（药物分析学专业论文）人血浆中舒芬太尼测定方法的建立及应用.pdf

目录 删f f f 脚 y 18 9 鲥岑芗。 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语5 三、论文 前f 言”6 刖蔷” 材料与方法8 结果2 1 讨论2 9 结论2 9 四、本研究创新性的自我评价3 1 五、参考文献3 2 六、附录 综j 丕3 3 致谢4 1 个人简介4 2 中文论著摘要 人血浆中舒芬太尼测定方法的建立及应用 目的 本研究建立一种灵敏度高、专属性强、操作简单易行的l c m s m s 方法，测 定全麻手术患者血浆中舒芬太尼的药物浓度，并用于正常体重患者与肥胖患者的 临床药动学研究，为临床用药提供理论依据。 方法 本试验采用l c m s m s 方法，以芬太尼为内标，用乙醚萃取法对血浆进行处 理。检测器为a p i4 0 0 0 液相色谱三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾离子源( t i s 源) ，采用正离子方式检测，扫描方式为多反应监测( m r m ) ，用于定量分析的 离子反应分别为毗3 8 7 2 寸n 汔2 3 8 2 ( 舒芬太尼) 和i l l z3 3 7 4 一i l 比1 8 8 2 ( 芬 太尼) 。色谱柱为d i 锄o n s i lc 1 8 柱( 1 5 0 x 4 6n l l t li d ，5o x n ) ，流动相为甲醇5 m m 乙酸铵乙酸( 7 4 ：2 6 ：0 5 ，v v v ) ，流速为o 5m l m i n ，柱温为室温，进样量为2 0 p l 。 选取择期在全麻下行甲状腺部分切除术病人1 8 例，男女各半，年龄2 5 6 0 岁， a s a 分级i i i 级，无精神病史、神经性疾病史、心血管系统病史及肝、肾功能 异常，术前无哮喘病史及阿片类药物滥用史。将这些病人按照体重指数分为两组： 组l ，体重指数1 8 5 2 2 9 k m 2 ；组2 ，体重指数2 5 0 2 9 9 k g m 2 。两组病人分别 顺次静脉注射咪达唑仑0 0 3 m 眺g ，舒芬太尼0 4 p g l ( g ( 注射时间3 0s ) ，罗库溴 铵0 8 m 北g ，依托咪酯0 3 m 眺g 。于静脉注射舒芬太尼后的0 ，l ，3 ，5 ，lo ，2 0 ，3 0 ，4 5 ， 6 0 m i n 采静脉血1 - 2 m l ，置于预先肝素化的离心管中，以5 0 0 0r p m 离心1 w i n 后， 吸取血浆按照上述l c m s m s 法测定舒芬太尼的血药浓度，并应用d a s2 0 软件 计算两组的主要药代动力学参数，应用s p s s1 1 0 进行t 检验。 结果 在上述色谱质谱联用条件下，舒芬太尼的线性范围为0 0 1 1 0 0 n # m l 。最低定 量限( l l o q ) 为0 0 1 n g m l 。日内r s d 小于9 2 ，日间r s d 小于1 1 6 ；高、 中、低三浓度的提取回收率分别为7 7 8 ，6 4 2 ，6 6 1 ，标准差小于4 2 ；血 浆样品室温放置4 h ，预处理后放置2 4 h ，3 次冷冻解冻循环及长期冷冻6 0 天的 r e 均小于1 2 4 。 正常体重组和肥胖组的主要药代动力学参数：t l 尼分别为2 2 3 4 3 + 6 9 6 9 和 3 8 2 20 4 2 5 8 8 7 m i r aa u c o a 分别为9 0 5 8 4 - 6 。21l 和9 8 3 24 - 3 7 2 5n g r r d * m i n ，a u c 帅 分别为9 9 8 7 4 - 6 0 5 6 和11 9 7 3 4 - 3 1 3 5n g m l * m i mm r 吡分别为1 3 0 8 2 4 - 4 5 1 9 和 1 6 5 30 4 5 0 3 3 m i r ac l 分别为0 0 5 1 4 0 0 2 4 和0 0 3 64 - 0 0 0 9l m i n k g 采用s p s sl1 0 两独立样本t 检验结果表明肥胖组的达峰时间较正常组长，有 显著意义( p o 0 5 ) ，其他药代动力学参数两组没有显著差异。 结论；口匕 本文建立的方法简便、快速、灵敏，适用于舒芬太尼在人血浆中的药物浓度 的测定及复合麻醉患者小剂量静脉注射舒芬太尼的临床药代动力学研究。根据实 验结果，体重指数偏高对舒芬太尼t i 尼，a u c o - t ，a u c 嘶，m r t o d ，c l 等药代动 力学参数没有显著影响，但肥胖组的达峰时间较长。因此，临床上小剂量静脉注 射舒芬太尼时，肥胖患者的给药剂量无需调整，但肥胖患者的气管插管时间应该 滞后于正常体重患者。 