（微生物学专业论文）重组葡激酶的高效表达与分离纯化.pdf

四川大学硕士学位论文 图表目录 研究内容 图1 ：不同碳源对发酵效果的影响1 4 图2 ：不同氮源对发酵效果的影响一1 4 图3 ；不同温度对发酵效果的影响1 5 图4 ：不同诱导时问f s a k 表达s d s p a g e 1 6 图5 ：工程菌生长曲线与不同诱导时间f s a k 表达量1 6 图6 ：d e a e 上样速度对蛋白回收率的影响2 8 图7 ：s p 上样速度对蛋白回收率的影响2 8 图8 ：洗脱速度对蛋白回收率的影响2 9 图9 ：生产工艺流程图3 0 图1 0 ：纯化阶段的s d s p a g e 3 1 图1 1 ：d e a e - s e p h a r o s f 层析图谱3 1 图1 2 ：s p - s e p h a r o s e 层析图谱3 2 图1 3 ：s d s p a g e 纯度分析：3 2 图1 4 ：s d s p a g e 分子量分析3 2 图1 5 ：h p l c 分析结果3 3 图1 6 ：r s a k 紫外吸收光谱3 4 图1 7 ：r s a k 抗生素残留3 4 图1 8 ：葡激酶生物学活性标准曲线3 8 图1 9 ：生物学活性测定结果3 9 表一：因素水平表1 6 表二：试验设计及分析结果1 7 表三：优化条件下的实验结果1 7 表四：分离胶与浓缩胶的配制2 4 表五：样品缓冲液的配制2 4 4 四川大学硕士学位论文 表六：两种纯化方案垄自质回收率及s d s p a g e 纯度比较2 7 表七：两种柱层析蛋白质回收率及s d s p a g e 纯度比较2 7 表八：不同洗脱条件蛋白质回收率及s d s p a g e 纯度比较2 8 表九：r s a k 纯化各步骤的分析结果3 1 表十：细菌内毒素检测结果3 5 表十一：平均酶活量一3 9 文献综述部分 图1 ：金黄色葡萄球菌菌落4 2 图2 ：体内血栓的形成和溶解4 6 5 四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得 的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 作者：导师： 四川人学硕士学位论文 重组葡激酶的高效表达与分离纯化 微生物专业 研究生卢锦指导老师孙启玲 摘要血栓病是人类面临的一类主要疾病，包括急性心肌梗塞、脑血栓、 肺静脉血栓、动脉血栓和缺血性休克等。其中急性心肌梗塞( a m i ) 的死亡率 高达3 0 。溶纤治疗被认为是治疗血栓病最为有效的方法，寻找、研制效果好、 副作用小的治疗药物一直是世界范围的热门课题。重组葡激酶( r e c o m b i n a n t s t a p h y l o k i n a s e ，r s a k ) 具有纤维蛋白特异性高、纤维蛋白原降解少、对血小板富 集型血栓作用强以及价格便宜等优点，使其成为一种极具潜力的特异性溶栓 剂。 本研究r s a k 是以活性可溶性状态存在于细胞内，在前期研究的基础上，对 e c o l i 生产r s a k 的发酵工艺及其下游纯化工艺进行了全面优化，建立了一套高 效表达、分离纯化简便、回收率高的工艺，为工业化生产提供了可行性研究。 其主要内容包括： i 基因工程菌生产r s a l 【的发酵工艺优化。 i i 发酵产物的分离纯化、结构性质鉴定。 i i i r s a l 【原液活性分析。 本研究的主要研究结果如下： i 、通过单因素摇瓶培养实验，研究了碳源、氮源、培养温度对菌体生长和 r s a k 表达的影响，确定合适的摇瓶培养条件：葡萄糖为碳源，氮源为酵母粉和蛋 白胨( 1 ：2 ) ，培养温度为3 0 3 2 ； 、将摇瓶优化出的培养条件放大至发酵罐进行单批发酵，研究了诱导维 持时间对菌体的生长和r s a l 【表达的影响，确定最佳诱导维持时间应控制在3 4 h ，此时r s a k 表达水平为3 5 左右，蛋白表达量和菌体密度相对较高且杂蛋白较 6 四川大学硕士学位论文 少； i i i 、采用正交法对大罐发酵培养条件进一步优化，研究发现四个因素对菌 体密度和目的蛋白质的表达存在这不同程度的影响，其影响大小依次为：葡萄 糖浓度 饱和氧浓度 氮源浓度 p h ，并进一步确定了最佳的发酵培养条件： 葡萄糖浓度2 、氮源浓度1 5 、p h 6 8 和饱和氧浓度3 0 。采用此优化条件 对基因工程菌进行连续三批发酵，蛋白质表达量和菌体密度都较高，平均菌体 密度a 6 0 0 为3 5 8 ，平均d c w 为8 2 9 l 以及平均蛋白质表达量达到5 2 。 