（微生物学专业论文）红曲色素合成机理及红曲霉混合培养的初步研究.pdf

摘要 本文围绕红曲色素的生物合成机理和混合培养对色素生物合成的影响进行 研究。 首先，采用刺激实验和静息细胞培养实验法来确定红曲色素的合成前体。 考察了不同氨基酸和脂肪酸等对抗生素合成的影响，结果表明甘氨酸 ( 5 m m o l l 。1 ) 、缬氨酸( 2 m m o l l - 1 ) 、异亮氨酸( 2 r e t o o l l 。) 、蛋氨酸( 1 m m 0 1 l o ) 、 谷氨酸( 2 m m o l l 。) 、精氨酸( 1 m m o l l 。) 以及乙酸( 2 m m o l l o ) 、丙酸( 3 m n a 0 1 l 1 ) 等能够最大的刺激色素的生产，具有前体的作用。而且这些前体物质都具有转 化为聚酮合成前体的共同特征。所以聚酮途径被认为是红曲色素合成的主要途 径。 为了证明红曲色素由聚酮合成，考察不同代谢途径的抑制剂对红曲色素合 成的影响，结果表明莽草酸途径的抑制剂三甲胺( 1 5 r e t o o l l 1 ) 和甲羟戊酸途 径的抑制剂邻氨基苯甲酸( 1 5 r e t o o l - l 。) 及3 , 4 二羟苯甲酸( 2 1 m m o l - l 。) ，对 红曲色素的生物合成以及菌体生长没有影响：而许多聚酮合成关键酶的抑制剂 对红曲色素的生物合成具有强烈的抑制作用，如t 3 一酮酯酰a c p 合成酶专一胜 抑制剂碘乙酰胺、咪唑、硫酯酶抑制剂2 , 4 一二硝基氟苯、甲基丙二酰异构酶的 抑制剂c u 2 + 和z n 2 + 。其中碘乙酰胺的浓度为1 m m o l - l 、眯唑浓度为l m m o l - l 一、 2 , 4 一二硝基氟苯浓度为2 m m o l l 、c u 2 + 浓度为4 m m o l l 一、z n 2 + 浓度为1 0 m r n o l l 1 时就已经完全抑制红曲色素合成。从而从正反两面都证明了红曲色素由聚酮途 径合成。甲基转移酶抑制剂磺胺( 2 0 0 r a g l 。1 ) 对色素合成以及菌体生长没有影 响，表明红曲色素中的甲基并非由甲基转移酶合成。 研究了红曲霉与酵母菌和乳酸菌混合培养，由于酵母菌和乳酸菌生长迅速 消耗了大量的营养物质，不利于红曲霉的生长和色素的分泌。但酵母菌和乳酸 菌的代谢产物能促进红曲色素的合成。 关键词：红曲色素生物合成聚酮途径 混合培养 a b s t r a c t t h eb i o s y n t h e s i sm e c h a n i s mo fm o n a s c u sp i g m e n ta n de f f e c to fm i x - c u l t u r eo n p i g m e n tb i o s y n t h e s i sw e r es t u d i e di n t h i sd i s s e r t a t i o n f i r s t ，f e e d i n ge x p e r i m e n t a n dr e s t i n gc e l l s y s t e mw e r eu s e d t oc o n f i r m p r e c u r s o r so fp i g m e n t s t h ee f f e c t so fd i f f e r e n ta m i n oa c i d sa n db r a n c h e df a t t ya c i d s o np i g m e n t sp r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h o s ea m i n oa c i d s a n db r a n c h e df a t t ya c i d s s u c hg l y c i n e ( 5 m m o l l 。) 、v a l i n e ( 2 m m o l l “) 、i s o l e u c i n e ( 2 r e t o o l l 一1 ) 、m e t h i o n i n e ( h n m o ll 。) 、g l u t a m i n e ( 2 m m o l l 。) 、a r g i n i n e ( 1 m m o l 、l 。) 、a c e t a t e ( 2 m m o l l 。) 、p r o p i o n a t e ( 3 m m o l l “) c o u l d a c ta s p r e c u r s o r s a n dm o s t l ys t i m u l a t ep i g m e n t sb i o s y n t h e s i s b e s i d e s ，a l lo ft h e s ec o m p o u n d sc o u l d b et r a n s f o r m e dt ot h ep r e c u r s o r so fp o l y k e t i d eb i o s y n t h e s i s s ot h ep l o y k e t i d e p a t h w a yw a sp r e