关键词 舒芬太尼、l c m s m s 法、临床药代动力学、肥胖 2 英文论著摘要 d e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no fa n a l y t i c a lm e t h o d s o fs u f e n t a n i li nh u m a np l a s m a o b j e e t i v e s a r a p i da n ds e n s i t i v el c m s m sm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs u f e n t a n i li n h u m a np l a s m ah a sb e e nd e v e l o p e dt o s t u d yp h a r r n a c o k i n e t i cc h a r a c t e r i s t i c s o f s u f e n t a i n li no b e s e p a t i e n t s m e t h o d s a f t e ra d d i n g2m o l l 1n a o ha st h eb a s i f i c a t i o nr e a g e n t ，s u f e n t a n i lw a se x t r a c t e d f r o mp l a s m ab ye t h e r t h e ns u f e n t a n i lw a sd e t e r m i n e db yl c m s m su s i n gf e n t a n y l a sa l li n t e r n a ls t a n d a r d s e p a r a t i o nw a sc a r r i e do nad i a m o n s i lc18c o l u m n ( 15 0 x 4 6 n l l n ，5w n ) w i t ham o b i l ep h a s eo fm e t h a n o l - 5 m ma m m o n i u ma c e t a t e a c e t i ca c i d ( 7 4 ：2 6 ：0 5 ，v v ) a tt h ef l o wr a t eo f0 5m l m i n t u r b oi o n i z a t i o ns o u r c e ( t i s ) w a s a p p l i e da n do p e r a t e di np o s i t i v ei o nm o d e q u a n t i t a t i o nw a sp e r f o r m e du s i n gm u l t i p l e r e a c t i o nm o n i t o r i n g ( m r m ) o f t h em z3 8 7 2 m z2 3 8 2f o rs u f e n t a n i l a n dr n z3 3 7 4 - - 9 m z18 8 2f o rf e n t a n y l e i g h t e e na m e r i c a ns o c i e t yo fa n e s t h e s i o l o g i s t s ( a s a ) io r i ip a t i e n t sw h oa l e 2 5t o6 0y e a r so l da n ds c h e d u l e df o rt h y r o i ds u r g e r yp a r t i c i p a t e dt h i ss t u d y a l lo ft h e m s h o u l dn o th a v ep s y c h i a t r i ch i s t o r y , n e u r o l o g i c a ld i s e a s e ，c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e ，l i v e r a n dk i d n e yd y s f u n c t i o n ，a s t h m aa n ds oo n t h ep a t i e n t sw e r ed i v i d e di n t ot w og r o u p s a c c o r d i n gt ot h e i rb o d ym a s si n d e x ( b m i ) g r o u po n e ：18 5 2 2 9k g m z ；g r o u pt w o ： 2 5 0 - - - 2 9 9k g m 2 t h ep a t i e n t sw e r er e c e i v e dm i d a z o l a m ( 0 0 3m e c k g ) ，s u f e n t a n i l ( 0 4 雌肚曲，r o e u r o n i u m ( 0 8m g k g ) a n de t o m i d a t e ( 0 3m g k g ) b yi n t r a v e n o u sw a y v e n o u sb l o o ds a m p l e so f1t o2m lw e r eo b t a i n e db e f o r et h ei n j e c t i o na n da t1 ，3 ，5 ，10 ， 2 0 ，3 0 ，4 5 ，6 0m i n t h ep l a s m ac o n c e n t r a t i o no fs u f e n t a n i lw e r ed e t e r m i n e db yt h e m e t h o dd e s c r i b e dp r e v i o u s l y p h a r m a c o k i n e t i ca n a l y s i sw a sp e r f o r m e du s i n gd a s2 0 p r o g r a m t h ei m p o r t a n tp h a r m a c o k i n e t i cp a r a m e t e r sh a db e e nd o n ett e s tb ys p s s11 0 3 s o f t w a r e r e s u l t s t h ec a l i b r a t i o nc 1 l r v ew a si ng o o dl i n e a r i t yo v e rt h er a n g eo f o 0 1 1 0 0n g m l ( r = 0 9 9 8 1 ) t h el o w e s tl i m i to f q u a n t i f i c a t i o n ( l l o q ) w a so 0 1n g m 1 t h ei n t r a - d a ya n d i n t e r - d a yp r e v i s i o n sd e t e r m i n e df r o mq cs a m p l e s ，e x p r e s s e da sr e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n ( r s d ) ，w e r en om o r et h a n9 2 a n d 11 6 t h ee x t r a c t i o nr e c o v e r yf o r s u f e n t a n i lw a sr a n g e df r o m6 4 2 t o7 7 8 a l lt h es a m p l e sw e r es t a b l ea f t e rt h r e e f r e e z et h a wc y c l e sa n dk e e p i n gf r o z e nf o rs i x t yd a y s t h ep h a r m a c o k i n e t i cp a r a m e t e r so ft h en o r m a lg r o u pa n dt h eo b e s eg r o u p ：t i n w e r e2 2 3 4 3 4 - 6 9 6 9a n d3 8 2 2 0 4 - 2 5 8 8 7 m i n ；a u c o - tw e r e9 0 5 8 4 - 6 211a n d9 8 3 2 4 - 3 7 2 5n g m l 奉m i n ；a u c o _ mw e r e9 9 8 7 4 - 6 0 5 6a n d11 9 7 3 士3 13 5n g r r d 宰m i n ；m r t o t w e r e1 3 0 8 2 - - 1 ：4 5 1 9a n d1 6 5 3 0 4 - 5 0 3 3r a i n ；c lw e r e0 0 5 1 4 - 0 0 2 4a n d0 0 3 6 ：k - 0 0 0 9 l m i n k g a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fs p s s 11 0s o f t w a r e ，m o s to ft h ep h a r m a c o k i n e t i c p a r a m e t e r sa r en od i f f e r e n c ee x c e p tt h a tt h et m 瓢o fo b e s eg r o u pi sl o n g e rt h a nt h e n o r m a lg r o u p co n c l u s i o n t h em e t h o di ss i m p l e ，r a p i da n ds e n s i t i v ew h i c hi ss u i t a b l ef o rd e t e r m i n a