（水生生物学专业论文）人肥胖基因在毕赤酵母中的表达.pdf

人肥胖基冈在毕赤酵母中的表达 摘要 肥胖基因编码的蛋白质( 1 e p t i n ) 是反映体内脂肪含量和调节体重的重要信号因 子，l e p t i n 能显著降低脂肪组织数量、促进青春期发育，对机体的免疫应答、繁殖功 能、神经内分泌等功能具有重要的作用。 本文根据己报道的人肥胖基因c d n a 序列设计引物，p c r 扩增出人肥胖基因的 c d n a 编码序列，然后将此定向克隆至毕赤酵母分泌型表达载体p p i c 9 k 的a 因子 信号肽编码序列37 端，构建成重组酵母表达载体，测序分析表明该c d n a 序列由 4 3 8 个核苷酸组成，编码1 4 6 个氨基酸组成的多肽。用化学方法转化毕赤酵母g s l l 5 ， 经p c r 鉴定证实，目的基因整合到重组酵母菌染色体中，对重组酵母进行g 4 1 8 筛 选和4 天的诱导表达，然后对阳性克隆进行了为期4 天的诱导表达，s d s p a g e 未 检测到目的产物的表达。 根据巴斯德毕赤酵母表达系统的密码子偏爱性，对肥胖基因进行了简并改造和 人工合成，然后将改造过的人肥胖基因以正确的读码框架插入到酵母分泌型表达载 体p p i c 9 k 的a 因子信号肽编码序列37 端，构建成重组酵母表达载体，测序结果与 预期一致。重组酵母用同样方法进行了为期4 天的诱导表达，并通过s d s p a g e 和 放免检测，得到一株表达目的蛋白量最高的重组酵母菌，该重组蛋白表达水平可达 7 7 1m g l ，不同浓度g 4 1 8 筛选表明该酵母菌是高拷贝的。s d s p a g e 检测表明分 泌蛋白分子量约为1 6 k d 。 关键词：肥胖基因；瘦素；毕赤酵母；克隆；表达 华中农业人学2 0 0 6 届硕上学位论义 a b s t r a c t t h ee x p r e s s i o np r o d u c to fo bg e n e l e p t i ni sa ni m p o r t a n ts i g n a lr e f l e c t i n gb o d yf a t m a s sa n dc o n t r o l l i n gw e i g h t ，i tc a nr e m a r k a b l yc u td o w nt h ea m o u n t so ff a tm a s s 、 s t i m u l a t et h ed e v e l o p m e n to ft h ea d o l e s c e n c ea n da l s op l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h e i m m u n ef u n c t i o n ，r e p r o d u c t i o n ，n e u r o e n d o c r i n es e c r e t i o n s p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa m p l i f yt h ec d n af r a g m e n te n c o d i n gh u m a n l e p t i n ，t h e n ，t h ec d n af r a g m e n tw a si n s e r t e di n t ot h e3 - e n do fc t f a c t o r o fy e a s t e x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 k d n as e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a t i tc o n s i s t e do f4 38 n u c l e o t i d e st h a te n c o d e da14 6 - a m i n op e p t i d e t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 9 k - o bw a s t r a n s f o r m e di n t ot h eg e n o m eo fg s115b yc h e m i c a lm e t h o d t h ep o s i t i v et r a n s f o r m a n t s w e r ei n d u c e db ym e t h a n 0 1 t h er e s u l to fs d s - p a g ed e m o n s t r a t e dt h a tt h eg e n en e a r l y c o u l d n tb ee x p r e s s e d t og e tah i g h e re x p r e s s i o no fh u m a nl e p t i n ，t h eh u m a no bg e n ew a sm o d i f i e da n d s y n t h e s i z e db ym a n u a li