s u m e dt ob et h em a i nb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f m o n a s c u sp i g m e n t s i no r d e rt ot e s t i f yt h eh y p o t h e s i sa b o v e ，i n f l u e n c e so fd i f f e r e n tm e t a b o l i c p a t h w a y s i n h i b i t o r so nm o n a s c u sp i g m e n tb i o s y n t h e s i s w e r ee x a m i n e da n dt h e f o l l o w i n gr e s u l t sw e r eo b t a i n e d i n h i b i t o ro fs h i k i m i ca c i dp a t h w a y s t r i m e t k l y l a m i n e o ri n h i b i t o r so fm e v a l o n i ca c i dp a t h w a y s a n t h r a n i l i ca c i da n d3 , 4 一d i h y d r o x y b e n z o i c a c i dh a dn oe f f e c t so np i g m e n tb i o s y n t h e s i s w h e r e a s p i g m e n tb i o s y n t h e s i sw a s s e v e r e l yi n h i b i t e db yi n h i b i t o r so ft h ek e ye n z y m e s i nt h ep o l y k e t i d ep a t h w a y s ，s u c h a st h es p e c i f i ci n h i b i t o r so fd k e t o a c y l a c y l c a r r i e rp r o t e i ns y n t h a s e i o d i a c e t a m i d e o ri m i d a z o l e ，t h e t h i o e s t e r a s e i n h i b i t o r - 2 , 4 一d i n i t r o f l u o r o b e n z e n e ， m e t h y l m a l o n y l c o ai s o m e r a s ec u 2 + ，z n 2 + b e s i d e s ，p i g m e n tb i o s y n t h e s i s w a s t o t a l l yi n h i b i t e dw h e na d d e d l m m o l l i o d i a c e t a m i d e ，l m m o l l - 1i m i d a z o l e ， 2 m m 0 1 l 12 ，4 d i n i t r o f l u o r o b e n z e n e ，4 n u n o l - l 一1c u 2 + ，l o m m o l - l 1 z n 2 + p o l y k e t i d e p a t h w a yw a st h e r e f o r ec o n f i r m e da st h em a i nb i o s y n t h e t i cp a t h w a y so fm o n a s c u s p i g m e n t i th a dn o e f f e c t so n p i g m e n tb i o s y n t h e s i s w h e na d d e d2 0 0 m g l _ 。 s u l p h a n i l a m i d e b e c a u s et h eg r o w t ho fl a c t i ca c i db a c t e r i aa n ds a c c h a r o m y c e sw e r et k s t e rt h a n m o n a s c u s ，t h e yq u i c k l yc o n s u m e dl o t s o fn u t r i e n ts u b s t a n c e m i x e dc u l t u r ei s a d v e r s et om o n a s c u sg r o w t ha n dp i g m e n t e x c r e t i o n b u tt h em e t a b o l i cp r o d u c t so f t h e ma r eg o o df o rp i g m e n te x c r e t i o n k e yw o r d s ：m o n a s c u sp i g m e