（微生物学专业论文）人乳铁蛋白基因转化银耳的研究.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中彳i 包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：嘭苏倦复苏1 日期：砂7 ，y 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：够袁t 五式日期： 指导教师亲笔签名：孑刁曙尹露 日期： 词。6 & ， 砷、舭 福建农林大学硕士学位论文 中文摘要 乳铁蛋白是一种糖蛋白，为转铁蛋白家族的一员，在人和哺乳动物的许多器 官与组织中广泛分布。乳铁蛋白具有多种生物学功能，这些功能包括：促进人体 肠道对铁的吸收及调节体内铁的平衡；广谱抗菌( 细菌和真菌) 、抗病毒感染作 用等。把人乳铁蛋白基因转入银耳中，让它合成具有生物活性的人乳铁蛋白，相 当于在银耳中添加新的营养保健因子。乳铁蛋白强的铁螫合能力和广谱抗菌、抗 病功能，可提高转基因银耳铁的含量，增强银耳抗菌、抗病能力。 本研究在对银耳遗传转化标记进行筛选及对其遗传转化体系进行优化的基 础上，构建了人乳铁蛋自基因银耳表达载体，在电激转化法介导下，首次把人乳 铁蛋白基因导入银耳，获得了转基因银耳菌株。对转基因菌株进行分子检测，证 实了外源基因己整合到银耳基因组中。具体结果如下： 1 银耳遗传转化标记的筛选 本实验对银耳的遗传标记进行了初步研究，以期对银耳转化载体选择和构建 提供依据。 测定了1 3 种抗菌素对银耳t r 2 1 芽孢的抑菌活性，t r 2 1 能耐大多数的抗菌素，仅对 卡那霉素、林可霉素、庆大霉索和潮霉素敏感。结果表明，潮霉素和卡那霉素可 以作为银耳转化子选择性抗菌素。此外，还对银耳本身是否具有g u s 活性进行了 研究，实验结果表明银耳没有g u s 背景，理论上讲，g u s 可作为银耳芽孢遗传转 化的报告基因。 2 构建了银耳表达载体 以质粒p b l l 2 1 和p c a m b i a l 3 0 1 为出发质粒，把p b l l 2 1 用h i n d l i i 和e c o r i 双酶切，回收带有3 5 s 启动子、t n o s 终止子及g u s 基因的片段，置换插入 p c a m b i a l 3 0 1 的多克隆位点，获得重组中问质粒p c b 。p c b 带有p b l l 2 1 片段， 该片段中的g u s 基因两侧有多个单酶切位点，可用于外源基因的置换。然后用 b a m hi s a ci 双酶切处理质粒p u c - h l f 和p c b ，把p u c - h l f d 片段与p c b 大 片段连接，把人乳铁蛋白基因亚克隆到重组中间质粒p c b 上，置换g u s 基因， 获得携带人乳铁蛋白基因的银耳表达载体，定名为p c b 以 3 建立了高效的银耳遗传转化体系 本实验研究了影响银耳的电激转化条件。实验结果表明，银耳的电激转化需 要先对银耳芽徇进行预处理才能获得转化子，用2 溶壁酶处理1h 效果最佳。电 压3 0 0 伏，电阻6 0 0 欧姆，电容2 5 微法为银耳的最适转化条件。此外，我们在电激 缓冲液中加入浓度为7 p e g 4 0 0 0 时，转化率得到较大提高，达到9 2 5 1 0 6 个i g 质粒d n a 。 4 人乳铁蛋白基因转化银耳及分予检测 利用电激介导转化法，把携带人乳铁蛋白基因的银耳表达载体p c s - m f 导h 银耳中，获得了大量的抗性菌株。通过对抗性菌株进行抗性鉴定、g u s 活性检测、 p c r 检测、s o u t h e r n 杂交证实了外源基因已整合到抗性菌株基因组d n a 中。对转 基因菌株进行r t - p c r 检验，得到了阳性结果，说明外源基因在银耳中能正常转 录。 关键词：人乳铁蛋白基因，遗传标记，表达载体，遗传转化，银耳 福建农林大学硕士学位论文 a b s t r a c t l a c t o f e r r i ni sak i n do fi r o ne o m b m eg l y c o p r o t e i nw h i c hd i s t r i b u t e sw i d e l y m a n yo r g a n sa n dt i s s u e so fp e o p l ea n dm a m m a l l a c t o f e r r i nh a sm a n yp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o ni n c l u d i n gs t i m u l a t i n gi r o na b s o r p t i o n ，a d j u s t i n gi r o nb a l a n c e ，a n t i b i o t i c s ， a n t i v i r u sa n ds oo n t r a n s f o r m a t i o no fh u m a nl a c t o f e r r i ng e n et ot r e m e l l af u c i