（动物学专业论文）睾丸特异转录因子fank1的dna结合序列的研究.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要一3 二、英文缩略语5 三、论文 前言6 丽看 材料与方法7 实验结果l6 讨论”2 2 结论”2 4 四、本研究创新性的自我评价2 5 五、参考文献2 6 六、附录 综述”2 9 在学期间科研成绩3 8 致谢3 9 个人简介4 0 中文论著摘要 睾丸特异转录因子f a n k l 的d n a 结合序列的研究 目的 精子的发生是一个复杂的细胞分化过程，分为3 个不同的阶段：有丝分裂期、 减数分裂期和单倍体期。在这个过程中，精原细胞经历了许多复杂而精密协调的 分子事件及细胞事件，通过增殖和分化形成功能特异的雄性配子精子。睾丸 组织在精子发生过程中乃至哺乳动物个体形成过程中显示了很强的转录活性，转 录因子在特殊的细胞事件中调控基因的表达。f a n k l 基因就是一个睾丸特异表达 基因，编码一种核蛋白，在精子发生过程的减数分裂到单倍体阶段广泛表达，相 关实验表明该蛋白为睾丸组织特异转录因子。本研究通过构建g s t - f a n k l 融合 表达载体，诱导表达f a n k l 蛋白，并用靶序列循环扩增( c a s t ) 实验确定f a n k l 的d n a 结合序列，为进一步研究f a n k l 调节的靶基因奠定基础。 方法 通过p c r 的方法，以p d s r e d f a n k l 质粒为模板，扩增小鼠f a n k l 蛋白中 的f n i i i 结构域d n a 序列，将目的片段插入原核表达载体p g e x 4 t - 2 的g s t 基因 下游，转化e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 细菌，通过内切酶鉴定及d n a 测序筛选出正确的重 组质粒。采用不同温度，0 5 m mi p t g 对菌体进行诱导表达，分别于l h 、2 h 、3 h 、 4 h 、5 h 、6 h 、7 l l 收集菌体，经s d s p a g e 电泳分析找到最适宜诱导温度和时间， 并且用不同浓度的i p t g ( 终浓度为0 5 r a m 、0 6 m m 、0 8 m m 、1 0 m m ) 进行诱导 表达，优化i p t g 的诱导浓度。按优化条件诱导重组表达质粒，经裂解、透析复 性得到溶解蛋白，该蛋白经过g s tb i n dr e s i n 亲和层析，获取纯化的g s t - f a n k l 融合蛋白并通过w e s t e r nb l o t 鉴定。获得f a n k l 蛋白用于c a s t 实验，通过对测 序结果的比对来确定蛋白质的d n a 结合序列。 结果 i 、f a n k l 基因的p c r 扩增产物经酶切后，与原核表达载体p g e x - 4 t - 2 连接， 经电泳、酶切及d n a 测序鉴定表明目的基因成功插入到载体中。 2 、鉴定正确的重组质粒经3 0 ，0 5 m mi p t g 诱导5 h 表达量最高，表达的 g s t - f a n k l 融合蛋白分子量约为4 3 k d a 。 3 、f a n k l 蛋白以包涵体形式存在，通过裂解包涵体，经透析复性，g s tb i n d r e s i n 亲和层析，纯化得到g s t - f a n k l 融合蛋白。 4 、c a s t 实验通过测序获得的4 4 个结果比对，d n a 序列a a a a a g 出现百 分率最高。 结论 1 、成功构建了小鼠f a n k l 蛋白f n l i i 结构域的重组原核表达载体p g e x f n l i i 。 以i p t g 诱导表达，并纯化出该重组蛋白，为进一步研究转录因子的作用奠定了 基础。 2 、d n a 序列a a a a a g 可能为f a n k l 转录因子特异性结合序列。 关键词 f a n k l ；转录因子；结合序列 2 英文论著摘要 s t u d yo nd n ab i n d i n gs e q u e n c eo ft e s t i s - - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o nf a c t o r - f a n k l i n t r o d u c t i o n s p e r m a t o g e n e s i si sac o m p l e xc e l l u l a rp r o c e s sw h i c hc a nb ed i v i d e di n t ot h r e e p h a s e s ：m i t o t i cp h a s e ，m e i o t i cp h a s ea n dh a p l o i dp h a s e d u r i n gs p e r m a t o g e n e s i s s p e r m a t o g o n i ap r o l i f e r a t ea n dd