（农药学专业论文）地衣芽孢杆菌l3发酵工艺优化及应用研究.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 摘要 本课题对地衣芽孢杆菌l 3 发酵培养基进行了优化研究。在单因素试验的基础 上，采用p l a c k e t t b u r m a n 设计确定了碳源、豆饼粉和k e h p 0 4 显著影响芽孢形成和 菌体数量。通过最陡爬坡路径试验、综合中心组合设计和响应面分析法得出最优培 养基组成为：豆饼粉8 9 l 、k 2 h p 0 42 9 l ，碳源3 2 2 0 9 l ，m g s 0 40 5 ：g l ，酵母膏 2 5 l ，地衣芽孢杆菌l 3 的活菌体数目可以达到1 0 0 2 x 1 0 8c f u m l ，比初始培养基 发酵水平提高近一倍。 通过对摇床的培养条件进行优化，得到最佳接种量为4 ，装液量为 2 5 m l 2 5 0 m l ，转速2 0 0 r m i n ，消泡剂豆油( 1 0 0 0m g l 一3 0 0 0m g l ) 或泡敌( 1 0 0m g l 3 0 0m g l ) 。1 6 l 发酵罐的活菌体数目为9 2 7 x 1 0 8c f u m l ，比初始( 5 2 7 x 1 0 8c f u m l ) 提高了7 0 0 9 。 初步试验表明地衣芽孢杆菌l 3 的发酵液对多种作物有一定的增产作用。通过分 别研究l 3 发酵液、发酵上清液及菌体，田间对玉米、棉花增产作用和盆栽对水稻、 小白菜增产作用，得出地衣芽孢杆菌l 3 发酵液对玉米、棉花等有显著的增产作用， 并且主要是菌体起作用，对旱田作物的效果优于水田作物。 关键词：地衣芽孢杆菌l 3 ：发酵培养基；响应面法；田间试验 地衣芽孢杆菌l 3 发酵条件优化及应用研究 a b s t r a c t o p t i m i z a t i o no fb a c i l l u sl i c h e n r m i sl 3f e r m e n t a t i o nm e d i u mi nt h i sr e s e a r c h b a s e do nt h e s i n g l e f a c t o rt e s t ，c a r b o ns o u e c e ，s o y b e a np o w d e ra n dk 2 h p 0 4w e r e d e t e r m i n ea sn e c e s s a r yf o rs p o r ef o r m a t i o no fb a c i l l u s 矗c h e n i f o r m i sl 3t h r o u g ht h e p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n t h em e d i u mc o n s i s tw i t hs o y b e a r lf l o u r8 9 | l ，k 2 h p 0 42 9 | l ， c a r b o n3 2 2 0 9 | l ，m g s 0 4q 5 9 | l ，y e a s te x t r a c t2 5 9 | lw e r ed e f i n e da st h eo p t i m u m m e d i u mf o rb a c i l l u s 办c h e n i f o 删括l 3g r o w t ha n ds p o r ef o r m a t i o n ，t h r o u g ht h ec e n t e r c o m b i n a t i o no fd e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s f e r m e n t a t i o nw i t ht h eo p t i m u m m e ：d i u ma c h i e v e dl i v eb a c t e r i a10 0 2 x10 8 c f u m l n e a r l yd o u b l et h a nt h a tw i t ht h ei n i t i a l c u l t u r em e d i u m t h r o u g ho p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n s ，t h eb e s ti n o c u l u mo fl i q u i dw a s4 ， 2 5 m l 2 5 0 m l ，s p e e do n2 0 0 r m i n ，u s et h ed e f o a m e ro i l ( f r o m10 0 0m g l t o3 0 0 0m g l ) o rt h eb u b b l ee n e m y ( f r o m l0 0m g | lt o3 0 0m g | l ) t oe l i m i n a t i o nt h eb u b b l e 。o nt h e 16 lf e r m e n t o r , t h en u m b e ro fv i a b l ec e l l s9 2 7 10 8c f u m l i n c r e a s e d7 0 0 9 t h a n t h ei n i t i a l ( 5 2 7x1 0 。