n t b i o s y n t h e s i sp o l y k e t i d ep a t h w a y m i x e d c l l 】t h r e i l 缩略词 英文全名中文名 u l t r a v i o l e t紫外线 e t h y lm e t h a n es u l p h o n a t e 甲基磺酸乙酯 g l y c i n e 甘氨酸 g l u t a m i ca c i d 谷氨酸 i s o l e u c i n e异亮氨酸 v a l i n e缬氨酸 a r g i n i n e 精氨酸 m e t h i o n i n e 蛋氨酸 d a y 天 v i t a m i nd 2维生素d 2 h o u r小时 m i n u t e分钟 v i t a m i n c维生素c j i s 。 2 猖叫嗍嘶m趣d喜|h蓍w 独创性声明 本人声明所暑交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除r 文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包台其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在沦文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研冗生签名： 筮重 时间：2 0 0 6 年6 月7 同 关于论文使用授权的说明 奉人完全了解安徽农业大学有关保倒、使用学位论文的规定，即：学校有权保 耐送交论文的复日j 件和磁蒲，允订论文被查阅和借阅，叮以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意安教农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密爵应遵守此协议1 研究生签名： 塞雷 时间：2 0 0 6 年6 月7 1 第导师签名 厉舻移 时问：2 吨彩年月7 日 文献综述 1 1 红曲霉的研究历史 红曲霉( m o n a s c u s ) 属于真菌界( f u 树) 子囊菌门( a s c o m y c e l e s ) 彳；整子囊菌 纲( p l e c t o m y c e t e s ) 散囊菌目( e u r o t i a l e s ) 红曲科( v o n a s c a c e a e ) 红曲霉属( m o n a s c u s ) 川。m o n a s c u s 是1 8 8 4 年v a nt i e g h e n 由在马铃薯培养基上分离的2 株真菌而建立的 属，其字意为单子囊菌。但陔名称定的不确切，因为被子器( 予囊壳) 内含多个子囊。 成熟后子囊壁解体，子囊孢子就留在被子器中，误认为只有一个子囊，敞名为 m o n a s c u s 。我国译名是根据用途而定为红曲霉菌【2 】。红曲，是以大米为主要原料，经 红曲霉( m o n a s c u ss p p 。) 发酵而制成的一种米曲，其色赤红，故又名赤曲或红米， 在福建又口q 福曲。 红曲霉在欧洲一度被视为腐败菌，但在东亚地区，红曲霉却是传统食品加工的神 奇微生物【3 】。作为东方国家的一种重要“霉”，它在中国被发现和利用，已有上于年 的历史，有考证可上溯至汉代【4 5 。在浩瀚的中国历史书籍中，我们祖先大量记录了 红曲在酿酒、发酵食品、食品色素、中药等方面的广泛应用。汉末诗赋七释有“瓜 州红曲，参糅相半，软滑膏润，入口流散”的记载，证明当时已经有红曲，并用它做 红饭或腐乳了。红曲的药用记载当数元代吴瑞撰写的同用本草一书：“红曲酿酒， 破血行药势，杀山岚瘴气，治打扑伤损”。其后的药书如饮善难要、本草衍义补 遗、本草备要、本草纲目等都有关于红曲药效的记载。我国近年出版的中药 大辞典对红曲的功能有长达3 2 字的叙述，将红曲功能概括为“活血化瘀，健脾消 食，治产后恶露不净，瘀滞腹痛，食积饱胀，赤白下痢及跌打损伤”。现在科学发现 了红曲中的许多代谢物，尤其是m o n a c o l i nk ，是胆固醇合成代谢途径中的一种酶抑 制剂，从而科学上揭示了红曲的许多药用功能。 1 2 红曲霉的特征 1 2 1 营养菌丝结构 红曲霉为腐生真菌，菌丝有分隔，分枝繁多且不规律，多核和多油滴。细胞幼时 含有颗粒，老后含空泡及油滴。菌丝体不产生与营养菌丝有区别的分生孢子梗，分生 孢子首先在菌丝及其分枝顶端，单生或以基式生出，2 “个成链，属于内生型分生孢 子( e n d o t h a l l i cc o n i d i u m ) ，且由上而下逐渐成熟，闭囊壳呈球形，有柄，柄长短不一。 壳内多散生十多个子囊，子囊呈球形，含有8 个子囊孢子，成熟后子囊解体，孢子留 在薄壁的子囊壳内。 1 2 2 生活史 红曲霉具有无性世代和有性世代。无性生殖时，由菌丝生出分生孢子梗，在菌丝 或其分枝的顶端直接生出分生孢子，分生孢子单生或以基式生出，2 6 个呈链状排列。 分生孢予大多呈梨形，多核，可萌发成菌丝。