（微生物学专业论文）产氢红杆菌色素蛋白复合体的分离纯化和活性研究.pdf

摘要 摘要 本论文对产氢红杆菌( r h o d o b a c t e rs p ) r 7 菌株进行了以下方面深入研究： 采用分光光度法探求了产氢红杆菌在产氢和非产氢条件下的色素合成规律；研究了 产氢影响因素供氢体、氮源和生长因子对产氢红杆菌细胞生长、类胡萝h 索表达和 合成量的影响；并对产氢红杆菌的类胡萝h 素进行了提取分离和初步纯化。为进一 步阐明产氢红杆菌光合产氢机制，本文对生长条件下和产氢条件下的产氢红杆菌的 色素蛋白复合体进行了分离纯化，并初步研究了其生物活性。主要实验结果如下： 光合色素的合成具有时序性，r 7 菌株首先合成可吸收近红外光的细菌叶绿索， 而3 7 0 n m 和5 9 0 n m 组分的细菌叶绿素的合成则晚于类胡萝h 素，4 2 6 n m 类胡萝 h 素含量的变化引起捕光色素复合体和光反应中心复合体比率的改变。在乙酸钠 供氢体体系中，分别用酵母提取物和谷氨酸钠替代生物素和硫酸铵后可使细胞生 物量提高3 7 9 和2 0 4 。乙酸钠供氢体可诱导细胞进行球形烯和球状菌素类胡 萝b 素代谢，苹果酸钠和谷氨酸钠有利于4 2 6 n m 类胡萝h 素组分的产生，但不 利于4 5 0 n m 类胡萝h 素组分的积累。酵母提取物可显著提高类胡萝h 素产量， 并改变类胡萝h 素合成途径。 分别采用有机溶剂浸提超声波处理和不处理方法分离提取产氢红杆菌细胞类胡 萝h 素。结果表明，超声波处理和不处理对产氢红杆菌光合色素的提取量影响较 小。吸收光谱表明，丙酮一甲醇( v v7 ：2 ) 浸提3 次可较完全提取光合色素， 最佳浸提时间为2 小时。采用薄层层析方法分析初步纯化到黄色、红色、浅黄色 和浅红色4 种类胡萝h 素组分，黄色和红色为主要类胡萝h 素组分。吸收光谱法 进一步研究表明，黄色组分为球状菌素( s p h e r o i d e n o n e ) 。 采用溶解酶和超声波相结合的破壁方法，以十二烷基二甲基胺氧化物( l d a o ) 作为膜蛋白的增溶剂，对生长和产氢条件下产氢红杆菌的色素蛋白复合体进行了 硫酸铵分级分离和d e a e - - 纤维素3 2 离子交换层析纯化。经u v v i s 光谱分析 和电泳检测结果表明：l d a o 对生长和产氢条件下产氢红杆菌膜蛋白构象有明显 的影响作用；从生长培养基培养的菌体中，分离纯化得了r c 和l h 2 色素蛋白 i 产氢光合细菌捕光色素蛋白复合体的分离纯化和活性研究 复合体，l h 2 色素蛋白复合体在8 0 0 n m 和8 5 0 n m 处出现特征吸收峰。s d s p a g e 表明r c 的l 、h 、m 三个亚基的分子量均在3 0 - - 3 5 k d ，l h 2a 、b 亚基分子量 在6 - - 7 k d ；在产氢培养基培养的菌体中分离获得了r c l h l 色素蛋白复合体， t r i c i n e s d s p a g e 分析反应中心( r c ) 的l 、h 、m 亚基分子量约在2 5 - - 3 0 k d ， l h la 、b 亚基分子量分别约为6 k d 。 分别以4 9 3 n m 、5 1 2 n m 、8 0 0 n m 为激发光，扫描l h 2 的荧光光谱，l h 2 可均在 8 5 0 n m 处出现一特征荧光峰，结果表明：分离产物l h 2 具有光能捕获和光能传 递的生物活性。为下一步的色素蛋白复合体与产氢之间关系研究奠定了基础 关键词： 产氢光合细菌；类胡萝h 素；色素蛋白复合体 i l 摘要 a b s t r a c t t h o s ew o r k sw e r ed o n eb yo u rl a ba b o u tr h o d o b a c t e rs p r 7 f i r s t l y ，t h e s y n t h e s i ss e q u e n c eo fp h o t o p i g m e n ti nl i v e c e l lo fh y d r o g e n p r o d u c i n g r h o d o b a c t e rs p w a si n v e s t i g a t e d t h ee f f e c t so fd i f f e r e n th y d r o g e nd o n o r s ， d i f f e r e n tn i t r o g e ns o u r c e sa n dd i f f e r e n tg r o w t hf a c t o r so nm e t a b o l i cp a t h w a y a n d c o m p o s i t i o n o fc a r o t e n o i d si n h y d r o g e n - p r o d u c i n gp h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i aw e r ea l s of u r t h e rs t u d i e d s e c o n d l y , t h ec a r o