i f f e r e n t i a t ei n t of u n c t i o n a l l yh i g h l ys p e c i a l i z e dm a l e g a m e t e s c a l l e d s p e r m a t o z o a t e s t i sd i s p l a y st r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t i e si n t h e s p e r m a t o g e n e s i sa n de n t i r eb o d yi nm a m m a l s ，t r a n s c r i p t i o nf a c t o rr e g u l a t e st h eg e n e e x p r e s s i o n f a n k li sat e s t i s - s p e c i f i cg e n ee n c o d i n gan u c l e a rp r o t e i ne x c l u s i v e l y e x p r e s s e dd u r i n g t h et r a n s i t i o nf r o mt h em e i o t i ct ot h e h a p l o i dp h a s eo f s p e r m a t o g e n e s i s t h er e s e a r c h e ss h o w e di t i sat e s t i s s p e c i f i ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r w e c o n s t r u c t e dp g e x - f n i i ic o n s t r u c tw h i c hc a nb ei n d u c e dt oe x p r e s sf n l i id o m a i no f f a n k lp r o t e i n t h e nw ed e t e r m i n e df a n k lb i n d i n gs e q u e n c eb yc y c l i ca m p l i f i c a t i o n o fs e q u e n c et a r g e ta s s a y m e t h o d s t h eg e n es e g m e n to ff a n k lg e n ew a sa m p l i f i e db yp c r ，a n dt h e ni n s e r t e di n t o t h ev e c t o rp g e x - 4 t - 2 t h er e c o m b i n a n tc o n s t r u c tw a st r a n s f o r m a t e di n t oe c o l ib l 21 t h ei n c i s i o ne n z y m ea s s a ya n dd n a s e q u e n c i n ga n a l y z ew e r ep e r f o r m e dt of i n do u t t h er i g h tr e c o m b i n a n tc l o n e t h et r a n s f o r m a t e db a c t e r i a si n d u c e db y0 5 m mi p t ga t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r ef o rl h ，2 h ，3 h ，4 h ，5 h ，6 h ，7 hw e r ec o l l e c t e da n dt o t a lp r o t e i n w a se x t r a c t e d t h ep r o t e i np r o d u c t sw e r ea n a l y z e dt h r o u g h ts d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i s t of i n do u tt h eb e s ti n d u c t i o nt e m p e r a t u r ea n dt i m eu n d e rw h i c ht h eb a c t e r i a sc a no b t a i n t h eh i g h e s te x p r e s s i o ne f f i c i e n c y a n dt h eb a c t e r i a sw e r ei n d u c e db yd i f f e r e n t 3 c o n c e n t r a t eo fi p t g ( 0 5 m m ，0 6m m ，0 8m m ，1 