c f u | m e ) o n e p r e l i m i n a r ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h eb a c i l l u sl i c h e n i f o ，7 竹括c o u l de x c i t et h e g r o w t ho fs o m ec r o p s t h i st o p i c sc a r r i e do u tt h er e s e a r c ho nt h ey i e l di n c r e a s eo n t o m ，c o t t o n ，r i c ea n dc a b b a g eb yt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h ，s u p e m a t a n ta n dp e l l e to fb a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sl 3r e s p e c t i v e l y r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho fb a c i l l u s l i c h e n i f o 删西l 3s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h ep r o d u c t i o no fc o m ，c o t t o ne t c f u r t h e r m o r e ， t h i si sm a i n l yc a u s e db yt h ep e l l e to ft h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho fb a c i l l u sl i c h e n 聊z 括l 3 t h ee f f e c to fu p l a n dc r o p sw e r eb e t t e rt h a np a d d yf i e l dc r o p s k e yw o r d s ：b a c i l l u sl i c h e n r m i sl 3 ；f e r m e n t a t i o nm e d i u m ；r e s p o n s es u r f a c em e t h o d ； f i e l de x p e r i m e n t 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 0 ； 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生张去，凰砷帆神7 年，r 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书。 始赵刚尹锄鲐桫 签名日期：沙叼年r 月，r 日 签名日期： z 移矽年厂月厂厂日 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 1 前言 1 1 芽孢杆菌的研究现状 1 1 1 芽孢杆菌的特征 芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 由形态上呈直或近直的杆状，产生抗逆性内生孢子，好 氧或者兼性厌氧，革兰氏阳性( 也发现有革兰氏阴性) ，化能异氧型的细菌组成。芽 孢杆菌在自然界分布广泛，能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很 强抗性的芽孢，可忍受各种不良环境，如可以在p h 为2 3 的地方生存，也可以在 温度高达8 0 甚至以上的地方生长，南极寒冷的冰雪中也能见到它们的踪迹 ( s l e p e c k yr a ，1 9 7 5 ) 。其生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。 芽孢杆菌属中，除了炭疽芽孢杆菌( b a n t h r a e i s ) l 发动物的炭疽热，蜡样芽孢杆菌 侣c e r e u s ) 容易造成人体肠胃炎外，其它种类的芽孢杆菌通常是不致病或者是机会致 病菌，其中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为“公认安全( g r a s ) ”的细菌( 南庆贤等， 2 0 0 4 ) ，可产生多种抗生素( 包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸 类物质) 、小分子细菌素、抗菌蛋白、溶菌酶等，对多种动、植物及人类病原菌起到 很好的抑制作用。 1 1 2 芽孢杆菌的分类 芽孢杆菌的分类依据几经演变，目前主要根据芽孢的有无，菌体的形状，革兰 氏染色，是否好氧生长来划分；其中芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分 类和鉴定中的重要指标。目前，有关芽孢的生理性质、生化组成以及生孢形态学和 遗传学研究已经成为一个非常重要的领域，其中枯草芽孢杆菌的孢子生成的研究已 经成为原核生物分化的最好范例。