都有爆发赤潮的记 录i 刚。 l 上海海洋人学2 0 0 9 届硕十学位论文 一般认为赤潮爆发的主要原因是人类日常生产生活过程中，将大量富含氮、 磷等生物所需的营养物质排入海洋，使某些水体交换差的河岛、海湾区营养盐含 量急剧增高，引起水体富营养化，从而造成大量微藻迅速繁殖，超出了水体承受 极限，最终导致赤潮大面积的发生。其次，异常的气候现象，如厄尔尼诺现象以 及海洋船舶压舱水的排入，给各大水域都带去了有毒赤潮藻类的孢子，也是引起 赤潮发生的原因，许多外来入侵藻种正是通过这些途径在全球范围内蔓延开来。 事实上，赤潮形成的原因非常复杂。与爆发海区的地理位置、水文、气象、 海流等自然环境因素都相关。除此之外，与人类过度养殖与捕捞、赤潮生物入侵 等因素也息息相关。潮流、船舶压舱水等则是赤潮生物或孢囊传播的重要媒介。 1 2 我国赤潮概述 我国是赤潮灾害比较严重的国家之一【7 j 。近些年，沿海海区富营养化污染不断 加剧，有害赤潮发生的频率明显升高。目前，赤潮灾害已遍及我国沿海所有省市， 每年的年初从南海开始，向北蔓延，到l o 月份止子渤海湾，影响的时闻长达半年。 海洋浮游微藻是引发赤潮的主要生物，分布于中国沿海的赤潮藻类有1 4 0 余种( 其中 4 0 多种曾引发过赤潮) 。分属于甲藻、硅藻、隐藻、金藻、蓝藻、针胞藻等多个门 类7 , 8 , 9 1 。另外，在我国沿海已发现2 0 多种赤潮生物的孢囊 i o l ，并呈逐年上升趋势。 近年来，中国沿海已多次爆发较大规模的有毒赤潮，据中国海洋环境质量公报记 载，2 0 0 2 年- 2 0 0 6 年问，在东海舟山海域、天津海域、渤海湾、浙江海域、长江口 海域分别爆发了由亚历山大藻、米氏凯伦藻、链状亚历山大藻等有毒微藻引起的 大面积赤潮，规模都在l o o o 耐以上。据不完全统计，我国因赤潮造成的经济损失 每年在l o 亿元以上，一次大规模的赤潮就可能带来几亿元的直接经济损失。如2 0 0 5 年东海米氏凯伦藻赤潮对南麂岛的养殖鱼类造成了毁灭性的打击，仅此一地直接 经济损失就高达2 0 0 0 万元【l l 】，足见有毒赤潮的发生对我国经济发展和生念环境安 全构成的严重威胁。我国四大海域有毒赤潮暴发时间及次数呈不不规则分布，其 种类5 、6 月份较多，这与赤潮毒素的检测结果也基本相符合。如产麻痹性贝毒的 链状亚历山大藻、塔玛亚历山大藻等仅在5 月份和6 月份出现【1 2 】。有害藻类的鉴定， 不仅需要对该藻种在多个海域的产毒状况以及毒性大小进行判断，还需要依赖多 种技术手段研究有毒藻类与各种受毒海产品的关系【l 引。 2 上海海洋人学2 0 0 9 届硕十学位论文 1 3 赤潮藻类鉴定的方法 1 3 1 传统形态学研究 传统的赤潮藻分类系统主要以藻种的形念结构和生理生化特点为基础，对各 藻种逐级分类。在过去十几年中普遍采用光学显微镜、电子显微镜等对甲藻的形 态结构进行了观察，以研究甲藻的分类及其亚显微结构。在获得藻样后，以藻细 胞的形态学特征对微藻进行分析是近些年鉴别和计量赤潮藻最直接有效的方法， 在浮游微藻检测方面一直发挥着很重要的作用，是赤潮藻分类鉴定的基础【l 引。但 是，对于某些形态类似难以区分的藻种，无法通过光学显微镜进行分类鉴定，需 要借助电子显微镜对其进一步分析，找出它们之间的差异，根据这些差异的大小 来判断它们是否属于相同的种类。这些形态学方法虽然比较直观，操作上较为简 便，但却存在着很大的缺陷。因为赤潮微藻的形态可塑性较强，容易随水环境的 改变而发生变化。有些甲藻仅个别甲板的形态上有极微小的差异，鉴定通常需要 特殊的染色和甲壳解剖。因此，如果没有相当的分类学知识或经验，用传统的分 类方法很难准确鉴定，而且鉴定时需借助电子显微镜，对设备上要求较高，同时 对检测人员要求高，人为因素影响较大，容易造成误差。以形态上的差异作为分 类依据，不同的分类学家有不同的分类标准，对于形态上特别相似的物种往往是 难以定论【1 4 】。例如塔玛亚历山大藻( a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) ，链状亚历山大藻 l e x a n d r i u mc a t e n e l l a ) 等在分类上一直存在着争议。 