有性生殖时，菌丝顶端或侧枝顶端首先 形成一个多核的单细胞雄器( a n t h e r i l d i u m ) ，随后在雄器上面的细胞又以单轴方式生 出一个细胞，这个细胞就是原始的雌性器官，即产囊器( a s c o g o n i u m ) 的莳身。雌性 器官的生长和发育向下推压雄器，使雄器与柄托呈一定的角度。这时雌性器官在顶端 又产生一层隔膜，分成两个细胞，顶端的细胞为受精丝，另一个为产囊器( 都含多个 细胞核) 。当受精丝顶端与雄器接触后，接触点的细胞壁解体产生一个小孔。雄器内 的细胞质和核通过受精丝进入产囊器内质配，细胞核成对排列。与此同时，在两性器 官下面生出许多菌丝将产囊器包围，形成初期的闭囊壳。壳内产囊器膨大，并长出许 多菌丝。每个产囊器形成许多双核细胞，此时发生核配，经过核配的细胞b 口子囊母细 胞，每个子囊母细胞的核经过3 次分裂，形成8 个核，每个核发育成一个单核的子囊 孢予。这时闭囊壳已经发育成熟，子囊壁消解。子囊孢子成堆留在壳内，似乎其中只 有一个子囊。闭囊壳破裂后散出子囊孢子，子囊孢子萌发后又形成多核菌丝 6 1 。 12 3 生物学特征 红曲霉嗜酸，尤嗜乳酸，耐高温、耐乙醇。在很多地方，如谷物、淀粉、新鲜牧 草、泥土、橡胶、鱼干、河川表面沉积物及松树根组织中都曾发现红曲霉属的踪迹。 红曲霉的生长温度范围很广，一般温度为1 5 一- 4 2 ，最适温度为2 5 3 0 ；生长的最 适p h 为3 5 5 ，能耐p h 2 5 ，能耐1 0 乙醇；能以淀粉、糊精、棉子糖、麦芽糖、密 二糖、纤维二糖、草糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、l 阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、乙 醇、甘油、乳酸、苹果酸、琥珀酸、延胡索酸、柠檬酸等为碳源；能利用硝态氮、氨 态氮和有机态氮；能合成生物素、泛酸、尼克酸、对氨基苯甲酸、肌醇、吡哆醇、硫 胺素、核黄素等；还能产生色素、乙醇、琥珀酸及少量乳酸、醋酸、杂醇油、丙酮、 葡萄糖酸、3 羟基丙酮、柠檬酸、麦角醇、抗菌素、桔霉素、洛伐他汀等【”。不同菌 株在不同培养基中具有不同的形态。大多数菌株在麦芽汁琼脂上生长良好，菌落初为 白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色，因种而异。菌落有的呈绒毡状，有的呈 皮膜状。表1 1 列出了常用红曲霉的生物学性质1 2 】 2 表1 i 常用红曲霉的生物学性质 主竺! 幽：! 望! ! ! 鲤型p ：! e ! 皿2 11 1 1 11 巴! ! ! ! ! 出 丝巳型缫型 型! ! ! 笙一型婴丝 丝旦! 堑燮 生氏形态( 麦芽菌丝初为闩色逐菌丝初为白色逐曲丝初为白色逐菌丝初为内色逐 汁斜面)渐变为紫红直径渐变为橙色，寅渐变为鲜红，直渐变为浅粉，直 3 - 6 u r n 苗落丝绒径3 - 6 u r n 菌落毡径3 - 5 m ；q 茵落隆径3 - 5 u r n 表面覆 状，有自色稀疏状，表面有辐射起晕疮疤状不生盖一层厚莉岛色 气生菌丝背面有纹。 气生卤丝具有辐絮状气生曲丝。 辐射纹。 射纹。 分生孢于白顶端连续分自顶端连续分2 - 3 个成链，卵形2 - 3 个成琏，倒梨 生，单生或成链，生，成链，球形或梨形。形或球形。 梨形或球形。或倒梨形。 子囊孢子椭圆形，光滑，椭圆形，光滑， 椭圆形，光滑，椭圆形，透明无 无色碱淡红色。榜色至褐色。白色。色。 生长温度 2 5 3 01 ；，3 8 i 停2 8 3 5 t ， 3 3 ，3 51 i 12 8 。3 3 f i e 生跃 1 3 红曲霉产生的次级代谢产物之红曲色素 l _ 3 1 红曲色素的应用现状及其理化性质 在中国、r 本与欧美，关于红曲色素生产的研究文献与专利甚多。目前在我国， 红曲色素产品大略有两类，传统的产品红曲米提取物和深层发酵红曲菌提取物红曲 红，各有其固家标准为：食品添加剂红曲米国标g b 4 9 2 6 8 5 ，食品添加剂纨曲红国 标g b l 5 9 6 1 1 9 9 5 。用于红曲色素生产的更为廉价的原料也逐渐被开发出来，目前见 于报道的除了大米外，有利用刺梨水果汁( 法国) 、木薯淀粉( 泰国) 、甘蔗渣( 香港) 、 牛奶乳清滤剩物、( 保加利亚) 、仙人球汁( 突尼斯) 、大豆浸泡液( 印度尼西距) 、全 麦粉、( 英国) 等。 红曲色素是红曲霉在生长过程中产生的一系列色素的总称，它是世界上目f i 仅有 的利用微生物生产的食用天然色素，长期以来作为食品着色剂和香料使用。与已知的 其它天然色素相比，红曲色素具有很多优点：稳定性好，在p h 2 9 的范围内都能保持 稳定；耐热性较强，其乙醇溶液在1 0 0 。c j i 热1 5 h 或1 2 0 。c 加热0 5 h 色素保存率在9 2 以上；其醇溶液对紫外线相当稳定：几乎不受金属离子如钙、镁、铁、铜等离子的影 响；几乎不受0 1 的过氧化氢、v c 、亚硫酸钠等还原剂的影响：对蛋白质的着色性 能好等。 1 3 2 红曲色素的化学结构 红曲色素已被确定出的j 。