0m m ) t of i n do u tt h eb e s ti n d u c t i o n c o n c e n t r a t eo fi p t ga f t e rt h ei n d u c t i o nb a c t e r i a sw e r eb r o k e nb ye x t r a c t i o nr e a g e n t ， t h es u p e m a t a n tw e r ed i a l y s i s e da n d p u r i f i e dt h r o u g h tt h eg s t b i n dr e s i nt oo b t a i nt h e p u r i t yg s t - f a n k lp r o t e i n t h ep u r i t yp r o t e i nw a sd e t e c t e db yw e s t e r nb l o t t h e nw e a n a l y s i s e dt h ec o n s i s t e n c yd n ab i n d i n gs e q u e n c e sf o rf a n k lb yc a s t r e s u l t s 1 t h eg e n es e g m e n to ff a n k lh a sb e e ns u c c e s s f u l l yi n s e r t e d i n t ot h ev e c t o r p g e x - 4 t - 2 2 t h ep r o d u c t i o no ft h ef u s i o np r o t e i nw a sh i g h t e rw h e nt h eb a c t e r i a sw e r e i n d u c e da t3 0 c ，5 h ，t h ep r o t e i ni sa b o u t4 3 k d a 3 t h r o u g ht h ei n d u c t i o nb a c t e r i a sb r o k e n ，d i a l y s i s e da n dp u r i f i e db yt h eg s t b i n dr e s i n ，w eo b t a i n e dt h ep u r i t yg s t - f a n k l p r o t e i n 4 i tr e v e a l e da a aa agw a st h ec o n s e n s u sd n a b i n d i n gs e q u e n c ef o rf a n k l t h r o u g ha l i g n m e n to f4 4s e l e c t e ds e q u e n c e so b t a i n e df r o mc a s t c o n e l u s i o n 1 c o n s t r u c t e dt h ec o n s t r u c to fp g e x f n i i ia n de x p r e s s e dt h ef a n k lp r o t e i n s u c c e s s f u l l y i ti st h ef o u n d a t i o no fr e s e a r c ht h et r a n s c r i p t i o nf a c t o r 2 a a a a a gm a yb et h ed n a b i n d i n gs e q u e n c eo f f a n k l k e y w o r d s f a n k l ；t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ；d n ab i n d i n gs e q u e n c e 4 英文缩略语 5 论文- 睾丸特异转录因子f a n k l 的d n a 结合序列的研究 刖声 精子的发生是一个复杂的细胞分化过程，分为3 个不同的阶段：有丝分裂期、 减数分裂期和单倍体期【啦】。在这个过程中，精原细胞经历了许多复杂而精密协调 的分子事件及细胞事件，通过增殖和分化形成功能特异的雄性配子精子【3 1 。 由于精子发生的复杂性，许多研究还处于探索的阶段，对调控相关基因和蛋白因 子功能方面还有许多未知领域。睾丸组织在精子发生过程中乃至哺乳动物个体形 成过程中显示了很强的转录活性【4 】，睾丸特异转录因子的研究对于我们认识雄性 配子形成的分子通路和信号传导系统有着重要的作用，其中转录因子与d n a 的相 互作用是基因表达调控系统的重要组成部分。 精子发生的每个阶段中，都有相应的基因表达。在有丝分裂期，精原细胞有 4 0 5 个基因表达【5 】；在减数分裂期，精母细胞中高表达的基因有4 4 2 个；在单倍体 期，减数分裂后的精子细胞中有1 7 5 个基因表达。