（微生物学专业论文）巴西固氮螺菌glnba基因的功能分析.pdf

里耍墅墨塑堕塑竺鲍旦型苎里垫! ! 坌堑 一 首先。利用已经从巴西圃氮螺菌( a z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s e ) y u 6 2 噬菌体文库中克隆到的咖口 基因f 编码信号转导蛋白p 。) ，对该基因的功能进行了分析。将卡那霉素抗性片段( k m c a s s e t t e ) 、 插入g t n b 基因的b g l l l 位点，对其进行体外突变，获得体外突变体，通过双亲结合将突变引入 、一 ab r a s i l e n s e y u 6 2 中通过基因同源重组，敲除基因组中的砂旧基因9 获得g l n b 突变株( g l n b ： k m ) 。为了进一步分析g l n b 基因的功能，将g t b 基因的编码区( 3 3 9 b p ) 构建在p v k l 0 0 中， 置于k m 启动子下呈组成型表达，形成重组质粒p v k - i i 。将p v k - i i 转入g l n b 突变株，构建成 互补株c - g l n b ( g l n b ：k m g l n b ) 。对g l n b 突变株和互补株的固氮酶活性分析和生长性能测 定表明，g l n b 突变株无固氮酶活性，即表型为n i l ，而互补株像野生型一样，具有固氨酶活性。 1 突变株、互补株及野生型菌株在菌落生长速度上基本相同。1 将含有g l n b 基因的熏组质粒p v k 1 1 分别转入到一b r o s i l e n s f y u 6 2 和具有一定抗铵能力的d r a t 突变株中，使g l n b 基因的拷贝数 增加并进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的g l n b 基因能显著提高固氮酶活性。 从构建具有稳定泌铵能力的联合固氯工程菌的目的出发对已经从a b r a s i l e n s ey u 6 2 噬 茵体文库中克隆到的部分g l n a 基因，懈壮观霉素抗性片段( n - e l e m e n t ) 插入g l n a 基因的n r u l 位点，对其进行体外突变，获得体外突变体，通过双亲结合法将其引入b r o s i l e n ey u 6 2 中 通过同源重组敲除基因组中的g l n a 基因获得g l n a 。突变株( g l n a ：n ) 对g l n a 突变株的 固氮酶活性、生长性能、泌铵能力和g s 酶活性测定结果表明g l n a 突变株固氮酶活性比野 生型的高2 倍左右；突变株不能利用铵和谷氨酸作为唯一氮源进行生长；g l n a 突变株可以泌 铵其泌铵能力比野生型菌株高3 4 倍，硝酸盐能促进突变株的泌铵能力f 试图获得g l n a 基 因全序列但没有成功。g l n a 突变株的g s 酶的活性只有野生型的2 0 0 , 4 左右。) 7 。 煺词晒固够菌蹦2 棚l 蒡卧驯步瓯0 8 秽紫 l 、x 里壅些查堂堡主堂堡堡苎 一一 a b s t r a c t t h ef u n c t i o no f g l n bg e n ec l o n e df r o mag e n o m i cl i b r a r yo f a z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s ey u 6 2w a s a n a l y z e d t h eg e n ew a sm u t e d nv i t r ob yi n s e r t i n gt h ek m - c a s s e t t ei n t ot h e 毋川lr e s t r i c t i o ns i t e o f g l n b 。t h e nt h em u t a t i o nw a st r a n s f o r m e di n t ow i l dt y p e 一b r a s i l e n s ey u 6 2 t ok n o c k o u tt h eg e n o m i c 西n bg e n e ，t h u so b t a i n e dt h eg i 啦m u t a n ts t r a i n ( g l n b ：k m ) t h ee n c o d i n gr e g i o no f g l n bw a sc l o n e d i n t ov e c t o rp v k t o oa n dw a s , i r a u s f e r r e di n t oa b r a s i l e m ey u 6 2 ，g l n b m u t a n ta n dd r a tm u t a n t s t r a i n sr e s p e c t i v e l y i ts h o w e dt h a tt h eg l n b m u t a n tl a c k e dn i t r o g e n a s ea c t i v i t y , i e i t sp h e n o t y p