为人知的化学结构有6 种，其化学结构式如图1 】所示， 可分为3 类，即红色素m o n a s c o r u b r a m i n e 与r u b r o p u n c t a m i n e ，橙色素m o n a s c o r u b i n 与r u b r o p u n c t a t i n 及黄色素a n k a f l a v i n 与m o n a s c i n 【l ”，这些色素是属于a _ z a p h i l o n e s 类的真菌代谢物，构造极为类似。1 9 9 2 年同本【l ”又从m a n k a 的突变株中分离出另 种天然黄色素，并对其结构进行了测定，认为具有一种新的碳骨架，命名为 x a n t h o m o n a s c i na o 。1 9 9 3 年郭东川等人【 副分离到了两种新的红曲色素，分子式为 c 2 5 h 3 1 0 5 ，和c 2 3 h 2 7 0 5 ，但尚未命名，且结构式待定。 c 2 2 h 2 1 0 5 ( i ) 潘红素 c 2 2 h 2 6 0 5 ( i i i ) 红 | 素 红乜邑录 睛色也索 c 憾- h ，t ：n 、 叫 1 0 c 2 s h 2 6 0 5 ( 1 1 ) 红曲红素 c 2 3 h 3 0 0 5 ( i ：v ) 红捕黄素 黻幽邸coc,h1 c 2 1 h 2 n 0 4 ( v )c 2 3 h 2 7 n o d ( v i ) 潘红胺红曲 图l 1 红曲色素6 种成分的结构式 f i g i 1s t r u c t u r a lf o r m u t ao fs i xm o n a s c u sp i g m e n t 1 3 3 红曲色素的生理功能 最近几年，国内外开始对红曲色素的生理功能进行了探讨并取得了一定的进展。 日本i z a w a 、s a t o k o 等人研究从 a n k a ，l d p u r p u r e u s 中制备的红、黄色素中，发现了 它们具有抑制突变的作用，初步推测是红曲色素能使突变剂的分解作用加速的缘故 d 9 1 。保加利亚k u j u m d z i e v a ，a n n av 等人口0 1 在用乳品工业的废弃物作为基础的培养基 上培养一株紫色红曲霉，结果发现产生的色素制品具有抗氧化的特征。暨南大学傅亮 1 2 1 1 认为红曲色素是红曲霉的一种能量贮存物质，同时又是一种氮源捕获剂。 1 3 4 红曲色素的分析测定方法 关于红曲色素的检测计量，一般以单位重量或单位体积内含的红色紊单位来表 示，习惯上称为色价。由于用固态发酵法生产的红曲色素一般不溶于水，分析方法是 用乙醇溶液溶解稀释，用分光光度计测定光密度，计算成色价。由于乙醇自q 浓度、使 用的波长以及溶液的p h 值均影响测定值，而且单独的红色波长区的测定值也不能反 应色素的全貌，因此，张永权弘l j 等人对红曲色素的色价和色调的分析方法进行了探讨， 确定了测定时的p h 为5 8 6 0 ，乙醇浓度为8 0 ，并将黄色价和红色价合起来称为色 素的总色价。目前此法已成为红曲色素测定的经典方法。方元样等1 3 2 】认为红曲中的红 曲色素有部分是可溶于水的，称水溶性色素，有一部分是可溶于醇的，称醇溶性色 素；测定时用水溶解则测定的水溶性色素的色价，用醇溶解则测定出醇溶性色价；用 此法可将红曲中的水溶性色素和醇溶性色素分别表示出来。 红曲色素中各种组分的分离一般采用薄层层析法【8 ”。以硅胶g f 2 5 4 为固定相， 以乙醚：苯：乙醇：水( 2 0 ：2 2 ：4 0 ：1 5 ) 为展开剂，可以分离出7 个斑点，其中1 个黄色斑点， 1 个具有荧光性质的无色斑点，和5 个红色斑点；也可以先用硅胶柱层析分离后再用 薄层层析法鉴定 3 4 】。 1 4 红曲霉产生的次级代谢产物之m o n a c o l i n s 物质 1 4 1m o n a c o l i nk 的结构和理化性质 m o n a c o l i nk 即洛伐他汀，英文名称为l o a s t a f i n 、m e v i n c l i n 等，是临床上一种重 要的降血浆胆固醇的药物，主要结构为氢化萘母核、d 羟一6 内酯环和2 甲基丁酸侧链。 m o n a c o l i nk 在常态下是透明的针状结晶，难溶于水，不溶于汽油、醚、正己烷中， 易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿和乙酸乙酯等有机溶剂。分子式以c 2 5 h 3 5 0 5 ( 内酯型) ， 分子量5 9 6 。在2 3 1 、2 3 7 、2 4 6 n m 处有紫外吸收峰，典型的红外吸收峰位于3 5 5 0 、 2 9 7 0 、1 6 9 0 n r n 处，熔点为1 7 4 5 v i i 4 9 】；在酸性条件下有酸型和内酯型两种形态，处于 一种相互转化的动态平衡中，见图1 3 。 1 4 2m o n a c o l i nk 的生物活性和作用机制 m o n a c o l i n s 的活性中心可能是分子中的6 一内酯基团，将c o m p a c t i n 的c 】3 或c 1 1 中任何一个羟基酰化后，活性就下降到1 1 0 0 0 或更低：将c o m p a c t i n 或m o n a c o l i n k 的c l i 羟基磷酯化后，活性分别下降到1 1 0 和1 2 0 ，这也支持这种观点1 5 0 。分子中 的亲脂基团。瑾甲基丁酰基和取代六氢萘环对活性的强度影响很大。 