这些基因中已经确定为精子发 生所必须的基因有1 0 0 多个【6 】，其中部分是广泛表达的，部分是睾丸特异性表达 的，这提示我们雄性生殖细胞成熟的过程不但涉及体细胞分化成熟的分子事件， 还需要特殊的雄性生殖细胞特异因子。本课题组在前期研究中，应用电子消减法 筛选表达序列标签数据库，从中发现了6 0 0 多个生殖细胞( 包括雄性和雌性) 特 异基因。例如c a t s p e r 3 7 、c a t s p e r 4 8 1 和s p e m l t 9 1 都是睾丸特异基因，并通过 基因敲除等实验证实这些基因与精子的发育关系密切。 f a n k l 基因是前期研究中新发现的睾丸特异表达基斟1 0 1 ，编码一种核蛋白， 在精子发生过程中的减数分裂到单倍体阶段广泛表达，相关实验表明该蛋白为睾 丸组织特异转录因子。进一步通过原位杂交和免疫组化实验证实该蛋白表达位于 细胞核内。由于f a n k l 基因在脊椎动物中具有高度保守性，表明其在精子发生过 程中具有重要的生理作用。转录因子基本结构包括d n a 结合域、转录活化域和蛋 6 白质之i 剐的调节结构域。转录因子通过特异性结合调控区域的d n a 序列来调控基 因的转录过程。本研究运用基因重组等相关生物学技术，构建了包含f a n k l 蛋白 f n l i i 结构域的重组质粒p g e x f n i i i ，并通过i p t g 进行诱导表达f a n k l 蛋白。通 过裂解包涵体、透析复性，最后用g s tb i n dr e s i n 亲和层析纯化得到重组蛋白。 并采用靶序列循环扩增( c a s t ) 方法【1 1 1 寻找f a n k l 蛋白可能的d n a 结合序列。 睾丸特异转录因子f a n k l 的d n a 结合序列的确定，将为进一步研究f a n k l 调 节的靶基因奠定基础。 材料与方法 一、实验材料 ( 一) 载体与菌株 1 、p d s r e d - f a n k l ( 本实验室构建) 2 、载体p g e x 4 t 2 ( 本实验室保存) 3 、大肠杆菌( e c o l i ) b l 2 1 ( d e 3 ) 菌株( p r o m e g e 公司) ( - - ) 主要试剂 1 、d n t p ，t a qd n a 聚合酶( t a k a r a 公司) 2 、引物( 上海生物工程有限公司) 3 、限制性内切酶( t a k a r a 公司) 4 、t 4d n a l i g a s e ( n e b 公司) 5 、a x y p r e pp l a s m i dm i n i p r e pk i t ( a x y g e n 公司) 6 、a x y p r e pd n a g e le x t r a c t i o nk i t ( a x y g e n 公司) 7 、琼脂糖( t a k a r a 公司) 8 、d l l 5 0 0 0d n a m a r k e r ( t a k a r a 公司) 9 、d l 2 0 0 0d n a m a r k e r ( t a k a r a 公司) 7 1 0 、蛋白电泳m a r k e r ( f e r m e n e n c e 公司) 1 1 、h r p g o a t - a n t i m o u s ei g g ( j l 京博奥森公司) 1 2 、t e m e d ( b i o m o l 公司) 1 3 、i p t g ( t a k a r a 公司) 1 4 、p r o t e i n a ( s a n t a 公司) 1 5 、g s t 抗体( s a n t a 公司) 16 、g s t - b i n d k i t s ( n o v a g e n 公司) 17 、p r o t e i nr e f o l d i n gk i t ( n o v a g e n 公司) 18 、r l y s o z y m es o l u t i o n ( n o v a g e n 公司) 1 9 、其他常用试剂：e d t a 、t r i s h c l 、乙醇、甲醇等均为分析纯 试剂。( 参照分子克隆实验指南配制) ( 三) 主要仪器 1 、超净工作台( 天津市医药净化设备厂) 2 、振荡培养箱( 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司) 3 、高速离心机( h e i w l e 公司) 4 、台式低温超速离心机( s i g m a 公司) 5 、p c r 扩增仪( b i o r a d 公司) 6 、凝胶自动成像仪( 天能科技上海有限公司) 7 、电泳仪( 北京市六一仪器厂) 8 、垂直电泳仪( b i o r a d 公司) 9 、蛋白质转移仪( b i o r a d 公司) 1 0 、紫外分光光度仪( s h i m a d z u 公司) 1 1 、h z s h 水浴震荡器( 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司) 12 、w d 9 4 0 5 b 型水平摇床( 北京市六一仪器厂) 1 3 、a e 一1 0 0 电子天平( m e t t l e r 公司) 二、实验方法 ( 一) f a n k l 蛋白f n i i i 结构域表达质粒p g e x f n i i i 的构建 l 、f a n k l 蛋白f n i i i 结构域d n a 序列的扩增 ( 1 ) 引物设计 通过g e n b a n k 中提供的小鼠f a n k l 基因的c d n a 序列，用p r i m e rp r i m e r 5 0 软件设计引物，同时在5 端引入b a r nhi 酶切位点，3 端引入s a li 酶切位点。