目前有关生孢遗传学的热点是进一步弄清芽孢形 成的连续事件过程中的信息传导及遗传控制之间的关系，导致对数生长结束的环境- 信号、外界信号的刺激和内部反应( 包括细胞的营养水平、细胞密度和细胞周期信 i 本课题由武汉天惠生物工程有限公司提供资助 地衣芽孢杆菌l 3 发酵条件优化及应用研究 号) 。对芽孢形成的诱生是通过双组分磷酸化途径完成的。到目前为止，尚不清楚起 到作用的那些环境因子的本质，这些信号在传递过程中所发生的具体化学反应的细 节更有待进一步研究。随着分子生物学水平的发展，芽孢杆菌的分类也不再只局限 于形态和理化性质的研究，而转向分子水平的分类，例如许多新分离的芽孢杆菌菌 株就是设计引物扩增其16 s r r n a ，确定其所属的种。 1 1 3 芽孢杆菌的研究进展 对于芽孢杆菌研究已经有一百多年的历史，其中的苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u s t h u r i n g i n e n s i s ，b t ) 研究最为广泛，自1 9 0 1 年发现首个亚种以来一个多世纪研究从未 停止。目前对于芽孢杆菌的研究仍然方兴未艾，其中很大一部分工作，特别是近些 年来主要集中在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者是通过诱变、基因 工程等手段对属于芽孢杆菌属的生产菌进行改造( 王红革等，1 9 9 7 ；陈玮等，1 9 9 7 ； 冯清平等，1 9 9 6 ) 。 然而，分子生物学手段在芽孢杆菌领域的应用并不意味着可以忽视自然界天然 野生菌株资源的调查、分离和收集工作。如果没有优良的出发菌菌株多样的原始基 因，分子生物学、细胞学等方法、手段就成为无本之木、无源之水。调查特定区域 内芽孢杆菌的资源，分离和描述具不同生理特性的菌株，分离、保藏新的菌种、变 种可以不断补充现有的微生物资源库。李荣森等在1 9 8 7 - 、一1 9 8 9 年对云南、贵州、四 川、陕西等西南4 省的2 6 个县土样中的苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌资源进行了 调查，并初步探讨了不同土壤条件下的检出率，戴顺英等则于1 9 9 2 1 9 9 4 年开展1 2 个省土壤中苏芸金芽孢杆菌的资源研究，并且分析了土壤p h 、土壤植被对苏芸金芽 杆菌分布的影响( 李荣森等，1 9 9 0 ；黄洋，1 9 9 6 ；戴顺英等，1 9 9 6 ) 。 随着经济的发展，对在工、农、医等方面有重大应用价值的芽孢杆菌资源的开 发利用更具有重要意义。通过对芽孢杆菌属细菌的研究，一方面可以积累其分布规 律资料，为正确制定相应的保护措施提供理论依据；另一方面也可了解芽孢杆菌与 生态环境间的相互关系，为芽孢杆菌资源的持续利用奠定基础( 郝文英等，1 9 8 3 ； 尹瑞龄等，1 9 9 5 ；李振高等，1 9 9 5 ) 。 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 1 2 地衣芽孢杆菌的应用及研究进展 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o t r o i s ) 是一种革兰氏阳性细菌，在自然界分布 广泛，可产生多种抗生物质。目前，地衣芽孢杆菌已广泛应用于医药、农药、食品、 饲料加工、环境污染治理等各个行业，是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一。近 年来，国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道不断增多，受关注程度日益加强。 1 2 1 农业植物病害防治上的应用 地衣芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，对一些植物病原菌有较好的抑制作用。因 此，将其抗菌物质开发为生物农药，成为研究的热点。从2 0 世纪8 0 年代开始，将 地衣芽孢杆菌应用于植物病害防治的研究已经起步。目前，国内登记的地衣芽孢杆 菌农药制剂为8 0 亿个活芽孢m l 地衣芽孢杆菌水剂，由广西金燕子农药有限公司 生产，用于防治黄瓜( 保护地) 霜霉病( 刘刚，2 0 0 7 ) 。 1 2 1 1 抗菌物质 地衣芽孢杆菌所产生的抗菌物质主要是一些蛋白类抗菌物质，如几丁质酶、抗 菌蛋白、多肽类等。国外还有报道指出，地衣芽孢杆菌可产生苯乙酸一类的抗菌物 质。抗菌物质抑制植物病原菌的途径有：作用于病原菌的细胞壁、细胞膜；与膜相 关的受体蛋白相互作用；作用于能量代谢系统；提高植物的抗病力( 蒙显英等，2 0 0 4 ) 。 地衣芽孢杆菌产生的抗菌物质多为肽类，其中以杆菌肽( b a c i t r a c i n ) 为代表。杆 菌肽最早为( j o h n s o ne ta 1 ，19 4 5 ) 从b a c i l l u ss u b t i l i sv a t t r a c y ( m e l e n e y ，19 4 9 改名为 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sv a r t r a c y ) 菌株中分离得到的一种环状肽类抗菌物质，分子量为 1 4 i ，其水溶液在弱酸性( p h5 7 ) 较稳定，在p h 9 0 以上易失活，对热敏感，并且 杆菌肽的抑菌活性需要依赖二价的金属离子，如z n 2 + ，c 0 2 + ，n i 2 + 和c u 2 + 等，其中以 锌对其活性的增强作用最大。