（有机化学专业论文）手性化合物和稀土元素的色谱分离.pdf

摘要 本文利用薄层色谱法和气相色谱法对手性化合物的分离和识别机理作了系 统研究。 一 1 合 成 了 四 种 薄 层 色 谱 手 性 固 定 相 。 2 1 5种氨基酸衍生物在 “ p ir k le 类型薄层色谱手性固定相和环糊精衍生物 类型气相色谱手性固定相上进行了测试，研究 了 待分离分子手性中心附近基团 大小对手性分离的影响。 3利用 “ p ir k l e ”类型薄层色谱手性固定相分离了有机磷系列的 1 0个化合 物，并初步提出手性识别机理。 4利用两种薄层色谱手性固定相分离了两种药物和两种三哇醇类化合物。 5利用牛血清蛋白作为手性流动相添加剂分离了p t h - 氨基酸系列化合物。 。 利 用 。 一 环 糊 精 作 为 手 性 流 动 相 添 加 剂 分 离 了 几 种 药 物 。) 本文还进行了计算机辅助高效薄层色谱优化分离稀土元素的研究。依据高 效薄层色谱保留值的基本方程，通过几个预实验，在薄层色谱上进行梯度展开 最 优 化 研 究 ， 这 是 薄 层 色 谱 优 化 的 深 层 次 研 完 李 验 以 硝 酸 溶 液 预 涂 的 正 相 高效硅胶薄层板为固定相，以p s o -f - 四 氢吠喃一 甲 基异丁基甲 酮一 硝酸为 流动相， 采用不同梯度展开方式分离了十三种稀土元素的金属离子，实验结果与计算机 预 示 结 果 一 致 。 并 将 梯 度 展 开 优 化 方 法 和 一 般 优 化 方 法 进 行 了 比 较 矛 关键词:对映林、 手性固定相 手性流动相 气相色谱 计算机辅助优化分离 稀土元素 洲梯浪.络民 . 高效薄层色谱 abs tract i n c h a p t e r o n e a n d t w o o f t h e p a p e r , s o m e r a c e m a t e s w e r e s e p a r a t e d a n d t h e i r c h i r a l r e c o g n i t i o n s w e r e i n v e s t i g a t e d b y h p t l c a n d g c : 1 .f o u r k i n d s o f c h i r a l s t a t i o n a ry p h a s e s ( c s p s ) w e r e s y n t h e s i z e d . 2 .f i ft e e n d e r i v a t i v e r a c e m a t e s o f d l a m in o a c i d s w e r e s e p a r a t e d b y p i c k l e ，一 勺 p e c s p i n h p t l c a n d b y c y c l o d e x tr in d e r iv a t i v e s c s p i n g c . t h e a ff e c t io n o f a lk y l g r o u p s n e a r c h ir a l c e n t e r o f t h e c h ir a l c o m p o u n d s w a s s t u d i e d . 3 .t e n o r g a n o p h o s p h o ro u s r a c e m a t e s w e r e s e p a r a t e d b y p ic k l e - t y p e c s p i n h p t l c . t h e p r o b a b le m e c h a n i s m f o r c h ir a l r e c o g n i t i o n w as p r o p o s e d . 4 .t w o d r u g s a n d t w o t r u a z i n e c h i r a l c o m p o u n d s w e r e s e p a r a t e d b y t w o k i n d s o f c s p s i n hp t l c. 5 .p t h - d l - a m i n o a c i d s w e r e s e p a r a t e d u s i n g b s a m o b i l e p h a s e a d d it i v e s . 