t i o no f d r u gc o n c e n t r a t i o no fs u f e n t a n i l i nh u m a np l a s m a t h ev a l i d a t e dm e t h o dw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt oe v a l u a t et h ec l i n i c a lp h a r m a c o k i n e t i c so fl o wd o s eo fs u f e n t a n i l i na n e s t h e s i ap a t i e n t s k e yw o r d s s u f e n t a n i l ，l c m s m sm e t h o d ，c l i n i c a lp h a r m a c o k i n e t i c s ，o b e s e 4 英文缩略语 5 论文 人血浆中舒芬太尼血药浓度测定方法的建立及应用 刖舌 药物动力学( p h a r m a c o k i n e t i c s ) 亦称药动学，系应用动力学原理与数学处理方 法，定量描述药物在体内动态变化规律的科学。作为药代动力学的重要分支，临 床药代动力学( c l i n i c a lp h a r m a c o k i n e t i c s ) 通过对人体药物动力学研究、药物浓度与 药物效应关系研究、合并用药对药物动力学过程的影响规律研究等，为药物的临 床评价与临床应用方法和临床个体化给药方案的制定提供理论依据【1 】。 而药动学研究结果正确与否，很大程度上依赖于生物样本中药物测定方法的 准确性和可靠性。与通常的药物分析工作相比，药动学研究所面临的生物样本具 有药物浓度低、药物浓度变化范围大、干扰组分多且不确定、样品不能重复获得 等特点。由于生物样本的特殊性，药动学研究要求测定方法具有良好的选择性、 足够高的灵敏度、较宽的线性范围和足够的准确度【2 】。 液相色谱一质谱联用技术( l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ，l c m s ) 是以质谱为检测手段的色谱技术，它集高效液相色谱的高分离能力与质谱的高灵 敏度、极强的定性专属特异性于一体。尤其是串联质谱技术( t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ，m s m s ) ，典型的为三重四极杆串联质谱，属于空间上的串联质谱， 具有强大的定量功能，其灵敏度比液相色谱紫外检测平均高l 2 个数量级，可 实现对复杂生物样品进行快速、高选择性和高灵敏度的分析。它应用范围广，可 用于不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物( 蛋白质、多 肽、多糖和多聚物等) 的分析。此外，由于质谱具有多通道检测功能，被测组分不 需要完全色谱分离，因而缩短了分析时间。目前该技术已成为药物动力学研究中 其他方法所不能取代的有效工具。 本文研究对象舒芬太尼( s u l f e n t a n i l ) ，化学名为：n 【4 ( 甲氧甲基) 1 2 一( 2 噻吩基) 乙基 4 哌啶基】- n 苯丙酰胺，是一种选择性u 受体激动剂，其镇痛效能强， 起效时间短，有较宽的安全阈范围，且它在体内有限的积蓄和迅速的清除使病人 6 能迅速地苏醒，因此被广泛的应用。舒芬太尼静脉给药的方法有三种：1 诱导期 总量一次给予2 一定剂量诱导，术中按时、按需间断追加给药3 一定剂量诱导， 静滴维持。其中方法2 可以保证诱导平稳、方法灵活，易被大家所接受。针对大 剂量应用舒芬太尼的副作用及其应用的局限性，目前多采用小剂量诱导，用于复 合麻醉，剂量范围一般在o 1 2 p g l 【9 3 1 。 关于舒芬太尼血药浓度的测定方法，国内报道较少，国外报道的方法主要有 放射免疫法( r t a ) 、气相色谱法( g c ) 、液相色谱质谱联用法( l c m s m s ) 。 其中r i a 和g c 的定量限较好，但r i a 的精密度和准确度较低，g c 需要将舒芬 太尼衍生化，较繁琐f l j 。有采用液液萃取，梯度洗脱，液质联用测定的，其定量 限可达到0 0 1 n 9 2 1 ，但操作复杂费时。因此本文建立了简单快速，定量下限更低 的l c m s m s 方法，用于测定小剂量应用舒芬太尼诱导麻醉患者的血药浓度，为 临床用药提供理论依据【4 1 。 随着生活水平的提高，肥胖已成为全球问题，而肥胖亦是麻醉风险的高危因 素之一。肥胖患者药动学发生改变主要是因为体重增加而导致药物的分布容积以 及肝肾血流量发生显著变化。一般来说，脂溶性高的药物在肥胖者体内分布容积 增大，消除半衰期延长。但是药物的亲脂程度与其在肥胖患者药物的分布没有系 统相关性，因此，负荷剂量应按照总体重还是理想体重调整，还是应该依赖于药 物在肥胖人群研究的结果【5 一。