至今已经发现了9 种杆菌肽成分，其中以b a c i t r a c i na 活 性最高。 几丁质是植物病原真菌细胞壁结构的主要成分，因此利用产几丁质酶的微生物制 备生物杀菌剂和用于培育抗病转基因植物广受关注。顾真荣等人报道了产几丁质酶的 地衣芽孢杆菌对油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌均有较好的抑制效果。 地衣芽孢杆菌”发酵条件优化及应用研究 通过试验表明，此菌株的抑菌效果与产几丁质酶有关。对其它影响抑菌的因子还有待 试验的进一步证明( 顾真荣等，2 0 0 1 ) 。 溶菌酶( l y s o z y m e ) 作用于细菌细胞壁n 乙酰胞壁酸( n a m ) 与n 乙酰葡萄 糖胺( n a g ) 之间的b 1 ，4 糖甘键。k i m 等( 1 9 9 9 ) 利用链球菌齿斑糖加富的方 法从土壤中分离到的一株芽孢杆菌y s 1 0 0 5 ，通过甲醇沉淀、离子交换色谱、凝胶 过滤色谱和羟基磷灰石色谱等从该菌株中分离到的两种溶菌酶l 2 7 和l 4 5 ，对龋齿 链球菌( s t r e p t o c o c c ic a r i o g e n i c ) 有强烈的溶菌作用，分子量分别为2 7 k d 和4 5 k d ， 其溶菌最适p h 为8 ，最适温度为3 7 。这两种溶菌酶能消解变异链球菌肽聚糖中 的肽键。 k i m 等从发酵的大豆中分离到一株拮抗地衣芽孢杆菌b 6 5 1 。通过分离纯化得 到该菌株产生的拮抗物质，经e i m s 和n m r 的分析为苯乙酸( 分子式为c 8 h 8 0 2 ) 。 该物质对酵母和多种细菌如s t a p h ) ，l o c o c c u sa u r e u s 、e s c h e r i c h i ac o l i 和c a n d i d as p p 有拮抗作用( k i me ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 2 防治植物病害 目前，国内外关于地衣芽孢杆菌应用于植物病害防治的报道比较多。综合大量文 献可以看出，地衣芽孢杆菌对植物的真菌性病害有较好的抑制效果( 见表1 ) 。黄高 ( 2 0 0 7 ，专利号c n l 9 3 0 9 9 1 ) 将地衣芽孢杆菌与一种或二种的生物杀菌剂或化学杀 菌剂( 井冈霉素、中生菌素、多抗霉素、宁南霉素、春雷霉素、木霉菌、霜霉威、 烯酰吗啉、多菌灵、福美双、噫霉灵、敌克松、嘧肽霉素、水合霉素、氨基寡糖素、 嘧菌酯、农抗1 2 0 、多粘类芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、腊质芽孢 杆菌等) 按一定比例混配成常规剂型的生物农药使用，对于防治喙孢属、子囊菌属、 核腔菌属、根霉属、镰刀菌属、疫霉属和霜霉属病菌具有很好效果。中国农业科学 院的郭荣君等发现了一株用于防治大豆胞囊线虫病和镰刀菌引起的根腐病的地衣芽 孢杆菌( c g m c cn o 1 0 3 5 ) ，田间试验表明，其不仅可以防治大豆胞囊线虫病和镰 刀菌引起的根腐病，同时调节根际微生物生态区系，促进植物生长，具有增产效果 ( 郭荣君等，2 0 0 5 ，专利号c n l 6 2 1 5 1 4 ) 。杨惠芳等以地衣芽孢杆菌为生产菌，通 过微生物发酵的方法制得菌体发酵液( “华能2 0 1 ”) ，对水稻白叶枯病、黄瓜枯萎病、 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 黄瓜霜霉病、马铃薯瘟病和棉花枯萎病等有明显防治效果，并对有害的蚜虫、红蜘 蛛和螨虫有杀灭作用( 杨惠芳等，1 9 9 4 ，专利号c n l 0 9 0 1 3 0 ) 。 1 9 9 8 年方敦煌等开始筛选利用土壤拮抗细菌防治烟草黑胫病的研究，最后分离 出对黑胫病菌有较好抑制效果的地衣芽孢杆菌g p l 3 ，通过两年的大田示范试验表 明，地衣芽孢杆菌g p l 3 的效果较好，防效稳定保持在5 0 - - 一6 0 ( 方敦煌等，2 0 0 3 ) 。 但是关于g p l 3 菌株的抑菌机理，还未见进一步的报道。 在所见的文献中，对地衣芽孢杆菌w 1 0 菌株研究的较为深入：童蕴慧等首次报 道w 1 0 菌株能诱导番茄植株对灰霉病的系统抗性。通过对其作用机理进一步研究 后，表明w 1 0 分泌的某些物质或一些次生代谢物具有诱导抗性的活性( 童蕴慧等， 2 0 0 4 ) 。但是，这类物质还有待进一步鉴定。唐丽娟等报道，地衣芽孢杆菌w 1 0 在 番茄叶面的定殖能力很强，与灰霉病菌发生营养和空间竞争，对灰霉病菌有较好的 抑制作用( 唐丽娟等，2 0 0 5 ) 。而且，在研究中发现，地衣芽孢杆菌w 1 0 所产生的 抗菌蛋白对灰葡萄孢也有较强的抑制作用。纪兆林等人报道了地衣芽孢杆菌w 1 0 对 苹果轮纹病菌、柑桔炭疽病菌和青霉病菌具有明显的抑制作用( 纪兆林等，2 0 0 3 ) 。 近几年，随着开发生物菌剂的热潮的高涨，将地衣芽孢杆菌作为拮抗菌来防治 植物病害的相关报道也日益增多。