、利用超滤系统进行粗纯化，大大缩短了生产周期，对制品起到提纯、 浓缩和转换介质的作用：确立了最佳的纯化工艺：粗提制品经d e a e s c p h a r o s e f f 和s p s e p h a r o s ef f 两步柱层析获得重组葡激酶原液；将两种同一性质不同 强度的阳离子交换柱进行对比，研究证明s p s e p h a r o s ef f 层析柱更适合于重组 葡激酶的分离纯化；对s p s c p h a r o s ef f 柱层析洗脱条件进行优化，实验表明低 盐浓度逐步梯度洗脱更易于去除杂蛋白、提纯目的蛋白质，蛋白质回收率达到 3 2 ，s d s p a g e 纯度离达9 9 i 在柱层析时，上样速度和洗脱速度对蛋白回 收率的影响较大，通过实验证明，d e a e s e p h a f o s ef f 层析时，上样速度以较 快为宜，而s p s e p h a r o s ef f 层析时适合较慢的上样速度；在对s p - s c p h a r o s cf f 层析柱洗脱时，洗脱速度宜较快。 v 、经小试工艺放大，进行连续三批试生产并对r s a k 原液作进一步的检测。 r s a l 【经s d s p a g e 检测为单带，且与r s a l 【标准品位置相同，通过s d s p a g e 和h p l c 分析，其纯度均在9 9 以上，分子量为1 5 5 k d ，与文献报道的相符， 分子内没有二硫键，分子为单链聚合多肽。三批原液紫外吸收光谱、抗生素残 留和细菌内毒素检测结果均符合基因工程制品的规定要求。 、采用人纤维蛋白溶解法测定r s a l 【原液生物学活性，本方法灵敏较高， 连续三批产品活性分别是2 2 x 1 0 8 、3 1 x 1 0 s 、2 8 x 1 0 s i u m l ，活性均较高并且稳 定，进一步证明了发酵和纯化工艺重现性好。 关键词重组葡激酶；葡激酶；高效表达；葡激酶纯化 7 四川大学硕士学位论文 h i g h l e v e le x p r e s s i o na n d p u r i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t s t a p h y l o k i n a s e m a j o rm i c r o b i o l o g y s t u d e n tl uj i nt e a c h e rs u nq i l i n g a b s t r a c tt h r o m b u si st h em a j o rl e a d i n gl i f e t h r e a t e n i n gd i s e a s eh u m a nf a c e d ， i n c l u d i n g a c u t em y o c a r d i a li n f a r c t i o n ，p u l m o n i ci n f a r c t i o n , a r t e r yi n f a r c t i o n ，s h o c k l a c k e do fb l o o da n ds oo n t h em o r t a l i t yi sm o r et h a n3 0 c a u s e db ya c u t e m y o c a r d i a li n f a r c t i o n t h r o m b o l y f i ct r e a t m e n tj sc o n s i d e r e da st h eb e s tw a yt oc u r e t h r o m b u s ，i ti sa l w a y sah o tp o i n tt os t u d yb e t t e rt h r o m b o l y t i cd r u g sw i t hf e w e r s i d e - e f f e c ti nt h ew o r l d i th a sb e e nd e m o n s t r a t e dt h a tr e c o m b i n a n ts t a p h y l o k i n a s e ( r s a k ) i n d u c e sf i b r i n o l y s i s s p e c i f i c a l l yw i t h o u tf i b f i n o g e nd e p l e t i o na n dh a s h i g h e l f i b r l n o l y t i ca c t i v i t yc o m p a r e dw i t ho t h e rp l a s m i n o g e na c t i v a t o r ss u c ha ss k , u r o k i n a s ea n dt p a i na d d i t i o n ，r s a kh a sb e e ns h o w nt ob em o r ee f f i c i e n tt h a ns kf o r t h ed i s s o l u t i o no fp l a t