（植物学专业论文）丹参多糖的初步研究.pdf

丹参多糖的初步研究 杨艳辉 摘要：多糖是中药中一类天然高分子化合物，是维持生命正常运转的基本物 质之一，具有调节免疫系统功能、抗氧化以及抗衰老等作用，具有巨大的开发潜 力。丹参( s a l v i am i l t i o r r h i z ab u n g e ) 为唇型科鼠尾草属植物，以根及根茎入药， 为我国传统的名贵中药材。有关丹参化学成分的研究已有不少报道，但对其多糖 成分的研究较少。 本论文以丹参为材料，研究了丹参多糖的提取、分离及纯化工艺，采用苯酚 硫酸法测定了丹参不同部位总多糖的含量，用h p l c 法测定了丹参不同部位多糖 的单糖组成和含量，并研究了多糖对质粒d n a 的保护作用。主要实验结果如下： ( 1 ) 采用无水乙醇回流脱脂，热水回流提取，提取液经8 0 乙醇沉淀，即得水 溶性粗多糖，租多糖复溶于水后，以s e v a g e 试剂法和反复冻融法相结合去除蛋白， 透析去除小分子杂质，然后冷冻干燥得丹参多糖。 ( 2 ) 采用苯酚硫酸法测定丹参总多糖的含量，结果显示，葡萄糖在0 0 1 - 0 1 i n g 范围内线性关系良好，回归方程为y = 9 6 5 8 4 x 0 0 3 9 5 ( r - 0 9 9 9 2 ，n = 6 ) 。结果表明， 方法精密度高，重现性好，可用于丹参总多糖的含量测定。 ( 3 ) 以丹参的不同部位为材料，对其总多糖的含量进行比较。结果显示，总 多糖含量根为1 8 6 6 ，茎为1 2 0 ，叶为1 1 4 ，花为4 5 9 ，种子为0 7 5 ， 总多糖在上述5 个部位中的分布比例为2 4 髂：1 6 0 ：1 5 2 ：6 1 2 ：1 。表明不同部 位样品中总多糖含量存在较大差异。 ( 4 ) 建立了h p l c 同时分析8 种单糖的方法，其色谱条件为检测波长：2 5 0 h m ； 柱温：4 0 ；流速：1 0 i i l u m i n ；溶剂a ：1 5 ( v v ) 乙腈+ 0 0 5 m o l l 磷酸缓冲液 ( k h 2 p 0 4 n a o h ，p h 6 9 ) ；溶和b ：4 0 ( v v ) 乙腈+ o 0 5 t o o i l 磷酸缓冲液 ( k h 2 p 0 4 n a o h ，p h 6 9 ) ；梯度模式：时间梯度为：o 一5 1 0 一6 0 m i n ，相应浓度梯度 为1 0 一1 1 6 一1 4 一2 0 溶剂b 。方法学考察结果表明，此法重现性好，精密 度高，可做为8 种单糖的同时分析方法。 ( 5 ) 用h p l c 法分析了不同部位多糖的单糖组成，并对其所含单糖的含量和 摩尔比进行计算。结果表明：丹参多糖的单糖组成和含量在不同部位中有较大差 异。根、茎、叶和花四个部位多糖的单糖组成相同，含m a n ，r h a ，g i c u a ，g a l u a ， g l c ，g a l 和a r a 等7 种单糖。而种子中则含m a n ，r h a ，g l c u a ，g a l u a ，g l c ， x y l 和a r a 等7 种单糖。 ( 6 ) 通过丹参多糖水溶液对h 2 0 2 光解反应诱导质粒d n a 损伤的保护作用的 研究，确定了最适反应浓度，并比较了不同部位多糖的保护效果。结果表明丹参 根、茎和叶多糖对质粒d n a 均有明显的保护作用。 关键词：丹参总多糖单糖组成d n a 保护作用 n p r e l i m i n a r ys t u d yo np o l y s a c c h a r i d eo fs a l v i am i l t i o r r h i z a y a n gy a n h u j a b s t r a c t ：p o l y s a c c h a r i d e ，o n ec l a s so fn a t u r a lp o l y m e r si nc h i n e s eh e r b s ，i st h e b a s i cm a t e r i a lt om a i n t a i nn o r m a lo p e r a t i o no ft h el i v e s ，a n dh a sb e t t e rr e g u l a t i o no ft h e i m m u n es y s t e mf u n c t i o na n da n t i a g i n ge f f e c t s s o ，t h e r ei saw e m e n d o u sp o t e n t i a l d e v e l o p m e n ti nt h eh e r b a lp l a n tp o l y s a c c h a r i d e s d a n s h e n ，t h ed r i e dr o o ta n d r h i z o m e o fs a l v i am i l t i o r r h i z a b u n g e ，i sar a r et r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n ei no u rc o u n t r y t h e r ea