t e n o i de x t r a c t i o no f t i m e ，t i m e s ，c o n d i t i o no fr h s p r 7w e r es t u d i e d ，a n dp u r i f i e dc a r o t e n o i d s w a sp r i m a r i l ys e p a r a t e db yt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y f i n a l l y , t h ed i f f e r e n t m e t h o d so f s e p a r a t i o n a n dp u r i f i c a t i o no fp r o t e i n p i g m e n tc o m p l e x e s ( i n c l u d i n gr c l h la n dl h 2 ) m e t h o d s o fr b s p r 7c u l t u r e di na g m va n d a h m vw e r ec o m p a r e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e b i o s y n t h e s i so fb a c t e r i o c h l o r o p h y l l aw a s e a r l i e rt h a nt h a to fc a r o t e n o i d si nt h eo r d e ro f8 0 0 n m ，8 5 0 r i m ，4 5 0n m ，4 8 0 a m ，5 1 2n m ，4 2 6n m ，8 7 0n mi nh y d r o g e n p r o d u c i n gp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a r b s p r 7s t r a i n ，a n dt h es y n t h e s i so f4 2 6a mc a r o t e n o i dc h a n g e dt h er a t i oo f c o n t e n to ft h e l i g h t - h a r v e s t i n gc o m p l e xa n dr e a c t i o nc e n t e ro fr b s p r 7 s t r a i n t h ea d d i t i o no fa c e t a t et ot h em e d i u mi n s t e a do fm a l a t ec o u l di n d u c e s p h e r o i d e n ea n ds p h e r o i d e n o n em e t a b o l i cp a t h w a yo fc a r o t e n o i db o s y n t h e s i s t h ea d d i t i o no f g l u t a m a t e a n dm a l a t et ot h em e d i u mw a sh e l p f u lt o a c c u m u l a t eo f4 2 6 n mc a r o t e n o i da n de n h a n c ec e l lg r o w t h t h ea d d i t i o no f y e a s t e x t r a c tt ot h em e d i u mc o u l dn o t o n l y e n h a n c ec e l l g r o w t ha n d c a r o t e n o i dy i e l dr e m a r k a b l y , b u ta l s oc o u l dc h a n g et h em e t a b o l i cp a t h w a yo f c a r o t e n o i db o s y n t h e s i s t h es t u d yo fe x t r a c t i o nc a r o t e n o i de x p e r i m e n t a t i o ns h o w nt h a tt h e r ew a s i n d i s c r i m i n a t i o no fc a r o t e n o i d y i e l d s b e t w e e nb r o k e nc e l lw a l lw i t h u l t r a s o n i ct r e a t m e n ta n du n b r o k e nc e l lw a l lo fr b s p r 7c u l t u r e di na g m v t h eb e s te x t r a c t i o nt i m ew i t ha c e t o n e m a t h