6 .s o m e d r u g s w e r e s e p a r a t e d u s i n g c y c l o d e x t r in m o b i l e p h a s e a d d i t iv e s . i n t h e t h i r d c h a p t e r , t h e a d v a n c e d c o m p u t e r - a s s i s t e d o p t i m i z a t i o n s e p a r a t i o n o f h i g h - p e r f o r m a n c e t h i n l a y e r c h r o m a t o gr a p h y ( h p t l c ) w a s d e v e l o p e d . b a s e d o n t h e 凡 v a l u e s e q u a t io n s i n h p t l c , a c o m p u t e r - a s s i s t e d m e t h o d i s p r e s e n t e d f o r o p t i m i z a t io n o f m o b i l e p h a s e c o m p o s it i o n s i n s t e p w i s e gr a d i e n t d e v e l o p m e n t b y u s i n g t h e s e v e r a l p re l i m i n a r y i s o c r a t i c r u n s . t h e h p t l c p l a t e w a s p re - d e v e lo p e d b y n h , n 0 3 s o l u t io n . t h e m o b i le p h a s e w as p s a ,/ t h f / n it r i c a c i d / 4 - m e t h y l - 2 - p e n t a n o n l t h i rt e e n r a r e e a r th s w e r e c o m p l e t e ly s e p a r a t e d i n d i ff e r e n t gr a d i e n t d e v e lo p m e n t s . t h e g o o d a gr e e m e n t w as o b t a i n e d b e t w e e n t h e e x p e c t e d a n d t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s . d i f f e re n t s t e p w i s e g r a d i e n t d e v e l o p m e n t s w e r e a l s o c o m p a r e d w i t h m o n o - f a c t o r i s o c r a t ic d e v e l o p m e n t k e y wo r d se n a n t i o me r s c h ir a l s t a t i o n a ry p h as e ( c s p ) c h i r a l m o b i l e p h as e ( c mp ) gc hp t l c c o m p u t e r - ass i s t e d s t e p w i s e g r a d i e n t r a r e e a r t h s 南开大学硕士学位论文1 9 9 9年 6月 一、薄层色谱法分离手性化合物 第一节 概述 一 弓 ! 言 近年来，随着科学研究的不断深入，人们逐渐认识到对映体分离技术的必要 性和重要性， 尤其是在生物学医学等领域。人们发现， 含有不对称结构的对映体 具有不同的生物活性。 某些药物的对映体之一可能呈现所需要的疗效， 而另一构 型却无效，甚至产生毒副作用。以 对映体形式存在的药物很多，据统计，美国 2 0 0 种常见药物中 有1 1 4 种至少存在一个手性中 心l l l而目 前，许多药物都是以 外消旋的形式出售的，只有 加%的光学活性药品是以其中一种对映体形式出售 12l 。因 此， 如何进行对映体的 拆分，己 越来越为人们所重视。 色谱法是新近发展的重要拆分方法之一。 它包括高效液相色谱法( h p l c ) ， 气 相 色 谱 法 ( g c ) 和薄 层 色 谱 法 ( t l c ) - . 高 效 液 相 色 谱 法 在拆 分 对映 体 分 子 方面 取 得了令人瞩目的进展， 拆分机理比较明 确， 拆分方法也较为成熟。 但它需要使用 较精密的仪器和昂贵的手性色谱柱，薄层色谱法便体现了它独特的优越性。 二 薄层色谱分离手性化合物的方法及原理 手性化合物的 分离一般可分为两大类19 ) ( 1 )间 接拆分法:又称手性试剂衍生化法。它是基于外消旋化合物与 一个手 性试剂反应，生成一对非对映异构体化合物，其机理如下所示: ( r ) - s a + ( s ) - s a + ( s ) - s o - - ( r ) - s a - ( s ) - s o + ( s ) - s a - ( s ) - s o 待分离对映体 手性试剂一对非对映异构体 非对映异构体化合物通常具有不同的物化性质， 因此可以采用分步结晶法、 生物 化学法或色谱法进行分离。 