f o r m i s p r o d u c e dh u m a nl a c t o f e r r i nw h i c hh a db i o a c t i v i t y s ot r e m e l l a f u c i f o r m i sw a s a d d e d n e wh y g i e n i c a lf a c t o r l a c t o f e r r i nw i t hh i g hi r o nc o m b i n m m na n dh i g ha n t i b i o t i c s c a ni m p r o v ei r o nc o n t e n ta n de n h a n c ea n t i b i o t i c so ft r a n s g e n i ct r e m e l l af u c i f o r m i s i nt h es t u d y , o nt h eb a s i so fs c r e e n i n go fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nm a r k e ra n d o p t i m i z i n gg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo ft r e m e l l af u c i f o r m i s ，ah u m a nl a c t o f e r r i n g e n ee x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e d , a n dt h e nt r a n s f e r r e di n t ot r e m e l l af u c i f o r m i s b ye l e c t r o p o r a t i o n m o l e c u l a re v i d e n c e sd e m o n s t r a t e dt h a th u m a nl a c t o f e r r i ng e n e h a db e e ni n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m co ft r a n s g e n i ct r e m e l l a - u c i f o r m i ss t r a i n s t h e s e r e s u r sw e r ef o l l o w i n g 1 s c r e e n i n g o f g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n m a r k e r o f t r e m e l ! a u c f f o r m i s i n h i b i t i o no ft h i r t e e na n t i b i o t i c sw a sd e t e r m i n e dt oy e a s t l i k e c o n i d i ao ft r e m e l l a f u c i f o r m i st r 2 1 t h er e s u l t ss h o w e dt r 2 1c a l lr e s i s t a n tm o s to fa n t i b i o t i e sa n do n l y h a ds e r k s i t i v i t yt ok a n a m y c i n ，l i n c o m y c i n ，g e n t a m y c i n , h y g r o m y c i n s ok a n a m y c i n a n dh y g r o m y c i nc a nb ea ss e l e c t i v ea n t i b i o t i c so ft r e m e u af u c i f o r m i st r a n s f o r m a n t s t r e m e l l af u c i f o r m i sh a sn og u sa c t i v i t yi t s e l f g u sg e n ec a nb eu s e dr e p o r t e rg e n eo f g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no f t r e m e l l af u c i f o r m i s 2 c o n s t r u c t i o n o f e x p r e s s i o n v e c t o r o f t r e r a e l l a f u c i f o r m i s t h ed n a f r a g m e n ti n e h d m g3 5 sp r o m o t e r , n o $ t e r m i n a t