a n o l ( v v7 ：2 ) w a st h r e e 2h o u r w a st h eb e s te x t r a c t i o nt i m e t h er e s u l ts h o w nt h a tt h e r ew e r e4s p o t so f p u r i f i c a t o i n c a r o t e n o i dd i s s o l v e di na e t h e rb y t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , n l 产氢光台细菌捕光色素蛋白复合体的分离她化和活性研究 f e l l o w e dy e l l o w ，r e d ，s u p e r f i c i a ly e l l o wa n ds u p e r f i c i a lr e d t h ey e l l o ww a s t h em o s tc o m p o n e n ti nt h ee x t r a c t i o n c a r o t e n o i d ，s e c o n d a r i l y t h e r e d c o m p o n e n t t h ey e l l o wc o m p o n e n tr e s p e c t i v e l yd i s s o l v e di nb e n z e n ea n d a e t h e rw e r ea n a l y z e db ys p e c t r a la b s o r p t i o n ，a n dt h er e s u l t ss h o w nt h a tt h e y e l l o wc o m p o s i t i o nw a ss p h e r o i d e n o n e t h er e s u l ts h o w nt h a tc e l lw a l lw a sc o m p l e t e l yd i s s o l v e db yu l t r a s o n i c t r e a t m e n t5m i n ( p l u s3 0 s ，s t o pl o s ) a n dl y s o z y m e t h em e m b r a n ep r o t e i no fr b s p r 7w a so b t a i n e ds a t i s f a c t o r i l yw i t ht h e s i n g l es u r f a c ea c t i v ea g e n to fl d a o b u tt h es p e c t r a la b s o r p t i o na n a l y s i s s h o w nt h a tt h ec o n f i g u r a t i o no fm e m b r a n ep r o t e i nw a sp a r t l yd e s t r u c t e db y l d a o a sar e s u l t ，t h ee l e c t r o p h o r e t i ca n a l y s i ss h o w nt h a to n l yt h et w o c o m p o n e n t so ft h er e a c t i o nc e n t e r ( r c ) a n dt h el i g h t - h a r v e s t i n gc o m p l e x l h 2w e r eo b t a i n e df r o ma g m v b u tt h em u l t i c o m p o n e n t sw e r eo b t a i n e d f r o ma h m v i n c l u d i n gp i g m e n t p r o t e i nc o m p l e xr c - l h l t h ea b s o r p t i o n s p e c t r u ma n de l e c t r o p h o r e t i ca n a l y s i s o fp a g ea n d s d s - p a g es h o w nt h a tr ca n dl h 2a n t e n n aw e r eo b t a i n e db yi o n - - e s c b a n g e c h r o m a t o g r a p h yo nd e a e 一3 2c e l l u l o s ei nt h ep r e s e n c eo fo 1 0 2 m o l ln a c l a n d0 4 - - 2 m o l ln a c ir e s p e c t i v e l yf r o ma g m v , a n da l s or c - l h lc o m p l e x w a so b t a i n e df r o