但是间接拆分法必需的光学纯试剂有时很难得到， 同 时该方法效率低，因此越来越多的分析化学工作者开始采用直接拆分法。 ( 2 ) 直接拆分法:待分离对映体与手性色谱中的手性选择器可逆地形成稳定 程度不同的非对映分子复合体，从而使其色谱保留值不同，如下 所示: 薄层色谱法分离手性化合物 ( r ) - s a + ( s ) - s a + ( s ) - s o ( r ) - s a h( s ) - s o + ( s ) - s a ( s ) - s o 待分离对映体 手性选择器一对非对映分子复合体 在直接拆分法中， 一对非对映分子复合物是在色谱洗脱过程中生成的。 根据一对 复合体稳定性的不同 可以用手性固定相拆分法( c h i r a l s t a t i o n a ry p h a s e , c s p ) 来分 离， 而根据它们在两相间分配比的不同可以 用手性流动相拆分法( c h i r a l m o b i le p h a s e , c m p ) 来分离。 直接拆分法主 要依赖于“ 三点原理”， 它是由 英国 科学家d a l g ie s h 于1 9 5 2 年在利用纸色谱分离氨基酸对映体时 提出的 1 0 1 0 8 0 年代， p ir k l e 在深入研究手性 色谱立体识别机理过程中 重新阐述了 三点作用理论3 1 : 手性识别要求手性固定相 至少与外消旋体之一同时存在三个作用力。 且这些作用力中至少有一个与立体化 学有关。 也就是说用一个对映体代替另一个对映体( 不作任何构型改变) 时， 至少 有一 个 作 用力 不 再 存 在 或明 显 改 变 其性 质。 在此 基 础上， t a y lo r 1 1 认 为 在 对 映 体 与固定相的三个作用力中， 至少有一个力具有立体选择性， 即依赖于外消旋体与 固定相的立体化学，而另外两个作用力必须是不同类型的作用力，如氢键，二 一 二 作用或偶极作用， 否则若存在两个相同的作用力时， 可能会产生不利的作用， 使 得固定相的手性识别能力降低或消失。 三 手性固定相拆分法( c s p ) ( 1 ) 纤维素及其衍生物 纤维素 是纯天然高聚物。 它是d - 葡 萄糖单 元邮一 1 ,4 糖昔键 相连接 而形成的 高度有序、 呈螺旋型空穴结构的光学天然高分子化合物。 它含有的不对称空腔对 于对映异构体具有对映选择性的识别能力。 通常能在纤维素薄层板上被拆分的化 合物极性较大，同时必须存在多个能发生氢键作用的位置。 1 9 6 5 年， c o n t r a c t o r 和w r a g g 1 2 1 首 先 将 纤 维 素 涂 布 在 玻 璃 板 上 制 备了 纤 维 素 薄层板， 并成功的分离了d l 一 色氨酸及其衍生物。 此后的一系列研究证实了这种 固定相的可行性，并用商品化的纤维素薄层板成功的分离了芳香氨基酸 1 3 - 1 9 1 d l - a ,a - d i a m in o d ic a r b o x y li c a c id 2 0 1 、d l - c y s t in e、d l - t h r e o n in e 2 1 1 、 d l - t r is - e t h y le n e d ia m in e c o b a lt ( i i i ) 配合 物2 2 和一 些 二 肤化 合物 2 3 1 。 虽 然纤 维素 结 构中的轻基对异构体的拆分有一定作用， 但是有关纤维素的手性识别机理还没有 完全弄清。 有研究表明，由于疏水溶剂可以促进纤维素螺旋结构的形成， 因此当 南开大学硕士学位论文 1 9 9 9年6月 以 疏水混合 溶剂作为流动 相时 将提高分离 效果 ( 1 5 1 目 前，又发展了一种微晶纤维素薄层板。 微晶纤维素由排列得比较规则的微 小结晶区域( 一般占 分子组成的8 5 %以 上) 和分子的无定型区交联而成， 其纯度比 天 然纤维 素高， 粒度约为2 0 - 4 0 p m ， 平均聚合度为4 0 - 2 0 0 0 h e s s e 和h a g e 112 0 1在 液 相 色 谱 上 用 纤 维 素 的 衍 生 物 三乙 酞 纤 维 素 进 行 手 性 物 质的 分 离， 并 且 将 其 应 用 到 薄 层 色 谱上 分离了d l - t r o e g e r 碱， 现 在已 有 商品 化 的 三乙 酞化微晶 纤维素薄层板( m c t a ) o ( 2 ) 硅胶表面化学键合固定相( c c p ) a卜环糊精键合相 在手性拆分的众多色谱方法如g c , h p l c , t l c中， 环糊精都可作为常用的 固定相或流动相。 环糊精( c y c l o d e x t r i n ) ， 简称c d 。它是由 多 个d - 毗喃葡萄糖单元以 a - 1 , 4 糖 昔键相互结合形成互为椅式构象的环状低聚糖化合物，其中较常用的是含有 6 , 7 , 8 个葡萄糖单元的 环糊精， 分别 称为 a - c d , p - c d , y - c d 。 环糊精分子成上 宽下窄、 两端开口 、中空的筒状物， 所有的经基都在分子外部2 5 ,2 6 1 ， 腔内 部呈相 对疏水性。 