在对棉花枯萎、黄萎病菌拮抗细菌的筛选中，齐 东梅等报道，有一株地衣芽孢杆菌，产生的抗菌蛋白对棉花枯萎、黄萎病原菌有较 明显的抑制作用( 齐东梅等，2 0 0 5 ) 。 彭化贤等从水稻作物根际分离筛选得到一株地衣芽孢杆菌，其对稻瘟病病菌具 有较强的抑制能力，经测定该菌的拮抗性，发现较稳定；通过连续两年的田间防病 效果测试，防效一直在5 0 以上( 彭化贤等，2 0 0 2 ) 。 a s i d 等人从不同区域采集的辣椒植株根际中分离得到5 0 0 株细菌。经过生物 活性测定，发现有1 0 个菌株对辣椒根腐病和辣椒叶斑病均表现较强的抑制作用，其 中h s 9 3 、l s 2 3 4 、l s 6 7 4 、l s 5 2 3 等4 个菌株的抑制率可达到5 0 - - 一8 0 。经鉴定4 个菌株均为地衣芽孢杆菌。通过盆栽试验发现，用这4 个菌株的菌悬液浸泡辣椒种 子，可降低根腐病和叶斑病的发病率，提高辣椒幼苗的成活率( a s i de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 a s i da h m e d 等人通过试验发现：地衣芽孢杆菌可增强角素( s i g m a ) 抑制辣椒 根腐病的活性。由此表明，地衣芽孢杆菌对某些药剂具有一定增效作用，但是具体 起增效作用的物质及其机理还有待进一步研究( a s i da h m e de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 5 地衣芽孢杆菌l 3 发酵条件优化及应用研究 表1 地衣芽孢杆菌抑制的植物病原菌 t a b l e l ：t h e c o n t r o l l i n gp l a n tp a t h o g e n sb yb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 另外，开发地衣芽孢杆菌应用于新型领域的研究也不可忽视。如在皮革制品中， 多种真菌可生长繁殖，主要有：白曲霉、拟青霉、黄绿青霉、黄曲霉、产黄青霉和 黑曲霉等，其中，部分真菌的生长受到地衣芽孢杆菌的抑制。赵婷等报道，地衣芽 6 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 孢杆菌对白曲霉、黑曲霉、拟青霉均有较好的抑制作用( 赵婷等，2 0 0 5 ) 。目前应用 地衣芽孢杆菌作为皮革防霉剂仅做了初步的研究，这一领域也为我们对地衣芽孢杆 菌的应用研究提供了空间。 1 2 1 3 刺激作物生长 北京大学1 9 9 4 年公布了一项关于一种高效花生增产剂及其制备方法，此增产剂 包括：芽孢杆菌、花生根瘤菌分别发酵培养的发酵液、多种植物微量元素、植物细 胞分裂素和吸附剂，如腐植酸或其盐等。此项发明的花生增产剂具有防治花生线虫 病害、促进苗期生长、提高抗逆力和花生增产的综合效果。 神州汉邦( 北京) 生物技术有限公司2 0 0 4 年公布了一项关于地衣芽孢杆菌产玉 米素、异戊烯基腺嘌呤和玉米素核苷植物生长调节剂的专利。该发明提供了用于产 生玉米素、异戊烯基腺嘌呤和玉米素核苷的地衣芽孢杆菌c g m c cn o 。1 0 0 9 ；含有该 地衣芽孢杆菌及其代谢产物的植物生长调节剂；以及该植物生长调节剂的生产方法， 该发明还提供了上述植物生长调节剂用于农作物的用途。 刘伟从地衣芽孢杆菌中分离提取了细胞分裂素，发酵液的含素量为3 8 p g m l ， 并对含有细胞分裂素的发酵液在黄瓜上进行田间应用试验，结果表明，该发酵液对 黄瓜的产量和抗病性均有促进作用，在黄瓜上的应用具有一定的可行性( 刘伟， 2 0 0 5 ) 。 1 2 2 饲料加工上的应用 根据我国农业部公布的结果，允许饲用的芽孢杆菌菌种有枯草芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、纳豆芽孢杆菌( b a c i l l u sn a t t o ) 、蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 、凝 结芽孢杆菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 、缓慢芽孢杆菌( b a c i l l u sl e n t u s ) 、地衣芽孢杆菌、短 小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 等1 2 种。芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢 子进入动物肠道后，产生具有拮抗肠道致病菌的多种物质：同时通过生物夺氧消耗 肠道内的氧气造成厌氧环境，肠道原籍优势菌大多属厌氧菌，而有害菌和外来菌多 为需氧菌，从而达到维持肠道生态平衡的目的。 近年来，地衣芽孢杆菌在饲料工业上应用的研究逐渐增多。牛天贵等发现，芽 孢杆菌的发酵上清液能降低蛋黄中的胆固醇含量，且胆固醇随着发酵液添加量的增 7 地衣芽孢杆菌l 3 发酵条件优化及应用研究 加而减少。b 祥斌等通过在肉鸡日粮中添加沸石粉、低聚木糖和地衣芽孢杆菌实验， 发现此配方能提高肉鸡生产性能，且效果优于沸石粉、低聚木糖单独添加或二者联 合添加( b 祥斌等，2 0 0 6 ) 。