缺少o l 甲基丁酰基的同系物m l 2 3 6 a 和m o n a c o l i nj 分别只有c o m p a c t i n 和 m o n a c o l i n k 活性的1 2 5 。c o m p a c t i n 活性比h m g ( 3 - 羟基一3 一甲基戊二酸) 大1 0 6 倍【盟1 ， 表明六氢萘环是和活性有关的重要构造，在六氢蔡环的c 6 上具有甲基的m o n a c o l i n k 的活性约为c o m p a c t i n 的2 倍，而d i h y d r o c o m p a c t i n 和d i h y d r o l o v a s t a t i n 活性分别 与c o m p a c t i n 和m o n a c o l i n k 相当。m o n a c o l i n s 物质的相对生物活性详见图1 2 。 r -硒相对活性 v l l - 2 3 6 aho h 2 c c o m p a c 6 t i ：ni ，h 。人一，)。7 v 、 m l - 2 3 6 c m o n a c o l i nj h h 3 m o n a c o l nk c h h o h 1 0 五 1 0 0 m o n a c o l i n lc岛h1 5 m o n a c o l l nm c h 3 o0 m o n a c 。岫x c h ， 人八 o d i h y d r o c o m p a c t i n h d 吣d r o o v a s t a t i n c h 3 o 。h 0 d 让l y d r o m o n o h nlch，h 1 0 0 _ - _ _ _ _ - _ - _ - _ 。“_ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ 。“。h _ _ - _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ - - _ u - j _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 1 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ - _ u _ _ u _ _ 1 一一 图1 2m o n a c o l i n s 物质的结构和相对活性 f i 9 1 2 s t r u c t u r a lf o r m u l aa n dr e l a t i v ea c t i v i t yo f m o n a c o l i n s 6 从 从 内醣型 圜1 3m o n a c o l i nk 两种形态的动态平衡 f i g l3d y n a m i cb a l a n c eo f t w os t r u c t u r a lf o r m u l ao f m o n a c o l i nk 1 4 3m o n a c o l i nk 的作用机制 临床学、流行病学和病理学的研究表明，在人类的冠心病和动脉粥样硬化的形成 和演变过程中，高胆固醇血症是主要原因。血浆中胆固醇主要存在于低密度脂蛋白 ( l d l ) d d ，美国国家胆固醇教育计划( n c e p ) 己肯定低密度脂蛋白胆固醇( l d l c ) 是主 要的致动脉粥样硬化脂蛋白，并与冠心病直接相关 5 3 1 。人体内的胆固醇7 0 以上是 在体内从头开始合成的，其中5 0 是在肝脏内合成的，抑制肝脏中内源性胆固醇的 生成就可以降低血浆胆固醇水平。 体内胆固醇合成的途径已经阐明1 5 4 】：从乙酰辅酶a 开始，由弪甲基戊二酰辅酶 a 合成酶生成h m g c o a ，再由羟甲基戊二酰辅酶a 还原酶还原成甲羟戊酸，再磷酸 化生成焦磷酸法昵酯后还原成鳖烯，再经羊毛甾醇，链甾醇等共二十多个步骤生成胆 固醇。其中从h m g c o a 经羟甲基戊二酰辅酶a 还原酶生成甲羟戊酸是胆固醇合成 的限速反应，h m g c o a 还原酶是限速酶。因此只要抑制羟甲基戊二酰辅酶a 还原酶 的活性就可以减少内源性胆固醇的形成。 1 4 。4m o n a c o l i n s 的生物合成机理 j e a n k c h a n “】等用标记的前体物质通过核磁共振研究了m o n a c o l i nk 中碳、氮、 氧原子的来源。他们的研究表明m o n a c o l i nk 的母核出九个完整的乙酸单位形成一个 十八碳聚酮体链，再经环化后形成的。c 6 位的甲基来源于甲硫氨酸，其侧链c 【一甲基 丁酰基也是由二个乙酸单位缩合而形成，一甲基也来源于甲硫氨酸。甲基化是按顺序 进行的，6 c 原子先被甲基化，在环封闭之前完成。甲基化需要在完全保持氢原子 的情况下j 能噘利进行。 r n m o o r 6 3 , 6 4 等用核磁共振和质谱相结合的方法证明m o n a c o l i nk 由2 个聚酮体 链构成：一个是9 个乙酸单位首尾相连而形成的十八碳链，另一个是2 个乙酸单位形 成的四碳侧链，余下的2 个甲基来自于甲硫氨酸，通过对c ，h 、c 0 键形成的研究表 明m o n a c o l i nk 合成与脂肪酸合成十分相似。