这种具有手性识别能力的空腔结构使其能与各种极性和非极性分子、 离子形成非对映主客体复合物， 从而在洗脱过程中造成滞留的差异， 达到分离的 目的。客体分子的疏水程度和形状是影响环糊精复合物形成和稳定性的主要因 素， 因为只有当客体分子大小正好使非极性部分进入空腔， 极性基团与空腔边缘 轻基产生强作用时才能被拆分。 如果被拆分的化合物含有能与空腔口 处的基团相 作 用的 取 代基时， 那么主客体之间的 结合力 就会加强， 从而使分离 效果 更佳2 7 1 a la k 和a r m s t r o n g 2 8 首 次 研 究了 将 p - c d 键 合 到t l c 板 上 的 方 法， 并 成 功的 分 离 了 丹酞、 禁 基取 代氨基 酸以 及二 茂铁 类化合物的 对映 体。 a r m s t r o n g 指出 这种 板 的 用 途很多， 还 可用 来分离某些非 对映异构体、 立体异构体等。 因 为r - c d比 较 便宜， 人们 常用它 来做手性固 定 相， 至今还未见用 a - c d和 y - c d作薄 层色谱手 性固定相的报道。 b手性配体交换色谱固定相 手 性 配 体 交 换 色 谱固 定 相中 用 作 手 性 配 体 的 一 般 为 氨 基 酸 类 物 质， 金 属 离 子 为c u 2 1 o g u n t h e r 2 9 1和w e i n s t e r 3 0 1 阐 述了 其分离 机理: 它 是利 用手性配体与 对映 异构体之间形成具有不同稳定性的铜复合物而进行色谱分离的。 薄层色谱法分离手性化合物 ho i-钾 c o o h l_ _, n -ch 2 - -c h - c o h 2 11 t ) h 图1 - 1 : 脯氨酸衍生物的结构 g u n t h e r 2 9 1 等 人 首 先 提出 以 ( 2 s ,4 r ,2 r s 卜 4 - 轻 基 一 1 - ( 2 ， 一 轻 基 - . 烷 基 ) 脯 氨 酸 作 配 体 ( 结 构 如图1 - 1 所 示 ) 与c u 2 + 络 合， 键合 到t l c板 上， 并 分离了 氨基酸 的 对 映 体。目 前， 这 种 板已 作 为 商品出 售， 商品 名 称为c h ir a lp la te , 该 板硅 胶 类 型为r p - c l 8 ， 硅胶粒子平均直径为51m,浓缩区由 孔径很大而比 表面积很小的 二氧化硅组成。 样品分子与这种惰性二氧化硅分子不发生作用， 因此当样品点于 浓缩区内展开至两相之间时， 可被浓缩成很窄的点或带， 再经高效层析可达到有 效的分离。 利用这种薄层板分离的对映体化合物应能与金属离子形成稳定性不同 的 复 合 物 ， 例 如 a - 氨 基 酸 、 a - 羚 基 酸 及 其 衍 生 物 等 3 1-3 6 1 c 电荷转移固定相 这种类型的固定相是利用待分离物与固定相之间形成电荷转移复合物来进 行对映体分离的。固定相为兀 电子给体或受体，而待分离物则相反。 p i r k l e 3 7 1 首先在液相色谱上使用了 这种类型的 手性试剂进行对映体的分离， 所以 此 类手性物质也 称 作 p i r k l e 类型， 它使用的 手性 物质是 ( r ) - n - ( 3 , 5 一 二 硝基 苯甲 r 基 ) 苯 基 甘 氨 酸 。 w a in e pi 首 次 将 ( r ) - n - ( 3 ,5 一 二 硝 基 苯甲 酞 基 ) 苯 基 甘 氨 酸 离子键合到氨丙 基硅胶板上， 制备了 含二 电子受体的手性固定相( 其键合情况如图 1 - 2 所 示 ) 。 并 成 功 的 分 离 了2 ,2 ,2 一 三 氟 一 1 一 ( 9 一 蕙 基 ) 乙 醇的 外 消 旋 体 。 w a l l3 9 在 此基础上进行了改进，将( r ) - n - ( 3 , 5 一 二硝基苯甲 酞基) 苯基甘氨酸和 n - ( 3 ,5 一 二 硝基苯甲酞基卜 亮氨酸以离子型和共价型两种方式分别键合到氨丙基硅胶的高 效薄层板上。此后，wa l l 还利用这些板分离了某些药物如环己烯巴比妥、 o x a z e p e m , l o r a z e p a m及1 , 1 一 双 - 2 - 蔡醇的 对 映 体。 在这 种 薄 层 板上 可以 使用 极 性较强的展开剂，甚至比用于h p l c的展开剂极性还要强。 、.l 际-nh3 (c h ,), s 、外 图1 - 2 : p i r k l e 类型手性固 定相结构 南开大学硕士学位论文1 9 9 9 年 6 月 d其它手性固定相 将薄层板简单的以光学活性的酸、 碱或其它手性试剂浸溃，也可制成手性固 定相， 进行对映体的分离。 对映异构体分子可以 在展开过程中与板上的手性分子 形成非对映异构体， 利用这些非对映异构体在流动相中溶解度的不同使其在薄层 板上得以分离。 b h u s h a n 和a lia o 1 根 据 这 一 原 理， 分 别 用 ( +) 一 酒 石 酸 和 ( +) 一 抗 坏 血 酸 浸 渍 过的 t l c板 分 离了p t h - 氨 基 酸。 