ma h m v t h el 、h 、ms u b u n i tm o l e c u l a rw e i g h to fr c f r o ma g m vw e r e3 0 3 5 k d ，a n d q1 3s u b u n i tm o l e c u l a r w e i g h to fl h 2 a n t e n n af r o ma g m vw e r e6 - 7 k d t h el 、h 、ms u b u n i tm o l e c u l a rw e i g h to f r cf r o ma h m vw e r e2 5 3 0 k d a n d bs u b u n i tm o l e c u l a rw e i g h to fl h l a n t e n n af r o ma h m vw e r e5 6 k d t h ef l u o r e s c e n ts p e c t r o s c o p ya n a l y s i ss h o w nt h a tl h 2a n t e n n af r o m a g m vh a st h e b i o l o g i c a lf u n c t i o no fc a p t u r ea n dt r a n s f e re n e r g y w h e n e x c i t e db y4 9 3 ，5 1 2a n d8 0 0 n ml i g h tw a v e ，l h 2a n t e n n ac o u l de m i tt h e8 0 0 a n d8 5 0 n me x c i t a t i o nl i g h tw a v ew h i c hb a c t e r c h l o r o p h y l lc o u l dc o m p l e t e l y a b s o r b k e y w o r d s ：h y d r o g e n p r o d u c i n g r h o d o b a c t e r s p ； c a r o t e n o i d ； l i g h t - h a r v e s t i n gc o m p l e x e i v 第一部分绪论 第一部分绪论 1 引言 光合细菌( p s bp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 属于水圈微生物，是一类能进行光合 作用而不放氧特殊生理类群的总称。广泛分布于江河、湖沼、池塘、水田厌气层上 部或底泥中以及小麦、水稻的根际土壤中，甚至在高达9 0 。c 的温泉、冰天雪地的南 极海岸以及含3 0 盐的水体中。光合细菌只含有光合系统i ，而不含光合系统， 光合机构也非常简单，能进行光能白养和光能异养产能代谢。因而，一直以来人们 选用光合细菌为研究材料提取反应中心并不断改进纯化方法，另一方面寻找不含类 胡萝h 素的光合细菌突变种，以便分离得到不含天线色素叶绿素和类胡萝h 素高纯 度的反应中心蛋白。8 0 年代，3 位诺贝尔获奖者就是利用光合细菌绿色红假单 胞菌( r h o d o p s e u d o m o n a sv i r i d b s ) 提取到了纯度很高的光合反应中心，在3 a 条件 下成功的解析了该菌株光合反应中心的晶体结构1 1 】，由此开创了光合反应中心研究 领域新纪元，同时也掀起光合反应中心研究新的热潮。 光合细菌光合机构的核心是色素蛋白复合体，包括捕光色素蛋白复合体( l h1 和l h 2 ) 以及反应中心色素蛋白复合体( r c ) 。l h1 和l h2 主要进行光能的吸收和 传递，r c 是光能转化的最重要反应场所( 2 1 。反应中心( r c ) 是光合作用原初反应的 核心。每个反应中心都包括原初电子供体、原初电子受体和一些特殊的蛋白分子并 起始光合作用的初始步骤。当光能被l h 色素蛋白复合物捕获后传递给r c ，反应中 心受到光能激发后，激发态的原初电子供体把电子转移给原初电子供体而产生电荷 分离，由此完成原初反应。因此，在光合系统中捕光色素蛋白复合体( l h ) 具有捕 获光能作用，反应中心( r c ) 起始电荷分离的原初光化学反应，而电子传递体和细 胞色素的组分传递电子和质子重要功能，经过原初反应、电子和质子传递光能转化 为化学能【2 ，3 1 。由于捕光色素蛋白复合体中只有少量具有特殊状态的叶绿素分子能进 行光化学反应，故一个时期以来，研究集中在色素蛋白复合体叶绿素分子的物理和 化学性质上。对于反应中心在光合膜上进行的原初反应、膜蛋白与脂类等重要组分 以及反应中心各种蛋白间相互作用尚不了解。要详细研究反应中心功能以及捕光色 素蛋白复合体捕获与传递能量效率，获得反应中心及捕光色素蛋白复合体的纯化物 及其清晰的原子三维空间结构至关重要。因而近年来，光合细菌反应中心及色素蛋 白复合体纯化物的获得和其空间结构研究取得了很大进展。现将有关反应中心及色 产氢红杆菌色素蛋白复合体的分离纯化和活性研究 素蛋白复合体研究进展综述如下。 