nt h eb a s i so fc o d o nb i a s ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a s c o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t ot h eg e n o m eo fg s115 t h em u t i p l ei n s e r tt r a n s f o r m a n t s w e r es c r e e n e db yg 418a n di n d u c e db ym e t h a n 0 1 a f t e r4d a y so fm e t h a n o li n d u c t i o n ， h u m a nl e p t i nw a ss e c r e t e di n t ot h em e d i u m t h ec o n c e n t r a t i o no fl e p t i ne x p r e s s i o n s u p e m a t a n tw a sa b o u t7 71m g lb yi r a t h er e s u l to fs d s p a g e d e m o n s t r a t e dt h a tt h e w e i g h to f t h es e c r e t e dp r o t e i nw a sa p p r o x i m a t e l y16k d k e yw o r d s ：o b e s eg e n e ；l e p t i n ；p p a s t o r i s ；c l o n i n g ；e x p r e s s i o n u 人肥胖基因在毕赤酵母中的表达 缩写 a m p b m m y b m g y b p ( s ) b i s d d h 2 0 d n t p d t r e b e d t a g h k b k d a l b m g m l n m l m m m d o b o d 0 n p a g e p b s p e g p i r m i n r n a s e s d s s e e t e t e m e d y p d y n b 嵋 此 p m 英文名称 a m p l i c i l l i n 缩略词表 ( a b b r e v i a t i o n s ) b u f f e r e dm e t h y a n o l - c o m p l e xm e d i u m b u f f e r e dg l y c e r o l c o m p l e xm e d i u m b a s ep a i r ( s ) b i s a c r y l a m i d e d o u b l ed i s t i l l e dh 2 0 d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e 1 4 一d i t h i o t h r e i t o l e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d g r a m h o u r k i l o b a s ep a i r k i l o d a l t o n l u r i a b e r t t a n im e d i u m m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r m i n i m a ld e x t r o s em e d i u m m i n i m a lm e t h a n a lm e d i u m o b e s eg e n e o p t i c a ld e n s i t y o r i g i no fr e p l i c a t i o n p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o l y e t h y e n eg l y c o l i s o e l e c t r i cp o i n t r o t a t i o np e rm i n u t e r i b o n u c l e a s e s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e s e c o n d t f i s c ie t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l et h y l e n e d i a m i n e y e a s te x t r a c tp e p t o n ed e x t r o s em e d i u m y e a s tn i t r o g e nb a s e m i c r o g r a m m i c r o l i t e r m i c r o m e t e r i i i 中文名称 氨苄青霉素 甲醇完全缓冲培养基 甘油完全缓冲培养基 碱基对 ( 