他 们 4 1 ,4 2 1 还 用 卜 卜 番 木 鳖 碱 和 硅 胶 混 合 制 成 薄 层 板，分离了d l - 氨基酸对映体。 四 手性流动相拆分法( c m p ) 由于在普通薄层板上以手性试剂作为流动相添加剂的方法比手性固定相拆 分法更简便， 易于操作， 且流动相改变也比较容易， 因此越来越受到重视。 此外， 利用手性流动相拆分法， 可以很方便的通过改变流动相中有机改性剂的种类、 比 例和手性添加剂的含量等因素来达到优化分离的目的。 ( 1 ) 环糊精及其衍生物 环糊精( c d ) 作为流动相中的手性添加剂用于对映体分离， 其原理与手性固定 相法类似。但是与手性固定相法不同，a - c d也可作为流动相添加剂。当然使用 最 多 的 还 是 p - c d ， 而 且c d最 早 是 作 为 流 动 相 用 于t l c分 离 的 4 s ,a a l a s y b il s k a 等 人 4 5 ,4 6 )在h p l c上以 p - c d作 流 动 相 添 加 剂 分 离了 扁 桃 酸 及 其 衍生 物 的 对 映 体， 但在t l c上没有实 现. 这主要是因为p - c d在水一 有机溶剂中 溶解度很小。 a r m s t ro n g 等 人 4 7 1在 这 一 方 面 作出 了 开 创 性 的 工 作。 他 们 发 现 在 水中 加 入 尿 素 可 以 提高 p - c d的 溶解度。 他们以 添加一 定浓度p - c d的甲 醇 或乙 睛为流 动相， 在 k c 1 8 f反相薄层板上成功的分离了 丹酞氨基酸、二茂铁类、 烟碱类以 及某些冠 醚 类对映 异构体。 在反 相薄层色 谱分离中， 一 般用p - c d作t l c中 的 手 性流动相 添 加剂， 而h p l c 则一 般以 p - c d作为手性固 定相。 虽然这两种方法都能 成功的 达 到 分离的 效果， 但 两者 存 在不同 的 机理。 在手 性固 定 相中 ， p - c d 是以 间 隔8 - 1 0 个原子间距联结在硅胶上，这一间隔形成的手臂可为包结物提供额外的作用中 心， 同 时 也限 制了 p - c d分子的 运动。 另 外， 作为手性固定 相时 环糊精在其表面 的密度和空间构型均比作为流动相时要固定，这也可能是其中的原因之一。而 p - c d作为流动相添加剂， 涉及到多种作用， 这对于手性识别具有一定的 影响。 薄层色谱法分离手性化合物 可能是两者的不同机理， 导致了有的对映体只能在其中一种形式下分离， 或者对 映体拆分后的 洗脱顺序也有所不同。 如d l - 氨基酸， 当 p - c d作为流动相添加剂 在t l c 拆分时， d型 先于l 型流出， 而以 卜c d作手性固 定 相在h p l c上被拆 分时，l型先于d型流出。 l e p r i 等 人 4 s 研究 发 现 当 流 动 相中 p - c d的 浓 度 相同 时 ， 随 着 尿 素 浓 度的 增 大， 分离效果会降低。 这是因为尿素分子和溶质分子都有与环糊精疏水性空腔生 成包结物的 倾向，因此， 另一个增加p - c d在水中溶解度的 方法由a r m s t r o n g 等 人 提出 4 9 7 ， 即 制 备 亲 水 性的 p - c d衍 生 物， 如 部 分 取 代的 轻乙 基、 轻丙 基 r - c d , 并以此作为手性流动相添加剂成功的拆分了某些取代氨基酸衍生物、己内酞脉 类、恶哇烷酮类对映体及某些孕激素和生物碱的差向异构体。 总之， 这种方法的分离效果与流动相的组成， 特别是流动相中有机改性剂的 类型浓度及环糊精的浓度有直接的关系。 ( 2 ) 手性离子对试剂 手性离子对试剂可以 作为流动相添加剂进行对映体的分离， 对映体分子可与 展开剂中的手性离子对试剂结合， 形成非对映离子对， 在非手性固定相上实现异 构体的分离。 t iv e r t 等 人 5 0 】 以d i o l f 2 5 4 h p t l c板 分离了 p 一 肾 上腺 素 受 体阻 滞剂 普蔡 洛 尔和烯丙洛尔的各对对映体，手性离子对试剂为n - 节氧基拨基一 甘氨酞基l - 脯 氨 酸 ( z g p ) a d u n c a n 等 人 5 1 以1 r - ( - ) - 1 0 - 樟 脑 磺 酸 胺 ( c s a ) 和z g p 作 为 手 性 离 子对试剂， 在正相薄层板上分离了8种含苯基一 a - 氨基醇类药物的对映异构体。 研究表明， 薄层板的类型、 展开剂的组成以 及离子对试剂的结构对于分离结果有 较大影响。 手性离子对试剂相对比 较便宜， 分离方法比 较简单， 但目 前还未用于 t l c中作手性固定相。 ( 3 ) 牛血清蛋白 ( b o v i n e s e r u m a l b u m i n , b s a ) 蛋白质是手性大分子聚合物， 具有天然的对映体选择性质，能分离大量的不 同类型的外消旋体。 牛血清蛋白是一种球型传输蛋白质， 对离子型的底物有大量 的不同类型的可键合部位. 