ew a s n i t , w h i l et h ec o m p l e m e n ts t r a i nw a sa sn o r m a l w i l dt y p ey u 6 2 t h eg r o w t hs p e e do f t h em u t a n t s a n dw i l d t y p ey u 6 2w a s t h es 帅e i nw i l dt y p ey u 6 2a n dd r a tm u t a n t s c o n t a i n i n gm u l t i p l ec o p i e so f g l n bg e n e ，t h en i t r o g e n a s ea c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s es t r a i n sw i t h o u tm u l t i p l ec o p i e s o f g l n bg e n e i no r d e rt oc o n s t r u c ts t r a i n st h a tc a ne x c r e t ea m m o n i u mi n t oe n v i r o n m e n t ，w ec o n d u c t e di nv i t r o m u t a g e n e s i so f g l n ag e n ef r o m 一b r a s i l e n s ey u 6 2 ，b yi n s e r t i n gt - e l e m e n t ( r e s u l t i n gr e s i s t a n c eo f a n t i b i o t i c ss p e c t i n o m y c i n ) i n t ot h eu n i q u es i t eo f n r u l t h em u t a t i o nw a st r a n s f o r m e di n t ow i l dt y p e a b r a s i l e n s e y u 6 2 t ok n o c k o u t t h e g e n o m i c g f ，叫g e n e ，a n d g o t g l n d 。m u t a n ts t r a i n ( g l n a ：n ) t h e g r o w t ha b i l i t i e sa tt h ep r e s e n c eo f a m m o n i aa n dg l u t a m a t ea n dt h en i t r o g e n u s ea c t i v i t yo f t h em u t a n t s w e r ea n a l y z e d t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h em u t a n tc o u l du t i l i z e n e i t h e ra m m o n i u mn o r g l u t a m a t e s o l en i t r o g e ns o u r c a st om eg s a c t i v i t yo f t h em u t a n t s ，i ts h o w e dt h a tl l l eg sa c t i v i t y o ft h em u t a n t sw a so n l y h i g ha sa b o u taq u a r t e ro ft h ew i l dt y p e n i t r o g e n a s ea c t i v i t i e so ft h e m u t a n t sw e r et w ot i m e sh i g h e rt h a nt h ew i l d t y p e a l s ow ed e t e r m i n e dt h ea m m o n i ae x c r e t i o na b i l i t y o ft h em u t a n ts t r a i n s i to c c u r r e dt h a tt h e g l n a m u t a n tc o u l de x c r e t em o r ea m m o n i ai n t ot h e e n v i r o n m e n tt h a nw i l dt y p e 一b r a s i l e n s ey u 6 2 。a n dn i t r a t ec a ns t i m u l a t et h ea m m o n i a e x c r e t e db yt h e m u t a n t st h et r i a l st oo b t a i nt h ef u l ls e q u e n c e o f g l n ag e n ew e f a i l e d k e yw o r d sa z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s ey u 6 2 ，g l n bg e n e ，g l n ag e n e ，a m m o n i u m e x c r e t i o n ，g sa c t i v i t y 里耍塑壑堡堕翌丝型! 