2r c l h l 复合体结构与功能 l h l 主要功能是捕获8 8 0 n m 近红外波长的光能，然后将捕获的光能传递给反 应中心，r c 包括直接参与电荷分离和电子传递的组分，在此光能转化为化学能。 l h l 称b 8 8 0 ，它与r c 结合形成的复合物称r c b 8 8 0 。 近年来，光合细菌反应中心及色素蛋白复合体纯化物的获得和其空间结构研究 取得了很大进展。光合细菌光合系统结构研究表明，反应中心( r c ) 和捕光色素 复合体( l h l ) 在光合膜上相结合在一起形成r c l h l 复合体。1 9 9 5 年k a r r a s c hs 等在8 5 a 条件下对深红红螺菌( r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m ) r c l h l 结构进行了研究， 研究结果表明，r c l h l 复合体中l h l 有1 6 对ab 亚基，a1 3 亚基组成l h l 结构单 位。1 6 对ab 亚基形成环状的结构包围在r c 周围，r c 位于l h l 形成的环状结构 中心。每个异二聚体结合1 分子细菌叶绿素( r c h l ) 和1 分子类胡萝h 素( c a r ) 1 4 。 也有报道结合2 分子细菌叶绿素( r c h l ) 和1 分子类胡萝h 素( c a r ) i s 】。a 亚基大 约7 k d ，b 亚基大约5 k d “。2 0 0 2 年j a m i e s o nw s 等以及2 0 0 3 年s c h e u r i n gs 等运 用电子显微镜和原子力显微镜对r h o d o s p i r i l l u m ( r s jr u b r u m 和b l a s t o c h l o r i s ( b c j v i r i d i s 在8 5a 和1 0a 条件下对r c l h l 进行研究，研究结果表明，l h l 环状结 构也由1 6 对ab 异二聚体组成，并包围在反应中心r c 的周围，在光合膜上形成紧 密结合的r c l h l 复合体【7 ，”，利于光能吸收和传递以及光能的转化。 近年来的研究表明，l h l 异二聚体的数目和组成随细菌种属不同而存在差异。 1 9 9 2 年l i l b u r nt g 等人在4 8a 条件下应用x 一晶体衍射技术，研究r h o d o b a c t e r c a p s u l a t u s 捕光色素复合体l h l ，表明该菌株的l h l 由1 5 对d1 3 异二聚体和一个 未知功能的w 蛋白组成旷”】。w 蛋白位于1 5 个异二聚体形成的c 形开环结构之间， 在b 亚基外侧c 形环状结构有一个缺口，该缺口被认为有利于质子载体醌与反应中 心( r c ) 之间快速的能量交换。2 0 0 4 年f r a n c i a f 等通过电子显微镜及2 0 0 5 年p u q i a n c 等在8 5a 条件下采用x 一晶体衍射技术对混球红杆菌r h o d o b a c 把r c r 6 ) s p h a e r o i d e s 光合膜上的反应中心和捕光色素复合体结构进行研究，结果表明该复 合物的结构为r c l h i p u f x 即反应中心( r c ) 、捕光色素蛋白复合体( l h l ) 和一个 p u f x 蛋白组成。l h ldb 异二聚体的数目为1 5 1 1 1 2 】，而且进一步研究表明 r h o d o b a c 把r ( r b ) 的l h l 异二聚体数目一般为1 2 - - 1 6 对【1 3 】。1 2 - - 1 6 对b 异二聚 体聚合形成开环状的c 形环状结构，p u f x 蛋白位于c 环缺口之间，与位于环状结 构内的r c 蛋白复合体组成一个称r c l h l - p u f x 的超复合体高聚物，并且两个c 第一部分绪论 环连接形成s 形聚集体1 1 4 1 。位于环状缺口的p u f x 蛋白在r c l h l p u f x 超复合 体结构中利于质子传递。r h o d o b a c t e r ( r b ) 原子力显微镜研究也表明 r c l h l 一p u f x 超复合体结构的存在，但l h l b 异二聚体的标准模型为1 2 + 1 ( 即 1 2 个b 异二聚体和1 个p u f x 蛋白) 。p u f x 蛋白位于1 2 个q1 3 异二聚体形成的环 状结构缺口处，使c 环连接形成连续的闭合环，包围在r c 的周围。但到目前为止， 高清晰度( 3 o a ) 的r c l h l 一p u f x 晶体结构研究尚未见报道，这不利于由l h l 到r c 光能传递细节以及r c 与醌，对苯二酚能量交换机制的研究 1 7 1 8 】。 虽然光合机构r c l h l 复合体结构研究表明，l h l 结构模型为1 2 1 6 + 1ab 异二聚体( 即1 2 - - 1 6 对ab 异二聚体和和1 个p u f x 蛋白) 或1 5 + 1ab 异二聚体 ( 即1 5 对ab 异二聚体和和1 个w 蛋白) 组成c 环，两个c 环连接形成s 形聚 合体【1 9 】。