o ra n dg u sg e n ew a s e x c i s e df r o mp l a s m i dp b l l 2 1w i t hh i n d i i f f 4 j e c o rie n z y m e sa n dt h e nw a si n s e r t e d i n t op l a s m i dp c a m b i a l 3 0 1 t h em i d d l er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sn a m e da sp c b t h eh u m a nl a c t o f e r r i ng e n ew a se x c i s e df r o mp l a s m i dp u c - h ga n ds u b e l o n e di n t o e x p r e s s i o nv e c t o rp c ba sa nb a m hi s a c i f r a g m e n ti n s t e a do fg u sg e n e t h e r e s u l t i n gr e c o m b i n a l l tp l a s m i dw a sn a m e d a sp c b h g 3 c o n s t r u c t i o no fh i g he f f i c i e n c y t r e m e l l af u c i f o r m i sg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n s y s t e m t h eo p t i m u mp a r a m e t e r sf o re l e e t r o p o r a t i o nw e r es t u d i e dt h er e s u l t ss h o w e d 2 福建农林大学硕士学位论文 y e a s t 1 i k e c o n i d i ao f t r e m e l l af u c i f o r m i sn e e d e dp r e t r e a t m e n tw i t h2 l y w a l l z 3 7 m el h t h e o p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ev o l t a g e3 0 0 v ，e l e c t r i cr e s i s t a n c e 2 0 0q 。c a p a c r a n c e 2 5 i tei na d d i t i o ne l e c t r o p o r a t i o nb u f f e rw a sa d d e dp e g 4 0 0 0 ，t r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c y c a nb ei m p r o v e da n dh a d9 2 5 x 1 0 6t r a n s f o r m a n t sp e r 嵋p l a s m i dd n a t h e c o n c e n t r a t i o no fp e g 4 0 0 0w a s7 4 t r a n s f o r m a t i o no fh u m a nl a c t o f e r r i ng e n et ot r e m e l l af u c i f o r m i sa n di t s m o l e c u l a re v i d e n c e t r a n s f o r m a t i o no fe x p r e s s i o nv e c t o rp c b h l fw i t hh u m a nl a c t o f e r r i ng e n et o t r e m e l l af u c f ，d r m i sb ye l e c t r o p o r a t i o ng a i n e dm a n ya n t i b i o t i cr e s i s t a n tt r a n s f o r m a n t s t h e s et r a n s f o r m a n t sb r i n gw i t hh u m a n ! a c t o f e r r i ng e n e ，g u sg e n eb yp c r d e t e r m i n a t i o n s o u t h e r nh y b r i d i z a t i o nd e m o n s t r a t e dt h a th u m a nl a c t o f e r r i ng e n eh a d b e e ni n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m eo ft r a n s g e n i