r em a n yr e p o r t so no t h e rc h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fs m i l t i o r r h i z a ，b u tf e wo n p o l y s a c c h a r i d e s i nt h ep r e s e n tp a p e r , w es t u d i e dt h ep o l y s a c c h a r i d e so fsm i l t i o r r h i z a i n c l u d i n g p r o c e s so fe x t r a c t i o n , i s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，a n dt h ec o n t e n t so ft o t a lp o l y s a c c h a r i d e si n d i f f e r e n tp a r t so fsm i l t i o r r h i z ad e t e r m i n e d b yp h e n o l s u l f u r i ca c i dm e t h o d t h e c o m p o s i t i o na n dc o n t e n to fm o n o s a c c h a r i d e sd e t e r m i n e db yh p l ca n a l y s i s t h ed n a d a m a g ep r o t e 虻 t i n ga c t i v i t yo fp o l y s a c c h a r i d e sw a sa l s os t u d i e d t h ep a p e ra i m e dt o o f f e rd a t af o rs t u d y i n gp o l y s a c c h a r i d e so fsm i l t i o r r h i z a n ep r i m a r yr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： ( 1 ) u s i n gt r a d i t i o n a lm e t h o df o re x t r a c t i n gp o l y s a c c h a r i d e s ：e t h a n o ld e g r e a s i n g , w a t e re x t r a c t i o na n da l c o h o lp r e c i p i t a t i o n , p r o t e i nr e m o v i n gb ys e v a g em e t h o da n d r e p e a t e df r e e z e , h a wm e t h o d ，t h es m a l lm o l e c u l e si m p u r i t i e sr e m o v i n gb yd i a l y s i s , a n d t h e np o l y s a c c h a r i d eo b t a i n e db yf r e e z e - d r i e d ( 2 ) u s i n gp h c n o l s u l f u r i ca c i dm e t h o dt od e t e r m i n et h ep o l y s a c c h a r i d ec o n t e n t , t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sag o o dl i n e a r i t yo fg l u c o s ei nt h er a n g eo f0 0 1t o 0 i m p n er e g r e s s i o ne q u a t i o n w a sy = 9 6 5 8 4 x - 0 0 3 9 5 ( r20 9 9 9 2 ，n = 6 ) m e t h o d o l o g i c a le x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h em e t h o dh a dh i g hp r e c i s i o na n dg o o d r e p e a t a b i l i t y a n dc a nb e u s e da st h ed e t e c t i o nm e a n so fp o l y s a e c h a r i d ei ns m i l t i o r r h i z a ( 3 ) c o m p a r i n gt h et o t a lp o l y s a c c h a r i d ec o n t e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r e e x i s t e dad i