梅安生发明了含有地衣芽孢杆菌等益生菌的优质肉鸡专 用绿色饲料添加剂，解决了鸡体内因某种细菌产生抗药性而降低了免疫力，鸡肉中 抗生素残留造成的食品安全、危害人体健康等问题( 梅安生，2 0 0 5 ，专利号c n l 6 1 5 7 2 6 ) 。地衣芽孢杆菌有望成为鸡饲料的良好添加剂。 周振峰报道，在奶牛饲料中添加地衣芽孢杆菌制剂能增强奶牛抵抗热应激的能 力，并可起到防病、抗病的作用。其机理是由于口服芽孢杆菌后，其作用于肠道集 合淋巴结的抗原结合位点，或通过调整动物的微生物群( 尤其是增加双歧杆菌菌群 数量) ，从而间接地发挥免疫赋活的作用，提高机体的局部或全部防御功能( 周振峰， 2 0 0 6 ) 。刘波等通过在异育银鲫饲料中添加地衣芽孢杆菌进行试验，结果表明，可促 进鱼体生长( 刘波等，2 0 0 5 ) 。刘文斌等人通过地衣芽孢杆菌分别与低聚木糖、复合 酶制剂适量混合后加入异育银鲫饲料中，不仅可以提供饲料的利用率，促进肠道有 益微生物的生长和抑制有害微生物，并且能提高肝胰脏蛋白酶m r n a 表达量和肠道 酶活性( 刘文斌等，2 0 0 7 ) 。谭北平等发明了一种对虾用复合微生态制剂( 含地衣芽 孢杆菌，5 1 0 亿c f u g ) ，饲料中添加量仅为0 1 0 2 ，但明显增强对虾的机体免 疫力，提高成活率；并显著提高对虾消化吸收率，促进生长，降低饲料系数( 谭北 平等，2 0 0 5 ，专利号c n l 6 2 0 8 9 2 ) 。广东昆虫研究所韩日畴等发明的一种由地衣芽 孢杆菌干粉等菌体混合组成益生素饲料添加剂，添加到饲料中，能显著提高菌体在 密闭包装中的存活率，加强添加剂和饲料间的粘合作用，提高了益生素的利用率， 并提高动物免疫能力，促进动物的新陈代谢，提高动物机体的抗病能力，改善动物 的消化机能，促进动物生长，并明显改善动物的肉质( 韩日畴等，2 0 0 5 ，专利号 c n l 6 3 1 2 0 5 ) 。 还有报道指出( 曹煜成等，2 0 0 5 ) ，地衣芽孢杆菌能分泌高活性的胞外酶系，可 将水体中的有机残余物迅速降解为无机物，有效地促进养殖水体的生态良性循环。 因此，将地衣芽孢杆菌作为鱼饲料添加剂，不仅可以促进鱼体生长，而且益于养殖 水体的保护。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 1 2 3 环境污染治理上的应用 丁海涛等在拟除虫菊酯类农药残留降解菌筛选实验中，筛选出地衣芽孢杆菌 q w 5 所产生的特异性酶可与氰戊菊酯羧酸酯键断裂的相应产物发生作用，加速其分 解。通过田间实验结果表明，q w 5 菌对于田间拟除虫菊酯残留，5 天内的去除率可 达9 0 以上，效果好于实验室摇瓶培养降解拟除虫菊酯的效果。其原因可能是田间 试验条件下降解菌与土著微生物的协同作用，有助于降解菌更有效地降解农药残留， 直到最后矿化( 丁海涛等，2 0 0 3 ) 。 周鸣研究采用地衣芽孢杆菌死菌体吸附水中的c r 6 + ，其研究结果与报道的同类 研究相比较。地衣芽孢杆菌死菌体对c r 6 + 具有更好的吸附效果，在优化条件下，即 温度为5 0 ，摇床转速1 4 0r m i n ，溶液p h2 5 ，吸附时间2 h ，菌体浓度1 l ，c r 6 + 起始浓度3 0 0m g l ，菌体对c r 6 + 有最大吸附量6 0 5m g g ( 周鸣，2 0 0 6 ) 。胡洪波等 人报道了利用微生物吸附回收金、银、铂、铅等贵金属( 胡洪波等，2 0 0 2 ) 。储卫华 以地衣芽孢杆菌( 质量百分比3 0 - - 4 0 ) 等菌体发明的微生态制剂，在水体中很 快能形成优势菌群，并能产生高活性生物酶，加速残饵和动物粪便的分解，同时能 产生抗生素样物质，抑致有害菌的生长，减少疾病的发生，确保绿色水产品的生产 ( 储卫华，2 0 0 8 ，专利号c n l 0 1 2 6 9 8 8 4 ) 。刘晓风等利用地衣芽孢杆菌( c g m c c n o 1 8 1 3 ) 和其它几种细菌混配而成的复合菌剂，显著缩短了处理有机固体废物时间， 提高原料利用率和处理效果及其生成物产量和质量，对有机固体废物的治理有很好 的效果，且无任何环境污染( 刘晓风等，2 0 0 7 ，专利号c n l 8 8 8 0 4 5 ) 。 1 2 4 做为生物表面活性剂的应用 微生物在一定条件下培养时，其代谢过程中分泌的一些具有一定表面活性、集 亲水基和疏水基结构于一分子内的两亲化合物，称为生物表面活性剂。y a k i m o v 等 ( 1 9 9 5 ) 报道了一株地衣芽孢杆菌b a s 5 0 能产生一种脂肽类生物表面活性剂。张翠 竹等报道，地衣芽孢杆菌n k x 1 可产生一种脂肽类表面活性剂，其疏水基半分子 为脂肪酸类，亲水基半分子是一个酸性的多肽，可耐受高温和高浓度盐( 尤其是高钙 离子) ，p h 适应范围广，是一种具有应用潜力的生物表面活性剂。其脂肪酸部分的 组成国内外未见报道，是一种新的脂肽类生物表面活性剂，在原油增采和输送方面 9 地衣芽孢杆菌l 3 发酵条件优化及应用研究 极具开发应用前景( 张翠竹等，2 0 0 0 ) 。尤其是它特有的理化性质可以适应特殊而复 杂的油藏环境，这是化学表面活性剂所无法比拟的。 1 2 5 医药上的应用 国内目前登记的地衣芽孢杆菌医药商品名为“整肠生”，是以地衣芽孢杆菌无毒 菌株b l 2 活体菌株制成的胶囊，主要用于治疗一些肠道疾病。其作用机制与传统的 化学药物、抗生素、中药相比较完全不同。 