以 牛 血 清 蛋白 作为 流 动 相 添 加 剂 在t l c 板 上 进行 对映 体的 分 离 是l e p r i 等 人 5 2 - 5 5 )提出的。 他们在这方面进行了很多研究， 分离了一系列化合物， 包括未衍生 化的 氨基酸、 n ( d n p - , d n p r - , d n b - , f m o c - , d a n s y l - , iv fh - , p t h - ) 和o 0 a 南开大学硕士学位论文1 9 9 9 年 6月 或硝基苯胺) 衍生化的氨基酸、乳酸衍生物等， 并且对色谱条件进行了 优化，提 高了b s a作为 流动相添加剂的分离效率( 5 6 目 前，蛋白质作为流动相添加剂的分离机理还不十分清楚， 但是其手性识别 能力可以归结为它们独特的一、 二、 三级结构特征。 尤其是在对映体的手性识别 过程中， 三级结构所创造的 疏水性口 袋、 沟槽或通道对非对映体复合物的形成常 常是十分重要的。 然而三级结构又不是固定的， 蛋白质是柔软的， 且它们的三级 结构可以被某些可逆或不可逆的过程剧烈的改变。 因此， 在分离不同的对映异构 体时， 板的类型、 流动相p h值和离子强度、 b s a浓度、 温度等条件均会对分离 结果产生影响。 五 本部分利用薄层色谱法对手性化合物的分离和识别机理作了系统研究。 ( 1 ) 合成了四 种薄层色谱手性固 定相。 ( 2 ) 1 5 种氨基酸衍生物在 “ p ir k l e ” 类型薄层色谱手性固定相上进行了 测试， 研究了待分离分子手性中心附近基团大小对手性分离的影响。 ( 3 ) 利用 “ p i r k le 类型薄层色谱手性固定相分离了 有机磷系列的 1 0个化合 物，并初步提出手性识别机理。 ( 4 ) 利用两种薄层色谱手性固定相分离了两种药物和两种三哇醇类化合物。 ( 5 ) 利用牛血清蛋白 作为手性流动相添加剂分离了 p t h - 氨基酸系列化合 物。 ( 6 ) 利用a - 环糊精作为手性流动相添加剂分离了 几种药物。 薄 层色谱法分离手性化合物 第二节 利用p i r k l e类型的手性固定相分离化合物 ( 一) n - 乙 酞- d l - 。 一 氨基酸酷的手性分离 一 实验部分 1试剂与仪器 异丙醇，石油醚，甲醇，乙睛，四氢吠喃，二氯亚矾:分析纯，经重蒸处理 环氧丙烷:分析纯 3 , 5 一 二硝基苯甲 酸:化学纯， 湖州生物化学厂 对甲氧基苯甲 酸:化学纯 卜亮氨酸:生化试剂 l 一 丙氨酸:生化试剂 各种d l - 氨基酸:生化试剂 薄层板:1 0 c m x 2 0 c m n h 2 f 2 5 4 s h p t l c ( c a t .n o . 1 . 1 3 1 9 2 .0 0 0 1 , m e r c k , d a r m s t a d t , g e r m a n y ) o n a n o m a t 自 动点 样器 ( c a m a g , m u tt e n z , s w i t z e r l a n d ) ， 附 铂 一 铱合金 毛细管。 2氨基酸的n 一 乙酞化及酷化 a 合成反应式 n h 舒 s c 丫， ，一 + o o h =七 云 卜c l h 3 n - 入2 un 许c o o r 2 异 c h 3c - n h - 许c o o r 2 b实验步骤 以 撷氨酸的乙 酞化及甲 酷 化 1 5 7 为 例。 取2 5 毫升无水甲 醇， 在水浴上滴加二氯亚讽5 毫升( 约3 0 分钟) ，加入6 克 d l - ,f a 氨酸，6 0 0c 回流至撷氨酸全部溶解，除去溶剂，得无色胶状物。加入 7 .5 克无水醋酸钠， 再加入3 7 .5 毫升乙 酸配， 在水浴中反应半小时， 室温搅拌过夜， 加入适量的水， 用碳酸氢钠中和反应， 再用氯仿分三次提取反应液， 合并氯仿层， 用 1 摩尔/ 升的盐酸和 1 摩尔/ 升的碳酸氢钠分别洗涤氯仿提取液两次，用无水硫 南开大学硕十学位论文1 9 9 9 年6 月 酸镁千燥， 过滤， 减压下除去氯仿， 得微黄色胶状物。 正己 烷加热溶解， 并加入 活性炭脱色，过滤， 在于冰箱内， 析出白 色晶体。用正己 烷重结晶得白 色品体。 熔点 5 7 - 5 9 c 其它各氨基酸的酷化与酞化反应同上进行。 手性试剂的合成 反应式 。i j o o h s l， 不- 军 一 - c l l -iv h z c h u u u i -i ii- o o h r = - c h 3 ，- c h 2 c h ( c h 3 ) 2 r = 3 , 5 一 二硝基， 对ff 氧基 b实验步骤 a ) n - ( 3 , 5 一 二 硝基 ) 苯甲 酞 基l - 亮 氨 酸 ( d n b - l e u ) 的 合 成 ( r = 3 ,5 一 二 硝 基， r ， 二 一 c h 2 c h ( c h 3 ) 2 ) 将 8 毫升二氯亚飒加入 6 克 3 , 5 一 二硝基苯甲 酸中， 加热回 流至固体全部溶 解， 除去过量的二氯亚矾， 得浅 黄色晶体。 用无水乙 醚洗涤， 即得3 , 5 一 二 硝基苯 甲 酞氯。 产量为6 . 