璺墅苎里些丝坌堑 一 第一部分信号转导蛋白p 。及g s 酶研究进展 一、导言 现在地球上有5 0 多亿的人口。且还在以每年八九千万的速度增长，预计到2 0 2 0 年世界总 人口将达到8 0 亿，本世纪末将达到l l o 亿。而在未来5 0 多年里，在人口增长两倍多的情况下， 即使在维持现在这种消费水平，人们必须从不断减少的耕地上生产更多的粮食才能维持自身的 生存，也就是说农作物的增长必须在2 3 倍以上。因此对限制农作物产量的重要因素的氮素， 必须有更大的投入。氮肥的过量使用现在已经对环境造成了严重的污染一方面使有毒的硝酸 ，亚硝酸离子进入水圈，严重危害人类和其它物种的生存；大量或超量的使用合成肥料，造成 土壤严重板结，结构遭到破坏。现在随化学肥料的使用，每公斤投入导致的是产量年递减 4 3 。另一方面促使合成氨工业不断发展，从而不仅在能源上造成了巨大消耗，而且氧化亚 氮排放大量增加，而氧化亚氮是破坏大气臭氧层及加重温室效应的主要因素之一。为了避免这 种局面的最终形成，发展可持续农业势在必行，这就必须解决生物固氮问题，发挥生物固氮的 效力。有效地利用生物固氮是减少氮肥使用，缓解环境污染，发展可持续农业的一条重要途径。 大气中有8 0 为氮气，据估计地球上有6 0 7 0 的化合态氮为生物固氮所合成。根据固氮 生物和植物的关系通常将其分为三类：自生固氨、共生固氨和联合固氦。白生固氨菌是研究 的最早且研究的最深入的，迄今为止，已有5 种固氮菌的固氮基因已基本弄清楚k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e a z o t o b a c t e rv i n e l a n d i i ，a z o t o b a c t e rc h r o o c o c c u m r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s 和 e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s ，且对这些菌的调控机制进行了许多研究，其中研究得最为清楚的是 k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ( a b d e l s a l a mm se t 口，1 9 8 7 ) 但由于自生固氮菌的固氮效率很低，且 固定的铵很少被分泌到胞外生物固氮体系中由根瘤菌与豆科植物形成的共生固氮体系最为重 要，它所固定的氮量占总生物固氮量的4 5 。对于共生固氮菌的研究已有一百多年的历史，然 而其固氮遗传学方面的了解远不如自生固氮菌清楚但近年来对三个有代表性的根瘤菌： r h i z o b i u mm e l l i l o t i 、b r a d y r h i z o b i u mj a p o n i c u m 和a z o r h i z o b i u mc a u l i n o d a n s 的固氮基因组成及 有关固氮的调控因子的遗传与功能也有了许多研究和进展( f i s c h e r ，j 9 9 4 ) 。但由于根瘤菌的 宿主专一性在很大程度上限制了它的应用。 联合共生固氮菌的首次报道是在本世纪七十年代初，当时巴西d o b e r e i n e r 等人报道了禾本 科植物根际可以固定相当量的氟。次年他们又发现p a s p a l u mn o l a t u m ( 显著雀稗) 根际常与大 景的a z o t o b a c t e r p a s p a l i 相联合( d o b e r e i n e re t a 1 9 7 3 ) ，并从其根际分离得到联合共生固氮菌 a z o s p i r i l l u ms p p 。这些与植物根际有密切关系并定植于根际但又不形成特异化结构的固氮菌被 称为联合共生固氮菌。至今许多与禾本科作物和牧草根际联合的固氮菌已被相继分离包括 | - 4 c e t o b a c t e r ，a z o a r c u s ，a z o s p i r i l l u m 、a z o t o b a c t e r e m e r o b a c t e r ，h e r b a s p i r i l l u m 、k l e b s i e l l a 等属( b a a l a n d r a u1 9 8 3 b a l d a n ie t 口，1 9 8 6 ，d o b e r e i n e r1 9 8 9 ，d o b e r e i n e r a n dp e d r o s a1 9 8 7 g i l l s e ta l1 9 8 9 r e i n h o l d - h u r e ke ta 1 1 9 9 0 ) 其中大部分属于新属有的原来被认为是自生阎氮菌。 