他们推测m o n a c o l i nk 是通过与脂肪酸 合成途径十分相似的途径合成的：先形成聚酮体链，再经过氧化还原后形成母核结构， 再连接上0 c 甲基丁酸侧链后形成的。构型与旺一甲幕丁酸侧链相似的异亮氨酸不能结合 上去。他们用“0 2 进行发酵研究表明c 1 1 、c 一1 3 、c 一1 5 和侧链c 1 的氧原子直接来 自于乙酸，只有c - 8 位的氧原子来源于0 2 他们推测m o n a c o l i nk 合成途径如图1 4 所示。乙酸单位通过m o n a c o l i nk 合成酶的作用首先形成c 1 8 聚酮体，然后通过酶 催化的d i e l d s a l d e r 反应形成双环 结构，c 一1 l ，c 一1 3 、c - 1 5 位的氧直接来自乙酸，在f 一个c 2 单位缩合上以前只被还 原到经基形式，最后化合物2 从m o n a c o l i n k 合成酶复合体上解离出来。 2 4a ，5 黻蛔r o m o n 踮o l 弧l 图1 4m o n a c o l i nk 可能的合成途径 l l v l o n a c o l l nk f i g1 4p o s s i b l es y n t h e t i cp r o c e s so fm o n a c o l i nk 1 5 红曲霉产生的其它生理活性代谢产物 1 5 1 酶类活性物质 酶类物质是红曲霉早期研究中的一个热点。现己明确红曲霉能产生多种酶类，主 要有淀粉酶、糖化酶、糊精化酶、蛋白酶、果胶酶、梭肤酶等，不同菌株产酶的类型 及产量会有差异，一般来说产液化酶的活性较弱，而糖化酶的活性较强。据文献报道 8 1 】，红曲霉属的某些菌株能分泌直接催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的胞外酶。赵华等 f 8 2 1 通过紫外线诱变成功地选育到一株己酸乙酯高产菌m 5 0 3 5 1 3 。 善。 1 5 2 脂肪酸 日本学者的研究表明红曲霉培养物主要含有的脂肪酸是c 1 8 ：1 ，c 1 8 ：2 ，c 1 6 ：0 ， c 1 8 ：0 ，c 1 6 ：1 ，认为不同红曲霉菌株产生的脂肪酸成分有很高的相似性8 3 1 。宋洪涛【8 4 l 采用了气相色谱进行分析，结果表明不饱和脂肪酸含量达6 4 7 7 ，多烯不饱和脂 肪酸含量达1 6 一2 7 。经过活性测定认为它们可能有增强m o n a c o l i n s 分解甘油三酯， 降低极低密度脂蛋白胆固醇的功能。德舀学者l b 5 】发现m p u r p u r e u s 能将短链脂肪酸转 变为甲基酮，并对其代谢途径进行了初步探讨。 1 5 3 降血压物质 日本国立健康研究所在进行饲料添加“红曲培养物”的动物试验中，发现添加 0 2 0 3 “红曲培养物”的饲料可使患有高血压症老鼠的血压由超过2 0 0 m m h g 降 至1 8 0 m m h g 以下，其有效成分为丫- 氨基丁酸( g a b a ) 及g l u c o s a m i n e ( 或红曲霉的其 他细胞壁成分) 。试验证明【86 j 红曲降血压成分具有较强的耐热性，而且为水溶性及醇 溶性的，不溶于v 一丁醇及醋酸乙酯等溶剂。红曲的降压作用和菌体的含量多少有关， 因此测定与菌体量相关的氨基葡萄糖指标便能推断其降压效果。另据研究，红曲还可 以作血压升高剂，对血压有双重控制作用，对循环系统疾病有预防作用。现在，不少 研究者已开始对y 氨基丁酸进行深入的研究，希望能找到一种新的可治疗人类高m 压的药物，以造福于人类。 1 5 4 降血糖物顾 远滕章教授曾直接以红曲霉的培养物作饲料进行动物试验，除确定含有红曲培养 物的饲料可有效地使兔子的血清胆固醇降低1 8 0 一2 5 0 之外，又意外的发现所有的 试验兔子在进食饲料之后的半小时内血糖降低2 3 3 3 ，而在1 小时质的血糖量仍 比对照组下降了1 9 2 9 ，其有效成分目前未明。 1 5 , 5 麦角固醇 麦角固醇是v d 2 的前体，而且还是生产“考的松”、黄体酮的原料。另外，麦 角固醇可与胆固醇竞争肠道中的吸收部位，从而减少外源性胆固醇的吸收。陈松生等 【8 7 1 发现红曲霉属中的许多菌株都能不同程度地产生麦角固醇。麦角固醇的含量与色素 形成量不成正比，有的菌株产量高达2 以上，接近目前工业生产的酵母水平。 1 引言 1 1 研究目的和意义 研究色素生物合成机理不仅可以指导色素高产菌株的选育，还具有以f 作用： ( 1 ) 为进一步从分子水平上研究红曲色素生物合成酶的相关基因的结构与功能、 研究与该色素合成相关的小分子物质所起的前体作用或其在信号传导途径亡卢的诱导 作用奠定基础。 ( 2 ) l h 于红曲霉还产生其它很多对人类有价值的次级代谢产物血h m o n a c o l i nk ，研 究红曲色素的生物合成和调控机理，可以了解红曲霉的细胞生理生化特性，对弄清其 它物质的代谢过程及合成机理也具有十分重要的作用。 ( 3 ) 为目日口红曲色素发酵工艺条件的优化提供参考。 1 2 国内外研究现状 目前工业上已经可以对红曲色素进行大规模的发酵生产，但发酵色价并不是很高， 国内外的研究主要集中在选育高产菌株和优化发酵工艺，对色素的合成机理并不清 楚。