1 克， 熔点5 8 - 6 0 0c 。 于三颈瓶中加入1 4 0 毫升干燥的四 氢吠喃， 加入2 . 8 克l - 亮氨酸和6 . 1 克3 ,5 - 一 : 硝基苯甲 酞氯。 在 氮气保 护下 滴加四 氢吹喃与 环 氧丙 烷 ( 体积比1 0 : 1 ) 的 混 合液 3 0 毫升，加毕继续反应 4 小时，溶液为淡黄色。 过滤除去未反应的l 一 亮氨酸。 然后蒸去溶剂， 用乙 睛重结晶， 得淡黄色晶体。 熔点1 8 5 - 1 8 7 c o 元素分析c % h % n % 理论值4 8 . 1 0 4 .6 2 1 2 . 9 2 实m值4 8 .0 3 4 .5 2 1 2 .6 6 b ) n - ( 3 , 5 一 二硝基) 苯甲 pa基l - w氨酸( d n b - v a l ) 的合成 实验操作步骤同 上，以l - w氨酸代替l 一 亮氨酸反应， 得产物n - ( 3 ,5 - .:- 硝 基) 苯甲 酞基l - 氨酸( d n b - v a l ) 的合成( r = 3 , 5 - 硝基， r 二 一 c h ( c h 3 ) 2 ) o 熔点 1 6 7 - 1 6 9 c。 薄层色谱法分离于性化合物 元素分析c % h % n % 理论值4 6 .2 9 4 .2 1 1 3 . 5 0 实测值4 8 . 3 5 4 . 1 8 1 3 .2 7 c ) n - ( 3 , 5 硝基) 苯甲 酞基l - 丙氨酸( d n b - a l a ) 的合成 实 验操作步骤同 上，以l 一 丙 氨酸 代替l 一 亮氨 酸反 应， 得产 物n - ( 3 ,5 一 二 硝 基) 苯甲酞基 l 一 丙氨酸( d n b - a l a ) 的合成( r = 3 , 5 一 二硝基，r =- c h 3 ) 。熔点 1 6 7 - 1 6 9 c o 元素分析c % h % n % 理论值4 2 .4 0 3 .2 1 1 4 . 8 4 实测值4 2 .5 0 4 .2 3 1 4 .6 6 d ) n 一 对甲 氧 基 苯甲 酸 基l - 亮 氨 酸 ( p m b - l e u ) 的 合 成 5 9 1 ( r = 对甲 氧 基， r = - c h 2 c h ( c h 3 ) 2 ) 取 4 克l 一 亮氨酸， 溶于 6 0 毫升 1 摩尔/ 升的氢氧化钠溶液中， 冰浴冷却， 加 入 5 毫升对甲氧基苯甲酞氯，搅拌过夜。用乙醚提取反应液，反应液用 1 : 1 盐酸 调至p h = 2 ，用乙酸乙酷提取，干燥。除去溶剂，用乙睛重结晶。产品为白色晶 体，熔点 1 2 1 一 1 2 3 v. 元素分析c % h % n % 理论值6 3 .3 6 7 .2 2 5 .2 8 实测值6 3 . 4 4 6 .9 0 5 . 0 0 4手性薄层板的制备 桩 氮丙 基 高 效 薄层 板在1 1 0 c 温度 下 烘1 小时 ， 放 入 干燥器内 备 用。 将n - ( 3 ,5 一 二 硝 基 ) 苯甲 酞 基l 一 亮氨 酸 (d n b - l e u ) 配制 成0 .0 5 摩 尔 / 升的 四 氢 吠喃溶液。取该溶液2 0 毫升于1 2 厘米x 5 厘米x 3 厘米的自 制玻璃缸内中。将一 块 1 0 厘米x 3 厘米的薄层板完全浸泡在溶液中，5 分钟后取出薄层板，在通风橱 中挥发四氢吠喃。 晾千后的薄层板用四氢吠喃洗涤两次， 以除去未键合而仅仅吸 附在薄层板表面的溶质。 n - ( 3 , 5 一 二硝基 ) 苯甲酞基l 一 亮氨酸( d n b - l e u ) 与薄层板键合的结果( c s p 1 ) 可 以用下式表示: 南开大学硕士学位论文1 9 9 9 年6月 1 一 - cooh + n h 2 c h 2 c h 2 c h 2 - a 厂 s il h c h 2 c h 2 c h 2 - s 02一0 n 0 2 - n h -c j - n cih2chc;h3ch3 其它溶液泡板结果与上式类似。这种手性固定相就是 “ p i r k l e 类型固定相。 对泡板前溶液、泡板后溶液进行紫外光谱分析( 见图1 - 3 ) a q ia nh o u x o o x w a oo a s o e m月5 们 波狱 n m ) 图1 - 3 :泡板前溶液和泡板后溶液紫外光谱图 由 上图可以 看出， n - 3 , 5 一 二 硝基) 苯甲 酞基l - 亮氨酸( p n b - l e u ) 的 特征吸收明显 减小，即溶液的浓度发生明显变化。可以认为薄层板与溶液发生反应， 形成了所 需固定相。 用d n b - v a l , d n b - a l a , p m b - l e u 泡板，得到类似的结果。 5色谱条件 样品用异丙醇溶解， 配成 1 毫克/ 毫升的溶液， 薄层板展开距离为8 厘米左右。 流动相组成:1 :石油醚: 二氯甲烷: 异丙醇= 7 0 : 2 :石油醚: 二氯甲烷: 异丙醇= 7 0 : 3 :石油醚: 二氯甲烷: 异丙醇= 7 0 : 2 0: 1 0 1 5: 1 5 1 0: 2 0 薄层色谱法分离手性化合物 检测方法:碘缸 二 结果与讨论 n 一 乙酞- d l - 。 