整肠生主要是通过以菌治菌的方法，地衣芽孢杆菌口服以后以活菌形式进入肠 道内，在生长代谢中能产生多种抗菌活性物质，如短杆菌肽、枯草杆菌素、制霉菌 素和头孢菌素c 等，可抑制肠道中的致病菌。因其是兼性厌氧菌，具有生物夺氧的 作用，可促进益生菌生长而使肠道中微生态环境达到平衡，使腹泻等症状缓解或消 失( 郭贵海和王崇文，2 0 0 2 ) 。地衣芽孢杆菌尚有促进巨嗜细胞非特异性吞噬作用， 由于该菌不是肠道固有细菌，不会在肠道中长期定植，一般在停药后1 0 天即全部排 出体外，仅起治疗作用而不会造成远期不良反应。无锡市东亭医院在2 0 0 0 年5 月 2 0 0 3 年8 月对整肠生胶囊进行临床试验，应用整肠生治疗顽固性腹泻3 8 例，经过 观察病例在服用中未发现有任何不良反应，证实了整肠生胶囊的安全可靠性( 袁锦 平，2 0 0 5 ) 。其后又在北京协和医院、中国医科大学附属第二医院和沈阳医学院附属 中心医院进行了地衣芽孢杆菌颗粒剂的试验，临床试验证明地衣芽孢杆菌颗粒剂治 疗急性感染性腹泻、急性细菌性痢疾非常有效、而且安全( 翟少华，2 0 0 5 ) 。吴铁林 利用地衣芽孢杆菌新菌株( 保藏号为c g m c cn o 0 2 9 8 ) 制备的微生态制剂，对急、 慢性肠炎和轻型痢疾以及细菌性阴道病( b v ) 有较好的疗效( 吴铁林，1 9 9 8 ， c n 】2 0 2 5 2 2 ) 。 1 3 地衣芽孢杆菌的发酵研究 抗生素作为饲料添加剂，在畜禽防疫方面虽起到积极的作用，但近1 0 多年来， 国外饲料业和饲养业中很多人反对用抗菌素做饲料添加。鉴于此，国内外专家学者 对研究开发微生态制剂用于畜禽养殖日趋关注，从而也促进了这一产业的迅猛发展。 国内用于制作微生态添加剂的主要是一些芽孢菌类和乳酸菌类，但长期以来生产成 本一直居高不下。为此许多学者对地衣芽孢菌发酵过程进行了优化试验以求提高 1 0 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 产量，降低生产成本。 地衣芽孢杆菌的生产方法按发酵方式可分为固态发酵和液体发酵两种形式。目 前国内外要采用液体发酵方式生产地衣芽孢杆菌。 1 3 1 地衣芽孢杆菌产品的农业行业标准 中华人民共和国农业部于2 0 0 8 年3 月1 日正式实旌了饲料微生物添加剂 地衣芽孢杆菌( n y 厂r1 4 6 1 2 0 0 7 ) 国家农业行业标准。根据规定，产品中地衣芽孢 杆菌活菌体数应1 1 0 9 c f u m l 或g 。 1 3 2 固体发酵 固体发酵是微生物生长在潮湿不溶于水的基质进行发酵，在固体发酵过程中不 含任何自由水，随著自由水的增加，固体发酵范围延伸至黏稠发酵( s l u r r y f e r m e n t a t i o n ) 以及固体颗粒悬浮发酵。 高浓度、高粘度的液体深层发酵技术是现代发酵工程研究的前沿，而固体发酵 就是高浓度、高粘度发酵技术的极限。固体发酵可克服传统液体发酵工艺对发酵技 术要求高，设备投资大，商品制剂成本高，而且在后处理过程中芽胞损失缺点。美 国的m e c h al a s 首先取得了固体发酵专利权，但该专利所要求的设备和发酵条件较 高，因此很难在发展中国家推广，而且发酵温度难以控制，杂菌污染严重，由于堆 料过厚，部分固体培养基通气不良。我国七十年代广泛推行的固体发酵工艺，存在 发酵前期料温升不起来；发酵周期长，霉菌污染严重；培养基的湿度难以控制；降 温措施用工多，劳动强度大等问题，因此固体发酵产品质量差。固态发酵的培养基 呈固态，无可流动的自由水，正因为如此，不能像发酵液那样用流体管道输送，也 不能像液体深层发酵反应器那样容易地由机械或气流搅拌使发酵培养基混合，强化 传质和传热，所以至今难以做出严格意义上的大规模纯种培养，而被挡在现代发酵 工业的大门之外( 欧阳俊，1 9 9 9 ) 。 谷春涛等分离到一株饲用地衣芽孢杆菌t s 0 1 ，并研究了该菌的固态发酵情况， 菌体浓度可达9 1 5 x 1 0 9c f u g 鲜曲，芽孢浓度可达7 5 0 x 1 0 9c f u g 鲜曲，芽孢形成 率在8 0 以上。虽然在实验室条件下的固体发酵也取得了不错的效果，但是就工业 地衣芽孢杆菌l 3 发酵条件优化及应用研究 生产来看仍然难以规模化进行( 谷春涛等，2 0 0 4 ) 。 1 3 3 液体深层发酵 自从地衣芽胞杆菌被分离以来，该菌在遗传工程技术、应用技术等领域发展较 快，但相比之下液体深层发酵技术方面的发展则相对缓慢。发酵技术的改造主要涉 及到菌种的选育和改造、培养基的优化、发酵工艺的优化和发酵控制等方面。目前， 国内对地衣芽孢杆菌发酵技术研究主要集中在培养基的优化和发酵工艺的控制方 面。 胡尚勤等以葡萄糖为碳源，多种氨基酸为氮源，最佳c n 为4 4 5 ：1 并在满足该 菌对维生素h 和必须氨基酸的需要以及主要无机盐的需要时，其菌数最高为 ( 3 5 5 6 7 ) 1 0 “c f u m l ，可使菌数是对照( 3 3 x 1 0 1 c f u m l ) i 均2 1 3 5 倍( 胡尚勤等， 2 0 0 0 ) 。吴晟曼等先采用单因素，后采用复合因素的方式，确定碳源和氮源，然后 采用中心复合设计分析法对地衣芽孢杆菌n g 5 2 l l 的培养基主要成分进行分析和优 化，根据预测最优发酵水平的配比，调整培养基，使发酵液中菌体生长量大大提高， 由原来0 3 5 x 1 0 8 c f u m l 提高到1 2 x 1 0 8 c f u m l ( 吴晟曼，2 0 0 5 ) 。