但2 0 0 5 年s h i n y as 等在8 0a 条件下对绿色红假单胞菌( b l a s w i ，i d i s ) 的 r c l h l 研究表明，l h l 由q 、b 和y 三种亚基组成c 形环状结构，、b 和y 形 成准1 6 折叠的环状结构类似于r p p a l u s t r i s 的1 5 + 1d0 异二聚体组成c 环结构( a 1 5 8 1 5 和1 个未知蛋白序列的w 蛋白) 。b i a s v i r i d ss d s p a g e 电泳结果表明，r c l h l 的分子量4 4 1 k d ，其中r c l 4 1 k d ，l h l 为1 6 k d ( d 为6 8 k d ，b 为6 1 k d ，y 为 4 0 k d ) ，细菌叶绿素( b c h l ) 为0 9 k d i ”j 。 2 0 0 3 年a l e k s a n d e rw r 在3 a 条件下以及和2 0 0 4 年a l e k s a n d e rw r 等在4 8 a 条 件下通过x 晶体衍射技术对绿色红假单胞菌( b i a s v i r i d i s ) 和混球红杆菌 ( r b s p h a e r o i d e s ) 反应中心( r c ) 结构及其空间构象进行研究，结果表明r c 有l 、 h 和m3 个亚基以及一些辅助因子组成。辅助因子包括4 个细菌叶绿素分子、2 个细 菌脱镁叶绿素分子、2 个醌、1 个非血红素、2 分子类胡萝h 素分子。l 、h 、m 亚基 的分子量分别为：l 为2 8 3 k d ，h 为3 0 6 k d ，m 为3 5 9 k d 。该晶体衍射还研究表 明，反应中心存在1 1 个跨膜螺旋，l 亚基和m 亚基各5 个，h 亚基1 个。l 亚基和 m 亚基紧靠在一起形成一个圆柱式核心，有一个椭圆横切面，距中心的距离为4 0a 和7 0 a ，在核心区含有4 个螺旋组成的螺旋束，每个亚基提供两个螺旋，每个螺旋 含有一个与铁配位的组氨酸残基【2 0 吨”。多跨膜螺旋的肽链有助于电子和质子传递。 3 捕光色素复合体l h 2 的结构和功能 l h 2 主要捕获8 0 0 - - 8 5 0 n m 波长的光能，又称为b 8 0 0 或b 8 5 0 。多个b 8 0 0 或 b 8 5 0 位于r c - - b 8 8 0 复合物的外周。l h 2 吸收光能后并将能量传递给l h l r c ，在 功能上辅助l h l l 2 2 矧。1 9 9 5 年m c d e r m o t tg 等以及1 9 9 6 年k o e p k ej 等用x 一晶 体衍射技术分别在2 5 a 条件下和3 a 条件下对r s a c i d o p h i l a 和r h o d o s p i r i l l “ 产氢红杆菌色素蛋白复合体的分离纯化和活性研究 m o l i s c h i a n u m 捕光色素复合体( l h 2 ) 结构进行研究1 2 6 - 2 7 】，研究结果表明l h 2 都由 1 5 对。1 3 亚基形成闭合环状结构，n 亚基位于a1 3 环状结构内环，0 亚基位于环状 结构外环。继1 9 9 5 年m c d e r m o t tg 等成功获得r s a c i d o p h i l a2 5 ax 晶体衍射结构 以后，2 0 0 3 年p r i n c es m 等已成功获得2 a r p s a c i d o p h i l al h 2 复合体的x 一晶体衍射 结构1 2 8 ，高清晰度的晶体衍射结构发现l h 2 的ab 亚基都存在一个跨膜肽链，a 亚 基与b c h l b 8 5 0 非共价相连形成一b c h l b 8 5 0 复合体。此结构的获得为b c h l b 8 0 0 和b c h l b 8 5 0 复合体在能量捕获和传递功能的研究提供了很好的结构基础。由结构 比较，l h 2 环较r c l h l 环小1 1 1 2 n m 2 9 3 。 研究表明l h 2ab 亚基的数目也因种而异，1 9 9 6 年k o e p k ej 研究r s p ， m o l i c h i a n u m 发现该菌株的l h 2 由8 对ab 亚基组成【2 6 l ，但2 0 0 3 年s c h e u r i n gs 等 对r b s p h a e r o i d e 研究表明，该菌株l h 2 则由9 对a1 3 亚基形成环状结构【3 5 】。1 9 9 6 年 f r e e ra 等及1 9 9 7 年p r i n c es m 等对r s a c i d o p h i l a l h 2 研究已获得部分l h 2a1 3 亚基 氨基酸序列已获得：l i e ( - ) a 6 ，l y s ( - ) a s ，v a l ( ) a 9 ，t r y b l 4 ，g i n ( ) a 3 ，v a l1 3 1 5 ，l e u a 2 0 ， g l y b l 8 ，1 r h t b l 9 ，p h e1 3 2 2 ，v a l a 2 3 ，l l e a 2 6 ，a l a ( + ) a 2 7 ，i l e ( + ) a 2 8a n d h i s ( + ) a 3 1l 3 6 - 3 7 1o 此外，闭合环状结构之间共价结合1 6 ( 1 8 ) 个b c h l 分子和1 个分子c a r 。