引 物由上海生物工程有限公司合成，稀释成浓度为5 0 p m o l p l 的工作液，一2 0 。c 保存。 ( 2 ) f a n k l 基因的扩增 以含有小鼠f a n k l 基因c d n a 全序列的质粒p d s r e d f a n k l 为模板，p c r 扩 增f n i i i 结构域的d n a 片段，按照如下反应体系，目的片段大小4 7 9 b p 。 10 x p c rb u f f e r 5 肛l d n t pm i x t u r e4 m f a n k lf o r w o r d 0 4 山 f a n k lr e v e r s e 0 4 i d t a qdna聚合酶04山 p d s r e d - f a n k l 1m d dh 2 0 3 8 8 1 a l t o t a l 5 0 i t l 反应条件：9 5 c 预变性5 m i n ，然后按9 4 。c 3 0 s ，6 2 1 2l m i n ，7 2 。c1 m i n ，进行 9 3 5 个循环，最后7 2 。c 延伸1 0 m i n 。反应结束后，取1 0 1 , t lp c r 产物，在1 琼脂糖 凝胶电泳，证实扩增产物。 ( 3 ) p c r 扩增目的片段的纯化 在紫外灯照射下，用刀片将目的d n a 条带切下，a x y p r e pd n a g e le x t r a c t i o n k i t 纯化( 具体步骤按照说明书) ，定量后在2 0 。c 冷冻保存备用。 2 、f a n k l 蛋白f n l i i 结构域片段与原核表达载体p g e x 4 t - 2 连接 ( 1 ) p g e x - 4 t - 2 质粒的小量提取 取出- 7 0 冻存的p g e x - 4 t - 2 菌液2 0 i _ t l ，加入到l o m l 含氨苄青霉素1 5 0 i _ t g m l 的l b 培养基中，3 7 震荡培养过夜。用a x y p r e pp l a s m i dm i n i p r e pk i t 从细菌中 提取质粒( 具体步骤按照说明书) ，取2 肛l 质粒经1 琼脂糖凝胶电泳检测。 ( 2 ) 酶切反应 按照如下体系分别用限制性内切酶b a r nhi 和s a li 酶切p g e x - 4 t - 2 质粒和 f n i i i 结构域的p c r 产物，3 7 * ( 2 水浴4 h 。 p g e x - 4 t - 2 p c r 产物2 0 1 x l 4 0 1 t l b a m hi 2 p l 2 “l s a li 2 p , l 2 i - t l 1 0 x tb u f f e r 5 p l 1 0 肛l d dh 2 0 2 1 p l 4 6 p l t o t a l 5 0 1 a l 10 0 i t l ( 3 ) 连接反应 用1 琼脂糖电泳鉴定酶切产物后，用a x y p r e pd n a g e le x t r a c t i o n 瞄t 纯化， 按如下然应体系连接，4 c 过夜。 t 4d n a l i g a s el l x l 10 x b u f f e r 2 山 f n i i i 酶切片段2 l l l p g e x - 4 t - 2 酶切产物5 m d d h 2 0 1 0 j _ t l t 0 t a l 2 0 1 x l 1 0 3 、转化及重组质粒鉴定 ( 1 ) 感受态细胞的制备 氯化钙法制备感受态e c o l ib l 2 1 ，具体步骤如下： 取7 0 。c 保存的e c o l ib l 2 1 接种于l b 固体培养基，放置于3 7 。c 培养箱中 过夜培养。 次同挑选单个菌落，接种于5 m ll b 液体培养基中，3 7 c 2 0 0 r p m 振荡培养 过夜。 取l m l 过夜培养的菌液接种于1 0 0 m l 的l b 培养基中，3 7 c 2 0 0 r p m 振荡培 养，直至o d 6 0 0 = 0 4 。 将菌液立即置于冰上，冷却后，6 0 0 0 r p m ，4 c 离心1 0 m i n 收集菌液，弃去 上清液。 用c a c l 2 t r i s c 1 混合液( 7 5 l i l 】o l lc a c i ；10 m m o l l ir i s c 1 ) 10 m l 重悬菌 体。