ct r e m e l l af u c i f o r m i ss t r a i n s ，a n dt h e d e t e r m i n a t i o no fr 乎p c ro ft r a n s f o r m a n t ss h o w e dh u m a nl a c t o f e r r i ng e n ec a n t r a n s c r i b ei nt r e m e l l a u c i o r m i s k e yw o r d s ：h u m a nl a c t o f e r r i ng e n e g e n e t i cm a r k e r e x p r e s s i o nv e c t o r g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nt r e m e l l af u c i f o r m i s 3 福建农林大学硕士学位论文 引言 用转基因生物来生产外源物质( 生物反应器) 已成为基因工程领域的研究 热点之一，成功地用于生产药用蛋白、抗体、口服疫苗等。生物反应器是目标基 因产物的定向生产系统，是一个通用平台，人们需要生产什么基因产品，就往生 物反应器转入什么基因。现己研发的生物反应器包括：原核生物的生物反应器、 酵母生物反应器、植物生物反应器、动物生物反应器。这些生物反应器各有其优 点，也存在一些问题，列表分析如下。 从上表可以看出，原核生物、酵母菌生物反应器所具有的优点，在植物和 动物生物反应器不具备；相反地，植物和动物生物反应器所具有的优点恰是原核 生物、酵母菌生物反应器所没有，它们各有优缺点。 银耳是一种真核生物，其生活史如下图。 香灰菌伴生 银耳的双型性赋予其既有原核生物、酵母菌生物反应器所具有的优点，又有 植物和动物生物反应器的优点，是个很好的受体菌，本实验的目的旨在尝试构建 一种同时具备上述四种生物反应器的优点，克服其缺点的生物反应器，将极大促 进药用蛋白、抗体、口服疫苗等基因工程产品的研发与生产。 4 福建农林大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 人乳铁蛋白及其遗传转化研究进展 1 1 乳铁蛋白的结构与功能 人乳铁蛋白( h u m a nl a c t o f e r r i n ，h l d 是一种属于铁结合蛋白家族的糖基化蛋 白【”，由s o r e n s e n 和h e r e m a 【2 】首次发现，并由b l a n c 和i s l i k e r 命名。乳铁蛋白 可以可逆性地结合两个铁离子，其离子结合强度是运铁蛋白f 在体内对铁起运输 作用的主要蛋白1 的3 0 0 倍【”。人乳铁蛋白由6 9 2 个氨基酸组成，分子量约为8 0 k d ( 4 1 ，其结构见图1 1 。在乳铁蛋白内有2 个具有铁离子结合能力的叶状结构， 一个是氨基端区，即n 1 0 b e ，另一个为羧基端区，即c l o b e i s 。两区间有4 0 的 同源氨基酸序列。每个区能结合一个铁离子，同时结合1 个二价炭酸根阴离子。 人乳铁蛋白为n 端连接的糖基所修饰。经酶促反应，一个寡聚糖苷链以共价键 结合在以a s n x a a t 1 1 r s e r 顺序排列的天冬酰胺酸残基上 4 1 。人乳铁蛋白有3 个可能被糖基化的位点，分别位于c 叶的第1 3 8 的天冬酰胺酸残基、n 叶的第 4 7 9 、6 2 4 天冬酰胺酸残基上【4 】。在3 个位点中，位于1 3 8 、4 7 9 的天冬酰胺酸残 基优先被糖基化，第6 2 4 的天冬酰胺酸残基的糖基化受第4 7 9 位天冬酰胺酸残基 糖基化的【7 j o 嚣嚣器一嚣器嚣： 图1 1 人乳铁蛋白构象 f i g1 1c o n f o r m a t i o no fh u m a nl a c t o f e r r i n 乳铁蛋白广泛存在于哺乳动物的体液和嗜中性粒细胞的次级颗粒中，乳铁蛋 白具有的生理功能主要包括：广谱的抗菌功能、抗炎症功能和免疫生理调节功能 1 8 】。这些功能是通过乳铁蛋白直接获取铁离子或结合在细胞表面而使菌体细胞通 透性增加实现的【9 1 。乳铁蛋白可结合发生炎症区域的铁离子，从而阻止游离的铁 离子参与催化有害的氧化反应。乳铁蛋白同时也能影响t 细胞的扩增反应【1 0 1 。一 些研究表明，乳铁蛋白在体内的抗菌作用远比体外强。这可能是由于乳铁蛋白上 存在着抑菌和潜在的免疫调节功能区。在体内，乳铁蛋白通过与体内的细胞结合 5 f蕊+i蕊0 福建农林大学硕士学位论文 而发挥抗菌和免疫调节作用【1 1 l 。人乳铁蛋白的许多生理功能的发挥有赖于与特异 性细胞受体的结合【1 2 1 。现己发现人乳铁蛋白受体存在于多种细胞，如肠细胞、血 小板、哺乳动物上皮细胞、淋巴细胞等【t 3 , 1 4 。其它人乳铁蛋白潜在的功能还包括 对骨髓细胞生成的调节、有氧代谢的产生1 1 5 】、生长因子作用、d n a d d 合功能【1 6 1 、 r n a 酶功能等。但乳铁蛋白的某些生物学功能还不甚明了，尚有待于进一步的研 究工作阐明。 