e l e t - e n r i c h e da n dr e t r a c t e db l o o dc l o t s t h e r e f o r ei nr e c e n t y e a r s r s a kh a sb e c o m eap r o m i s i n gd r u ga n ds t i m u l a t e dm u c hs t r u c t u r a la n dp r o t e i n e n g i n e e r i n gr e s e a r c h i nt h i sr e p o r t r s a l 【w a se x p r e s s e di nas o l u b l ea n da c t i v ef o r m 1 1 1 i ss t u d y c o m p r e h e n s i v eo p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o no fr e c o m b i n a n te c o l ie x p r e s s i n gr s a k , a n d d o w n s t r e a mp r o c e s so f r s a kw a si n v e s t i g a t e d m o r e o v e l t h er e s u l t sw e r eh e l p f u lt o b es c a l e du pt ot h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fr s a k t h em a i nc o n t e n t si n c l u d e ： i s t u d yo n t h eo p t i m i z i n go ff e r m e n t a t i o np r o c e s s i i s t u d yo nt h ep u r i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fr s a k b 四川大学硕十学位论文 1 1 1 a n a l y z et h ea c t i v i t yo f r s a k t h em a i nr e s u l t so fo u rs t u d yi n c l u d e ： i 、t h er e c o m b i n a n te c o l is t r a i nw a si n c u b a t e di nt h ef l a s k sa n dt h eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o rc e l lg r o w t ha n de x p r e s s i o no fr s a kw e r ea s f o l l o w s ：舀u c o s c ，y e a s t e x t r a c t ：t r y p t o n e ( 1 ：2 ) ，t e m p e r a t u r e3 0 3 2 c h 、t h eg i v e nf e r m e n t a t i o n p a r a m e t e rw a sa p p l i e d t ob i o s t a r7 0l i t r e f e r m e n t a t i o nt a n ki nap i l o ts c a l e i tw a sf o u n dt h a ti n d u c t i o nt i m ea f f e c t e dc e l l g r o w t ha n de x p r e s s i o no fr s a l 【，o nt h es a m et i m e ，t h eo p t i m u mi n d u c t i o nt i m ew a s 3 4 h 、t h ep i l o t - s c a l ef e r m e n t a t i o n sw e r et h o r o u g h l ys t u d i e db yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n td e s i g n d u r i n g t h ef e r m e n t a t i o n p r o c e s s ，t h e c o n d i t i o n so fs o m e e x p r e s s i o nf a c t o r s ，s u c h a sp h , d os a t u r a t i o na n ds u p p l e m e n t , e