冰浴2 0 m i n ，9 0 0 0 r p m ，4 c 离心1 0 r a i n ，弃上清液。 用2 m l 预冷的c a c l 2 加1 5 甘油混合液重悬菌体，分装到e p 管中，每管 1 0 0 1 a l ，7 0 保存。 ( 2 ) 转化 将1 0 0 i t l 感受态e c o l ib l 2 1 置于冰上，加入连接后的质粒p g e x - f a n k l 2 9 l ， 立刻混匀，冰浴3 0 r a i n 。 4 2 水浴9 0s ，再冰浴5 m i n 。 加入3 7 c 的l b 培养液l m l ，放入3 7 恒温振荡培养1 h 。 取2 0 0 p 1 上述菌液接种在l b ( a m p + ) 培养皿上，3 7 。c 培养箱中培养1 6 h 。 ( 3 ) 质粒提取鉴定 1 6 h 后从平皿中挑取单克隆菌落，接种到5 m l l b ( a m p + ) 培养液中，于3 7 振荡培养箱中过夜培养，用小提质粒试剂盒a x y p r e pp l a s m i dm i n i p r e pk i t 提取质 粒。按上述方法分别用2 种双酶切方法进行鉴定，s t ui 腓fi 和s t ui a p ai 进行 酶切，消化后，用1 琼脂糖凝胶电泳鉴定。再将上述初步鉴定正确的阳性克隆进 行d n a 测序鉴定，将鉴定正确的质粒及菌种置于2 0 保存。 ( 二) 目的蛋白的诱导表达 1 、i p t g 诱导蛋白表达 ( 1 ) 将冻存的分别含有质粒p g e x - f n l i i 和p g e x 一4 t - 2 的菌种1 0 i r t l 接种到6 m l 的l b ( a m p + ) 培养基中，3 7 。c 振荡过夜培养。 ( 2 ) 吸取过夜培养的菌液5 0 0 9 l 接种到9 m l l b ( a m p + ) 中，3 7 。c 振荡培养， 至o d 6 0 0 值为0 6 0 7 。吸出l m l 未诱导的培养物放于离心管中。 ( 3 ) 剩余培养物在不同培养温度条件下，i p t g 终浓度为0 5 m m ，分别诱导 1 h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 、6 h 、7 l l 优化培养温度和时间。 ( 4 ) 优化i p t g 浓度，在培养物中加入i p t g 至终浓度为0 5 m m 、0 6 m m 、 0 8 m m 、l m m 分别诱导3 h 。培养温度为3 0 。 ( 5 ) 将收集上述菌体各l m l 于离心管1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，沉淀悬于1 0 0 i - t l 1x s d s 上样缓冲液中，1 0 0 加热煮沸1 0 m i n 。 2 、s d s p a g e 凝胶电泳 ( 1 ) 液体配n - 1 ll x 电泳缓冲液中含有3 0 2 9 t r i s ，1 8 8 9 甘氨酸，l gs d s 。 5 上样缓冲液含有5 0m m t r i s h c l ( p h6 8 ) ，1 0 0m md t t ，2 s d s ，1 溴酚蓝， 1 0 甘油。考马斯亮蓝染色液( 4 0 0 m 1 ) 含有1 8 0 m l 甲醇，4 0 m l 冰醋酸，0 5 9 考 马斯亮蓝g 2 5 0 ，1 8 0 m l 去离子水。脱色液( 1 l ) 含有3 0 0 m l 甲醇，1 0 0 m l 冰醋酸， 6 0 0 m l 去离子水。 ( 2 ) 配制1 0 分离胶，5 浓缩胶。 ( 3 ) 电泳：电压8 0 v 电泳，待溴酚蓝进入分离胶后，提高电压至1 2 0 v ，至 溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。 ( 4 ) 染色：用考马斯亮蓝染色1 h ，脱色液脱色。 3 、w e s t e r nb l o t ( 1 ) 液体配制：1 l 转移液中含有5 8 9t r i s ，2 9g 甘氨酸，0 3 9 9s d s ，2 0 0 m l 甲醇。t b s t - 2 0 m l1 mt r i s h c i ( p h 7 4 ) ，8 9n a c i ，l m lt w e e n 2 0 。封闭液：5 脱脂奶粉( t b s t 配制) 。 ( 2 ) 将上述全菌蛋白经电泳后，3 0 0 m a ，l h 转至p v d f 膜上。取下膜后， 1 2 用5 脱脂奶粉室温封闭2 h 。加入l ：2 0 0 稀释的小鼠抗g s t 抗体，4 c 过夜。次 日，用t b s - t 洗膜3 次，每次1 0 m i n 。加入l ：2 0 0 0 稀释的h r p 标记的山羊抗小 鼠的二抗，室温孵育2 h ，t b s t 洗膜3 次，每次1 0 m i n 。在平皿中用e c l 化学发 光法5 m i n ，成像。 