e g a n 7 1 等人研究表明与1 2 例正常体重的病人相比， 肥胖病人给予雷米芬太尼负荷量后，其药动力学显示有一个更高的血药浓度。但 也有一些研究表明，用正常体重人的药动力学参数来靶控输注舒芬太尼，可以准 确预测肥胖患者的血药浓度【8 】。在麻醉师的实际经验中，更多人倾向给予肥胖患 者较低的剂量，因此本实验测定并比较了肥胖对舒芬太尼药动力学的影响很有意 义。 7 材料与方法 一、实验材料 ( 一) 药品 枸橼酸舒芬太尼，宜昌人福药业有限责任公司，规格5 0i x g m l ，批号：0 9 1 0 枸橼酸芬太尼，宜昌人福药业有限责任公司，规格5 0i t e d m l ，批号：0 9 1 2 0 1 舒芬太尼结构式 ( 二) 试剂 甲醇 乙酸铵 乙酸 无水乙醚 空白血浆 肝素钠 ( 三) 仪器 芬太尼结构式 色谱纯，天津市大茂化学试剂厂 分析纯，沈阳化学试剂厂 分析纯，沈阳化学试剂厂 分析纯，沈阳化学试剂厂 沈阳中心血站提供 南京新百药业有限公司 a p i4 0 0 0 三重四极杆串联质谱仪( t i s 源) a n a l y t e 数据采集软件 岛津9 1 0 0 泵 a g i l e n t110 0 型液相色谱仪 d i a m o n s i lc 1 8 柱( 1 5 0 x 4 6m m i d ，5l x m ) a l 1 0 4 电子分析天平 x k 9 6 a 快速混匀器 8 美国a b 公司 美国a b 公司 日本岛津 美国a g i l e n t 公司 北京迪马公司 德国梅特勒公司 姜堰市新康医疗器械有限公司 l 一11 9 型试管恒温加热仪北京莱亨科贸有限公司 t d l 6 a 台式离心机上海菲恰尔分析仪器有限公司 二、人血浆中舒芬太尼血药浓度的测定 ( 一) 舒芬太尼标准溶液的配制 精密量取枸橼酸舒芬太尼注射液o 7 5m l ，置1 0m l 容量瓶中，用甲醇稀释至 刻度，摇匀，作为储备液( g e 度3 7 5p 咖l ，相当于舒芬太尼浓度2 5i _ t g m 1 ) ， 冰箱( 4 ) 内保存备用。 ( 二) 色谱、质谱条件 色谱柱为d i a m o n s i lc 1 8 柱( 1 5 0 x 4 6m mi d 5r t r a ) ；流动相为甲醇5 m m 乙酸铵乙酸( 7 4 ：2 6 ：o 5 ，v v v ) ；流速为0 5m l m i n ；柱温为室温。 离子源为t i s 源；温度为5 5 0o c ；源电压为1 3 0 0v ；g a s l ( n 2 ) 5 0p s i ；g a s 2 ( n 2 ) 3 0p s i ；c u r t a i ng a s ( n 2 ) 1 5p s i ；c a dg a s ( n 2 ) 6p s i ；正离子方式检测； 去簇电压( d p ) 均为7 0 v ；入口电压( e p ) 均为1 0 v ；碰撞能量( c e ) 均为3 0 v ； 碰撞室出口电压( c x p ) 分别为1 6 c v ( 舒芬太尼) ，1 3 e v ( 芬太尼) ；扫描方式 为多反应监测( m r m ) ，用于定量分析的离子反应分别为m z3 8 7 2 专m z2 3 8 2 ( 舒芬太尼) 和m z3 3 7 4 专m z1 8 8 2 ( 芬太尼) ；扫描时间为0 1 s 。 ( 三) 血浆样品处理 取待测血浆4 0 0m ，置1 0m l 具塞玻璃试管中，依次加入甲醇4 0 山，内标溶 液( 5 0 9n g m l 芬太尼甲醇溶液) 4 0i x l 和2m o l ln a o h 溶液2 0m ，涡旋3 0s ， 再加入乙醚2m l ，涡流6 0 s ，振荡提取1 0m i n ( 1 2 0 次r a i n ) 后，离心5m i n ( 3 5 0 0 r p m ) ，分离上清液，于4 0 。c 空气流下吹干，残渣溶于1 0 0 l l 流动相，取2 0 “l 进行l c m s m s 分析。 ( 四) 分析方法的确证 l 、方法的选择性 舒芬太尼和内标芬太尼在t i s 电离方式下，主要生成 m + h 】+ 准分子离子， 分别为m z3 8 7 2 和m z3 3 7 4 。分别选择对二者的准分子离子 m + h 】+ 进行产物 离子全扫描分析，其中舒芬太尼m z2 3 8 2 ，芬太尼m z1 8 8 2 碎片离子响应最强， 9 被选作定量分析时监测的产物离子。相应的二级全扫描质谱图见图1 。 分别取6 名受试者的空白血浆4 0 0 r t l ，除不加内标外，按“血浆样品处理”项下 依法操作，进行l c m s m s 分析，获得空白血浆样品的色谱图，如图2 a ；将一 定浓度的标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作，得色谱图，如图2 b ， 其中舒芬太尼的保留时间约为3 8 3r a i n ，内标芬太尼的保留时间约为3 4 2m i n ；取 受试者给药后收集的血浆样品，依同法操作，得色谱图，如图2 c 。