s t i n c td i f f e r e n c ea m o n gd i f f e r e n tp a r t so f 工m i l t i o r r h i z a 1 8 6 6 i nr o o t , 1 2 0 i ns t e m , l 1 4 i nl e a v e s 4 5 9 i nf l o w e r sa n d0 7 5 i ns e e d s t h ed i s t r i b u t i o n r a t i oo ft o t a lp o l y s a c c h a r i d ei nt h ef i v ep a r t sa r e2 4 8 8 ：1 6 0 ：1 5 2 ：6 1 2 ：1 ( 4 ) t h eo n l i n eh p l cd e t e c t i o nm e t h o df o re i g h tm o n o s a c c h a r i d e ss i m u l t a n e o u s l y 1 1 1 w a se s t a b l i s h e d t h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：t h ew a v e l e n g t ho f 2 5 0 n m ；t h ec o l u m nt e m p e r a t u r eo f4 0 。c ：t h es o l v e n tf l o w1 o m l m i n ；t h es o l v e n ta ： 1 5 ( v ) a c e t o n i t f i l e + 0 0 5 m o i lp h o s p h a t eb u f f e r ( k h 2 p 0 4 - n a o h ，p h 6 9 ) ；t h es o l v e n t b ：4 0 o r ) a c e t o n i t r i l e + 0 0 5 m o l lp h o s p h a t eb u f f e r ( k h 2 p 0 4 n a o h ，p h 6 9 ) ；t i m e g r a d i e n t ：0 5 _ 1 0 _ 6 0m n ；c o r r e s p o n d i n gs o l v e n tbc o n c e n t r a t i o ng r a d i e n t ： 1 0 - - * 1 1 6 1 4 2 0 m e t h o d o l o g i c a le x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h em e t h o dh a d h i g hp r e c i s i o na n dg o o dr e p e a t a b i l i t ya n dc a nb eu s e da st h ed e t e c t i o nm e a n so fe i g h t m o n o s a c c h a r i d e s ( 5 ) c o m p a r i n gm o n o s a c c h a r i d ec o m p o n e n t so ft h ep o l y s a c c h a r i d ei nd i f f e r e n t p a r t s o f &m i l t i o r r h i z a b yh p l ca n a l y s i s a n d a c c o u n t i n g t h ec o n t e n to f m o n o s a c c h a r i d e s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，t h es a m em o n o s a c c h a r i d ec o l i i i p o n e n t s ，s u c h a sm a n ，r h a ，g l c u a ，g a l u a ，g l c ，g a la n da r a , e x i s t e di nr o o t ，s t e m ，l e a fa n df l o w e r h o w e v e r ，t h e r ew a sx y li n s t e a do fg a le x i s t e di ns e e d t h e r ew e r eb i gd i f f e r e n c e si n c o m p o n e n t s a n dc o n t e n to fm o n o s a c c h a r i d e sa m o n gd i f f e r e n t p a r t s o ft h e m i l t i o r r h i z a ( 6 ) t h ee f f e c to fp o l y s a e c h a r i d es o l u t i o no np r o t e c t i n gd n ad a m a g ew a st e s t e d n e