甲叉) 双丙稀酰胺 双蒸水 三磷酸脱氧核糖核苷酸 1 , 4 二硫代苏糖醇 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 克 小时 千碱基对 道尔顿 l b 培养基 毫克 分钟 毫升 葡萄糖基本培养基 甲醇基本培养基 肥胖基因 光密度 复制起始区 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 聚乙二醇 等电点 每分钟转数 核糖核酸酶 十二烷基磺酸钠 秒 t r i s c ie d t a 缓冲液 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 酵母浸出物蛋白胨葡萄糖培养基 酵母氮源 微克 微升 微米 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 切 是否保密劢 如需保密，解密时间 z 广纩年厂乙月多- e i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 鼢再 帆岫月西 鲐百名：矽勿厂 签名日期：加毛年6 月c 厢 签名日期：衫年么，月【莎日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 人肥胖基因往毕赤酵母中的表达 1 前言 肥胖是机体脂肪细胞数量增加或体积肥大致体重超过标准体重2 0 以上的病理 状态，同时也是一种常见的、复杂的代谢失调症，可以影响整个机体正常功能的生 理过程。目前已知肥胖同糖尿病、高血压、高血脂甚至肿瘤的发病有关，因此肥胖 已经成为一个公共健康问题，倍受科学界重视。近年来，随着现代分子生物学技术 的迅猛发展，人类对肥胖基因的研究更为深入，更为广泛，这为人类努力寻找防治 肥胖、提高人类健康的有效方法提供了保障。特别是肥胖基因及其产物瘦素( 1 e p t i n ) 的发现，成为肥胖研究领域的一个重大突破。 1 1 人肥胖基因的发现 肥胖基因o b 基因( o b e s eg e n e ，o bg e n e ) 的提出始于1 9 5 0 年，当时i n g a l l s 发现了 一个基因的隐性突变，并且可以导致肥胖，他将该基因称为肥胖基因。1 9 5 3 年， k e n n e d y 提出控制机体体重的“脂肪自稳理论”( l i p o s t a t i ct h e o r y ) ，h e r v e y 在联体小 鼠试验结果证实了这一点，并解释为小鼠脂肪组织能够产生一种“循环饱感因子， 这种因子可作用于下丘脑而减少摄食。1 9 9 1 年f r i e d m a n 描述了五种可以使小鼠形成 肥胖的单基因突变，分别是o b e s e ( o b ) 、d i a b e t e s ( d b ) 、f a t ( f a ) 、t u b b y ( t u b ) 和o b e s e y e l l o w ( a y ) ，为研究肥胖的分子机制奠定了基础。随后z h a n g 等( 1 9 9 4 ) 利用基因的 定位克隆技术克隆出了小鼠和人o b 基因同源框，同时发现o b 基因的突变可以导致 肥胖，使肥胖研究真正进入分子时代。 1 2 人o b 基因和l e p t i n 的基本结构 1 2 1o b 基因的基本结构 人o b 基因为单拷贝，位于7 q 3 1 染色体上，覆盖约2 0k b 的区域，由3 个外显 子和2 个内含子组成，第一外显子和第一内含子位于57 非翻译区，直至a t g 起始 密码子上游2 9b p ，第二内含子位于+ 4 9 位谷氨酰胺，第三外显子包括下游编码序列 和3 非翻译区。 1 2 2l e p t i n 的基本结构 人l e p t i n 前体前2 l 位氨基酸残基为l e p t i n 信号肽，该信号肽分子量为2 6k d ， 理论上等电点为6 4 9 ；信号肽之后为l e p t i n 成熟肽，由1 4 6 个氨基酸组成，分子量 华中农业大学2 0 0 6 届硕学位文 ，焘，一套：茹j j 鼗蠢致一0 _ 7 爹 j ：蓼嚣秒。j 、 74 雾。 1 23 圈1 人l e p t i n 三维结构 f i g 1t h r e e - d i m e n s i o ns t r u c t u r eo f h u m a nl e p t i n 1 3 人l e p t i n 受体( o b r ) l e p t i n 和其它激素一样，需要与特异的受体结合爿能发挥其生物学作用。研究发 现人o b r 广泛地分布于各种小同的组织中有5 - 6 种剪接体：o b r a ，b ，c ，d ，e 和f 。根据他们胞内艮度的不同可分为两类：长形受体( o b r i ) 和短形受伴( o b r s ) 。 o b r b ，含有j a n u s 活化酶和信号传导和转录活化因子结合顺序，是最主要的功能性 受体，广泛分布于脑和其它组织器官。 b u r g u e r a 等( 2 0 0 0 ) _ i jn o r t h e r n b l o t 和原位杂交等方法研究了瘦人、肥胖人和糖尿 病人腑内o b - r b m r n a 的分布。