ta l , a f f e c t e dr s a k e x p r e s s i o n t h e r e s u l t sw e r e a s f o l l o w s ：g l u c o s e2 n i t r o g e n r e s o u r c e 1 5 ，p h 6 8 ，d o s a t u r a t i o n 3 0 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h e a v e r a g ee x p r e s s i o no f r s a l 【w a s5 2 , a 6 0 0w a s3 5 8a n dd e ww a s8 2 9 ，l i v 、u l t r a f i l t r a t i o nw a su s e dt oc o n c e n t r a t ea n dd e s a l ts o l u t e sr e t a i n e db yt h e m e m b r a n eo rt oc o l l e c tm a t e r i a lp a s s i n gt h r o u 曲t h em e m b r a n e p u r i f i c a t i o np r o c e s s w a se s t a b l i s h e d s t a r t i n g w i t h p r e c i p i t a t i o n o f 3 0 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，u l t r a f i l t r a t i o n ， f o l l o w e d b yi o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h i e s o n d e a e s e p h a r o s e f fa n d s p - s e p h a r o s ef f u n d e rt h e s eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，p r o t e i ny i e l dw a s3 2 a n dt h e p u r i t ya n a l y z e db ys d s p a g e w a so v e r9 9 v 、t h ep r o d u c t i o nw a sr e p e a t e d l yo b t a i n e dw i t ht h es t a b l ee x p r e s s i o n , p r o t e i n y i e l da n dp u r i t yo fr s a l 【t h ep u r i f i e dr s a km i g r a t e da sas i n g l ep r o t e i nb a n do n r e d u c e d n o n r e d u c e ds d s p a g ew a sa b o v e9 9 m o l e c u l a rw e i g h to fs i n g l e p e p t i d e c h a i na tr e d u c e ds d s p a g ec o n d i t i o nd e m o n s t r a t e d1 5 5 k d b y i n s p e c t i o n so fs d s - p a g e ，h p l c ，u va b s o r p t i o ns p e c t r u m ，r e s i d u a la n t i b i o t i c sa n d b a c t e r i a le n d o t o x i n ，t h es o u r c e so fr s a kf r o mc o n t i n u o u st h r e eb a t c hw e r eu pt ot h e s t a n d a r do fb i o l o g l c s v i 、t h ea c t i v i t yo fr s a kw a sm e a s u r e db yu s i n gt h ef i b r i np l a t em e t h o dt h a t 9 婴型查兰堕主堂堡笙茎 w a sm o r er a p i da n ds e n s i t i v et h a no t h e r s t h er e s p e c t i v er e s u l t so fa c t i v i t y w e r ea s f o i l o w s ：2 2 1 0 s ，3 1 