4 、重组蛋白的可溶性检测 将重组表达的菌液1 5 m l ，离一t l , 后加入3 0 0 , 1b u g b u s t e r ( 1 9 lb e n z o n a s e n u c l e a s e 于l m lb u g b u s t e r ) 室温裂解2 0 m i n ，离一t l , ，分别取上清和沉淀进行 s d s p a g e 电泳分析。 ( 三) 融合蛋白的分离纯化 通过蛋白的可溶性检测证明f a n k l 的f n l i i 结构域蛋白存在于包涵体中，故 从包涵体中纯化蛋白。 1 、包涵体纯化 ( 1 ) 经w e s t e r nb l o t 鉴定的表达f n l i i 蛋白的菌种进行扩增、诱导后，取3 m l 菌液置于离- t l , 管中，1 2 0 0 0 9 离心1 0 r a i n ，弃液体。 ( 2 ) 按g s t - b i n dk i t s 操作步骤，n k 6 0 0 r t lb u g b u s t e r ( 1 山b e n z o n a s e n u c l e a s e 于l m lb u g b u s t e r ) ，室温孵育2 0 m i n 。1 6 0 0 0 9 ，4 c ，离- t l , 2 0 m i n ，收集包涵体。 ( 3 ) 加入6 0 0 u lb u g b u s t e r ( 含有r l y s o z y m es o l u t i o n 终浓度1 k u m 1 ) ，温和 混匀，室温孵育1 0 m i n 。 ( 4 ) 加入6 倍体积的l ：1 0 稀释的b u g b u s t e r 涡旋l m i n 。 ( 5 ) 5 0 0 0 9 ，4 。c 离心1 5 m i n ，收集包涵体，弃上清液。 ( 6 ) 用0 5 倍原始菌液体积的1 ：1 0 稀释的b u g b u s t e r 重悬沉淀，按步骤( 5 ) 离一t l , ，2 次。最后1 6 0 0 0 9 ，4 c 离一t l , 1 5 r a i n ，弃上清液。沉淀即为纯化的包涵体。 2 、包涵体的溶解与蛋白的重折叠 ( 1 ) 按p r o t e i nr e f o l d i n gk i t 操作步骤，称重包涵体，按1 0 2 0 m g m l 加入i b s l u b i l i z a t i o nb u f f e r 裂解包涵体，室温孵育15 m i n 。 ( 2 ) 1 0 0 0 0 9 离一t l , 1 0 r a i n ，上清液中包含溶解的蛋白。 ( 3 ) 将上述液体放入透析袋中，在5 0 倍体积的透析液( 含0 1 m md t t ) 中 1 3 4 c 透析，换液1 次，每次透析3 h 。 ( 4 ) 将透析袋放入5 0 倍体积的透析液( 无d t t ) 继续透析，换液1 次，每 次透析3 h 。 3 、纯化蛋白 ( 1 ) 制备g s tb i n dr e s i n ：取适量的g s tb i n dr e s i n ，离心后用5 倍体积的 b i n d w a s hb u f f e r 洗柱，1 0 0 0 9 离心3 m i n ，弃液体。再用1 倍体积的b i n d w a s hb u f f e r 洗柱，1 0 0 0 9 离心3 m i n 。 ( 2 ) 加入上述透析后的蛋白溶液，室温孵育3 0 m i n ，可以轻轻摇晃。 ( 3 ) 1 0 0 0 9 离心3 m i n ，弃上清液体。加入1 0 倍体积的b i n d w a s hb u f f e r 重 悬树脂，离心后，弃上清液。 ( 4 ) 加入1 倍体积的g s te l u t i o nb u f f e r 洗脱结合的蛋白。离心后，上清液 即含有f a n k l 蛋白。反复洗脱3 次，分别收集每次的洗脱液。 ( 5 ) 进行w e s t e r nb l o t 鉴定纯化后的重组蛋白。方法同上述的w e s t e r nb l o t 。 ( 四) c a s t 实验( 靶序列循环扩增实验) l 、引物设计 设计寡核苷酸引物，两端侧翼序列为固有序列，中间含有2 6 个随机碱基。上 游引物序列为：5 g c t g c a g t t g c a c t g a a t t c g c c t c ( n ) 2 6 c g a c a g g a t c c g c t g a a c t g a c c t g3 ；下游引物序歹0 为：5 c a g g t c a g t t c a g c g g a t c c t g t c g ( n ) 2 6 g a g g c g a a t t c a g t g c a a c t g c a g c3 ：稀释引物，浓度为3 1 x g l x l 。 在退火缓冲液( 1 0 0 m mn a c l ，5 0 m mh e p e s ) 中经9 4 。c 4 m i n ，7 0 。c1 0 m i n ，3 7 * c 2 0 m i n 合成双链寡核苷酸。其两端已知的侧翼序列引物为，c a s tl e f t5 g c t g c a g t r g c a c t g a d t c g c c t c3 ：c a s tr i g h t5 c a g g t c a g t t c a g c g g a t c c t g t c g3 。