人乳铁蛋白的多功能属性引发了人们对其编码基因的研究，以便在此基础上 对该蛋白进行大规模生产。p o w e 和o g d e n l l 7 1 、r e y 1 8 】等宅e 1 9 9 0 年首次分别发表 了人乳铁蛋白的c d n 州芋列和部分基因组序列。后来的研究表明，人乳铁蛋白基 因位于人的第3 号染色体q 2 1 q 2 3 的位置，全长约3 5 k b ，共有1 7 个外显子组成，内 含子的大小在3 0 0 b p 3 3 k b ；之_ n t ”】。基于人乳铁蛋白基因的研究，许多研究者开 始致力于这一转基因的研究，以了解通过转基因的方式大量生产重组人乳铁蛋白 的可能性及重组人乳铁蛋白的性质。人乳铁蛋白转基因研究的最终目的是通过转 基因技术生产大量功能上与人乳铁蛋白相同或相近的重组人乳铁蛋白，使之为人 类造福。 1 2 人乳铁蛋白转基因研究 过去入们曾以真菌、酵母菌、植物、动物细胞系和动物为宿主进行了人乳铁 蛋白的转基因研究。表1 1 概括了该方面研究的情况。 在过去的研究中，人乳铁蛋白c d n a 曾广泛用于各类转基因研究中。这主要 是因为人乳铁蛋白c d n a y _ , 基因组全序列基因更易获得，由于c d n a 序列较短， 也更易于被构建到表达载体中去。同时，c d n a 可用于原核生物的表达，也使它 较早地被用于转基因研究中。l i n g 并1 r i c h a r d s o n 2 2 1 1 9 9 3 年首次报道了重组人乳铁 蛋白在酵母菌中表达的研究。在该研究中，人乳铁蛋白和酵母菌蔗糖酶信号序列 区分别用于引导重组人乳铁蛋白的分泌。含酵母菌蔗糖酶信号序列的酵母菌有较 高的重组人乳铁蛋白表达量，而含人乳铁蛋白信号序列的酵母菌则重组人乳铁蛋 白的表达量很低。在真菌中，a s p e r g i l l u s 菌种在自然条件下分泌糖基化蛋白，这 种属性使它成为一种理想的表达重组糖基化蛋白的宿主1 3 2 】，现在它已经用于糖基 化蛋白的商业化生产 3 3 1 。已经有用人乳铁蛋白基因转化真菌a s p e r g i l l u sn i d u l a n s 和a s p e r g i l l u sa w a m o r i 的报道 2 0 2 ”。在此两项研究中，在宿主中商表达的基因的 启动子用于引导重组人乳铁蛋白的表达。在a s p e r g i l l u s a w a m o d 中，人乳铁蛋白 c d n 卿在a s p c r g i l l u sa w a m o r i 高效表达的葡糖糖化酶基因连接在一起，中间用 k e x - 2 切割位点隔开。经过翻译，融合蛋白用k e x - 2 切割，形成单独的重组人乳 铁蛋白。在此研究中，在表达重组人乳铁蛋白的转化子中引入突变，可获得较高 的重组人乳铁蛋白的表达量( 2 0 0 01 1g m l ) 。此表达量是迄今为止在酵母菡、 6 福建农林大学硕士学位论文 真菌和细胞系的入乳铁蛋白转基因研究中重组人乳铁蛋白表达量最高的【1 争矧。这 可能是因为采用了融合的方法进行转染并w _ 。a s p e r g m u sa w a m o r i 作为转基因宿主 的缘故。根据以往研究的结果，转基因所用宿主、启动子和分泌信号区序列显著 影响着重组人乳铁蛋白在酵母菌、真菌和细胞系中的表达水平。由于人乳铁蛋白 抗菌的作用，影响了一些酵母菌和真菌的正常生长，在培养后达不到较高的浓度， 它们的生长被分泌的重组人乳铁蛋白所抑制。这样，选择对重组人乳铁蛋白抑菌 作用不敏感的细菌就显得很重要。当转基因寄主的自身基因的启动子和信号区序 列用于转基因研究时，往往会得到较高的外分泌重组人乳铁蛋白的表达水平。到 目前为止，还没有人乳铁蛋白全基因在真菌和细胞系内进行转基因研究的报道。 在这方面还有待进一步的研究。对植物进行乳铁蛋白转基因研究的最初目地是生 产大量的重组人乳铁蛋白并增强植物对细菌、真菌以及酵母菌的抵抗能力。对重 组人乳铁蛋白在烟草和土豆中的表达已有报道【”2 6 j 。在这些研究中，人乳铁蛋白 c d n a 和c a m v 的启动子整合在一起对植株进行转化，重组人乳铁蛋白在植株中 得到了正确表达。但在实验中对植株抗病菌能力的提高尚未有报道，在这方面尚 有待于进一步的研究证实。人乳铁蛋白基因组全序列在植物中转基因的研究尚未 有报道。1 9 9 3 年p h t e n b u r g 等【卅首次报道了人乳铁蛋白基因转基因小鼠获得了成 功。早期该领域的研究仅局限于人乳铁蛋白c d n a 。后来的研究发现，携带有人 乳铁蛋白基因组全序列的转基因小鼠分泌的重组人乳铁蛋白的量远高于携带有 人乳铁蛋白c d n a 的量。1 9 9 7 年n u i i e 舾等i 勰】分别用人乳铁蛋白c d n a 和人乳铁蛋 白全基因组序列片段与a l p h a s l c a s e i n 基因启动子相连接构建成乳腺组织特异 性表达载体。结果显示，c d n a 转基因小鼠重组人乳铁蛋白的表达范围为4 0 0 1 3 0 0ng m l ，而在基因组全基因片段的转基因小鼠中荛1 3 0 0 3 8 0 0ug m l 。 