结果表明空白 血浆中的内源性物质不干扰舒芬太尼及内标物芬太尼的测定。 a + m s 2 0 0 7 2 0 ) c e 9 町3 0m c a o c - * u j 丽 c t - 2 3 8 2 3 刮；3 t 4 0 0 3 8 7 4 1 1 1 1 i2 0 0 2 ，1 4 4 l9 9 1 、l升誓1i 广 3 2 7 5 5 01 0 01 5 02 2 3 0 03 4 0 r 盹o a b + m s 2 ( 3 3 7 4 0 ) c ec 3 0 l3 0m c a 厅 立 u 苦 丽 c e 1 2 5 0t 0 01 5 02 0 02 5 03 0 03 , 5 04 0 0 4 5 0 盹d a 图1 ，舒芬太尼和内标芬太尼【m + h 】+ 的产物离子全扫描质谱图 ( a ) 舒芬太尼( b ) 芬太尼 l o 7 7 7 7 7 6 0 钆 i ：! ： “ 驰 驰 叫 m 2 2 2 1 1 5 7 7 7 7 7 6 0 叽 i ：! ： 铀 叽 盹 n 3 2 2 1 1 5 a x 。co + m r m 口p jo 密3 8 7 施3 8 2d a 。d ：钊f e n b 0 1 o2 o3 04 0 t i m e r a i n co f + m r m 往p a l 目良3 3 7 4 1 8 8 2d ai d ：f e nf r o ms a m 0 1 d2 03 - 04 o t i m e r a i n x j co f + m r m 口p a i 时3 8 7 2 2 3 8 2d ai b ：s u f e n 0 3 9 0 i 1 02 d3 04 0 t i m e m i n x i co f + m r m c 2p a i s ) ：3 3 7 4 1 8 8 2d ai d ：f e n 2 0 e 5 1 0 e 5 o 0 3 ， 1 o2 03 d4 0 t i m e m i n c co + m r mgp a 时7 墟2d 1 d ：5 “。“ 4 6 e 4 0 0 3 8 3 ，i 1 02 03 04 0 t i m e r a i n y - j co f + m r m 口p a i r s ) ：3 3 7 4 1 8 8 2d ai d ：f e n 1 d 0 西 c 0 1 02 03 o4 0 t i m e r a i n 图2 ，测定血浆中舒芬太尼和内标芬太尼的典型m i 乏3 v i 色谱图 ( 峰i 为舒芬太尼，峰i i 为芬太尼) ( a ) 空白血浆 ( b )空白血浆加入舒芬太尼至o 8 0n 咖l 和内标芬太尼至5 0 9n m l ( c ) 一例受试者静脉注射枸橼酸舒芬太尼后3 m i n 血浆样品 1 l 2 、标准曲线的制备 取空白血浆4 0 0m ，加舒芬太尼标准系列溶液4 0 山，配制成相当于舒芬太尼血 浆浓度为0 0 1 ，o 0 2 ，o 0 5 ，o 2 0 ，0 5 0 和1 0 0n g m l 的血浆样品，按“血浆样品处理” 项下依法操作，每一浓度进行双样本分析，进样2 0m ，记录色谱图；以待测物浓 度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最t b - - 乘法进行回 归运算【9 1 ，求得的直线回归方程即为标准曲线，每个分析批( 每天) 建立一条标 准曲线，如图3 。 线性范围：根据标准曲线，舒芬太尼血浆浓度测定方法的线性范围为o 0 1 1 0 0n g m l 。 2 o 1 6 o 絮 三1 2 氤 d 二 酱0 8 o 山 0 4 o o o0 20 40 6 c o m e n w a t i o n ( n g m l ) 图3 ，血浆中舒芬太尼血药浓度测定的标准曲线 3 、定量下限 取空白血浆4 0 0i d ，加入舒芬太尼0 1n g m l 标准溶液4 0 “l ，配制成相当于舒 芬太尼血浆浓度为o 0 1n g m l 的样品，该样品在方法确证第一天进行6 样本分析， 并根据当日标准曲线，求得每一样本的测得浓度，数据见表l 。该结果表明 l c m s m s 法测定血浆中舒芬太尼的定量下限可达0 0 10 n g m l 。 1 2 表1 ，l c m s m s 法测定人血浆中舒芬太尼定量下限时的精密度和准确度 4 、方法的精密度与准确度 取空白血浆4 0 0 山，按“标准曲线的制备”项下的方法配制舒芬太尼低、中、高 三个浓度( 舒芬太尼分别为0 0 2 0 、o 10 0 和0 8 0 0n g m 1 ) 的质量控制( q c ) 样品。 每个浓度分别制备6 个样本，重复三个分析批，并与标准曲线同批测定，以当日的 标准曲线，计算q c 样品的测得浓度，与配制的浓度对照，求得本法的准确度与精 密度，数据分别见表2 。实验数据表明，测定人血浆中舒芬太尼的分析方法符合有 关的规划1 0 1 要求。 5 、血浆样品提取回收率。 