e x p e r i m e n t sd e t e r m i n e dt h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n a n dc o m p a r e dt h ed n ad a m a g e p r o t e c t i n ga c t i v i t yb e t w e e nd i f f e r e n tp a r t so fs m i l t i o r r h i z ap o l y s a c c h a r i d e t h er e s u l t s s h o w e dt h ep o l y s a c c h a r i d e si nr o o t ，s t e ma n dl e a v e sh a do b v i o u sa c t i v i t y k e y w o r d s ：s a l v i a m i l t i o r r h i z a b u n g e ，t o t a lp o l y s a c c h a r i d e s ，m o n o s a c c h a r i d e c o m p o n e n t s ，t h ed n ad a m a g ep r o t e c t i n ga c t i v i t y i v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名。叫日期：j 掣 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文 的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：二哟 日期：2 霉斟 1 文献综述 i i 丹参的研究概况 1 1 i 丹参的本草考证 丹参始载于神农本草经，被列为上品，历代本草均有收载。名医别录 载：“今近道处处有之。茎方有毛，紫色”；图经本草载：“二月生苗，高一尺许。 茎方有棱，青色。叶相对，如薄荷而有毛。三月至九月开花成穗，红紫色，似苏 花。根赤色，大者如指，长尺余，一苗数根”；本草纲目载：“处处山中有之， 一枝五叶，叶如野苏而尖，青色皱皮，小花成穗如蛾形，中有细子。其根皮丹而 肉紫”i “。 丹参味苦，性微寒，归心、肝二经。具有活血化瘀、凉血消肿以及清心除烦 的功能。本经载：“心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚，破症除瘕，止烦 满，益气”；时珍日：“活血，通心包络，治疝痛”。其描述的作用与现代药理研究 相一致l l j 。 1 1 2 丹参的形态学特征 植物丹参为唇形科鼠尾草属的多年生直立草本，高约3 5 - - z s 0 c m ，多分枝。根 圆柱形，肉质，外面砖红色，内部乳白色。奇数羽状复叶，叶柄长1 3 7 5 c m ； 小叶3 7 片，长1 5 8 c m ，宽l 4 c m 。轮伞花序6 至多花，组成总状花序，密 被腺毛和长柔毛；花萼钟形，带紫色，先端2 唇形。能育雄蕊2 ，着生于下唇的中 下部，药隔长1 7 2 c m ，小型果椭圆形。花期5 9 月，花后见果。种子发芽率低， 一般不采用种子繁殖1 2 】。 i i 3 丹参的化学成分 。 对丹参化学成分的研究始于2 0 世纪3 0 年代，日本学者n a k a o 首先得到了3 种 脂溶性成分。7 0 年代以来，我国学者在水溶性成分的分离鉴定方面作了大量的工 作，直至最近，仍不断有新报趔1 , 3 】。 丹参主要含脂溶性的二萜类化合物和水溶性的多聚酚酸类成分，此外，还含 有多糖类物质和挥发油类成分等。 i i 3 1 脂溶性二萜类成分 1 1 3 1 1 邻醌型的丹参酮类二萜化合物 邻醌型的丹参酮类二萜化合物在丹参中含量较高，并且具有较强的生理活性。 是丹参主要有效部位之一。该类化合物主要有：丹参酮i 、丹参酮1 1 2 a 、丹参酮 1 1 2 b 、隐丹参酮、丹参酸甲酯、丹参新酮、二氢丹参酮i 、次甲丹参酮、准丹参 酮、红根草邻醌、丹参二醇、紫丹参甲素、乙素、丙素、丁素、戊素等。其中丹 参酮1 1 2 a 是丹参治疗冠心病的主要有效成分之一，在丹参中的含量可达o 5 以 上，将其磺化制成丹参酮i i2 a 磺酸钠后，不仅增加了水溶性有利于制剂，而且提高 了其药理活性。隐丹参酮抗菌活性比小檗碱强许多倍，含量亦高，常作为抗菌消炎 类丹参制剂的质量控制指标成分。 1 1 3 1 2 对醌型的罗列酮类二萜化合物 对醌型的罗列酮类二萜化合物在丹参中含量很低主要有：异丹参酮i 、异丹参 酮1 1 2 a 、1 1 2 b 异隐丹参酮、异二氢丹参酮i 、7 a 乙氧基罗列酮、丹参新醌甲、 乙、丙、丁等。 1 1 3 1 3 其它的二萜类化合物 其它的二萜类化合物种类较少且含量较低。主要有丹参螺旋内酯、新隐丹参 酮、鼠尾草卡偌醇和阿罗卡二醇等。【4 l 1 1 3 2 水溶性酚酸类成分 目前己从丹参中分离得到1 0 多个水溶性化合物。主要有：丹参素、原儿茶醛、 迷迭香酸、紫草酸、咖啡酸和丹酚酸a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 等。