1 9 9 9 ：年k i l n - - 等p 1 i 进行的转基因实验中显示，在同时用b e t a - e a s e i n 作为启动子的情 况下，含人乳铁蛋白基因全序列片段的转基因小鼠的泌乳量最高可达6 6 0 0l ig m l ，而用c d n a 得到的转基因小鼠的重组人乳铁蛋白的表达量不超过3 0pg m l 。2 0 0 2 年刘兆良等p 2 谰含有人乳铁蛋白基因全序列及其完整调控序列的 b a c 大片段进行转基因小鼠研究，得到最高重组人乳铁蛋白表达量为7 8 0 0 1 1g m l 。在大家畜的转基因研究中新西兰科家学v 柚b e r k e f 等p 3 l 以人乳铁蛋白基 因全序列片段和as 1 c a s e i l l 基因启动子构建载体，经过近1 0 年努力终于成功获得 了人乳铁蛋白转因牛。总体来看，用人乳铁蛋白全基因序列比用其c d n a 序列为 转基因材料得到的重组蛋白表达量高。在转基因研究中，有些情况下，用c d n a 作为转基因材料可得到较高的重组蛋白的表达量。如人体蛋白c 的r c o n a t - 1 “】，人 i g f - ic d n a l 3 5 1 ，和人e p oc d n a 等p 6 l 。但在另外一些情况下，用c d n a 转基因得 不到高表达量。为此，有研究采用了模式附着元僻：( m a t r i xa t t a c h m e n t e l e m e n t s ， 7 福建农林大学硕士学位论文 m a r s ) ，位点控制区域( 1 0 c 瑚c o n t r o l r e g i o 璐，l c r s ) ，或y a c 克隆等克服位置效 应，以获得高表达量的重组外源蛋白p 1 3 2 删。以往的工作表明，有一些基因的内 含子内存在着正向的或负向的调控元件，调控着基因的表达人乳铁蛋白转基因 的研究表明，在人乳铁蛋白基因内部存在着重要的调控元件，对人乳铁蛋白的表 达发挥着正向的调控作用。现在尚需进一步的研究以调查人乳铁蛋白内含子内调 控元件对表达起调控作用的机理。过去，对哺乳动物的人乳铁蛋白转基因的研究 主要局限在小鼠上，对大家畜少有涉及。对牛、羊等大家畜进行人乳铁蛋白的转 基因研究将是下一步的发展方向。 表1 1 人乳铁蛋白转基因研究的概况 墅b 】e ! ! 婴! ! ! ! ! ! 里! 旦! 生壁皇兰至! ! ! ! 塑! ! 堡墨! ! ! 转基因宿主址，基因序列启动子r h l f 表达水平 作者及发表年代 t r l e 8 9 e m c h o s th l f s e q u e r e e p m m a t e rm e x p r e s s i n g l e v e l p u b l i s h e d f e a r & a u t h o r 8 福建农林大学硕士学位论文 1 3 对重组人乳铁蛋白主要理化性质和生物活性的分析 人乳铁蛋白转基因研究的最终目的是生产在生物活性、功能方面与天然人乳 铁蛋白相同或相似的重组人乳铁蛋白，使之造福于人类。于是，对重组人乳铁蛋 白的理化性质和生物活性的分析与鉴定就显得特别重要。现在已建立起一些鉴定 重组人乳铁蛋白主要理化性质和生物活性的方法，主要包括免疫属性鉴定，氨基 酸序列分析，铁离子结合能力的测定，糖基化的分析，生物结合能力的分析，抑 菌能力的测定等。到目前为止，就得到的实验结果来看，重组人乳铁蛋白的生物 活性的测定是很乐观的。 n 端测序分析的结果表明，重组人乳铁蛋白与人乳铁蛋白的序列一致 f 2 2 。8 j 3 j 9 1 。1 9 9 6 年n u i i e n s 等i 冽的小鼠免疫实验中，用人乳铁蛋白注射人乳铁蛋 白转基因小鼠，发现在1 1 只转基因鼠中有9 只没有发生免疫抗性反应，而作为对 照的注射过人乳铁蛋白的非转基因小鼠则都产生了免疫应答反应。这一结果表 明，在人乳铁蛋白转基因小鼠中，进人体内的人乳铁蛋白已被免疫系统所承认， 而不被认为是侵入体内的抗原【勰】。 金属离子与人乳铁蛋白的结合可改变蛋白的构象，在进行s d s - p a g e 凝胶电 泳时的迁移率较没有结合金属离子时快。人乳铁蛋白在p h4 0 时释放出铁离子， 在p h2 5 时完全和铁离子分离。重组人乳铁蛋白铁离子的结合属性在以往的研究 中已被证明和人乳铁蛋白完全一致【2 2 2 3 , 2 8 , 3 3 3 9 】，但有报道称，重组人乳铁蛋白比 人乳铁蛋白的铁饱和程度高f 2 8 1 。 蛋白糖基化具有组织特异性和物种特异性 4 0 , 4 1 1 因而重组人乳铁蛋白和人乳 铁蛋白在糖基化方面有所不同。在进行s d s p a g e 凝胶电泳时，重组人乳铁蛋白 的带型有些弥散，不象人乳铁蛋白那样界线分明。这主要是由于在重组人乳铁蛋 白中杂合型的糖基化造成的。但在相同条件下经肽n 糖基化酶的消化，在 s d s p a g e 电泳时表现出相同的分子量【2 2 郐3 3 舶】。毛e v a nb e r k e l 等p 川的研究中， 在人肾脏细胞中转人人乳铁蛋白基因，使其表达人乳铁蛋白。同时，在同类细胞 中加入可阻断糖基化的衣霉素，表达没有糖基化的人乳铁蛋白。结果表明，没有 糖基化并不影响人乳铁蛋白的主要属性，如在体内的抗菌和抗炎症功能。但没有 糖基化的人乳铁蛋白比糖基化的乳铁蛋白更容易被胰蛋白酶所消化。