其工作浓度为5 0 p m o l 。 2 、c a s t 实验 ( 1 ) 将蛋白与双链寡核苷酸引物在b i n d i n gb u f f e r ( 1 0m mt r i s ( p h 7 5 ) ，5 0 m mn a c l ，7 5m l v lm ：g c l 2 ，l m l v le d t a ，5 甘油，5 蔗糖，o 1 n p - 4 0 和5m g m l 牛血清白蛋白) 中室温孵育2 0 m i n 。反应体系如下： 1 4 g s t - f n l i i 融合蛋白 双链寡核苷酸引物 5 x b i n d i n gb u f f e r d dh 2 0 1 0 斗l 1 肛l 4 p i 5 p l t o t a l 2 0 9 l ( 2 ) 加入g s t 抗体，4 ，l h 。 ( 3 ) 加入p r o t e i n a a g a r o s e5 1 d ，4 。c ，过夜。 ( 4 ) 2 5 0 0 r p m ，4 。c 离心5 m i n 。弃上清液体，加入b i n d i n gb u f f e r 洗涤3 次。 ( 5 ) p c r 反应扩增靶序列，反应体系如下： 1 0 x p c rb u f f e r 5 p l d n t pm i x t u r e 4 p l c a s tl e f t 0 4 p l c a s tr i g h t 0 4 1 上1 r t a q e 0 4 p l d n a - 蛋白质复合物 l l d d h 2 0 3 8 8 9 l t o t a l 5 0 i t l 反应条件：9 9 。c 5 m i n 变性，之后按照9 4 。cl m i n ，6 2 。cl m i n ，7 2 。cl m i n ，进 行1 0 个循环，最后7 2 延伸1 0 m i n 。 ( 6 ) 重复前5 步，第5 步中的p c r 产物替代双链寡核苷酸与蛋白共同孵育。 即d n a 一蛋白质结合、免疫沉淀反应、p c r 扩增为一个循环，总共进行5 个循环。 ( 7 ) 将p c r 产物纯化，连接到p u c m t 载体上，4 。c 过夜，反应体系如下： t 4d n a l i g a s el g l 10 x b u f f e r 2 m p c r 产物5 u l p u c m t1 m d dh 2 0 l l 山 t o t a l 2 0 m 1 5 ( 8 ) 连接产物转化到感受态细胞e c o l id h 5 t t 内，均匀地涂在含有i p t g x g a l 的固体l b 培养基上，进行蓝自斑筛选。1 6 h 后从培养基中挑取白色的单克隆菌落， 接种到l m l l b ( 6 山伊+ ) 液体培养基中，于3 7 。c 过夜振荡培养。 ( 9 ) 以菌液为模板进行p c r 鉴定，产物进行2 的凝胶电泳，将有目的条带 的菌落送测序公司进行测序。 ( 1 0 ) 将测序结果用1 , a s e r g e n e 软件进行比对分析，碱基出现频率最高的为 该位点的结合碱基，从而得到特异性结合序列。 实验结果 一、p g e x f n l i i 质粒构建 l 、f a n k l 蛋白f n l i i 结构域d n a 序列的扩增 p c r 扩增的目的基因片段经1 琼脂糖凝胶电泳结果显示其大小与预计的 4 7 9 b p 一致( 图1 ) 。 一l 5 0 0 图l ，p c r 扩增f a n k l 蛋白f n 结构域d n a 序列产物电泳结果 m ：d l 2 0 0 0m a r k e r ；1 ：f a n k l 蛋白f n l i i 结构域d n a 序列的p c r 产物。 2 、p g e x 4 t 2 质粒及f a n k l 蛋白f n l i i 结构域片段酶切后纯化 p g e x - 4 t - 2 质粒和f a n k l 蛋白f n l i i 结构域的p c r 产物经限制性内切酶 b a m hi 和s a li 酶切后用1 琼脂糖电泳鉴定，可见p g e x - 4 t - 2 质粒酶切产物为l 条4 9 5 0 b p 大小的片段。f a n k l 蛋白f i 皿结构域d n a 序列的酶切产物可见一条 约4 7 0 b p 大小的目的条带( 图2 ) 。 1 6 i l 1 1 2 2 2 0 0 0 1 0 0 0 7 5 0 5 0 0 1 0 0 2 5 0 _ 。_ _ 4 7 0 图2 ，p g e x 4 t - 2 质粒及f a n k l 蛋白f n 结构域d n a 目的片段酶切后纯化 m 1 ：d l l 5 0 0 0d n am a r k e r ：1 ：p g e x - 4 t - 2 质粒经限制性内切酶b a m t t i 和 s a li 酶切后片段( 4 9 5 0 b p ) ；2 ：f a n k l 蛋白f n l i i 结构域的p c r