1 3 2 分子生物学研究 1 3 2 1 基于p c r 技术的赤潮藻类鉴定方法 现代分子生物学研究方法基本建立在p c r 技术基础之上。近些年，逐渐出现了 r f l p 、r a p d 、a f l p 、s s r 、s n p 等针对基因组d n a 与物种多样性分析的多种分 子标记技术，其中多种已应用于赤潮藻类的研究，并取得了一定的成果。 a d a c h i 等1 1 5 】采用p c r 方法获得日本海域亚历山大藻属几个种的i t s 基因 序列，并进, t r f l p 分析对它们进行分类鉴定，研究表明r f l p 分析i t s 基因是 进行亚历山大藻在种水平上分类学和遗传学研究的有效分子标记。s c h o l i n 等 t 1 6 , 1 7 禾0 用r f l p 分析l s u 和s s u ，也说明了它是对具有全球分布性的亚历山大 藻属种和种间区分和鉴别的有效遗传标记。p e r s i c h 等i l8 j 利用r f l p 分析l s u 序 列，探讨了1 株分离自巴西南部的塔玛亚历山大藻的可能起源和毒型。陈月琴、 屈良鹄等u 9 i 以i t s 为分子指标，采用r f l p 及序列分析方法对南海海域链状亚历山 3 上海海洋人学2 0 0 9 届硕十学位论文 大藻和塔玛亚历山大藻进行分析和鉴定，并与日本海不同海域的相同藻种进行比 较，结果表明i t s 用于不同海域的藻种间的鉴定是一个较稳定的指标，并且为设计 链状亚历山大藻和塔玛亚历山大藻专一性的d n a 分子探针提供了分子生物学方面 的理论依据和基础【2 0 艺。陈月琴等【2 2 1 利用p c r r f l p 技术分析了中国南海海域 不同地理株的塔玛亚历山大藻的s s u ，并与北美和西欧等地的塔玛压力山大 藻进行比较，发现中国南海的塔玛亚历山大藻缺少某种基因，提示了此基因 可作为该藻的分子地理标记。 a d a c h i 等i 2 3 j 比较了用i t s 序列和r a p d 研究不同地理株的链状裸甲藻的种群遗 传学，发现它们的i t s 序列相同，而同一地理株具有相同的r a p d 模式，证明了r a p d 是该种种内水平遗传区分的一种有效工具。b o l c h 2 4 】用同功酶结合r a p d 技术研究 了澳大利亚塔斯马尼亚海域有毒赤潮多发藻种链状亚历山大藻的起源，发现r a p d 能较好地揭示不同地理株之间的遗传多态性关系。 j o h n 等1 25 j 探讨了用a f l p 技术分析塔玛亚历山大藻种的遗传结构，结果表 明a f l pr 范够通过分析赤潮原因藻种，从中得到有用的种群水平的遗传信息， 而获得的种间变异水平遗传信息能够区分不同时期或不同地理分布的藻株 2 6 1 o b o m e t 等1 27 j 用微卫星作为分子标记来研究了亚历山大藻、中肋骨条藻和拟菱 形藻之间的遗传特征与进化关系，对几种藻进行分子鉴定，证明了该技术的实用 性【2 8 】。e v a n s 等获得了多纹拟菱形藻( p s e u d o n i t z s c h i a 垅“l t i s e r i e s ) 的微卫星标记， 并将其用于该种的遗传变异研究，表明该方法有助于理解拟菱形藻种水平的遗传 变异和藻种地理分布状况的研究。除此之外，还筛选得到了圆鳞异囊藻【3 0 1 、微小 亚历山大藻【3 u 和多环旋沟藻【3 2 】的微卫星引物，这些成果促进了赤潮藻分子鉴定和 种群遗传方面的研究。 本实验室针对两种外来入侵赤潮多发藻米氏凯伦藻( k a r e n i am i k i m o t o i ) 和环状 异帽藻( h e t e r o c a p s ac i r c u l a r i s q u a m a ) 各设计了一对特异性p c r 引物，对其进行专一 性p c r 检验，取得了良好的效果( 详见第三章) 。 