这表明糖基 化对人乳铁蛋白的主要功能没有显著影响，但对其稳定性也许是重要的。 9 福建农林大学硕士学位论文 在抗菌功能方面，在研究中已发现人乳铁蛋白转基因小鼠对s t a p h y l o c o c c u s a u r e n u s 菌有更强的t h l 反应【4 2 1 。人乳铁蛋白对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑制作 用【2 4 2 s , 4 3 4 4 1 。对预先注射过重组人乳铁蛋白和没有预先注射过重组人乳铁蛋白的 小鼠注射致死量的大肠杆菌0 7 8 ：h l l ，结果表明，预先注射过重组人乳铁蛋白 的死亡率显著低于对照组。有研究表明，重组人乳铁蛋白在体外可抑制多种细菌 的生长【2 1 】。人乳铁蛋白的结合属性与其抗菌和抗消炎作用密切相关。研究发现重 组人乳铁蛋白对d n a 、h l z 、l p s 脚j ”、某些抗体以及对表达乳铁蛋白的细胞的 结合属性与人乳铁蛋白相同吲。 尽管许多人乳铁蛋白的生物活性已被科学家所证实，但重组人乳铁蛋白在体 内的细致功能尚有待于实验研究的进一步阐明。 1 4 人乳铁蛋白转基因研究的展望 在过去的2 0 年时间里，人乳铁蛋白转基因研究已取得了很大进展。一些成功 的转基因系统可得到较高表达量的重组人乳铁蛋白( 高于1 9 l ) 。许多重组人乳 铁蛋白的属性与人乳铁蛋白相同。但离最终通过转基因方法大量生产有生物活性 的重组人乳铁蛋白并使之造福于人类的目标还有一段不小的距离。下列一些方面 尚有待于实验工作进一步阐明：用人乳铁蛋白基因基因组全序列片段研究在大 家畜( 牛、羊等) 乳中表达具有生物活性的重组人乳铁蛋白的可能性；在酵母菌 等真菌中以人乳铁蛋白基因基因组全序列进行转基因研究，以期得到高表达量的 重组人乳铁蛋白；重组人乳铁蛋白在生物体内的功能尚需进一步的研究；对 于重组人乳铁蛋白与人乳铁蛋白不同的属性，应作为重点做细致研究，以调查其 对人类潜在的副作用。 2 食用菌遗传转化研究进展 2 i 筛选标记 2 i 1 营养缺陷型标记 目前已报道的利用营养缺陷型作为筛选标记的有u r a l ( 二氢乳清酸) 基囚、 p a b l ( p 一氨基苯甲酸) 基因及t r p 2 ( 色氨酸) 基因，分别应用于杨树菇m 1 鬼伞 双孢蘑菇1 遗传转化研究。 2 1 2 抗性标记 抗生素抗性标记在植物、真菌、细菌等的遗传转化子筛选上广泛应用，主要 有h y g 。、k a n 。、p h l 、b l e 。等。在食用菌方面，h y g 在蘑菇的遗传转化已有应用删， 但糙皮侧耳、草菇对潮霉素不敏感1 。h o n d a ( 2 0 0 0 ) 报道了利用杀菌剂c a r b o x i n 作为标记用于平菇的遗传化洲，j i aj h ( 1 9 9 8 ) 报道了利用代谢产物撷抗剂 5 - f l u o r o i n d o l e 作为标记转化平菇和草菇o ”都取得成功。 福建农林大学硕士学位论文 2 i 3 绿色荧光蛋白( g f p ) 标记 自1 9 9 4 年c l a l f i e 首次在异源细胞表达g f p 以来o ”，g f p 标记得到应用。 1 9 9 9 年，周炜等在裂殖酵母表达了g f p o ”，证明g f p 可应用于真核微生物。c h e n x 等人h 8 1 于2 0 0 0 年以潮霉素为选择性标记转化蘑菇，经过改造的e g f p 已进入基 因组，但没有表达，他们认为可能是m r n a 加工错误或密码偏好问题。 2 2 启动子 目前已分离的并用予食用菌遗传转化研究的启动子主要有两种：r a s 启动子 和g o d 启动子。r a s 基因是从香菇分离到的o “，后来在鬼伞中也分离到r a s 基因 ，该基因的产物能激活腺苷酸环化酶的活性，参与调节细胞中c a m p 水平，在 菌丝生长和子实体形成过程中有很高的转录水平。r a s 启动子已用于鬼伞表达外 源基因的研究。6 ”3 。g p d 基因是糖酵解途径的关键酶基因，它的启动子最早从酿 酒酵母中分离获得，并己证明它具有很强的调控外源基因表达的能力。该启动子 已用于蘑菇外源基因h p t 、草菇和平菇外源基因t r p3 “表达的启动子“。 最近h i r a n ot 等人从香菇中分离g o d 启动子并证实g o d 启动子比r a s 启动子具 有更强的调控外源基因表达的能力。 2 3 遗传转化方法 食崩菌的遗传转化己进行了多种途径的尝试，包括p e g 介导转化“。“”1 、 电激转化“7 “、基因枪转化嘟“6 ”“、限制性内切酶介导转化懈。”4 “7 “、 农杆菌介导转化“”7 ”等。其中p e g 介导法需要制备原生质体，有些食用菌的 原生质体再生率还比较低( 如平菇为1 2 左右) ，p e g 对原生质体有一定的毒性， 变异率较高，转化率又较低。电激转化法仍然是需要制备原生质体，转化率与 p e g 法差不多，但操作较为简单。基因枪转化法无需制备原生质体，可用菌丝体 也可用子实体的组织块，操作简单，转化率也较高；限制性内切酶介导转化法是 九十年代发展起来的一种较为高效的转化方法，在其它真菌中应用的转化率与 p e g 法和电激转化法相比可提高2 0 6 0 倍。