l o s , 2 8 1 0 8 1 u m 1 i t w a sc o n f i r m e dt h a tt h ew h o l e f e r m e n t a t i o na n d p u r i f i c a t i o np r o c e s s w e r es u i t a b l ea n ds t a b l e d u r i n g r s a k p r o d u c t i o n k e yw o r d s ：r e c o m b i n a n ts t a p h y l o k i n a s e ( r s a k ) ；h i g h l e v e le x p r e s s i o n ；s t a p h y l o k i n a s e ； p u r i f i c a t i o n ； 1 0 婴型奎兰堡兰兰堡丝兰 前言 s a k 是由金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c c u sa u r e u s ) 分泌的一种含1 3 6 个氨基 酸残基的胞外蛋白质。早在1 9 4 8 年，l a c k 发现金黄色葡萄球菌培养物血清中 有一种蛋白质( s a k ) 能溶解人血栓，引起许多学者的兴趣；在5 0 7 0 年代对 s a k 的分离、纯化、理化性质和动物体内外溶血栓机制进行了初步研究，由于 天然s a k 来源少、制剂纯度不高，一直限制了它的进一步研究和应用：直到1 9 8 3 年，s a k o 等首先克隆了s a k 基因，并于两年后将其在e c o l i 中实现表达；继之， s c h l o t t 等构建了p m e x - 6 0 2 s a k 重组质粒，在t a c 启动子和两个串连的s d 序列 控制下，于e c o l d 中获得高效表达，表达量占菌体总蛋白1 0 1 5 。 s a k 是一“间接型”纤溶酶原激活物，当有血栓存在时，s a k 激活纤溶酶 原变成活性纤溶酶；而当血栓溶解后没有血栓时，a2 抗纤溶酶与纤溶酶形成 无活性的复合物，s a k 与纤溶酶解离，处于一种抑制状态。s a k 对富含血小板 的动脉血栓疗效更佳，不激活系统纤溶，溶栓后出血并发症少，无显著促凝作用， 具有高度的纤维蛋白特异性，并可防止用药后出血倾向的发生。s a k 具有纤维 蛋白特异性高、纤维蛋白原降解少：对血小板富集型血栓作用强以及价格便宜 等优点，使其成为一种极具潜力的特异性溶栓剂。 本文进行基因工程菌的发酵和r s a l 【纯化条件的研究，建立适合该菌株的发 酵以及发酵产物的纯化工艺。对重组葡激酶工程菌发酵过程中的p h 、饱和氧浓 度、补料以及诱导时间进行考察，获得该工程菌的高效表达条件。在此条件下， 重组葡激酶表达水平在5 0 以上，并以活性可溶性状态存在于细胞内；经渗滤， 超滤浓缩、透析，d e a f _ ，s e p h a r o s e f f 层析和s p - s e p h a r o s e f f 层析后，s d s p a g e 和h p l c 纯度均达到9 9 。在还原条件下进行s d s p a g e 分析，测得该酶相对 分子质量为1 5 5 k d 。 婴型叁兰堡兰篁堡奎 第一章重组葡激酶发酵工艺优化 研究发酵条件的根本目标就是要降低能源和原料消耗，提高产品产出率。 本室构建的基因工程菌为分泌型菌株，表达产物是以活性可溶性状态存在于细 胞内，避免了变性、复性这一系列复杂的纯化步骤，为该蛋白质的分离纯化提 供了极大的方便。产物的表达易受到外界环境的影响，一个不利于细菌生长的环 境会导致产物表达量下降，甚至不表达，因此，对重组葡激酶发酵工艺的优化就 显得尤为重要。 1 材料 1 1 菌种r s a k 工程菌由地奥制药集团有限公司构建 1 2 培养基 1 2 1 种子培养基( g l ) ：酵母粉5 ，蛋白胨1 0 ，氯化钠1 0 ，p h 6 8 1 2 2 发酵培养基( g l ) ：酵母粉5 ，蛋白胨1 0 ，氯化钠5 ，磷酸氢二钾5 ，泡 敌0 0 3 ，p h 6 8 1 2 3 补料培养基i ( g l ) ：葡萄糖6 ，硫酸镁2 ，微量金属元素0 0 0 5 1 2 4 补料培养基1 1 ( g l ) ；酵母粉3 ，葡萄糖1 0 ，复合维生素0 0 0 3 1 2 5 补料培养基( g ，l ) ：酵母粉5 ，葡萄糖1 2 ，蛋白胨1 0 1 3 主要试剂与仪器： 1 3 1 试剂：蛋白胨、酵母粉购自英国o x o i d 公司；磷酸盐、氯化钠、硫酸镁、 葡萄糖等系国产a r 级试剂；微量金属元素；复合维生素 1 , 3 2 仪器： b i o s t a r7 0 l 发酵罐( b b r a u n 公司产品) a g i l e n t1 1 0 0 高效液相色谱( i - i p l c ) ( 美国安捷伦公司) p e l l i c o n 2m i n i 型超滤系统( m i l l i p o r c 公司) t u 1 8 0 0 紫外可见分光光度计( 北京普析仪器有限责任公司) p o w e r p a c 2 0 0 凝胶电泳仪，g s - 1 0 0 扫描仪( b i o r a d 公司) 2 实验方法 2 1 种子液制备 四川大学硕士学位论文 甘油菌种解冻后划线接种于l b ( 含有7 5 1 0 0ug m l 氨苄青霉素) 琼脂平 皿中，3 2 培养过夜。