中周农业大学硕士学位论文 联合共生固氮菌中研究的晟早以及最多的为固氮螺菌( 4 z o s p i r i l l u m ) ，该菌是d o b e r e i n e r 等人首先从巴西热带禾本科牧草俯仰马唐( d i g # a r i ad e c u m b e n s ) 根际分离得到的，当时命名 为勋i r i l l u ml i p o f e r u ms p 7 ，但1 9 7 8 年t a r r o r n d ( t a r r o m d e la l1 9 7 8 ) 等人根据其固氮作用、d n a 碱基组成、同源性分析以及生理生化特征等将它立为新属，并重新命名为a z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s e s p 7 。由于固氮螺菌分布广泛，可与许多禾本科植物联合固氮，提高作物产量，如玉米，水稻 和小麦等，又能产生植物生长激素，增强植物的抗逆性，因此成为最受重视的联合共生固氮菌。 人们对它的形态、分类、生理生化、遗传、生态、与植物的关系以及田间的应用等方面作了大 量的工作，并取得了一些进展( e l m e r i c h1 9 8 3 ，e l m e r i c he t a l 1 9 9 2 ，m i c h i e l se l 口，1 9 9 3 ，m i c h i e l s e ta 1 1 9 9 4 ，e y e r s 甜a 1 1 9 9 0 。p e d r o s a1 9 9 3 ) 。但由于联合共生固氮菌与宿主植物的根系只是一种 松散的联合关系，而没有形成固定有形的结构，而且联合共生固氮菌在植物根际的联合固氮作 用受到很多因素的限制，结合态氮、氧分压、土著菌的竞争与拈抗、能源物质成为主要的限制 因子加上细菌本身存在精密的氮素调控机制，使得联合共生固氮菌只能为植物提供极为有限 的氮素营养，接种的促生效应主要来源于联合共生固氮菌分泌的植物激素和其它活性物质改善 了根系对水分和矿质元素的吸收。随着对联合共生固氮菌生理生化及遗传特性的研究，使得人 们可以联合共生固氮菌改造成为泌铵工程菌株，增强联合共生固氮菌对植物的氮素供应。 c h r i s t i a n s e n - w e n i g e r ( 1 9 9 1 ) 最早用抗乙二胺法从a b r a s i l e n s ew a 5 中筛选得到泌铵菌株， 并对小麦接种，发现该突变株对小麦有明显的促生效应，且小麦植株中同化氮素来源于泌铵突 变株的比例要比野生型高，其联合固氮酶活性不受结合态氮的抑制。在此之后已有很多泌铵 菌株被分离且被作为接种剂应用到田问，但这些接种效应并不确定。人们希望在研究泌铵机制 后有目的的改造联合固氮菌，使之成为泌铵工程菌。由于细菌中存在着精密的氮代谢调控机制。 因此只有深入研究固氮菌的氮代谢、生物固氮和铵转运的分子机制及其相互关系后，才能最终 阐明泌铵的分子机制，从而可以构建理想的泌铵工程菌株。 二、信号转导蛋白p n 研究进展 信号转导蛋白p n 家族是细菌中分布最广泛的信号转导蛋白自1 9 6 9 年作为g s 酶调节系 统的组成部分发现以来，p 。蛋白已经被认为在原核细菌的氨代谢调节中发挥着重要作用近 来，该家族成员在植物中也有发现这就意味着它们在植物中也可能参与氮代谢调节。p 。蛋 白的功能主要是通过调节调节蛋白的活性来调节基因转录，以及调节参与氮代谢的酶的活性。 有证据还表明p 。蛋白可能参与调节向细胞内运输氮化合物的蛋白的活性 近年来随着细菌基因组学的发展以及认识到p 。蛋白参与细菌的氨调节的现象。使人们 认识到p n 蛋白家族的原核生物中是广泛存在的编码p 。蛋白的基因在变形细菌 ( p r o t e o b a c t e r i a ) 、放线细菌( a c t i n o b a e t e r i a ) 、厚壁细菌( f i r m i b a c t e d a ) 、蓝细菌( c y a n o b a c t e r i ) 、 占菌( a r c h a e b a e t e r i ) 中发现，最近在高等植物中也发现了类似p 的蛋白( h s j c h ，1 9 9 8 ) 。在这 2 里堕旦墨坚堕塑! ! 坐璺型苎望垫堡坌堑 些4 i 同的p 。蛋白，考虑到它们推测产物的一级氨基酸顺序和遗传连锁，它们被分为4 i 同几类 ( 详细的分类请参考a r c o n d e g u y 2 0 0 1 ) 。关于这些基因的表达信息相差非常大，有的研究非 常详细，而宵的根本就毫无了解。 ( 一) p 。基因的转录调控 1 y 变形细菌( yp r o t e o b a c t e r i a ) ec o i l 的幽b 基因在染色体的5 0 分钟处( l i u ，1 9 9 3 ) ，在h m p a 基因( 在咖b 基因的3 端t 与砌口基因转录方向相反) 和j ，m 基因( 也叫o r f - 2 或者o r f x b ，在g 如b 基因的上游，与 g t n a 基因的转录方向相同) 之间( l i u ，1 9 9 3 ，v a n h e e s w i j k ，1 9 9 3 ) 。这种遗传方式在k p n e u m o n i a e 巾也是保守的的。 