根据红曲色素的结构推测其很可能为聚酮类化合物。聚酮类化合物生物合成的基 本过程是由低级脂肪酸( 乙酸，丙酸，丁酸等) 进经活化后，以丙二酰，丙酰或甲基 丙二酰辅酶a 的形式由酰基携带蛋白( a c p ) 介导，经聚酮缩合酶将碳链不断延长， 最后由硫脂酶催化进行碳链的环化形成聚酮体内酯。在碳链的延长过程中可伴随着还 原，脱水等反应导致聚酮体内酯环中酮基或烯键的形成，聚酮体内酯环形成后再进行 配糖体的糖营化或糖分子c 位上的酰基化等不同的修饰。 1 3 研究内容和方法 目前通过结构鉴定，已经获得色素的化学结构，借鉴微生物其它次级代谢产物合 成机理的研究方法，我们试图从以下几个方面进行色素合成机理及调控机制的研究： ( 1 ) 进行不同类型前体的刺激实验，根据这些物质对红曲色素合成的影响确定色 素合成的前提物质。 ( 2 ) 进行添加各种抑制剂实验，确定红曲色素的生物合成途径。 ( 3 ) 诱变筛选阻断突变株，进行共合成能力实验，得到红曲色素合成较详细的步 骤和了解阻断突变株所积累的一些中间代谢，便于以后分离提取。 ( 4 ) 研究红曲霉与酵母菌和乳酸菌混合培养对色素合成的影响，为发酵工艺提供 参考。 显然，阐明红曲色素生物合成和调控机理是长期的、复杂的研究过程，往往需要 反复实验。生物合成和调控机理j 提高色素产率两者间具有相辅相成的关系，若能在 任一方面取得重要研究成果，都将推动另一方面的研究进展。本论文希望通过上述的 研究，阐明红曲色素生物合成和调控的一些机理，为菌种的推理选育和发酹工艺优化 提高产率奠定理论基础。然后，通过产率的提高反过来再推动色素的生物合成机理的 研究，从分子水平t 继续研究色素生物合成酶的相关基因的结构与功能、研究与该色 索合成相关的小分子物质所起的前体作用或其在信号传导途径中的诱导作用，最终为 实现通过色素的代谢_ 亡程改造生物合成途径开辟新途径提供试验基础。 2 材料方法 2 1 菌种 红曲霉菌株m 5 0 3 4 ( m o n a s c u sa n k a ) ( 中国工业微生物菌种保藏中心) 2 2 试剂 试剂纯度生产单位 碘乙酰胺分析纯北京化学试剂公司 三甲胺醇溶液 化学纯 中国医药集团上海化学试剂公司 咪哗 乏9 9 天津化学试剂公司 3 , 4 一二羟苯甲酸化学纯 中国医药集团上海化学试剂公司 邻氨基苯甲酸分析纯 北京西沽化工厂 2 ，4 二硝基氟苯分析纯中国医药集团上海化学试剂公司 磺胺 分析纯天津市光复精细化工研究所 乙酸分析纯广西汕头市西陇化工厂 丙酸分析纯 广西汕头市西陇化工厂 1 8 种不同氨基酸和一些氨基酸中间体。 2 3 培养基及培养条件 2 3 1 麦芽汁琼脂斜面培养基 葡萄糖1 ，酵母膏o 3 ，麦芽浸膏o ：3 ，蛋白胨o 5 ，琼脂2 ，p h 6 4 ，o 1 m p a 灭菌2 0 m i n 。 2 3 2 种子培养基及培养条件 种子培养基成分与斜面培养基相同，不加琼脂，p h 6 4 ，5 0 0 m l 三角瓶分装7 5 m l ， 0 1 m p a 灭菌2 0 m i n 。用1 0 m l 无菌水从麦芽汁琼脂斜威培养基上洗下红曲霉孢子，每 瓶种子培养基接种5 m l 孢予悬浮液( 孢子浓度镜检为1 0 5 个m 1 ) ，3 0 。c 下1 4 0 r r a i n l 回 转摇床上避光培养3 d 。 2 3 3 发酵培养基及培养条件 葡萄糖2 ，蛋白胨o 5 ，酵母膏0 5 ，k h 2 p 0 4o 1 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ， c a c l 2o 0 1 。p h 6 4 ，2 5 0 m l 三角瓶分装6 0 m l ，o 1 m p a 灭菌2 0 r a i n ，每瓶发酵液中加 入3 m 1 种子培养液，3 0 下1 2 0r m i n l 回转摇床上避光培养。 2 4 静息细胞培养方法 将菌体发酵培养3 天后，离心收集菌体( 4 8 0 0 r p m ，1 0 m i n ) ，再用灭菌0 8 生理盐水 洗涤3 次后悬浮在灭菌n o 8 生理盐水中( 浓度为5 9 湿菌体l “) ，然后加入各种氨基酸 或短链脂肪酸培养2 天。 2 5 菌体干重的测定 取1 0 r o t 充分振荡均匀的发酵液，无菌水洗涤除去培养基，滤纸过滤，8 0 。c 烘干 2 4 h ，称重，每1 0m l 发酵液含干菌体重w 1 ，然后换算成发酵液中干菌重：w l 1 0 0 ( g l 1 1 ) 2 6 液体色价的测定f 9 5 】 发酵制备纯色素溶液，稀释后在分光光度计上进行全波段扫描，确定色索吸收峰 波长根据扫描结果测定各峰值波长处的o d 值，以总的o d 值的变化表示红曲色素色 价的变化。 2 6 1 胞外黄色素的测定 取一瓶发酵液，用蒸馏水定容至6 0 m l ，摇匀后取1 0 m l 发酵液，定性滤纸过滤，以 未添加种子的培养基滤液作为空白，根据全波段扫描结果，l c m 的比色m t j f j , 0 定滤液在 该处的o d 值。 2 6 2 胞外红色素的测定 处理方法同2 1 7 1 ，然后根据全波段扫描结果，测定其在该处的o d 值。 2 6 3 胞内黄色素的测定 取一瓶发酵液，用蒸馏水定容至6 0 m l