次日从平皿中挑取单一菌落接种于5 m 1 种子培养基中， 3 2 、2 5 0 r p m 摇床振荡培养1 6 h 。然后按1 ：1 0 0 比例扩种到1 0 0 m 1 种子培养基 中，3 2 c 、2 5 0o p m 培养至a 6 0 0 达到0 5 时，按4 接种量转接于发酵罐中。 2 2 发酵培养： 2 2 1 每次发酵前必须先进行一次空罐灭菌。 2 2 2 发酵培养基配制好后进行实罐灭菌。 2 2 3 通过调节搅拌转速、压缩空气量和纯氧的流通量控制培养基中饱和氧浓度 在3 0 ，自动控制p h 在6 8 ，3 b 3 2 培养4 6 h 。当a 6 0 0 达到0 5 时，流加 补料培养基i ；流加结束后，流加补料培养基i i ；当补料培养基i i 加完，饱和 氧浓度逐渐升高，a 6 0 0 达到1 2 1 6 时，将其培养温度升高到4 2 c 进行诱导表 达；继续流加补料培养基，培养3 4 h ，发酵结束，发酵液经5 0 0 0op m 离 心1 0 m i n ，收集茵体。- - 2 0 冷冻保存。 2 2 4 收罐后，发酵罐应进行一次彻底的清洗和消毒灭菌处理。 3 分析方法 3 1 菌体密度测定：用分光光度计在波长6 0 0 r i m 处比浊法测定菌液密度。 3 2 菌体生物量( d c w ) 的测定：采用烘干恒重法，样品发酵后，离心 去除上清液，沉淀在8 0 烘干至恒重，称重，即得菌体生物量。 3 3r s a k 蛋白质表达量的测定t 取l m l 菌液经离心，收集菌体并洗涤三次 后，加入5 0 ul 磷酸盐缓冲液溶解、煮沸5 分钟，离心并收集上清液，用s d s p a g e ( 分离胶浓度为1 5 ) 检测r s a l 【蛋白的表达量，电泳凝胶用b i o r a dg s 7 0 0 扫描 仪进行扫描，用m o l e c u l a r a n a l y s t 软件对结果进行分析。 4 结果与讨论 4 1 单因素摇瓶实验 4 1 1 不同亟逐盟筮醛效果的影响 蔗糖、乳糖、玉米粉、淀粉、葡萄糖分别作为碳源，初始浓度为3 ，进 行摇瓶发酵培养8 h 后，收集发酵液，检测其菌体密度和蛋白质表达量，以确 定最佳碳源。实验发现，葡萄糖作为碳源时，菌体密度和蛋白质表达量都明显 高于其他碳源，确定最佳碳源为葡萄糖，结果见图1 。 四川大学硕士学位论文 图1 不同碳源对发酵效果的影响 f i g 1e f f e c t so fd i f f e r e n tc a r b o nr e s o u r c eo af e r m e n t a t i o n 4 1 2 不同氮源对发酵效果的影响 酵母粉、黄豆饼粉、( n h 4 ) 2 s 0 4 、蛋白胨、酵母粉和蛋白胨( 1 ：2 ) 分别作 图2 不同氮源对发酵效果的影响 f i f p 2e f f e c t so fd i f f e r e n tn i t r o g e nr e s o u r g eo nf e r m e n t a t i o n 为氮源，初始浓度为2 ，进行摇瓶发酵培养8 h ，收集发酵液，检测其菌体密 1 4 四川大学硕士学位论文 度和蛋白质表达量。实验发现，酵母粉和蛋白胨( 1 ：2 ) 作为氮源时，蛋白质 表达量2 9 左右，a 6 0 0 为2 6 3 ，菌体密度和蛋白质表达量都相对较高，确定最佳 氮源为酵母粉和蛋白胨( 1 ：2 ) ，结果见图2 。 4 1 - 3 不同培养温度对发酵效果的影响 培养温度是影响工程菌生长和调控细胞代谢的重要因素，较高的温度有利 于工程菌的生长，而低温培养能提高重组产物的表达量，因此，必须确立一个 合适的培养温度，既利于菌体的生长，又利于提高产物的表达量。采用不同的 培养温度进行摇瓶发酵实验：2 8 3 0 、3 0 3 2 、3 2 3 4 、3 4 3 6 、3 6 3 8 c ，检测其菌体密度和蛋白质表达量。综合分析，培养温度为3 0 3 2 c 时， 菌体密度和蛋白质表达量都相对较高，确定培养温度为3 0 3 2 ，结果见图3 。 图3 不同温度对发酵效果的影响 v i g 3e f f e c t so f d i f f e r e n tt e m p e r a t u r eo nf e r m e n t a t i o n 4 2 发酵罐中培养条件的优化 4 2 1 诱导维持时间对茵体生长和目的蛋白表达的影响 在细菌对数生长初期，进行诱导控制，对不同诱导时间菌体密度和葡激酶蛋 白表达量进行分析，确立最佳的诱导维持时间。