ec o i lg l n b 基因有四个转录起始位点但所有这些转录都不受氮状况的影响。g l n b 基因的 主要启动子位于g t n a 基因的上游( a t g 上游的3 3 和9 5 ) ，但g l n b 基因的转录还从一个位于) ，m 基因上游的启动子开始转录。e c o i l 的基因组序列显示，在g l n b 基因的上游有一个潜在的由三 个基因( y f h k g a ) 组成的操纵子，并一相同的方向转录。j 獗4 基因的产物是与氮调节蛋白n t r c 高度同源，y f l ) k 和y f l i a 可能组成潜在的一个二元调节系统，对其功能还不清楚。因此，可 以想象，在某些条件下g l n b 基因从册k 基因上游的启动子开始转录( h e ，1 9 9 3 ：b u e n o 1 9 8 5 ) 。 在g l n b 基因的两个主要启动予之问( - 6 8 到- 8 3 ) 有阻遏蛋白p u r r 的结合位点，p u r r 阻 遏嘌呤核苷酸生物合成的酶。在嘌呤过量时，p u r r 使曲b 基因的转录降低两倍。在氮过量时 这种调节的生理意义可以适应于当合成嘌呤核蛋白所需要的谷氨酸少时另外一个对g s 酶活性 的微调。 与e c o l d 相似其它的y 变形细菌还有第二个p u 基因g l n k ，位于铵转运蛋白基因a m t b 的 上游。在e c o l i 和k p n e u m o n i a e 中，在g l n k 基因的上游有一个6 “结合位点，和一个潜在的 n i r c 结合位点。该操纵子的表达依赖于n t r c ( t h o m a s 。2 0 0 0 ) 。唯一的例外是a v i n e l a n d i i 和 h a e m o p h i l u si n f l u e n z a e 。a v i n e l a n d i i 只有一个p 基因且与a m t b 基因连锁其表达从一个类 6 ”的启动子开始，以低的组成型表达( m e l e t z u s ，1 9 9 8 ) 。h i n f l u e n z a e 也只有一个类g l n b 基 因其上游是与e c o l im o g 基因同源的基因，下游是一个编码与e c o l iy d g g 和y h h t 有2 8 相同性的蛋白的基因。y d g g 和y h h t 都是潜在的内膜蛋白。在x y l e l l a f a s t i d i o s a 的g l n a 和a m t b 之间有一个p 蛋白基因( a c c e s s i o nn oa a f 8 4 6 4 8 ) 。在x a n t h o m o n a sc i t r i 的g l n a 和g t n k 之间 也有相似的遗传连锁( a c c e s s i o nn oa f l 8 2 3 9 5 ) 。 2 口变形细蕾( np r o t e o b a c t e r i a ) 在已经研究的多数q 变形细菌中，包括r h i z o b i u m ，b r a d y r h i z o b i u m ，a z o r h i z o b i u i n ， a c e t o b a c t e r ，a z o s p i r i l l u m ，r h o d o b a c t e r ，和r h o d o s p i r i l l u m ，都有两个p i l 基因( z h a n g ，2 0 0 l ； m a s e p o h l ，2 0 0 2 ；v i t o r i n o ，2 0 0 1 ) 。一个基因编码的p u 蛋白与k c o l i g i n b 非常相似，位于g l n a 的上游并与g l n , 4 一起转录。另一个基因编码的蛋白与g i n k 相似并与一个a m t b 同源基因 连锁。这种连锁方式的例外是ab r a s i l e n s e t 它的类咖k 基因( g l n z ) 不与a m t b 连锁而是 3 中国农业文学确士学位 e 文 与一个编码一个与b 口c i l l u s b t i l i s 天冬氨酸氨基转移酶有2 6 相同性的开放阅读框连锁t 该 o r f 在g l n z 的下游3 0 0 b p 处。另一个例外是a c e t o b a c t e rd i a z o t y o p h i c u s ，它既有一个g l n b - g l n a 操纵子还有两个g l n k - a m t b 操纵子。 g l n b a 操纵子和g l n k a m t b 操纵子的表达在q 变形细菌中进行了一定深度的研究。g l n b a 操纵子的转录在各种细菌中不同但也有一些共同特点。r h i z o b i u ml e g u m i n o s a r u m 和 s i n o r h i z o b i u mm e f i l d f i 在g l n b 和g l n a 上游都有启动子。g l n d 启动子中不含有以前描述过的启 动子的共有序列，但g t n b 启动子中含有依赖6 “的启动子的- 2 4 和1 2 共有序列。