b c h l 分子卟啉环头位于环状结构外测，而c a r 分子深埋于ab 亚基结构内部 2 5 2 “。b c h l 分子主要吸收8 5 0 n m 的光能，c a r 分子主要吸收4 0 0 - - 5 0 0 n m 的光能并将光能传递给 l h 2 复合体中的b c h l 分子。因此两种色素在l h 2 中执行着吸收和传递光能重要作用。 此外，b c h l 和c a r 分子对l h 2 的结构稳定也起到重要作用【3 4 1 。c a r 在l h 2 中的类 型和含量随光合细菌种属差异而不同，但有关c a r 在光合反应中心含量和种类与光 能捕获和传递之间的关系未见系列报道。目前己通过：不激活c a r 基因的方法， 选择激活的方法，重组色素，运用生物抑制剂的方法获得不含c a r 以及少量 己知c a r 方法。对l h 2 中c a r 含量和种类以及功能进行研究，己取得初步进展【2 22 训。 4 光合色素结构和功能 光合细菌包含有丰富的细菌叶绿素( b c h l ) 和类胡萝h 素( c a r ) ，这两种色素都 属于胞内结合色素，主要与内质膜上的光合系统组分相结合( 即与反应中心f r c l 和 捕光色素蛋白复合体( l h l 、l h 2 ) $ h 结合) 3 8 - 3 9 】。c a r 是一个具有多烯结构的长链烃， 胞内的类胡萝h 素长链多烯多为9 1 3 个双键烃，这种多稀结构的存在有利于光反应 进行。b c h l 是一个菌绿素环和叶绿醇长链相结合的大分子物质。在捕光色素复合体 ( l h l 、l h 2 ) 结构中b c h l $ 口c a r 结合于l h l 和l h 2ab 亚基组成的环状结构之间，在 l h 2 结构中c a r 深埋于环状结构内部，而b c h l 的头部菌绿素环则伸出环状结构之外。 4 第一部分绪论 l h 2 中b c h l 和c a r 色素这种存在方式是否与其捕获光能并将捕获的光能传递给 r c l h l 复合体有关还不清楚。相关研究未见文献报道。 色素蛋白复合体c a r 主要吸收可见光( 波长范围在4 0 0 - - 5 0 0 n m ) ，这个波长范围 b c h l 没有光吸收活性，b c h l 主要吸收近红外的可见光( 波长范围在8 0 0 - - 8 8 0n m ) 。 c a r 吸收的光n n 2 0 - - 9 5 传递给细菌叶绿素a d o 】，进而再传递到反应中心进行光能和化 学能转化。 2 0 0 6 年s o f i ag 等对r 6 s p h a e r o i d e s 的捕光色素蛋白复合体l h lc d 光谱研究表 明，类胡萝p 素球形稀( s p h e r o i d e n e ) 和球状菌素( s p h e r o i d e n o n e ) 、链孢红素 ( n e u r o s p o r e n e ) 、八氢番茄红素( p h y t o y n e ) 在l h l 都有存在。2 0 0 3 年冯娟等对 光合细菌r p a l u s t r i s 捕光色素蛋白复合体l h 2 = - 重态能量传递的研究表明，该菌株 l h 2 中主要存在5 种类胡萝h 素：螺菌黄质( s p i r i l l o x a n t h i n ) 、紫菌红醇( r h o d o v i b i n ) 、 番茄红素f l y c o p e n e ) 、紫菌红素乙( r h o d o p i n ) 、脱水紫菌红醇( a n b y d r o r h o d o v i b i n ) 【4 2 1 。在色素蛋白复合体中存在的球状菌素( s p h e r o i d e n o n e ) 、螺菌黄质 ( s p i r i l l o x a n t h i n ) 、紫菌红素乙( r h o d o p i n ) 等属于光合细菌类胡萝t - 素代谢的终产 物，而链孢红素( n e u r o s p o r e n e ) 、八氢番茄红素( p h y t o y n e ) 、球形稀( s p h e r o i d e n e ) 、 紫菌红醇( r h o d o v i b i n ) 、脱水紫菌红醇( a n b y d r o r h o d o v i b i n ) 等属于类胡萝卜素代 谢的中间代谢产物【4 3 “】。由此可见，与捕光色素蛋白复合体结合的类胡萝h 素并非 是类胡萝b 素代谢的终产物，同时也存在中间代谢产物。其中如番茄红素( l y c o p e n e ) 等重要的中间产物在l h i w l h 2 结构中都有存在。在色素蛋白复合体中存在的这些多 烯烃化合物是否与其捕获光能的效率有关，以及类胡萝h 素组成和含量对色素蛋白 复合体结构稳定性的关系均未见报道。因此，对捕光色素色素蛋白复合体中色素研 究将有助于对光合作用能量传递机制的深入了解。 5 光合色素与光合产氢 对光合细菌产氢机制研究表明，光合细菌产氢包括固氮产氢和发酵产氢。