本文在发酵培养6 h 后开始诱导， 四川大学硕士学位论文 诱导1 h 后检测到明显表达，3 4 h 后表达达到高峰，工程菌的目的蛋白带占菌体 可溶性蛋白的3 5 左右，蛋白表达量相对较高且杂蛋白较少。通过对不同诱导时 间葡激酶电泳图谱进行扫描获得表达量的变化曲线，不同诱导时间葡激酶的表 达量变化与细菌生长曲线基本一致，见图4 和图5 。因此，确定在诱导后3 4 h 收获菌体。 图4 不同诱导时间r s a k 表达 图5 工程菌生长曲线与不同诱导时间 s d s p a g er s a k 表达量 f i g 4s d s - p a g eo fr s a ke x p r e s s i o nf i g 5g r o w t hc u r v eo f e c o l ia n d r s a ke x p r e s s i o n 4 2 2 发酵培养条件的优化 通过以前的单因素摇瓶发酵实验，确定了碳源为葡萄糖、氮源为酵母粉和 蛋白胨( 1 ：2 ) 、培养温度3 2 。在此基础上，实验首先将影响葡激酶发酵生 产的四个主要因素：葡萄糖浓度、氮源浓度、p h 、饱和氧浓度分别作为正交试 验的四个因素x l 、x 2 、x 3 和) ( 4 ，每个因素均取三个水平进行正交试验b ( 3 4 ) 。 表一因素水平表 t a b l e11 b e v e ha n df a c t o r s 水平l e v e l s 因素f a c t o r s 1 1 l 5 82 0 2 2 1 5 6 8 3 0 3 3 2 7 84 0 x l ：葡萄糖浓度g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n ：) ( 2 ：氮源浓度c o n c e n t r a t i o no fn i t r o g e nr e s o u r c e x 3 ：p h ；x 4 ：饱和氧浓度d o s a t u r a t i o n 四川大学硕士学位论文 以蛋白质的表达量( y l ) 和菌体生长密度( y 2 ) 这两个指标作为目标函数进 行统计分析，实验安排和结果见表一和表二。 表二试验设计及分析结果 t a b l e2 e x p e r i m e n td e s i g na n d i t sr e s u l t s 实验号 x l x 2 x 3 iy2、t -l-x4 y 21 2224 63 2 7 3 13333 22 5 1 421 233 8 2 7 2 5 2231 4 7 3 3 4 6 2312 4 0 2 9 8 7313 2 3 6 2 6 9 83 ，2133 02 3 6 933213 22 4 3 均值13 7 6 6 73 6 3 3 33 5 0 0 03 8 0 0 0 均值2 4 1 6 6 74 1 0 0 03 8 6 6 7 4 0 6 6 7 均值33 2 6 6 7 3 4 6 6 73 8 3 3 33 3 3 3 3 极差9 0 0 06 3 3 3 3 6 6 77 3 3 4 y 1 ：蛋白质的表达量p r o t e i ne x p r e s s i o n ( ) ；y 2 ：菌体密度a m 通过正交试验，各因素对菌体生长及r s a l 【表达的影响作用大小依次为：葡 萄糖浓度 饱和氧浓度 氮源浓度 p h 。碳源对菌体的生长非常重要，尤其是 在生长初期，直接影响菌体生长密度从而影响目的蛋白的表达；饱和氧、氮源、 p h 都在不同程度直接或间接地影响细菌的生长和目的蛋白的表达。由此得出 表三优化条件下的实验结果 实验批次a 咖d c w g l )蛋白质表达量 13 5 _ 37 85 1 23 5 8& 55 3 33 6 28 2 5 2 一 平均 3 5 88 25 2 优选实验方案为：葡萄糖浓度2 、氮源浓度1 5 、p h 6 8 以及饱和氧浓度3 0 。 1 7 四川大学硕士学位论文 采用此优化条件对基因工程菌进行连续三批发酵实验，发酵培养基体积为4 0 l ， 平均菌体密度a 6 0 0 为3 5 8 ，平均d c w 为8 2 9 l 以及平均蛋白质表达量达到 5 2 ，结果见表三。 4 3 讨论 本实验室对此工程菌长期的摸索，发现：( 1 ) 该工程菌在发酵过程中易产酸。 当加入诱导物时，p h 值下降明显。太迟扩培，或有杂菌的干扰都会导致p h 值下 降，影响工程菌表达。因此，发酵的整个过程应对p h 进行监控，确定最佳p h 值。 ( 2 ) 发酵过程中碳源、氮源偏低时，菌体生长缓慢，发酵时间延长，蛋白质的表 达量低；碳源、氮源偏高时，菌体生长旺盛，但质粒易丢失，蛋白质的表达也 偏低。由此可见，发酵过程中的补料对葡激酶的表达影响较大。