研究发现o b r m r n a 分御于返= 类人的内皮细胞、 脉络从r 皮和室管膜细胞，o b r bm r n a 分栉于下丘脑、新皮质、仁核、蒲肯野 氏细胞和m e y n e r t 氏基底核、齿状核、延髓的下橄榄核和脑神经核。以下丘脑视上 核和小脑内分布的o b r m r n a 最多。o b - r 可在人的脑、心脏、胎盘。肝脏、肌肉、 肾脏、睾丸、胰脏等多种组织和器官中均有分御( 吴举等，2 0 0 0 ) 。早期的大多数 研究表明，妊型l e p t i n 受体主要分布在下丘脑的弓状核和室旁核这两个调节摄食和 代谢的热点区。l e p t i n 受体m r n a 呈浓集分布，因而队为l e p t i n 主要通过中枢神经 系统影响动物的摄食和代谢。 人肥胖桀闪在毕赤酵母中的表达 1 4 人l e p t i n 的功能 l e p t i n 作用于下丘脑的特异受体，通过下丘脑对机体的摄食和能量消耗( h a l a a s e ta 1 ，1 9 9 5 ) 进行调控，是反映体内脂肪组成及含量的信号因子( p e l l e y m o u n t e re t a 1 ， 1 9 9 5 ) ，l e p t i n 还参与调节机体的免疫应答( m a t a r e s ee ta 1 ，2 0 0 0 ) ，促进细胞因子的生 成( l o r de ta 1 ，1 9 9 8 ) ，具有广泛的生物学效应。 1 4 1l e p t i n 与体重 l e p t i n 与体重的关系密切，新生儿脐血中即可检测到l e p t i n ，且高出生体重儿( 出 生体重超过9 0 百分位) 的l e p t i n 水平升高与体重显著相关。l e p t i n 反映体内脂肪的含 量。现已发现，l e p t i n 水平与体重指数( b m i ) 、脂肪组织含量呈显著j 下相关。大多数 学者认为血l e p t i n 与b m i 、体重、脂肪含量的正相关存在于全体人群中，无论消瘦 者、正常体重者，还是肥胖者。当能量处于负平衡时，血l e p t i n 产生减少，食欲不 受控制：当能量处于正平衡时，血l e p t i n 产生增加，食欲受限，从而调节体重。 1 4 2l e p t i n 与生殖发育 近年的研究表明，体脂含量较低的人群容易发生生殖功能紊乱，女性表现排卵 停止，男性体内睾酮水平降低。体脂含量较高的女性则表现青春期提前，并且l e p t i n 的浓度明显高于正常女性，由此认为脂肪组织产生的某种信号可能对青春期的发育 具有重要的影响，l e p t i n 与青春期发育存在一定的联系，有加速青春期发育的作用， 而在启动和维持青春期发育中是非决定性因素( 孙长颢等，2 0 0 4 a ；孙长颢等，2 0 0 4 b ) 1 4 3l e p t i n 与免疫功能 研究表明，饥饿和炎性感染时血清中l e p t i n 的表达水平大幅度上升，l e p t i n 可能 在宿主炎性反应中起重要保护作用( f a g g i o n ie ta 1 2 0 0 1 ) 。以磷酸盐缓冲溶液( p b s ) 处理的胸腺皮质细胞凋亡较多，而以l e p t i n 处理的胸腺皮质细胞则相对受到较好的 保护，凋亡稀少( h o w a r de ta 1 ，1 9 9 9 ) ，因此l e p t i n 有可能直接调节免疫细胞，保 护免疫器官。z a r k e s h 等( 2 0 0 1 ) 研究发现人外周血单核细胞存在一定的o b rm r n a 的表达，高剂量的l e p t i n 通过o b r 直接激活白细胞的免疫应答。 华中农业大学2 0 0 6 届硕上学位论文 1 4 4l e p t i n 与妊娠和胎儿的发育 有几位学者在胎盘滋养层细胞中检测到了l e p t i n 的表达( g r e e ne ta 1 ，1 9 9 5 ； m a s u z a k ie ta 1 ，19 9 7 ) ，h a s s i n k 等( 19 9 7 ) 采用原代培养的滋养层细胞株j e g 3 和l a r 也发现了l e p t i n 的表达，并且这些细胞还分泌绒毛膜促性腺激素、催乳素和孕酮， 因此l e p t i n 酮其他激素一样也是胎盘分泌的一种激素，证实了胎盘组织中l e p t i n 的合 成与分泌，表明l e p t i n 对胎儿的生长发育具有重要意义。胎盘和乳腺是胎儿l e p t i n 的重要来源( h a s s i n ke ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在妇女怀孕过程中，母体的l e p t i n 与胎儿的受体 结合，影响胎儿的生长发育，其o b 基因的表达水平与胎儿的体重和胎盘的重量有较 好的相关性，胎儿体重越大，l e p t i n 的表达水平越高( 贲晓明等，2 0 0 2 ) 。在哺乳期， l e p t i n 及其受体还可以在乳腺上皮中表达，表明o b 。r 在妊娠和哺乳期乳腺生长中起 调节作用。哺乳期l e p t i n 的水平与乳汁的产量有关，此外l e p t i n 可通过乳汁传递给后 代，从而影响婴儿的生长或摄食。 