一 氨基酸酷的母体结构为 c h 3c- n h c o o r 21 由 于d l - 氨基酸 廉价易 得， 且l - 氨基酸均有重要的 生 物活性， 从手性分离 一 开始 d l - a - 氨基酸的衍生物就是各种手性分离方法研究的焦点6 0 o 氨基酸结 构简单， 多种氨基酸之间可作有序比 较， 因而氨基酸常作为考核手性固定相作用 的 研究 对 象 5 9 ,6 1 。 下 面就 利 用n 一 乙 酞 - d l - a - 氨 基 酸酷 对 “ p ir k le 类型固 定 相进 行测试， 并利用氨基酸衍生物来讨论待分离分子手性中心附近基团大小对手性分 离系数a 及r f 的影响。 表1 - 1 列出的是利用对n - 乙酞- d l - 。 一 氨基酸酷在不同流动相组成下 的分离 情况。其手性分离结果随溶质中r , , 凡基团大小和极性的不同而不同。 r ， 分别 为c h 3 c h 2 - , ( c h 3 ) 2 c h - , ( c h 3 ) 2 c h c h 2 - , c 6 h 5 c h 2 一 和c h 3 s c h 2 c h 2 - o r 2 分 别为c h 3 - , c h 3 c h 2 - , ( c h 3 ) 2 c h - o 由 表1 - 1 可以得出如下几个结论: ( 1 )所有氨基酸衍生物的薄层色谱保留值 r f 均随异丙醇浓度的增大而增 大， 分离系数a 从总体上来说随异丙醇浓度的增大而减小， 但化合物l b , l c 在异 丙醇浓度由1 5 % 上升到2 0 % 过程中， a 值保持恒定。 ( 2 ) 色谱理论认为: 溶质分子与其色谱行为有很大的关系。在本实验中，当 r 1 为 非 极性的 烷基时， 即 氨基 酸衍生 物1 - 4 ， 其r 1 分别为c h 3 c h 2 - , ( c h 3 ) 2 c h - , ( c h 3 ) 2 c h c h 2 - ， 均相差一个亚甲 基， 其保留 值r f 也有所不同。 但从总体上来说， r f 随r 1 基团 碳数的增加而增加。 可见，结构对其色谱保留 行为有着直接和重要 的影响。 分离系数。 在理论上应随r , 碳数的增加而减小， 从上表的数据中发现基 本趋势与理论相一致，但是在2 和3 的各个相应化合物中， a 值保持基本恒定和 略有减小。这种反常结果的出现，可能是由于实验误差所致。 当r ， 为非烷基基团，即化合物4 , 5 时，其r f 随r : 的极性或极化率的增加 而减小，同时其分离系数a 随r ， 性质的改变而改变，此时不能单从r 1 基团的大 小来评价其对a 值得影响。 ( 3 ) 表中所列的五个系列的氨基酸衍生物， 在所有的流动相组成条件下， 其 各自的玲均随r z 基团碳数的增加而增加， 其手性分离系数a 均随r z 基团碳数的 南开大学硕士学位论文 1 9 9 9年 6月 表1 - 1 :不同流动相组成下的分离情况 流动相 1流动相 2流动相 3 no化合物 r f2 r f , a r f 2 r f i a r f 2 r f l a ， 00 : c h 3 - c o - b u t y - o me c h 3 - c o - b u t y - o e t c h 3 - c o - b u t y - o i p r c h 3 - c o - v a l - o me c h3 - c o - va l - oe t c h3 - c o - va l - oi p r c h 3 - c o - l e u - o me c h 3 - c o - l e u - o e t c h 3 - c o - l e u - o i p r c h 3 - c o - p h e - o me c h3 - c o- p h e - o e t c h 3 - c o - p h e - o i p r c h 3 - c o - me t - o me c h 3 - c o - me t - o e t c h 3 - c o - me t - o i p r 0 . 4 9 0 . 5 7 1 . 0 8 0 .6 5 0 . 6 2 1 . 0 6 0 . 7 0 0 . 6 8 1 .0 6 0 . 6 8 0 . 6 4 1 .0 3 0 . 7 3 0 . 7 1 介、，玉 气厂匕 : n八u 0 . 6 4 0 . 6 1 1 . 0 4 0 . 7 3 0 . 7 1 1 .0 3 0 . 7 6 0 . 7 4 1 . 0 3 auc 11.1 、曰内j nuoi : . 5 1 0 . 4 7 . 5 8 0 . 5 4 1 . 0 9 0 . 6 0 0 . 5 6 1 . 0 7 0 . 6 6 0 . 6 3 0 . 6 6 0 . 6 3 0 . 7 0 0 . 6 8 1 . 0 5 0 . 6 4 0 . 6 2 1 . 0 3 0 . 6 9 0 . 6 7 0 . 7 1 0 . 7 1 ajhc