砌口和g l n a 的表达都是部分依赖n t r c 的。但在g l n b 的上游没有明显的n t r c 结合位点。在足l e g u m i n o s a r u m 中，这些基因是共转录的但g l n b a 和g l n a 的转录并不明显受氮的调节。但在类菌体分化过 程中，g l n b 的表达明显降低。 ab r a s i l e n s e 也产生g l n b a 和g l n a 的转录本，但在这种情况下，g l n b 的前面有两个启动子。 在氮充足的时候，g l n b 从个类6 ”的启动予开始转录在氰缺乏时。第二个依赖6 “的启动 子被激活，g l n b 的转录增加5 倍然而g l n b 的表达不是n i r c 依赖型的，于是有人提出g t b 受一个n t r c 类似物激活。9 1 a 启动子中不含有以前描述过的启动子的共有序列在以分子氨 为唯一氨源时，9 1 a 的转录下降( d ez a m a r o c z y 。1 9 9 0 1 9 9 3 ) 。 在b r a d y r h i z o b i u mj a p o n i c u m 中g l n b 和g l n a 的转录几乎是分开的，但g l n b 从串联的启 动子转录。g l n a 从一个类6 ”的启动子以组成型转录，而在氮充足的时候，g l n b 从一个类6 ” 的启动子开始转录。在氮缺乏时，从一个依赖6 “的启动子开始转录氨状况有变化时转录 的量很少有变化。 在足c a p s u l a t u s 中，g l n b 和g l n a 基因从串联的启动子转录第一个启动子g l n b p i ，受n t r c 抑制。第二个启动子g l n b p 2 ，受n t r c 激活。在足c a p s u l a t u s 中。n t r c 不与含有6 “的r n a 聚合酶作用，因此在g l n b 的上游没有6 “结合位点。b o r g h e s e 和w a l l 利用珈口；jl a c z 融 合蛋白来研究g l n b 的表达。f o s t e r - h a r t n e t t 和k r a n z 研究了不同生长条件下g l n b 的表达。在这 些情况下，即使在n t r c 突变的背景下在氮充足的情况下g l n b 的表达比氮不足时g l n b 的表 达还高，而且。数据还显示有翻译后修饰导致g l n b 和g l n d 的表达水平不等。r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 的g l n b a 启动子区域与足c a p s u l a t u s 的启动子区域相似。这意味着包括氮对g l n b 表达的部分调节在内的调节方式是相似的。有趣的是，在一个缺失r u b i s c o 的突变株中。g l n b 的表达被抑制了，而且无论用什么作为氮源，g s 酶活性都非常低，这意味着有一个很弱的组 成型的g l n a 启动子。 在r h o d o b a c t e rr u b r u m 中无论在氮充足或者固氮的条件下。g l n b 和g l n a 都是从一个弱 的类6 ”的启动子( 曲且p ，) 和一个强的类6 “的启动子 g t n b p 2 ) 共转录。然而在固氮条 件下tg m 印2 的活性受n t r c 的激活。仍然n o r t h e r nb l o t t i n g 分析显示了有两个转录本。但却 检测不到g l n a 启动子，这说明g l n am r n a 是由转录后加工产生的( f o s t e r ，1 9 9 4 ) 。与在 r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m 和足c a p s u l a t u s 中一样，a z o r h i z o b i u mc a u l i n a u d a n sg l n b 和g l n a 也好象 是共转录。在氮充足和不足的条件下，g l n b a 操纵子从两个重叠的启动子开始转录。这两个启 动子有相同的起始位点，其中一个是6 “和n t r c 依赖型的。另一个还不清楚。在g l n a 的上游 4 巴西固氮螺菌y u 6 2 窖抽傩基因功能分析 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ 一一 也没有检测到启动子，所以g l n am p 小i a 也可能是由转录后加工产生的( m i c h e l ，1 9 9 7 ) 。 侄所有已经研究的变形细菌ab r a s i l e n s e ( g l n z ) 、a c a u l i n a u d a n s ，rm e l i l o t i 中tg 加k 的调节是相似的。在每种情况下，初级转录本是从一个65 4 依赖型的启动子开始的，在氮不足 时有活性，也是n t r c 依赖型的。在兄s p h a e r o i d e s 中，g l n k 还只在氮不足的条件下表达，在 缺失r u b i s c o 的突变株中，有铵存在时，g t n r 的表达被部分脱抑制。 