谷春涛等以葡萄 糖、豆饼粉和玉米浆为培养基，对地衣芽孢杆菌t s o l 在1 0 0 l 发酵罐中进行了培养， 通过调整通风量和搅拌转速，接种量6 情况下，菌数为9 2 5 x 1 0 9 c f u m l ( 谷春涛 等，2 0 0 3 ) 。崔京春等通过对培养基配方的调整和发酵培养过程中对发酵工艺的调 整发酵过程中控锌j l j p h 值，3 2 h 发酵以后，芽孢形成率达至 j 9 5 ，活菌体数3 x 1 0 9 c f u m u 崔京春等，2 0 0 4 ) 。 1 4 本课题的研究目的、意义 地衣芽孢杆菌是一种革兰氏阳性微生物，广泛分布于土壤和其它自然环境，具 有耐热、酶系丰富，产酶量高，安全等诸多优良特性，被认为是较理想的工业生产菌 株。已广泛应用于工业生产高温淀粉酶、植酸酶等，具有良好的应用前景。地衣芽 孢杆菌有很强的生命活力、具备产生各种酶的能力，而且有耐高温、耐酸碱、耐挤 压等特性，进入2 l 世纪以来，关于地衣芽孢杆菌在饲料工业上的应用研究很多，在 医药、畜牧、水产业等中都有广泛的应用，地衣芽孢杆菌包含在农业部允许的添加 1 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 剂菌种目录中。但是从整体上来看，目前地衣芽孢杆菌发酵培养的活菌数和芽孢率 还较低；而且，不同的菌株的发酵结果差别很大。 地衣芽孢杆菌l 3 是从上千株地衣芽孢杆菌中筛选得到的具有强抗菌活性的菌 株，初步研究表明该菌株对玉米小斑病菌、小麦赤霉病菌、莴苣菌核病菌等1 7 种植 物病害有较强的抑制作用。菌体的发酵液可以促使种子的萌发，提高发芽率，还可 以促进胚芽和胚根的生长。另外，该菌株还具有强的促进植物生长的作用，显示出 良好的应用前景。 本课题拟对地衣芽孢菌l 3 发酵配方进行逐步优化，摸索出最佳的发酵培养基配 方和发酵条件；降低其生产成本，为产品广泛在农牧业推广应用奠定基础。 另外，国内外就地衣芽孢杆菌对作物增产作用的研究的文献报道还不是很多。 而且，到底是地衣芽孢杆菌菌体芽孢对作物生长起到了促进作用还是发酵过程中产 生的促进生长的物质所起的作用，肖有争论。本课题将通过田间增产试验在该方面 做进一步探索。 1 3 地衣芽孢杆菌l 3 发酵条件优化及应用研究 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 供试材料 地衣芽孢杆菌l 3 ( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sl 3 ) ，武汉联华实验室分离，武汉天惠生 物工程有限公司科研所保存。 病原真菌：玉米小斑病菌( b i p o l a r i sm a y d i s ) ，武汉天惠生物工程有限公司科研所 提供和保藏。 试验作物：玉米，品种为华甜玉3 号。 水稻，品种为华早糯1 0 0 3 。 棉花，品种为华抗杂3 9 。 小白菜，品种为华良5 号。 2 1 2 培养基 马铃薯蔗糖琼脂培养基：马铃薯2 0 0 9 ，蔗糖2 0 9 ，琼脂1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， p h 自然 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 o g ，蛋白胨l o 0 9 ，n a c l5 0 9 ，琼脂1 5 9 ，蒸馏 水1 0 0 0 m l ，p n7 2 7 4 种子培养基：葡萄糖2 0 9 ，豆饼粉2 0 9 ，k 2 h p 0 42 9 ，m g s 0 4o 5 9 ，蒸馏水10 0 0 m l ， p h7 0 l 号发酵培养基：豆饼粉3 0 9 ，鱼粉1 2 9 ，玉米淀粉1 5 9 ，酵母粉5 9 ，m g s 0 43 5 9 ， c a c 0 33 0 9 ，n a c l2 5 9 ，k c l lg ，k 2 h p 0 4 0 3 9 ，n a h c 0 3 o 15 9 ，蒸馏水10 0 0 m l ， p h7 5 。 2 号发酵培养基：葡萄糖2 0 9 ，豆饼粉2 0 9 ，酵母膏2 5 9 ，k 2 h p 0 42 9 ，m g s 0 40 5 9 ， 蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h7 0 。 1 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 2 1 4 供试试剂 2 1 4 1d n s 溶液 甲液：溶解6 9 9 结晶酚于1 5 2 m l l 0 的n a o h 溶液中，并用水稀释至6 9 m l ， 在此溶液中加6 9 9 亚硫酸钠； 乙液：称取2 5 5 9 酒石酸甲钠溶到3 0 0 m l l o 的n a o h 溶液中，再加入8 8 0 m l l 的3 ，5 二硝基水杨酸溶液； 将甲、乙溶液混合，即得到黄色试剂，储存于棕色瓶中，室温下放置7 1 0 d 后 方可使用。 2 1 4 2 硝普钠 称取0 5 9 亚硝基铁氰化钠，用去离子水定容至1 0 0 m l ，保存于棕色瓶中，保存 时间不超过一个月。 2 1 4 3 碱液 2 0 9 的柠檬酸钠加上l g 的n a o h ，用去离子水定容至1 0 0 m l 。 2 1 5 主要仪器 p h s 3 c 型精密酸度计 h q l l5 0 b 恒温冷