1 4 5l e p t i n 与造血功能 l e p t i i l 对造血功能的影响主要是由于l e p t i n 能够促进造血细胞的增殖、分化和造 血功能，这种功能主要来源于l e p t i n 的受体，l e p t i n 能促进胎儿和成年入骨髓中基质 细胞层造血组织中l e p t i n 受体的识别和脂肪组织中肥胖基因的表达，许多细胞因子 都可以通过促红细胞生成素受体家族的成员而发挥它们的生物学效应( m i k h a i le ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。l e p t i n 还能增加巨噬细胞的数量，它和促红细胞生成素协同作用促进红细胞 的生成( h o u s e k n e c h te ta 1 ，1 9 9 8 ) 。此外，也有证据表明胎儿的脐带血中存在l e p t i n ， 其l e p t i n 的水平和婴儿出生体重存在正相关。这些研究表明l e p t i n 在调节胎儿和成人 的血细胞生成中均起着重要作用( g i m b l ee ta 1 ，1 9 9 6 ；m i k h a i le ta 1 ，1 9 9 7 ) 。因此，除 了影响能量贮存外，骨髓的l e p t i n 还可能调节造血功能，激活胎儿和成年人的红细 胞和骨髓细胞的分化。 1 4 6l e p t i n 对骨代谢的作用 l e p t i n 是一种内分泌激素，又是骨组织中的旁分泌和自分泌激素。t h o m a s 等( 1 9 9 9 ) 对人骨髓基质细胞系- - h m s 2 1 2 的作用进行研究，结果表明l e p t i n 可作用于人骨髓 基质细胞，提高其向成骨细胞分化，抑制其转化为脂肪细胞。l e p t i n 还被证明是一种 抗骨髓基质细胞和成骨细胞凋亡的因子，促进成骨细胞向骨细胞转化，通过中枢神 经系统来调控骨形成，其作用部位很可能在下丘脑( d u t y e ta 1 ，2 0 0 0 b ) 。血清l e p t i n 的浓度与年龄和骨密度具有密切的关系( z h o n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) ，年龄增长的同时多伴 4 人肥胖基冈谯毕赤酵母中的表达 骨量丧失及骨髓中脂肪组织的增加，表明脂肪组织的分化可能会影响骨髓祖细胞分 化为成骨细胞或破骨细胞的过程( 钟妮等，2 0 0 4 ) 。研究还发现，肥胖者骨质疏松 的发病率明显低于非肥胖者( c o r n i s he ta 1 ，2 0 0 2 ) ，l e p t i n 的含量越高，骨密度越低， l e p t i n 可能导致或加重骨质疏松症的发生( 肖德明等，2 0 0 4 ) 。 1 4 7l e p t i n 对组织代谢的作用 l e p t i n 与胃肠道内l e p t i n 受体结合后促进脂肪酸的1 3 氧化，协同胆囊收缩素 ( c c k ) ，减少能量摄入。对完整肌肉组织，可促进脂类氧化，增强能量消耗，避免 脂质沉积。l e p t i n 可通过对磷酸烯醇丙酮酸羧激酶及糖异生的影响限制三酰甘油的合 成，提高肝脏及外周组织的胰岛素敏感性，从而减少体重。 除此之外( p i n k n e y je ta 1 ，1 9 9 8 ) l e p t i n 还与下丘脑垂体甲状腺轴共同参与机体 的进食、体重、能量代谢调节，两者可能在下丘脑水平以及在脂肪细胞水平发生相 互调节作用。 1 5 人o b 基因的体外表达研究 人o b 基因在原核表达系统中已得到表达。s c o t t 等( 1 9 9 5 ) 根据大肠杆菌密码子 偏爱性改造了人o b 基因，实现了改造基因的原核表达，分泌目的蛋白占上清可溶性 蛋白的7 。邹民吉等( 2 0 0 0 ) 在大肠杆菌中表达了人肥胖基因，薄层扫描结果显示， 此蛋白约占菌体总蛋白的1 5 ，昔奋攻等( 2 0 0 5 ) 将人肥胖基因，克隆原核表达载 体p t 7 7 ，重组质粒转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，经温度诱导，表达量最高占菌体蛋白 总含量的4 5 以上。许婉宁等( 2 0 0 0 ) 大规模纯化大肠杆菌中的表达的重组人瘦素， 每升发酵液中含量约2 4m g 。除此之外，刘建忠等( 2 0 0 1 ) 成功制备了乳腺高水平表 达人o b 基因的转基因小鼠，表达水平为lm g m l ，在研究瘦素功能异常与其它多种 相关疾病的工作中发挥重要的作用。 1 6 毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r & ) 表达系统 1 6 1 毕赤酵母表达系统 毕赤酵母的发现始于1 9 6 9 年，当时o g a t ak 等首次发现它可以在甲醇为唯一碳 源的条件下生长，这个发现立即引起了高蛋白动物饲料生产商的注意，并在几年后 由p h i l l i p s 石油公司率先研制出了毕赤酵母在甲醇中高密度连续培养的培养基和技 术方案。随后的1 0 多年中，p h i l l i p s 石油公司与美国加州的s i b i a 公司合作进行毕 5 华中农业人学2 0 0 6 屈硕一l 学位论文 赤酵母表达系统的研究，成功分离了醇氧化酶基因( a o x l 、a o x 2 ) 和启动子并构 建了表达载体，建立了酵母品系和实验操作方案。