农杆菌介导转化在植物已有广泛应 用，在真菌上1 9 9 8 年d eg r o o tm j a 等人首先引用，并获得较高的转化率”3 ，2 0 0 0 年c h e nx 把农杆菌介导应用于蘑菇上1 ，取得成功。上述文献报道的转化率都 在5 0 个转化子u g d n a 以下。 3 银耳的食药用价值与品质改良 3 1 银耳的食药用价值 自古以来，银耳都被视为滋补食品。历代医书对银耳的滋补作用评述为：味 甘、性平，入肺、胃、肾三经，有滋阴润肺、养胃生津、补。肾益精以及强心健脑 胂】的作用，对身体虚弱、久病初愈者能起到滋养强壮、加速康复的功效。 从古到今，银耳也被视为名贵的药用菌。历代医家的著述中都认为银耳有“补 福建农林大学硕士学位论文 肾、润肺、生津、止咳”功效。中国药物大辞典中对银耳的用途写道，“主治 肺热咳嗽，肺燥干咳，久咳喉痒，咳痰带血或痰中血丝或久咳络伤胁痛，及肺痈， 肺瘘、妇人月经不调，肺热胃炎，大便闭结，大便下血”。 近代研究表明，银耳的主要药用成份是多糖，从银耳子实体分离获得的多糖 有5 种( 酸性多糖、中性杂多糖、酸性低聚糖、胞壁多糖、胞外多糖) 。银耳多 糖具有强心、延缓衰老、抗血栓、降血脂、降血糖、抗肝炎、抗突变、抗肿瘤、 提高免疫力、抗辐射等功效【舳】。 银耳也具有丰富的营养价值，据分析，银耳干品一般成分为粗蛋白质4 6 、 脂肪0 2 、总碳水化合物9 4 8 、纤维1 4 、灰分0 4 。每一百克银耳干品含： 维生素b 1 0 1 m g 、维生素b 2 0 3 m g 、维生素c a 9 m g 、维生素p p 7 2 m g 、钙2 9 m g 、 磷3 8 1 m g 、铁4 4 m g 、钠7 2 m g 、钾4 5 1 m g 。 3 2 银耳的遗传育种 银耳目是非典型的双因子交配系统【8 。陈明等【8 2 1 以古田银耳为材料，经担 孢子弹射，稀释分离法获得2 8 个银耳芽孢单孢分离物。单孢配对试验结果表明， 银耳为双因子控制的四极性异宗结合担子菌，由同一银耳子实体可得到4 种不同 交配型的银耳芽孢，它们之间的交配反应受两个因子控制，a ( a ) 和b ( b ) ， 其中a 因子控制配对芽孢萌发管的产生，b 因子控制配对产生的萌发管能否形在 具锁状联合中的双核菌丝。 长期以来，银耳菌种的选育主要依赖于野生种的驯化，目前使用的银耳品种 如t r 0 1 、t r 0 5 、t r 2 1 、t r 5 2 、t r 7 6 ，t r 9 6 、t 9 4 8 6 等均是野生种分离纯化获得【8 l 】。 稔碧如【蚓以三明和湖北野生子实体为材料，通过弹射担孢子，萌发出芽孢后 挑取单菌落进行配对，进行出耳品比试验后获得高产菌株t r 8 0 4 。这是目前为止 唯一的一篇杂交育种报道。 3 3 银耳品质改良的研究 基因工程技术作为育种工作的一个突破，为银耳拓宽可利用的基因库创造了 条件。这就使得我们可以按照事先计划好的方案引发定向变异，改良银耳品质。 基因工程在银耳品质改良上的优越性主要表现在以下几方面：( 1 ) 打破了生殖隔 离，为拓宽银耳可利用基因库创造了条件，并提供了新的创造变异的技术手段； 伫) 通过改良银耳品质的关键性状提高银耳营养。( 4 ) 随着对基因工程认识的不 断深入、新基因的克隆和转基因技术手段的完善，对多个基因进行定向操作，使 银耳营养更加丰富、全面成为可能，这在常规育种中是难己想象的。 因此，利用基因工程技术定向选育银耳菌株，迸一步提高它的营养保健价值， 具有很重要的意义。 福建农林大学硕士学位论文 4 本研究的目的和意义 乳铁蛋白是种具有多种生物学功能的蛋白质，已经证明的功能包括：广谱 抗菌、抗病毒感染作用：促进肠道对铁的吸收及调节体内铁的平衡；调节骨髓细 胞的生成，促进细胞的生长：调节机体免疫功能，增强机体抗病能力；抑制人体 肿瘤细胞的生长，具有预防及治疗肿瘤的作用；能同多种抗生素及抗真菌制剂协 同作用，更有效地治疗疾病等。把人乳铁蛋白基因转入银耳，让它合成具有生物 活性的人乳铁蛋白，相当于在银耳中添加新的营养保健因子。此外，乳铁蛋白具 有广谱抗菌抗病、促进铁吸收功能，若把它转入银耳，还可望提高转基因银耳菌 株铁的含量，增强转基因菌株抗菌、抗病性，用作遗传育种抗源。因而具有重要 的意义。 银耳是一种重要的食药用菌。通过基因工程技术，进一步提高银耳特殊营养 成分和保健品质，将有利于银耳的产业升级和产业化开发，因而具有巨大的潜在 社会效益和经济效益。 1 3 福建农林大学硕士学位论文 第二章银耳遗传转化标记 银耳是一种著名的食用菌，又是一种重要的药用菌，即可以大量人工栽培， 又可利用其无性型( 芽孢) 进行发酵生产，如果能作为生物反应器将有特殊的优 势。但是，银耳的基础研究甚少，目前还没有遗传转化及其相关报道。本实验对 银耳的遗传标记进行了初步研究，以期对银耳转化载体选择和构建提供依据。 1 材料和方法 1 1 供试菌株 大肠杆菌( e s c h e d c h i ac o l i ) d h 5a 和携带p c a m b i a l 3 0 1 质粒的d h 5a 由华 南农业大学食科系林俊芳教授赠送。银耳( t r e m e l l af u c i f o r