丹参水溶性成分 的药理活性基本相似，均具有抗心肌缺血、缺氧等作用，但作用强度和含量有所 不同。丹参素和原儿茶醛在丹参体内含量较高，活性较强，是丹参治疗冠心病的主要 有效成分之一二者常作为丹参原药材和丹参制剂的质量控制指标成分。但原儿茶 醛刺激性大，丹参素不稳定，易氧化生成有色的醌类化合物。近年来研究发现：丹 酚酸a 和丹酚酸b 的抗心肌缺血、缺氧的活性比丹参素和原儿茶醛更强，其中丹酚酸 a 是目前己知的抗氧化作用最强的化合物之一，并且还具有改善记忆、降低抗癌药 阿霉素毒性等作用1 5 1 。 1 1 3 3 多糖类成分 汪红等将丹参药材经过水提醇沉得到丹参粗多糖。用d e a e s e p h a r o s ef a s t f l o w 纯化后，以h 2 0 2 脱色，流水透析，冷冻干燥后得到2 个浅黄色均一多糖s m p l 、 s m p 0 5 ，结果表明，它们的相对分子质量分别约为1 3 9x 1 0 6 ，4 0 3x 1 0 5 ，s m p l 主要 以a ( 1 6 ) d g l c 聚合而成，有少量的a - ( 1 2 ) d - g l c 聚合；s m p 0 5 主要由a - ( 1 6 ) d g l c 聚合而成i o j 。 人们在对丹参的化学成分进行药理筛选过程中，发现丹参根中提取到的多糖给 肾病模型和肝损伤模型实验小鼠口服和肌注，能减少小鼠尿蛋白的排泄，抑制血清 胆固醇和脂质过氧化物浓度的提高，改善血清白蛋白与球蛋白的比值( a g ) ，并能降 低肝损伤引起的a l t 的升高i ”。 1 1 3 4 挥发油成分 典灵辉等通过气相色谱质谱联用技术分析丹参根中挥发油成分，结果表明， 丹参根中挥发油主要化学成分为正十六酸、正二十烷和邻苯二甲酸二异丁酯等【8 l 。 2 1 1 4 丹参的药理作用 1 1 4 1 对心血管的影响 1 1 4 1 1 防治脑血栓、改善脑缺血 乙酸丹酚酸a ( a s a a ) 可g 著降低大鼠脑梗塞范围，改善行为障碍，减轻脑组织 形态学缺血性改变。实验表明，a s a a 的抑制血小板聚集作用可能是其抑制大脑 中动脉血栓形成的重要机制之_ _ 1 9 1 。 1 1 4 1 2 对心肌的保护作用 丹参水溶性成分丹参素可防止大鼠心肌线粒体h + - a t p 酶水解活性下降，对心 肌具有明显的保护作用。丹参能有效清除心肌再灌注所产生的具有细胞毒性的氧 自由基，从而对缺血再灌注损伤的- i l , 肌起保护作用1 1 0 1 ”。 1 1 4 1 3 扩张血管 丹参素能明显扩张实验性急性心肌梗塞的犬、猫以及离体猫、猪的冠状动脉， 增加冠状动脉血流量，并能对抗吗啡和心得安的收缩冠状动脉作用，因此丹参素 被认为是扩张冠状动脉血管的有效成分之一1 1 2 1 。 1 1 4 1 4 抗动脉粥样硬化 丹参素能抑制内源性胆固醇合成，保护血管屏障，防止动脉粥样硬化形成1 1 3 l 。 1 1 4 2 抗肿瘤作用 1 1 4 2 1 对肿瘤细胞的杀伤作用 从丹参中分得的1 8 种丹参酮类化合物对体外培养的几种肿瘤细胞( 非小细胞 肺癌、卵巢癌、结肠癌和中枢神经癌等) 均有显著的抑制扩散作用，且几类癌细 胞对丹参酮均未见耐药现象【1 4 l 。 1 1 4 2 2 诱导肿瘤细胞凋亡 研究丹参酮i i a 对体外培养的人早幼粒白血病细胞株( h l 6 0 ) 的影响时发现，丹 参酮i i a 能诱导h l 6 0 发生形态改变，亚二倍体细胞数目增加，g 1 合成期细胞数目下 降，诱导核小体d n a 断裂，从而使d n a 在合成前期受阻，不能进入正常s 期。同时 通过激活c a s p a s e - 3 酶活性，促进细胞凋亡i 埘。 1 1 4 2 3 诱导肿瘤细胞逆转 丹参酮i i a 是通过抑制癌基因的表达来抑制d n a 多聚核酸酶的表达，抑制细胞 进入d n a 合成期，从而抑制s m m c - 7 7 2 1 细胞生长增殖，使之趋于良性分化。丹参 酮i i a 诱导细胞分化的同时却无细胞毒副作用是一种很有前途的分化诱导剃阍。 1 1 4 3 保肝作用 丹参能够改善动物术后的肝功能，提高存活率，并且能使肝再生时的肝再生 度、有丝分裂指数及血清甲胎蛋白阳性率增高。另外丹酚酸有显著的抗肝损伤和 3 抗肝纤维化作用，对肝细胞损伤具有明显保护作用【1 7 , 1 8 1 。 1 1 4 4 抗过敏作用 丹参酮i 、丹参酮l ia 、隐丹参酮和1 5 ，1 6 二氢丹参酮i 对体外培养的肥大 细胞r b l - 2 h 3 株系脱颗粒有明显抑制作用，说明丹参酮类有抗过敏作用。丹参对 增生性瘢痕组织成纤维细胞生长具有明显抑制作用，有望为瘢痕的治疗开辟新的方 法【1 9 瑚l 。 1 1 4 5 抗菌作用 丹参对革兰氏阳性菌特别是金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，其抗菌有效 成分为总丹参酮，尤以隐丹参酮的作用最强【2 1 j 。 1 1 4 6 抗氧化作用 丹参有效成分丹参酮i ia 、丹参素和丹酚酸经体内外实验证明均是有效的抗 氧化剂，尤其以丹酚酸的抗氧化作用最强。丹参水溶性成分能显著抑制动物的心、 脑、肝、肾和睾丸的脂质过氧化1 2 2 - 2 5 1 。 1 1 4 7 对中枢神经系统的作用 丹参水提液能明显抑制小鼠自主活动，其作用与剂量大小成正比，与氯丙嗪 和眠尔通合并使用，镇静催眠作用明显增强。