固氮 产氢机制是在固氮酶催化下，消耗菌体a t p 以及n a d ( p ) h 2 ，产生电子并通过铁氧还 蛋白或黄素氧还蛋白传到固氮酶的铁蛋白，将分子氮还原成氨，与此同时也伴随 h 还原成分子氢。光合细菌固氮产氢过程中n a d ( p ) h z 提供的电子和质子一部分在固氮 酶上被还原成氢气，一部分被消耗固氮，可见固氮酶催化的产氢实际上是固氮和产 氢同时进行的，固氮的同时也释放氢气。影响产氢因素包括对固氮酶有影响的所有 因素，如细胞内a p t 供应、还原力【h 】、电子供体的种类、光照强度以及产氢底物。 此外，光合细菌的某些类群能利用无机物或有机物为质子和电子供体，在光驱动下， 产氢红杆菌色素蛋白复合体的分离纯化和活性研究 由放氢酶催化而产生分子氢，如发酵产氢。 由以上产氢机理可知，胞内能量水平( a t p 含量) 、胞内还原力水平( n a d ( p ) h 2 产量) 以及光照对光合细菌产氢过程都有至关重要的影响。由此推测光合细菌光合 作用产生的能量( a t p ) 水平和光能捕获及传递效率可能对光合细菌产氢也有着重要 影响，但相关研究未见报道。 光合细菌的光合色素( 细菌叶绿素和类胡萝h 素) 作为光合反应中心( r c ) 、捕 光色素复合体( l h l 、l h 2 ) 重要的组成成分，对光合作用过程光能捕获和传递以及 光合作用效率都有作重要影响。类胡萝h 素为光合细菌次生代谢产物，参与形成细 胞结构并执行重要的生理功能。杨素萍等对勋5 p a l u s t r i s & r b s p h a e r o i d e s 产氢研究 表明，菌体中类胡萝h 素的组分和含量与光合放氢活性有关【4 “。 a l e k s a n d e r w 实验室曾经设计有趣的实验，将r 6 s p h a e r o i d e s 类胡萝h 素突变株 的光反应中心复合物( r c l h l ) 重新掺入球形烯( s p h e r o i d e n e ) 、紫菌红素乙( 3 、 4 d i h v d r o s p h e r o i d e n e ) 、球状菌素( s p h e r o i d e n o n e ) 等类胡萝h 素分子，重新掺入的 类胡萝h 素分子在复合物中能形成稳定的构型【2 “，类胡萝h 素与色素蛋白复合体松 弛的结合方式是否与其调控产氢等重要生物学功能有关还有待进一步研究和证实。 6 研究中存在的问题和发展趋势 光合细菌光合机构( r c l h l 、l h 2 ) 的研究已成为光合作用研究领域的研究热 点。尤其近年来电子显微镜、原子力显微镜以及x 一衍射技术在光合机构( r c l h l 、 l h 2 ) 结构研究中的运用，高分辨率原子三维结构的获得有助于r c l h l 、l h 2 复合 体结构研究。此外，在l h l 、l h 2 能量传递机制、r c 光能转化机制研究取得很大进 展。所以，对光合细菌光合机构( r c l h l 、l h 2 ) 的研究任然以获得高分辨率( 2 a ) 的原子三维结构结构为主要研究方向。 光合细菌含有丰富的光合色素( b c h l 和c a r ) 。光合色素主要功能是捕获光能和 传递光能，同时对光合细菌光合机构( r c l h l 、l h 2 ) 结构稳定也起着举足轻重的 作用。目前，对光合色素领域的研究主要通过突变的方法获得某种突变色素或不含 色素突变株( 主要是获得不含c a r 或某；f q j c a r 突变的菌株) 而研究其在能量传递中的 作用。有关光合色素与细胞其它生理功能关系的研究还是空白。 光合细菌具有产氢的生理功能，固氮酶催化的固氮产氢和放氢酶催化的发酵产 氢都与细胞内能量水平( a t p 水平) 、细胞还原力n a d ( p ) h 2 含量和光照有关。而这 些因素都与光合作用机构r c l h l 、l h 2 以及光合色素功能有密切关系。因此，有关 光合色素以及光合机构在捕获和传递光能并将光能转化为化学能的功能对细胞内能 第一部分绪论 量水平( a t p 水平) 、细胞还原力n a d ( p ) h 2 含量影响机制研究将成为光合细菌产氢 研究新的研究热点。 7 本研究的目的和意义 光合细菌的光合系统包括反应中心( r c 复合体) 和捕光色素蛋白复合体( l h l 和l h 2 ) 。l h l 主要捕获8 8 0 n m 近红外波长的光能，然后将捕获的光能传递给反应 中心进行光能和化学能的转化。l h 2 主要捕获8 0 0 - - 8 5 0 n m 波长的光能。l h 2 吸收 光能后并将能量传递给l h i r c ，在功能上辅助l h l 。而r c 主要进行光能转化，它 包括直接参与电荷分离和电子传递的组分。这些组分均位于光合内膜上。 光合细菌含有丰富的光合色素( b c h l 和c a r ) ，他们都属于胞内结合色素，在r c 、 l h l 和l h 2 都存在。c a r 主要捕获4 0 0 - - 5 0 0 n m 波长范围的光能，在这个波长范围 b c h l 没有光吸收活性，b c h l 主要8 0 0 - - 8 8 0n m 波长范围的光能。c a r 吸收的光能并 传递给细菌叶绿素，进而再传递到反应中心进行光能和化学能转化，完成