1 9 9 3 年，p h i l l i p s 公司将毕赤酵母 表达系统的有关专利卖给了t u c s o n 公司，并授权i n v i t r o g e n 公司出售该表达系统。 在这之后，z y m o g e n e t i c s 公司开发了一种新的嗜甲醇酵母，命名为甲醇毕赤酵母 ( p i c h i am e t h a n o l i c a ) ( c r e g ge ta 1 2 0 0 0 ) 。这种酵母在培养时可用葡萄糖代替甘 油，且异源蛋白的表达仅需少量甲醇作为诱导剂。目前该系统的发布权亦已授予 i n v i t r o g e n 公司。毕赤酵母可以进行类似哺乳动物细胞的蛋白翻译后修饰，此外，还 具有发酵方法成熟，培养简单廉价，所表达的外源蛋白既可以在胞内积累又可分泌， 产量高，背景少等特点，使其表达的异源蛋白质在分离、纯化和表达量等问题上具 有很强的优势。 1 6 2 毕赤酵母表达系统的应用 经过多年的研究，毕赤酵母表达系统已相当成熟，是目前最为成功的外源蛋白 表达系统之一。己用毕赤酵母表达系统成功表达的蛋白主要有以下几类：( 1 ) 疫苗 抗原类如破伤风毒素片段c ( c r e g ge ta 1 ，1 9 8 7 ) 、乙肝表面抗原、百日咳抗原p 6 9 、 h i v 1 外膜糖蛋白g p l 2 0 、登革热病毒e 蛋白( s c o r e re ta 1 ，1 9 9 4 ；s u g r u ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 等；( 2 ) 细胞因子类如肿瘤坏死因子( t n f ) ( c l a r ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 、表皮生长因 子( r e e se ta 1 ，1 9 9 9 ) 、内皮素抑制因子( d h a n a b a le ta 1 ，1 9 9 9 ) 、人和鼠的内因子 ( w e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 等；( 3 ) 蛋白酶类如人溶菌酶、伐葡萄糖苷酶( m u s l i ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 、 乙醛氧化酶( k o i w a ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 、人胃促胰酶( n a k a k u b oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 、人肝单 胺氧化酶( p a i g ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 、人胎盘碱性磷酸酶( h e i m oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 等： ( 4 ) 蛋白类激素如胰岛素前体( k j e l d s e n ，2 0 0 0 ) 、人绒毛膜促性腺激素( s e na n dd i g h e ， 1 9 9 9 ) 、鲤鱼生长激素( 李英华等，2 0 0 1 ) 、牛胰蛋白酶原( h a n q u i e re ta 1 ，2 0 0 3 ) 等；( 5 ) 抗体及单链抗体、受体等生物活性蛋白( g o e le ta l ，2 0 0 0 ；y a s u h a r ae ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。 毕赤酵母合成的蛋白质制成的药物如i g f 1 和人血清蛋白质已通过临床试验， 乙肝表面抗原在南非己作为小单元疫苗投放市场。仅2 0 0 5 年，国内外就有一百多种 蛋白在该系统中得到了表达。 随着对毕赤酵母表达系统的研究的广泛深人，该表达系统也将更完善。相信在 将来的理论和实践中，如在分子生物学基础研究、基因工程产品开发、生物催化剂、 生物制药等诸多应用领域中也必将发挥巨大作用。 6 人肥胖堆闪神：毕赤酵母中的表达 表12 0 0 5 2 0 0 6 年报道的应用毕赤酵母系统表达的蛋白 t a b l e1p r o t e i n se x p r e s s e db yp i c h i ap a s t o r i sd u r i n g2 0 0 5 2 0 0 6 2 本研究的目的与意义 近年来，人们一直关注在能否把l e p t i n 应用到人类肥胖的治疗中，试图通过增 加l e p t i n 的生成、减少其消除、改变游离型与结合型的比例、或者促进l e p t i n 透过血 脑屏障等途径实现减肥。研究表明，约1 4 的肥胖个体相对缺乏l e p t i n ，部分l e p t i n 相对缺乏的肥胖者将有可能成为l e p t i n 治疗的对象。目前，外源性重组l e p t i n 的应用 已取得显著效果，美国a m g e n 公司的i 期临床结果显示重组l e p t i n 能使人体重下降。 i i 期临床正在进行中。