由此可见，传统医学认为丹参具 有清心除烦恼的功效确有一定道理。 1 2 多糖的研究概况 1 2 1 多糖的制备及结构鉴定 1 2 1 1 多糖的提取 目前，从植物中提取活性多糖的方法主要有：超声波提取法、酶提取法以及 溶剂提取法( 水提法、碱提取法、酸提取法以及醇水提取法) 等。植物多糖的提 取方法因植物原料不同而不同，各种提取方法各有利弊。 超声波提取其提取效率较低，一般应与其它方法结合使用。 酶提取法虽成本较高，但效率较好。不过也存在一定的局限，如必须严格控 制酶反应时的温度和p h 值，提取时易改变中药中某些成分等1 2 7 1 。 碱提多糖时，易使多糖的糖苷键断裂，且只适用于含果胶物质少，粘度小的 原料。酸性条件下提取，也会引起多糖降解及糖苷键的断裂，因此在稀酸提取时， 时间宜短，温度不宜超过5 0 。 多糖类物质易溶于水，水作为最为常用且价廉的提取溶剂，常会将植物淀粉及 动、植物蛋白类物质一同提取出来，为提高多糖含量，常需除去其它成分。 由于植物组织细胞大多有脂质包围，要使其多糖释放，首先要除去细胞表面 脂肪。通常是将原料粉碎后以乙酸乙酯、石油醚或乙醇浸泡并回流一定时间，残 4 渣再用水提取。 不同的多糖受不同提取温度、时间以及溶剂量等因素影响呈现不同的提取效 果，依具体情况确定最佳提取工艺。 1 2 1 2 多糖的分离 粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素和低聚糖等杂质，必须分别除去。多糖的 分离过程主要是去除这些杂质的过程1 2 8 1 。 1 2 1 2 1 蛋白质的去除 一般常用的有以下几种方法： s e v a g e 法：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯仿：戊醇r 或正 丁醇) 5 ：1 或4 ：1 ，混合物剧烈振摇2 0 - - 3 0 r a i n ，蛋白质与氯仿戊醇( 或正丁醇) 生成凝胶物而分离。离心分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法在避 免降解上有较好效果，但效率不高，如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用s e v a g e 法效果更佳。 三氟三氯乙烷法：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温搅拌1 0 m i n 左 右，离心，上层水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法 效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5 3 0 - - 氯醋酸，直至溶液不再混浊为止， 在5 1 0 放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多 糖的降解。 1 2 1 2 2 色素的去除 ， 植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离 子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂d e a e 纤维素或d u o l i t e a - 7 来吸 附色素；若糖与色素结合，易被d e a e 纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可 进行氧化脱色：以浓氨水( 或n a o h 溶液) 调至p h 8 0 左右，5 0 c 以下滴加h 2 0 2 至 浅黄色，保温2 小时；发酵来源的多糖颜色般较浅；对于动物和微生物等提取 到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。一般情况下，尽量避免用活性炭处 理，因为活性炭会吸附多糖，造成多糖损失。 1 2 1 2 3 低聚糖等小分子杂质的去除 通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质，这样得到的就是多糖混合物。 1 2 1 3 多糖的纯化 纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种。 季铵盐沉淀法，制备性区域电泳法，金属络合物法，盐析法以及超过滤法等， 现在较常用的方法是凝胶柱层析法和纤维素阴离子交换剂柱层析法。 5 凝胶柱层析是根据多糖分子的大小和形状不同进行分离，常用的凝胶有葡聚 糖凝胶和琼脂糖凝胶。此法不适宜粘多糖的分离，展开剂为各种浓度的盐溶液及 缓冲液。 纤维素阴离子交换剂柱层析法适用于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。 吸附力一般随多糖分子中酸性基团的增加而增加。常用的交换剂为d e a e - 纤维素 和e c y e o l a 纤维素。在d e a e 纤维素类柱上层析，用不同浓度的盐或碱梯度洗 脱，可得到不同的级分1 2 ”。 