3 b 变形细菌( op r o t e o b a c t e r i a ) 1 3 变形细菌的两个代表h e r b a s p i r i l l u ms e r o p e d i c a e 和a z o a r c u ss p 被详细研究过。h s e r o p e d i c a e 有两个类p i i 基因，其中一个与k c o l in a d e 基因( 编码一个依赖于铵的n a d 合成 酶) 同源的一个基因连锁。a z o a r c u ss p 有三个类p 基因，一个是g l n b 同源基因两个是曲k 同源基因，它们每个都与一个a m t b 同源基因连锁( g l n k 与a m t b ，g l n y 与a m t y ) 。a z o a r c u ss p 的两个p n 基因，g l n k 和咖y - 只在固氮的条件下转录( m a r t i n ，2 0 0 0 ) 。 4 6 变形细曹( 6p r o t e o b a e t e r i a ) 在6 变形细菌中，有证据表明，在d e s u l f o v i b r i og i g a s 固氮酶结构基因n i f l v 的下游，有一 个类g t n b 的开放阅读框( a c c e s s i o nn ou 6 8 1 8 3 ) 。这种情况与下面的n 2 营养的甲烷杆菌的情况 非常相似。 5 厚壁细菌( f i r m i b a c t e r i a ) 到目前为止，在革氏阳性细菌中报道p u 基因的情况比较少。b s u b t i l i s 有一个p 。基因，最 初将其命名为n r g b ，并在一个a m t b 同源基因( n r g a ) 的下游。其上游区域包含着一个b s u b t i l i s 6 “依赖型的启动子，两个转录本仅仅由一个核苷酸隔开，说明它们从一个共同的启动子起始 点。在氮不足时，这个操纵子被明显诱导无论是在n r g b 背景还是在n r g b a 背景下对r g a 融合蛋白的调节没有改变，说明这些基因的产物不参与对自己基因的氮调节。更确切的说，它 们的表达受b s u b t g i s 全球氨调节蛋白t n r a 的激活( w r a y 1 9 9 4 ) 。 对d n a 序列数据库进行搜索。发现类咖8 基因还存在于c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ( w w w g e n o m e c o r p c o m g e n e s e q u e n c e s c l o s t r i d i u m ) ，c l o s t r i d i u ml o n g i s p o r u m ( a e c e s s i o n n o u 5 9 4 1 4 ) ，l i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s ( a c c e s s i o n n o a f l 0 4 2 2 4 ) 中。 6 放线细曹( a c t i n o b a c t e r i a ) 在许多放线细菌中已经鉴定出有p 基因。m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s 有一个基因，在其 上游是一个a m t b 同源基因，下游是一个g l n d 同源基因，组成一个潜在的a m t b - g l n k - g l n d 操 纵子。相似的遗传连锁在c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m 和s t r e p t o m y c e sc o e h c o l o r 中也发现 ( j a k o b y 1 9 9 9 ；c o l e ，1 9 9 8 ) 。 7 蓝细曹( c y a n o b a c t e r i a ) 5 中嗣农业大学硕士学位论文 g l n b 在兰细菌中出现最早在s y n e c h o c o c c u ss p p c c 6 3 0 1 一个1 3 k d a 的磷酸化蛋白的n 端 发现的。后来有发现g l n b 基因也存在于s y n e c h d ws p p c c 7 9 4 2 、c a l o t h r i xs p p c c 7 6 0 1 、 p s e u d a n a b e n as p p c c 6 9 0 1 、m i c r o c y s t i ss p p c c 7 8 1 3 、n o s t o cs p p c c 8 0 0 9 ，并暗示着所有的兰 细菌都含有g l n b 基因。从此以后，g 加占基因已经从s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 、s y n e c h o o c y s t i s s d p c c 6 8 0 3 、n o s t o c p u n c t 析o r m e 、a n a b a e n as p p c c 7 1 2 0 中克隆并测序。