这使人们看到了应用l e p t i n 治疗肥胖症的可喜前景，重组l e p t i n 的临床应用更是个相当诱人的领域。本研究的目的在于实现人o b 基因克隆及其在巴 斯德毕赤酵母中的分泌表达，为下一步研究奠定基础。 7 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 3 材料与方法 3 1 材料 3 1 1 质粒与菌株 酵母表达载体p p i c 9 k 、g s l l 5 菌株购自i n v i t r o g e n 公司，质粒的限制性图谱如 图2 ；大肠杆菌d h 5 a 由本室保存。 3 1 2 主要试剂 r t p c r 试剂盒、限制性内切酶、t 4d n a 连接酶、t a q d n a 聚合酶、d n a 分 子量m a r k e r 均购自t a k a r a 公司；g 4 1 8 和p e p t o n e 购自s i g m a 公司；y e a s te x t r a c t 、 y n b 、d s o r b i t o l 和d b i o t i n 购自上海生工生物工程公司；d n a 快速回收试剂盒购 自鼎国生物技术有限责任公司；抗生素、s s d n a 购自昆明杰辉生物技术有限责任公 司；低分子量标准蛋白质m a r k e r 为上海升正生物技术有限公司产品；人瘦素放免检 测试剂盒购自北京原子能研究所：其它试剂均为国产分析纯。 3 1 3 主要溶液的配制 氨苄青霉素( a m p ) ：用灭菌d d h 2 0 配制成浓度为5 0m g m l ，小管分装后置2 0 冻存备用。 卡那霉素( k a n ) - 用灭菌d d h 2 0 配制成浓度为1 0m g m l ，小管分装后置一2 0 c 冻 存备用。 溶液i ：葡萄糖5 og ，e d t a1 4 6g ，s 碱1 5 1g ，溶于4 5 0 0m ld d h 2 0 中， 调p h 至8 0 ，在1 5 磅高压蒸气灭菌3 0m i n ，置4 保存备用。 溶液i i ：o 2m o l ln a o h ，1 0 s d s ，现配现用。 溶液i ：3 0m o l lk a c ，冰醋酸调p h 至4 8 。 5 0 t a e 缓冲液：s 碱2 4 2 0g 加入到7 0 0 0m ld d h 2 0 中，再加入冰醋酸，5 7 m l ，0 5m o l le d t a ( p h 8 0 ) 1 0 0m l ，用d d h 2 0 定容至ll ，室温保存备用。 o 8 琼脂糖凝胶：2 0m l5 0 x t a e 缓冲液，9 8m ld d h 2 0 ，琼脂糖0 8g ，加热 完全溶解。 t e 缓冲液( p h 8 0 ) ：1 0m m o l l e d t a ( p h 8 0 ) ，1 0 0m m o l l s c 1 ( p h 8 o ) 。 人肥胖基因住毕赤酵母中的表达 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ：用吸管分别吸取 i r i s 饱和酚2 5m l ( p h 8 0 ) 、 氯仿2 4m l 和异戊醇1m l ，到棕色瓶底部，轻轻混匀，覆盖，储存于棕色瓶备用。 7 5m o l l 醋酸铵( n h 租c ) 溶液：5 7 8gn h 租c 溶于少量d d h 2 0 ，然后用d d h 2 0 定容至1 0 0m l 。 p b s 缓冲液：每升溶液中含o 0 1m o ln a 2 h p 0 4 和n a i l 2 p 0 4 ，o 1 5m o ln a c i ，配好 后调p h 至7 0 。 2 重组质粒快速鉴定裂解液：0 1m o l ln a o h ，1 s d s ，0 0 1m o l le d t a ，0 0 5 溴酚兰，0 1 甘油，充分溶解后，调p h 至8 0 ，再用d d h 2 0 定容至相应体积。 0 1m o l lc a c l 2 溶液：取1 1 1gc a c l 2 溶于d d h 2 0 中并定容至1 0 0 0m l ，过滤 除菌，分装后置2 0 保存，用于大肠杆菌感受态细胞的制备。 lml i c i - 取4 2 4gl i c l 溶于d d h 2 0 中并定容至1 0 0m l ，过滤除菌，分装后置 2 0 保存，用于酵母感受态细胞的制备。 5 0 p e g 3 3 5 0 - 取5 0gp e g 3 3 5 0 溶于d d h 2 0 中并定容至1 0 0m l ，过滤除菌， 分装后置2 0 保存，用于酵母感受态细胞的制备。 2m g m ls s d n a - 取2m gs s d n a 溶于lm l d d h 2 0 中充分溶解，煮5m i n ，冰 上速冷，分装成小管置- 2 0 保存，用于酵母感受念细胞的制备。 1 m 山梨醇贮存液：称取1 8 2g 山梨醇溶于终体积为1 0 0m ld d h 2 0 中，高压除 菌，4 保存。 1 0 x y n b ( 1 3 4 y n b 含硫酸铵不含氨基酸) 贮存液：称取y n b ( 含硫酸铵不含 氨基酸) 3 4g ；硫酸铵1 0 0g 溶于9 5 0m ld d h 2 0 。y n b 需要加热才能完全溶解，过 滤除菌，4 保存。 