1 2 1 4 纯度鉴定 多糖属于高分子化合物，其纯度不能用一般小分子化合物的标准来判断，通 常所说的多糖纯品实质是指一定分子量分布的均一组分，它的纯度只代表相似链 长的平均分布。通常要确定一种多糖的均一性，至少要两种以上方法才行。目前 测定多糖纯度常用的方法有：旋光测定法、纸层析、高效液相色谱、高压电泳、 超离心分析法等。现在色谱技术已经得到较快的发展，应用也很方便。 多糖纯品的判断可根据糖基的摩尔比恒定，比旋度相同，纸层析呈现一条带， 高效液相层析、柱层析和超离心分析呈现一个峰来确定1 3 0 l 。 1 2 1 5 分子量的测定 多糖属于高分子化合物，所测的分子量只是一种统计平均值。多糖的分子量 测定过去常用的有超离心法、高压电泳法、渗透压法、粘度法和光散射法等，但 这些方法比较麻烦，误差也大。现在多采用凝胶色谱法，它是一种样品用量少， 操作简单的方法，应用最广泛的凝胶是s e p h a d e x 和s e p h a r o s e 系列。 软电离技术的出现，使质谱可以直接用于生物大分子的分子量测定，例如场 解析质谱、场致电离质谱、快原子轰击质谱、液体二次离子质谱和电喷雾质谱等 均可应用于多糖的分子量测定。近年来发展起来的基质辅助激光解析电离质谱， 亦可应用于蛋白质和多糖等高分子化合物的分子量的测赳”捌。 1 2 1 6 结构的测定 多糖的结构分为初级结构和高级结构，一级结构为初级结构，二、三和四级结 构为高级结构。多糖的一级结构是指单糖的组成，糖基排列顺序，相邻糖基的连接 方式，异头碳构型以及糖链有无分支，分支的位置与长短等。多糖的二级结构是指 多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象。多糖的三级结构和四级 结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构 在有序的空间里产生的有规则的构象印j 。 1 2 2 多糖的构效关系 实验表明，多糖是由单糖脱水形成的糖苷键线性或分支连接而成的。多糖能 6 够以游离形式或糖复合物形式( 糖链与其它生物大分子以共价键相连所形成的化 合物，如糖蛋白和糖脂等) 参与许多重要的生命活动，如细胞生长、细胞识别、 物质代谢、细胞间物质运输、免疫功能调节等过程密切相关。多糖所表现出的复 杂多样的生物活性，是与糖的特殊结构相关联的。由于多糖结构比较复杂，人类 对于多糖的构效关系的研究还相当不完善，多糖的结构和功能的关系还不十分清 楚，限制了其临床的应用和发展。对多糖结构和功能关系的研究，寻求多糖作用 的活性部位是一个极富挑战性的课题。多糖的生物活性与其结构、分子量、溶解 度和黏度等因素有关。 1 2 2 1 多糖的组成与糖苷键的类型 由植物中提取的抗肿瘤活性多糖一般由半乳糖或半乳糖醛酸等组成，如从双 子叶植物苦楝的树皮分离的抗肿瘤多糖，主要由半乳糖构成，以a 阿拉伯糖b - 3 ， 6 分支半乳聚糖为构造体。l l i e n 等从紫松果菊( e c h i n c a n ap u r p u r e a ) 分离的由阿拉 伯糖和半乳糖所组成的多糖，可促进巨噬细胞产生肿瘤细胞坏死因子例。 大部分香菇多糖具有b 葡聚糖结构，这种8 ( 1 3 ) 和b ( 1 6 ) 结构是抗癌所 必需的。香菇多糖可抑制肿瘤的形成，阻止肿瘤癌细胞转移。表现出直接的抗肿 瘤和病毒的能力。香菇多糖不直接消灭癌细胞，而是通过激活免疫系统抵抗癌细 胞【3 5 1 。 许多高等植物的多糖均有激活补体作用，补体蛋白上存在的识别点可识别多 糖的结构。h i r a n o 对多糖活性决定簇研究中认为分支区与抗补体作用，促进有丝 分裂和调节巨噬细胞f c 受体兴奋性的活性有关。例如柴胡、当归和甘草的果胶多 糖p g 2 含有带2 酮3 脱氧辛醛酸( k d o ) 糖链，在人体的单核细胞产生，1 时， 脂多糖( l p s ) 中k d o 基团起重要的信号作用。因此，含有k d o 氨基酸残基的 特异性果胶可能被细胞表面上的l p s 受体识别，从而启动了一些相应的生物活性 l 删。 1 2 2 2 取代基 多糖中的官能团的种类或有无对其生物活性有极大的影响，如糖链上硫酸基、 乙酰基、烷基和羧甲基等的取代位置和含量及络合元素的种类决定了多糖有何活 性及活性大小。而这些官能团往往可以通过一定的化学方式进行添加或消除，所以 多糖中官能团的改造已成为研究多糖构效关系的有力手段。通常可以通过降解、 羧甲基化、硫酸酯化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化、二乙基氨基乙基化、碘化以 及氨化等改造多糖官能团的方法有目的地得到高活性的多糖片段或寡糖。 大多数通过硫酸酯化的多糖具有明显的抗病毒作用、抗肿瘤和抗凝血等活性， 如硫酸葡聚糖，硫酸戊聚糖和硫酸香菇多糖等。硫酸根对抗h i v 病毒目前认为是 7 必须的，并且其抑制h i v 的作用同分子中硫酸根含量和位置有关。硫酸多糖能有 效的抑制h i v 的感染和复制，对其它具囊膜病毒也有明显的抑制作用。硫酸多糖还 能抑制h i v 诱导的合胞体的形成1 3 7 。卡拉胶对h i v 等病毒有显著的抑制作用，脱去 硫酸根后活性消失。卡拉胶中硫酸根的数目和位置对其抗病毒和抗凝血活性有着 显著的影响，如n 卡拉胶中a d 半乳糖2 ，6 位的两个s 0 4 5 在其抗凝血活性中起决定 性作用【3 8 1 。 