在所有的情况中，g l n b 基因似乎为单顺反子，转录受氮不足激话( h a r r i s o n ，1 9 9 0 ：t s i n o r e m a s ，1 9 9 1 ) 。 在母n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 和s y n e c h o o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 中，g l n a 基因从两个串联的 启动子表达，一个为e c o i l6 ”型的启动子，导致g l n b 基因组成型表达。另一个为氮调节启动 子，受氮调节蛋白n t c a 的激活。尽管有这些相同点，启动子的物理组织并不相同。在 & y n e e h o o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 中，只有细胞氮饥饿时，受调节的启动子才有活性，而在 b 3 y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 中。启动子在缺乏氮和有硝酸盐时都有活性。而且在s y n e c h o o c y s t i s s p p c c 6 8 0 3 中。当细胞被转入暗处时，或者在有光合作用抑制物存在时孵育，g l n bm r n a 水 平降低，这说明g l n b 基因受细胞内氧化还原状态的控制( g a r c i a 1 9 9 7 ；l e e 1 9 9 9 ) 。 8 古曹( a r c h a e b a c t e r i a ) 在所有已经完成基因组测序的古菌中，人们发现类g l n b 基因与a m t b 同源基因遗传连锁， 并且经常以多拷贝形式出现然而在n 2 营养的甲烷杆菌中，月矿基因簇的删d 和n i h 之间有 另外两个类g l n b 基因。这些基因已经在m e t h a n o c o c c u sm a r i p a l u d i s 中做了深入研究，它们似 乎以一个启动子从r i c h 转录起始点上游8 0 b p 处的转录起始点开始转录转录出一个7 5 k b 的 产物。有趣的是在生活在白蚁肠道中的固氮微生物n e o t e r m e sk o s h u n e n s i s 中也发现相似的基 因组织结构，有两个类g l n b 基因位于a n t i l 和a n y o 之间( 1 抽m a s 。2 0 0 0 ：k e s s l e r ，1 9 9 8 ) 。 9 其它细一 极端嗜热菌a q u i f e x a e o l i c u s 的基因组序列表明它有两个类g l n b 基因。其中一个是g l n b - g l n a 操纵子，与在y 变形细菌中的相似，另外一个是由g l n b 。、n a s a ，n a r b 组成的基因簇中的笫一 个基因( g l n b j ) 后一个类g l n b 基因( g l n b i ) 似乎编码一个全新的2 0 5 个氨基酸的p 多肽。 这个基因组成一个串联重复t 因此第一个拷贝的c 端直接融合到第二个拷贝的n 端。除了靠 近组成c 环的最后两个b 折叠的n 端的拷贝被截短预测每个拷贝都有所有p l 。蛋白的结构特 征( p 。蛋白的结构学研究见下) 。这种序列表明，如果该基因表达，它将表达一个由六个类p 。 结构域组成的三聚体蛋白有一个面上三个t - 环，在另外一个面上有三个相似的但不完全相 同的t - 环。对p l 。的氨基酸序列进行比较，a a e o l i c u s 曲目的预测产物与在n ：营养的甲烷杆菌 n 的下游编码的类p 。蛋白非常相似( d r k e r t 1 9 9 8 ) 。 1 0 没有p 。蚤白的徽生物 p - 蛋白并不是无所不在的随着许多微生物基因组序列的获得。人们发现有些微生物不 含有类p a 蛋白它们包括h e l l c o b a c t e r p y l o r i 、m y c o p l a s m a g e n i t a l i u m 、m y c o p l a s m a p n e u m o n l a e 、 6 里堕旦塑塑堕兰竺鲤苎型苎里望些坌堑 c 口m p y l d 6 口c t p rj e j “”i 、 c h l a m y d i a m u r i d a r u m 、 c h l a m y d i a t r a c h o m a t i s 、 c h l a m y d o p h i l a 口月p “m o n i a e 、p y r o c o c c u sa b y s m 、t r e p o n e m ap a l l i d u m 、 u r e a p l a s m au r e a l y t i c u m 、 r i c k e t t s i a p r o w 叩p f f 、a e r o p y r “用口e r i x 、b o r r e l i ab u r g d o r f e r i 、p y r o c o c c u sh o r i k o s h i i 。值得注意的是，这 些微生物的很大一部分都是致