5 0 0 x b ( 0 0 2 b i o t i n ) 贮存液：称取2 0m g 生物素溶于1 0 0m ld d h 2 0 ，过滤除菌， 4 保存。 1 0 x d ( 2 0 葡萄糖) 贮存液：称取2 0gd 葡萄糖溶于1 0 0m ld d h 2 0 ，过滤除菌， 4 保存。 1 0 x m ( 1 0 l 手i 醇) 贮存液：1 0m l 甲醇与9 0m ld d h 2 0 混合，过滤除菌，4 保 存。 1 0 x g y ( 1 0 甘油) 贮存液：1 0 0m l 甘油与9 0 0m ld d h 2 0 混合，高压除菌，室 温保存。 1 m 磷酸钾缓冲液( p h 6 0 ) 贮存液：1m o l l 磷酸氢二钾1 3 2m l 与8 6 8m l l m o l l 磷酸二氢钾混匀，调节p h 至6 0 ，高压除菌，室温保存。 1 0 0 x a a ( 0 5 氨基酸) 贮存液：分别称取5 0 0m gl g l u 、l m e t 、l l y s 、l - l e u 和l i l e 溶于1 0 0m ld d h 2 0 ，过滤除菌，4 保存。 1 0 0m g m lg 4 1 8 贮存液：配制1 0 0m m lg 4 1 8 后，过滤除菌，4 保存。 9 华中农业人学2 0 0 6 届硕。l ：学位论义 l b 液体培养基：胰蛋白胨1 0 0g ，酵母浸出物5 0g ，n a c i1 0 0g ，溶于d d h z o 中，完全溶解后用5 0m o l l 的n a o h 调p h 至6 8 7 0 ，定容至1 0 0 0 0m l ，于1 5 磅高压蒸汽灭菌3 0m i n ，然后室温保存。 含抗生素l b 固体培养基：在l b 液体培养基中加入1 5 的琼脂，于1 5 磅高压 蒸汽灭菌3 0m i n ，等温度降至5 0 左右，加入相应的抗生素后，铺制平皿，待培 养基凝固后，将制好的平皿放于4 冰箱保存。 y p d 培养基( 1 酵母浸出粉、2 蛋白胨、2 d 葡萄糖) ：1 0g 酵母浸出粉和 2 0g 蛋白胨溶于9 0 0m ld d h 2 0 ( 若配制固体y p d ，添加1 5g 琼脂粉) 。高压灭菌 3 0m i n ，等培养基降温至6 0 左右，添加1 0 0m l1 0 x d 。液体培养基室温保存， y p d 平板4 保存。 r d b 平板( 山梨醇1 8 6g l ，y n b1 3 4g l ，4 x 1 0 。5 生物素，葡萄糖2 0g l ， 氨基酸o 5g l ，琼脂粉2 0g l ) 7 0 0m ld d h 2 0 中溶解1 8 6g 山梨醇，加入2 0g 琼 脂粉，高压除菌2 0m i n ，降温至6 0 后加入已预温至4 5 的各贮存液：1 0 0m l 1 0 x y n b 、2m l5 0 0 x b 、1 0 0m l1 0 x d 、1 0m l1 0 0 x a a 、8 8m ld d h 2 0 ，尽快混匀， 倒平板。 m d 培养基( 1 3 4 y n b ，4 x 1 0 。5 生物素，2 葡萄糖) ：8 0 0m ld d h 2 0 高压除 菌2 0m i n ( 若配制固体m d 平板，添加1 5g 琼脂粉) ，降温至6 0 后，加入1 0 0m l 1 0 x y n b ，2m l5 0 0 b ，1 0 0m l1 0 x d ，4 保存。 m m 培养基( 1 3 4 y n b ，4 x 1 0 巧生物素，0 5 甲醇) ：8 0 0m ld d h 2 0 高压 除菌2 0m i n ( 若配制固体m d 平板，添加1 5g 琼脂粉) ，降温至6 0 后，加入1 0 0 m l1 0 x y n b ，2m l5 0 0 x b ，2m l1 0 x m ，4 保存。 b m g y 0 酵母浸出粉、2 蛋白胨、1 0 0m m o l l 磷酸钾缓冲液、1 3 4 生物素、 1 甲醇) ：1 0g 酵母浸出粉，2 0g 蛋白胨溶于6 0 0 m l d d h 2 0 中，高压除菌3 0 m i n ， 待冷却至室温，添加1 0 0m llm 磷酸钾缓冲液，1 0 0m l1 0 x y n b ，2m l5 0 0 x b ，1 0 0 m ll o g y ，4 保存。 b m m y ( i 酵母浸出粉、2 蛋白胨、1 0 0m m o l l 磷酸钾缓冲液、1 3 4 生物素、 1 甲醇) ：1 0g 酵母浸出粉，2 0g 蛋白胨溶于6 0 0m i a d h 2 0 中，高压除菌3 0r a i n ， 待冷却至室温，添加1 0 0m l1m 磷酸钾缓冲液( 不同p h 值) ，1 0 0m l1 0 x y n b ，2 m l 5 0 0 x b ，1 0 0m l l o x m ，4 保存。 不同浓度g 4 1 8 y p d 平板：y p d 平板配制到添加1 0 x d 后，加入适当体积的g 4 1 8 贮存液，至g 4 1 8 终浓度分别为o 2 5m g m l 、2m g m l 、4m g m l ，避光4 保存。 3 0 丙烯酰胺：6 0 0m ld d h 2 0 中加入2 9 og 丙烯酰胺和1 0gn - n 亚甲叉双丙 烯酰胺，溶解后定容至1 0 0 0m l ，置棕