实验表明，多糖乙酰基的数量和位置对多糖活性也有显著的影响。o 3 位具乙 酰基时，多糖抗肿瘤活性最强；0 5 位具乙酰基时活性明显减弱；在o 位上全部乙 酰化时，活性消失。原因是乙酰基能改变多糖分子的定向性和横向次序，从而改变多 糖的物理性质，乙酰基的引入使分子的伸展变化，最终导致多糖羟基基团的暴露，增 加其在水中的溶解性，因此对其活性产生影响p 。 烷基化对多糖活性也产生影响。1 9 9 2 年, u r y u 对寡糖进行分子修饰，引入烷基 和硫酸根，发现其修饰产物具有抑制h i v - 1 的能力。硫酸化烷基寡糖可能从两个方 面抑制h i v - 1 ，一方面其寡糖部分与h i v 的囊膜糖蛋白有高度亲和性，这与其它硫酸 化多糖一致：另一方面其烷基部分与表面活性剂类似，可与病毒囊膜脂双层作用，破 坏其囊膜，其抗h i v 能力在烷基脱去后明显降低【钟l 。 1 2 2 3 多糖的高级结构 一般认为多糖的高级结构对于多糖活性的影响比初级结构更大。k u l i c a k e 等1 4 1 l 研究认为，包含单螺旋结构的( 1 + 3 ) b d 葡聚糖具有生物活性，而( 1 3 ) a - d 葡聚 糖具有一种带状的单链构象，沿着纤维轴伸展而不是呈螺旋状，所以不具抗肿瘤活 性。b o l i i i 也认为( 1 3 ) b d 葡聚糖的抗肿瘤活性是由其主链上的单螺旋结构赋予 的，或许是三股螺旋结构，但最重要的是亲水性基团( 多羟基) 位于螺旋体的表面。 1 9 9 7 年，m a t s u o k a 【4 2 l 报道经x 射线分析得知香菇多糖具有b 三股绳状螺旋型立体 结构，对胃癌、直肠癌等有抑制作用，与白细胞介素2 ( l - 2 ) 联合可抗3 - 甲基胆葸诱发 的纤维肉瘤的转移；如果加入尿素、二甲亚砜使分子的立体构型发生改变，则活性 也就消失1 4 3 】；但如果向水不溶性的裂褶多糖中添加尿素或氢氧化钠，则可诱导其产 生规则的空间构象，从而表现出抗肿瘤活性1 4 4 1 。 1 2 2 4 分子量 多糖的活性还与其相对分子质量有一定的关系。相对分子质量越大，则分子体 积越大。不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物活性。m i s a k i 等1 4 5 j 研究的一种真菌多糖不溶于水，在大鼠体内仅有很微弱的抑瘤活性。在降低其相对 分子质量后，完全溶于水，抑瘤活性也因此大大提高。从细菌中分离的某种果聚多 糖l e v a n s ，相对分子质量达到2 1 x 1 0 5 时抑制肿瘤生长的活性最强i 删。相对分子质 量为9 0 0 0 左右的右旋糖酐具有一定的活性，其活性大小随着大于或小于此相对分 子质量而迅速降低。由此可见，不同的多糖产生生物学活性有其最佳相对分子质量 范围。 1 2 2 5 溶解度 多糖溶于水是其发挥生物活性的前提。如从茯苓中提取的多糖组份中，不溶于 水的组份没有生物学活性，水溶性组份则有较强的抗肿瘤活性；灵芝多糖具有a 葡 聚糖构型，不溶于水，羧甲基化后溶解性提高，在体外也表现出一定的抗肿瘤活性。有 些含有疏水分支的多糖不溶于水，经过氧化还原成羟基多糖后才溶于水，从而产生 生物学活性。因此，对于溶解性较差的多糖组份进行适当的化学修饰，提高溶解度， 就可以增强其生物活性。 1 2 2 6 黏度 多糖的黏度也能影响其抑瘤活性。如果黏度过高，则不利于多糖药物的吸收与 扩散。裂褶多糖是很有应用前景的抗肿瘤药物，起初因为黏度太大，无法供临床使用， 后来通过部分降解，使其相对分子质量降低，黏度也减小，并由于其基本重复结构不 变，仍保持抗肿瘤活性，已供临床使用 h 7 1 。 1 2 3 多糖的药理作用 1 2 3 1 抗肿瘤作用 手术、放疗和化疗仍是目前治疗癌症的主要手段，但存在术后并发症、癌细 胞转移及放化疗对正常细胞的杀伤而引起机体免疫力下降等问题。多糖通过增强 机体的免疫力可以与手术、放疗及化疗药物配合使用，从而更有效地预防和治疗 癌症【矧。多糖的抗肿瘤活性除了体现在增强机体的免疫力外，还表现在如下几个 方面1 4 9 删。 1 2 3 1 1 直接抑制肿瘤细胞生长 牛膝多糖能提高荷瘤小鼠的自然杀伤细胞与1 2 淋巴细胞的活性，产生肿瘤坏 死因子，对肿瘤细胞起不同程度的杀伤和抑制作用。香菇多糖作为已经投入临床使 用的抗癌药物，亦能提高自然杀伤细胞的活性，激活巨噬细胞，在一定程度上抑 制肿瘤细胞的生长【5 1 j 2 1 。 1 2 3 1 2 抑制肿瘤细胞的蛋白质和核酸的合成 树舌多糖可使i j e p a 癌细胞的d n a 合成速度减慢，从而使癌细胞分裂减慢，抑 制肿瘤细胞生长。u m e m u r a 等从一种海洋藻类裸甲藻( g y m n o d i n i u ms p ) 中分离得 到一种胞外多糖g a 3 p ，g a 3 p 对拓扑异构酶具有高度的亲和力，体外细胞实验证 实对人癌细胞具有很强的毒性作用。g a 3 p 可以同时抑制拓扑异构酶l 和，具有 成为治疗癌症新药的潜力【5 3 爿】。 9 1 2 3 1 3 诱导肿瘤细胞凋亡 季宇彬1 5 别等研究证实羊栖菜多糖可以阻滞s g c - 7 9 0 1 人胃癌从g o g 1 期进入 s 期，升高细胞凋亡指数，可使s g c 7 9 0 1 细胞内钙离子浓度先升高然后下降。给 c a