1 3 2 2 环介导等温核酸扩增技术l a m p ( l o o p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n m e t h o d ) 2 0 0 0 年，日本学者n o t o m i 等1 3 | j j 开发了一种新型的恒温核酸扩增方法，即环介 导等温扩增反应( l o o p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ，l a m p ) ，此反应无需经历 p c r 程序中的模板的热变性、多个温度循环、产物电泳、紫外观察等过程，基因的 扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率极高，可在1 5 6 0 m i n 扩增1 0 9 1 0 1 0 倍。 l a m p 技术不需要运用特殊仪器设备，配备简单的水浴锅即可，且其方法具有快速、 4 上海海洋大学2 0 0 9 届硕士学位论文 特异性强、结果判定简单等优势，既可以利用仪器检测也可以直接肉眼观察焦磷 酸镁沉淀判定反应结果，也可以采用s y b r eg r e e n i , 显色反应迅速判定结果【3 训。目 前，该项技术已广泛用于病原菌检测方面，取得了理想的检测效果【3 5 , 3 6 】，也有用 在牛胚胎性别鉴定方面【3 7 1 ，但对微藻的检测未有报道。 本实验室利用l a m p 技术对赤潮入侵种米氏凯伦藻的快速鉴定开展了研究，成 功丌发了该藻的特异性l a m p 引物，优化了反应条件，建立了整套方法体系( 详见 第四章) 。 1 3 2 3 在赤潮藻研究中常用的分子标记基因 在赤潮藻类研究中，应用于鉴定工作最广泛的是核糖体r r n a 基因和转录间隔 区基因。藻类核糖体由大小亚基组成。大亚基由2 8 s rr n a 、5 8 sr r n a 、5 sr r n a 组成。小亚基由1 8 sr r n a 组成。r d n a 由转录区和非转录区构成，转录区包括5 s r d n a ，5 8 sr d n a ，1 8 sr d n a 和2 8 sr d n a ，其中后3 种组成一个转录单元。转录 间隔区( i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r s ，i t s ) 位于5 8 s 和18 sr d n a ( i t s l ) 、5 8 s 和2 8 s r d n a 之间( i t s 2 ) ( 图1 6 ) 。 图1 - 6 核糖体基因序列示意图 f i g l - 6 g e n es e q u e n c e so fr d n a 由于r r n a 基因的各部分进化速率不同，即存在着保守区与高变区，因而被广 泛的应用于藻类的分类与进化研究【3 1 1 。保守区在系统进化过程中的变异速率较 慢，核苷酸变异较少，不同生物间有较高的相似性，该区域反映了生物在进化上的 同源性，可用于亲缘关系较远的藻种间的比较；而高变区则相反，核苷酸变异较 大，亲缘关系较近的藻种间也存在一定的差异，这种差异会随着亲缘关系的疏远而 扩大【4 2 1 。核糖体r n a 大、小亚基之间的转录间隔区i t s 区，即为高变区域，该区域 种间差异值较大【4 引，通常可以作为属下水平研究的分子指标。因此，可以根据r r n a 基因保守区和高变区核苷酸序列变异速率的差异选择不同区域作为分析比较的分 子指标【4 4 4 5 】，进行相应分类水平的系统进化分析。 a d a c h i 等以核糖体基因i t s 区为分类指标对日本海域链状亚历山大藻 ( a c a t e n e l l a ) 和塔玛亚历山大藻( a t a m a r e n s e ) 不同地理株进行分析，得出日本海 域亚历山大属不同种相互间序列存在显著差异，而种内不同株系间i t s 区序列则非 5 上海海洋人学2 0 0 9 届硕十学位论文 常相似【4 6 4 7 1 ；庄丽、陈月琴等【4 8 】在对赤潮叉角藻1 8 sr d n a 和i t s 区序列测定与分 析研究中，发现i t s 区为种问的高变区，可用于设计快速鉴定叉角藻的特异性核苷 酸探针；苟万罩等利用中肋骨条藻i t s 区序列设计了种特异性探针对其进行p c r 检 测，获得了良好的结果【4 9 1 。