取人空白血浆4 0 0 i t ，按“标准曲线的制备”项下操作，制备舒芬太尼低、中、 高三个浓度( 分别为0 0 2 0 、0 10 0 和0 8 0 0n g m 1 ) 的质量控锘t j ( q c ) 样品，每一浓度 进行3 个样本分析。同时另取人空白血浆4 0 0 肛l ，各以4 0 “l 甲醇代替舒芬太尼标准 系列溶液和内标溶液制备空白样品，按“标准曲线的制备”项下的方法操作，分离 有机上清液，向获得的上清液中加入相应浓度的标准溶液和内标溶液各4 0 山，涡 流混合，4 0 0 c 空气流下吹干。残留物以l o o “l 流动相溶解，进样2 0 斗1 分析，获得相 应峰面积( - - 次测定的平均值) 。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提 取回收率。实验数据表明，该方法中舒芬太尼在0 0 2 0 、0 1 0 0 和o 8 0 0n g m l 三个浓 度的血浆样品提取回收率分别为7 7 8 ，6 4 2 和6 6 1 ，内标的提取回收率为 6 7 5 。结果见表3 。 1 3 表2 ，l c m s m s 法测定血浆中舒芬太尼的精密度和准确度 1 4 表3 ，舒芬太尼血浆样品提取回收率 6 、基质效应 向干净的试管中加入内标液和舒芬太尼低、中、高三个浓度的标准溶液各 4 0 1 x l ， ( 与“提取回收率”项下标准溶液浓度相同) ，混匀后于4 0 0 c 空气流下吹干。 残渣溶于1 0 0 i t l 流动相，取2 0 p 1 进行l c m s m s 分析，获得相应峰面积( 三次测定 的平均值) 。以每一浓度基质效应的样品峰面积与提取回收率样品峰面积的比值 计算基质效应，结果见表4 。 表4 ，舒芬太尼血浆样品基的质效应 6 、稳定性的考察 舒芬太尼血浆样品室温稳定性：取0 0 2 0 ，0 8 0 0n g m l 的q c 样品各3 份，于室 温放置4 h 后按本方法规定分析，求得相对偏差。结果见表5 ，相对偏差在4 - 1 5 之 内，表明舒芬太尼血浆样品室温放置4 h 内可保持稳定。 1 5 舒芬太尼血浆样品经液液萃取处理后室温放置4 h 和2 4h 的稳定性：取0 0 2 0 ， 0 8 0 0n g m l 的q c 样品各3 份，经“血浆样品处理”项下操作后，室温放置4 h 、2 4 h 后复溶进样分析，求得相对偏差。结果见表6 、表7 。相对偏差在士1 5 之内，表明 舒芬太尼血浆样品预处理后在室温放置2 4 h 1 为可保持稳定。 舒芬太尼血浆样品冻融稳定性：取0 0 2 0 ，0 8 0 0n g m l 的q c 样品各3 份，于 2 0 冷冻2 4 h ，取出。待完全溶解后按本方法规定分析，反复冻融3 次，求得相对 偏差。结果见表8 ，相对偏差在4 - 1 5 之内，表明舒芬太尼血浆样品在3 次冻融循环 条件下可保持稳定。 舒芬太尼血浆样品长期稳定性：取0 0 2 0 ，0 8 0 0n g r m 的q c 样品各3 份，于 2 0 分别冷冻6 0 天后，取出。待完全溶解后按本方法规定分析，求得相对偏差。 结果见表9 ，相对偏差在4 - 1 5 之间，表明舒芬太尼血浆样品在2 0 条件下可保持 6 0 天稳定。 结果表明，舒芬太尼血浆样品室温放置4 h ，预处理后室温放置2 4 h ，经历3 次 冻融循环，2 0 条件下冷冻6 0 天均稳定，该测定人血浆中的舒芬太尼的分析方法 符合有关规范【l o 】要求。 表5 ，舒芬太尼血浆样品室温放置4 h 后的稳定性 加入的血浆浓度( n g m 1 ) 0 0 2 00 8 0 0 1 6 表6 ，舒芬太尼血浆样品预处理后室温放置4 h 后的稳定性 加入的血浆浓度( n g m 1 ) 0 0 2 0 0 8 0 0 表7 ，舒芬太尼血浆样品预处理后室温放置2 4 h 后的稳定性 塑旦丝垒鏊鉴鏖! 呈血! ! 0 0 2 00 8 0 0 表8 ，舒芬太尼血浆样品经过3 次冻融循环后的稳定性 测得血浆浓度 ( n g m 1 ) 加入的血浆浓度( n g m 1 ) 0 0 2 0 0 8 0 0 冷冻解冻第3 周期冷冻一解冻第3 周期 0 0 2 3 0 0 2 l 0 8 8 5 0 8 8 4 0 0 2 2 0 8 3 9 1 7 表9 ，舒芬太尼血浆样品经过2 0 冷冻6 0 天后的稳定性 加入的血浆浓度( n g m 1 ) 0 0 2 00 8 0 0 ( 五) 血浆样品的测定与质量控制 在血浆样品测定分析时，每天建立一条标准曲线，随行测定低、中、高3 个 浓度的质量控制( q c ) 样品，每一浓度进行双样本分析，q c 样品数不少于当日 测定未知样品总数的5 ，并均匀分布于未知样品测试顺序中。根据当日标准曲线， 求算q c 样品和未知样品的浓度。当q c 样品的高、中浓度点r s d 1 5 、r e 1 5 ， 低浓度点r s d 1 5 、r e _ 2 0 时，当日所测样品数据方可接受。 三、药动学研究 ( 一) 研究对象 1 、入选标准 ( 1 ) 择期行全麻下甲状腺部分切除术患者。 ( 2 ) 年龄2 5 6 0 岁，a s a 分级i i i 级。 ( 3 ) 体重指数在1 8 5 2 2 9 k g m 2 范围内或2 5 0 2 9 9 k g m 2 范围内。 ( 4 ) 健康：无精神病史、神经系统疾病史、心血管系统疾病史、肝。肾功能严 重异常，术前无哮喘病史。 ( 5 ) 无阿片类药物滥用史，术前没有长期使用镇静药及抑制细胞色素药物( 红 霉素、酮康唑、伊曲康唑等) 。 ( 6 ) 严格遵守赫尔辛基宣言的有关伦理准则，在试验开始之前，向受试者说 1 8 明试验的目的、方法，并获得受试者的书面知情同意书。 2 、入组对象 经中国医科大学伦理委员会授权同意，依据入选标准选取全麻手术患者1 8 例，受试者自然状况见表1 0 。按照体重指数将其分为两组：正常组1 8 5 2 2 9 k g m 2 ， 肥胖组2 5 2 9 9 k g m 2 ，两组病人的性别、年龄、a s a 分级等均无显著差异，详见 表1 1 。 表l o ，1 8 例受试者的自然状况 1 9 表1 1 ，两组病人的自然状况统计 ( 二) 给药方案 入室后开放静脉通道，麻醉前1 0m i n 肌肉注射长托宁1m g 。输注平衡盐液8 1 0m l k g 。麻醉诱导：两组病人分别顺次静脉注射咪达唑仑0 0 3 m g k g ，舒芬太 尼0 4 x g k g ( 注射时间3 0s ) ，罗库溴铵0 8 m g k g ，依托咪酯0 3 m g k g 。同时面 罩吸氧去氮，于静注舒芬太尼5m i n 后，顺利插入气管导管，连接麻醉机进行机 械通气，潮气量8 1 0m l k g ，呼吸频率1 2 次mi n 。气管插管3 m i n 内不再用任何 麻醉药物，并避免各种刺激。麻醉维持以七氟烷1 5 2 5m a c ，复合丙泊酚恒速 输注。同时监测b i s 使麻醉深度维持在4 5 5 5 范围内。从麻醉诱导至气管拔管时 间均在1 5 小时左右。 ( 三) 血样采集 受试者于静脉注射完舒芬太尼后的0 ，1 ，3 ，5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 5 ，6 0m i n 经静脉留置 针于非给药前臂，取静脉血1 2m l ，置肝素化试管中，5 0 0 0r p m 离心，分离血 浆，保存于2 0 。c 冰箱待测。整个采血过程在中国医科大学附属第一医院手术室进 行。试验期间有1 名临床医生，1 名麻醉师和2 名护士监护，时刻监测患者心率、 血压等生命指标，备有抢救设备。当患者术中失血大于5 0 0m l 或有其他危险因素 存在时立即终止实验，以保证受试者的安全。 ( 四) 数据处理 列出各受试者给药后各时间点血浆中舒芬太尼的药物浓度，并绘出血药浓度 时间曲线。应用d a s2 0 软件进行模型拟合，并根据非房室模型计算出每位受试 者的药代动力学参数，采用梯形法计算a u c o t 值和a u c o 。值，以半对数作图法， 2 0 由消除相的末端4 个浓度点计算l 【e 和t l 陀，t 。懈和c 。嗽采用实测值。采用s p s s l l 0 软件对正常体重组、肥胖组两组的主要药动学参数进行t 检验。 结果 一、舒芬太尼血药浓度数据及血药浓度时间曲线 两组受试者单次静脉注射舒芬太尼后，各个时刻血浆中舒芬太尼血药浓度见 表1 2 ，表1 3 ；对应血药浓度时间曲线分别见图4 ，图5 ； 二、房室模型拟合结果 1 8 例患者中，舒芬太尼药动学有1 4 例用三房室模型描述最佳，5 例用二房室模 型描述最佳。经分析，正常体重组患者9 例中有8 例用三房室模型拟合最佳，与文 献报道的一致；而肥胖组9 例中有5 例用二房室模型拟合最佳，文献未见相关报道。 患者模型拟合c t 分布趋势图分别见图6 ，图7 ； 三、药代动力学参数 两组受试者分别单次静脉注射舒芬太尼后，舒芬太尼的主要药动学参数见表 1 3 ，表1 4 。两组的平均药时曲线见图8 。 应用s p s s l l 0 软件对两组受试者的主要药动学参数进行t 检验，见表1 5 。 表1 l ，正常患者单次静脉注射舒芬太尼后的血浆药物浓度( n 咖l ) 受试者采血时间 编号 也i 堂 no0l351 02 03 04 56 0 n d ：浓度低于定量下限 2 1 表1 2 ，肥胖患者单次静脉注射舒芬太尼后的血浆药物浓度( n g m l ) 3 o 瑙 蠖 n d ：浓度低于定量下限 o l o 2 03 04 05 06 0 7 0 时间( m i n ) 图4 ，9 名体重正常患者单次静脉注射舒芬太尼后血浆中舒芬太尼的药物浓度 一时间曲线 o2 0 4 06 08 0 时间( m i n ) 图5 ，9 名肥胖患者单次静脉注射舒芬太尼后血浆中舒芬太尼的药物浓度一时 间曲线 o 9 0 8 0 7 o0 6 詈0 5 运0 4 袋0 3 o 2 o 1 o c - t ( n 0 2 ) 0 1 02 03 04 05 06 07 0 时间“i n ) 1 2 l 0 8 i = 0 30 6