因此，根据发酵 过程中碳源、氮源消耗速率进行合理地补料，控制好补料后的碳氮比就至关重 要了。( 3 ) 饱和氧浓度对蛋白质的表达影响也较大。饱和氧浓度过低时，细菌生 长缓慢，导致葡激酶的表达偏低，甚至不表达；过高时，增加生产成本，浪费能 源，因此必须合理控制饱和氧浓度。( 工程菌发酵的升温时间对于通过热诱导 表达目的蛋白的工程菌影响非常大。在由培养温度升到诱导温度时，此刻只有 工程菌处于对数生长期时，目的蛋白的表达水平才最高，一旦工程菌进入稳定 生长期再升温，目的蛋白的表达水平迅速下降，推测这可能与菌体内酶体系有 关。在对数生长期菌体内各种酶体系代谢旺盛，尤其是转录、翻译酶体系很活 跃，而进入稳定生长期后，该酶体系活性减弱或代谢速度减慢，只能勉强进行 转录和翻译。( 5 ) 当通过升温诱导时，菌体开始表达产物，但同时菌体还在不断分 裂、繁殖，菌体量不断增加，随着菌体量的增加，表达产物量也在直线上升。当菌 体生长到一定程度，开始进入衰老期时，有些细菌开始死亡，破裂，释放出菌体蛋 白，发酵液杂蛋白量开始增加，如果此时才收获，必将给后面纯化工作带来巨大压 力。因此，应在菌体进入衰老期之前收罐。 5 小结 5 1 初步研究了在摇瓶培养中碳源、氮源、培养温度对大肠杆菌生长和r s a k 表 达的影响，确定最佳的摇瓶培养条件：葡萄糖为碳源，氮源为酵母粉和蛋白胨 ( 1 ：2 ) ，培养温度为3 0 3 2 ： 5 2 将摇瓶优化出的培养条件放大至发酵罐进行单批发酵，研究了诱导维持时 凹型盔兰堡主兰堡堡兰 - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ 间对菌体的生长和r s a k 表达的影响，诱导维持时间应控制在3 4 h ，工程菌的 目的蛋白带占菌体可溶性蛋白的3 5 左右，蛋白表达量和菌体密度相对较高且杂 蛋白较少； 5 3 在发酵罐的培养中，对培养条件进一步优化，确定葡萄糖浓度为2 、氮源 浓度为1 5 、p h 为6 8 、饱和氧浓度为3 0 。采用此优化条件对基因工程菌进 行发酵三批，平均菌体密度a 6 0 0 为3 5 8 ，平均d c w 为8 2 9 f l 以及平均蛋白质 表达量达到5 2 。 1 9 四川i 大学硕士学位论文 第二章重组葡激酶发酵产物的 分离纯化、结构性质鉴定 目前，采用的纯化方法主要是凝胶过滤和离子交换两步层析，但生产周期 长，回收率低，成本高，而且所需的设备条件要求较高，需要液相色谱仪，不 利于工业化生产。 本文研究的主要内容：采用阴离子交换和阳离子交换层析对r s a l 【蛋白进 行纯化，并与阴离子交换和凝胶过滤层析组成的工艺相比较，分别进行总蛋白 含量测定、s d s p a g e 分析目的蛋白含量及纯度检测；对s p - s e p h a r o s ef f 层析和c m s e p h a r o s ef f 层析这两种阳离子交换层析工艺进行比较； s p s e p h a r o s ef f 层析洗脱条件的摸索；两种层析柱不同的上样速度对蛋白质 回收率的影响；不同的洗脱速度对蛋白质回收率的影响；重组葡激酶原液 纯度、分子量、紫外吸收光谱、抗生素残留和细菌内毒素测定。通过纯化工艺 摸索，旨在改进r s a k 蛋白的提取纯化工艺，获得较高纯度的产品，为r s a l 【蛋 白分离纯化的产业化奠定基础。 1 实验仪器及试剂 仪器：p e l l i c o n 2 m i n i 型超滤系统为m i l l i p o r e 公司产品，p o w e r p a c 2 0 0 凝胶电泳 仪，g s 7 0 0 t m a g i a gd e n s i t o m e t e r 为b i o r a d 公司产品，a g i l e n t l l 0 0 为美国安 捷伦公司产品，r 1 2 - - 3 8 型均质机为a p vr a n n i e 公司产品。 试剂：d e a l s e p h a r o s ef f 、s p s e p h a r o s ef f 、s u p e r d e x 7 5 购自a m e r s h a m p h a r r n a c i ab i o t e c h 公司，其它试剂均为国产a r 级试剂 2 实验方法 2 1 预处理 收获湿菌体1 2 4 6 9 ，用2 0 m m o l l p h 7 2 磷酸盐缓冲液( p b ) 洗涤菌体三次， 加入1 2 4 6 0 m l 相同缓冲液，均匀悬浮菌体；用高压均质机破菌，以5 0 6 0 m p a 匀浆3 次，离心收集破菌制品；在搅拌下加入固体硫酸铵，使饱和度达到3 0 ， 静置1 h ，离心，收集上清液：在4 c 条件下超滤，收集滤过液；将滤过液进行 2 0 四川人学硕士学位论文 超滤浓缩，浓缩3 倍；用p b 对超滤浓缩液进行3 次置换，即得r s a k 粗提制品。 2 2 精纯化 2 2 1 第一个纯化方案： d e a e s e p h a r o s ef