陈月琴、庄丽等人通过对我国淡水铜绿微囊藻、惠氏 微囊藻和颤藻科o s c i l l a t o r i a c e a e s p 的r d n a1 6 s 2 8 s 的基因间隔区进行序列测定 和分析，发现1 6 s rd n a 2 8 s rd n a 基因间隔区可以作为精确稳定的分子指标，用 于蓝藻专一性核酸分子探针的制备1 5 0 5 3 j 。根据以上所述，r d n a 基因转录问隔区的 研究为赤潮藻属种界定和系统进化提供了分子生物学依据。 线粒体基因( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m td n a ) 总的来说较为保守，但较核糖体大亚 基基因高变，因此较适合于属间水平的系统进化分析【5 3 1 。生物进化过程中，线粒 体与细胞核出现的时间大体一致，这使得m td n a t 常适合于真核生物系统进化关 系方面的研究【5 4 1 。细胞色素b 基因( c y t b ) 和细胞色素氧化酶亚基i 基因( c o x i ) 是常用 的线粒体标记基因，已经广泛应用于物种进化和种群遗传结构分析中。目前，将 c y t b 用于赤潮藻类系统进化的研究较少，但已展现了良好的应用价值，女h l i n 等【5 5 】 利用p p i s c i c i d a 的c y t b 序列和1 8 sr d n a 基因序列研究了它的系统进化关系，发现 用二者构建的系统进化树相似，但c y t b 树优于1 8 s r d n a 树，并且c y t b 序列变异度 大，更适合设计特异性引物对其进行定量检测。c o x i 基因较c y t b 基因进化速率快， 适于作近缘物种的系统进化分析，而c y t b 基因相对保守，较适于作亲缘关系较远 物种的系统进化分析，近年来已被广泛用于系统进化研究中。 叶绿体基因也可应用于赤潮藻的分类中，特别在甲藻的遗传多样性研究中， 可以作为一种优良的分子标记【5 酬。目前用于赤潮藻类标记的叶绿体基因主要为核 糖体1 ，5 二磷酸氧化脱羧酶基因( r b c l ) 和r b c s 基因( r i b u l o s e 1 ，5 b i s p h o s p h a t e c a r b o x y n a s e o x y g e n a s es m a l ls u b u n i tg e n e ) 。l ，5 二磷酸核酮糖羧化酶，该酶是植物 卡尔文循环过程中的关键酶，其中r b c l 为该酶的大亚基基因，r b c s 为小亚基基因。 r b c l 基因演化速度较慢，相对要保守，比较适用于科级水平以上的系统分析，而r b c s 基因相对变异高，因而适用于属问和种以上水平的研究。r b c l 基因对于研究赤潮生 物多样性是良好的分子指标，女f l l i u 等【57 】通过对r b c l 基因的克隆和测序，研究了胶 州湾浮游生物生物种群的遗传多样性和季节变换情况。 1 4 研究对象 本文研究对象为流入我国海域的两种外来入侵种米氏凯伦藻与环状异帽藻。 米氏凯伦藻属甲藻门，裸甲藻目，裸甲藻属；环状异帽藻属甲藻门，异囊藻目， 6 上海海洋大学2 0 0 9 届硕十学位论文 异囊藻科。1 9 3 5 年，米氏凯伦藻首次由日本学者o d a t 5 8 】发现于京都湾( g o k a s h o ) ， 之后在韩国、澳大利亚、挪威等国海域都有发现，已成为全球性赤潮多发藻种 5 9 , 6 0 】。 环状异帽藻又称圆鳞异囊藻，于1 9 9 2 年首次在f 1 本a g o 湾形成赤潮，造成极其严重 的渔业损失【6 l 】。 1 5 研究的立题依据和意义 赤潮藻类的鉴定是治理赤潮的关键步骤。传统形态学鉴定方法由于其分类方 法不一，人为因素影响大，误差大等弊端，而分子鉴定避免了这些缺点，以其快 速、准确的鉴定方法逐渐被应用。本研究，对两种外来入侵赤潮藻米氏凯伦藻和 环状异帽藻核糖体1 8 8r d n a 和i t s ( 转录间隔区) 进行序列测定，在i t s 区寻找到适 合特异性鉴定的核苷酸序列，分别设计了用于鉴定两种藻的p c r 引物和针对米氏凯 伦藻的l a m p 引物，成功进行了特异性检验，为快速、准确鉴定外来入侵藻提供了 方法依据和技术支持。 7 上海海洋大学2 0 0 9 届硕士学位论文 第二章米氏凯伦藻18 sr d n a 和i t s 区序列测定及遗传进化 分析 2 1 材料与方法 2 1 1 藻种来源及培养 目标藻种为米氏凯伦藻( k a r e n i am i m m o t o ih a n s e n ) 藻样来自暨南大学水生生 物所，取自中国南海。对照藻株有塔玛亚历山大藻( a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) 、链状 亚历山大藻似c a t e n e l l a ) 、微小亚历山大藻似m i n u t u m ) 等。培养基采用天然海水， 按照不含硅酸盐的f 2 6 2 j 配方配制，其中氮、磷浓度按实验要求另加。培养基经1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0m i n 后备用。培养温度为2 5 + 1 ，以日光灯为光源，光照强度约 为2 0 0 0 4 0 0 0 1 x ，光暗比为1 2 h ：1 2 h 。 表2 1 藻类舵培养基配方( 1 0 0 0 m l 海水) t a b 2 - 1 f 2s o l u t i o no f a l g a e ( 10 0 0 m l s e aw a t e r ) 2 1 2 基因组d n a 提取 藻液培养2 周后，将锥形瓶中藻液移至无菌操作台，用5 0 m l 离心管分装， 8 上海海洋大学2 0 0 9 届硕士学位论文 s i g m a3 k 3 0 型玲冻离心机8 0 0 0 r r a i n ，弃上清液，分装至2 m l 离心管，然后采用改 良c t a b 法提取d n a ，酚、氯仿抽提纯化嘟j 。方法如下：( 1 ) 每管中加入6 0 0 l 提取 液( 1 0 0 m m o l l t r i s - h c l 。1 0 0 m m o l l e d t a l _ 4 m o l l n a c l ，2 c t a b ，2 b 一巯基乙 醇) ，6 5 水浴l h 。( 2 ) 加入等体积p c i 抽提液( 苯酚2 5 ：氯仿2 4 ：异戊醇1 ) ，混匀，4 ，1 2 5 0 0 t p m 1 0 r a i n 。( 3 ) 转移上清液至新离心管中，加入r n a 辩至终浓度为1 咖1 l ， 3 7 放置3 0 r a i n 。( 4 ) p c i 重复抽提一次，4 ：c ，1 2 5 0 0 t p m 离，b 1 0 m i n 。( 5 ) 水相转移至 新离心管中，加入2 倍体积无水乙醇，室温下放黄8 1 2 r a i n ，静置沉淀d n a 。( 6 ) 4 ，1 2 5 0 0 r p m ，离一0 , 2 0 m i n 。( 7 ) 弃上清液，7 0 乙醇洗涤d n a 沉淀2 次。( 8 ) d n a 溶于无菌水或t e 溶液。 幽2 - i 赤潮藻d n a 电泳效果图( 1 ：米氏凯伦藻。2 ：环状异帽藻，3 ：塔玛历山大藻， 4 ：链状亚历山大藻，5 ：微小弧历山大藻，6 ：立玛原甲藻，7 ：赤潮异弯藻) f i 9 2 】d n ae l e c t x o p h o r e s i sr e s u l t so fr e d 啊d ea l g a e s ( 1 ：k a m n 蛔m i m m o t o i , 2 ：t t e t e r o c 印s a c i r c u l a r i s q u a m a , 3 ：a l e x a d r i u mm p4 ：c a t e n e l l a , 5 ：0m l n u t u m 6 ：p r o r o c e n t r u m 斯i m 7 ： h e t e r o s i g m a a k a s h i w o ) 2 1 3 p c r 扩增 1 8 sr d n ap c r 引物为真核生物通用扩增引物1 8 s f c c t g g t t g a t c c t g c c a g - 3 ) , 和i $ s rf 5 - t t g a t c c t t c t g c a g 2 g t t c a