（微生物学专业论文）蓝藻光合系统电子传递蛋白（fd）突变体的初步研究.pdf

摘要 蓝藻的铁氧还蛋白( f e r r e d o x i n ，f d ) 是一个以 2 f e - 2 s 为辅基的小分子可 溶性蛋白，分布于类囊体膜外。在光反应过程中，f d 作为光反应终端的电子传 递体，介导p s i 与c o ：固定、硝酸盐、硫酸盐和谷氨酸盐等代谢途径闻的电子传 递以及光合循环磷酸化中的电子回流。真核藻类和非固氮蓝藻的类囊体膜和氢酶 耦联光解水产氢机制研究表明，f d 是光系统与氢酶耦联问的重要电子传递成分， 参与体内光解水过程的h 。代谢。因此，在蓝藻太阳能光解水制氢系统研究中， f d 是一个重要的功能蛋白靶点。 本研究以聚球藻p c c 7 9 4 2 作为受体，构建了同源双臂整合载体p u c h a t h f 和p u c f s 。利用内源平台双交换原理，将质粒p u c h a t h f 上携带的集胞藻p c c 6 8 0 3 p e t f 外源表达盒序列和抗性筛选标记潮霉素b 磷酸转移酶基因( h y g r o m y c i nb p h ot r a n s f e r a s e ，劫f ) 外源序列( 含c a m v 3 5 s 启动子，h p t 编码框，c a m v3 u t a p o l y a 终止子) 定点插入到受体藻细胞染色体h c o ，高亲和转运蛋白操纵子基因 c m p a b c d + 1 5 0 8 - - + 1 5 0 9 区( 衄弗基因的起始编码框为+ 1 ) 位点上。并在此基础上 以质粒p u c f s 介导聚球藻p c c 7 9 4 2 如以的插入失活，获得了具有潮霉素b 和链 霉素双重抗性的突变藻株p f l 。以此初步建立了聚球藻p c c 7 9 4 2 抬以功能性基 因突变研究平台。 利用聚球藻p c c 7 9 4 2 矗以功能性基因突变平台系统，迸一步对集胞藻 p c c 6 8 0 3p e t f 进行突变，获得了突变藻p f n 。和p f 一矗协厩并在p f n 。和p f 一肪止 生理特性研究基础上分析了基因突变对基因功能造成的影响。结果表明，与野生 藻相比，p f n 蚺具有耐酸性条件下生长的特性，而p f 一胁柑在起始p h5 p h 儿 的b g 一1 l 培养基中生长明显缓慢，藻体容易黄化死亡。野生藻、p f l 、p f n 。和 p f 一肋艇光照放氢活性比较实验，暗示了f d 突变体电子传递功能上的改变将可 能导致藻体的光照放氢特性提高。 本研究所构建的聚球藻p c c 7 9 4 2 突变株p f l 、p f n 船和p f 一肋癌将为进一 步研究高效介导光系统一氢酶耦联产氢的电子传递系统奠定基础。 关键词：聚球藻p c c 7 9 4 2 ； 2 f e 一2 s 铁氧还蛋白：基因突变 a b s t r a c t t h e 2 f e 一2 s f e r r e d o x i n ( f d ) i nc y a n o b a c t e r i ai sak i n do f a c i d i c s o l u b l ei r o ns u l p h u rp r o t e i nw h i c hd i s t r i b u t e do v e rt h es u r f a c e o ft h y l a k o i dm e m b r a n e a st h ee l e c t r o nc a r r i e rp r o t e i no fp h o t o s y s t e m ， f di n v o l v e dd i r e c t l yi nt h ee l e c t r o nt r a n s p o r to fm e t a b 0 1 i s mo fc 0 2 f i x a t i o n ，n i t r a t er e d u c t i o n ，s u l f a t er e d u c t i o n ，g l u t a m a t es y n t h e s i sa n d p h o t o p h o s p h o r y l a t i o n t h e r e s e a r c ho f p h o t o b i 0 1 0 9 i c a lh y d r o g e n p r o d u c t i o ni ng r e e na l g a ed i s c o v e r e dt h a t f di sr e s p o n s i b l ef o rt h e e l e c t r o nt r a n s p o r tb e t w e e np h o t o s y s t e ma n dh y d r o g e n a s es y s t e m l i m i tw o r k a l s os u g g e s tt h a tf di sak e yt a r g e tp r o t e i ni nt h eh y d r o g e nm e t a b o l i m i nc y a n o b a c t e r i a i nt h i ss t u d y ，t h eh o m o l o g o u si n t e g r a t i o np l a s m i dv e c t o rp u c h a t h f a n dp u c f s fw e r ec o n s t r u c t e du s i n gs y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2a sh o s tc e l l t h ec m p a b c dg e n e s ，w h i c he n c o d e da na b c t y p eh c o ft r a n s p o r t e ri n v o l v e d i nc y a n o b a c t e r i a lc 0 2c o n c e n t r a t i n gm e c h a n is m ( c c m ) ，w e r ec l o n e di n t o p l a s m i dp u c l 9t og e n e r a t ep l a s m i dp u c h a t b yi n s e r t i n gh y g r o m y c i nbp h o t r a n s f e r a s e ( 五p 幻c a s s e t t ea n das y n e c h o c y s i ss p p c c 6 8 0 3p e t fc a s s e t t e i n t ot h ec o d i n gr e g i o no fc m p a b c d + 1 5 0 8 一+ 1 5 0 9i n t op u c h a t t h e h o m o l o g o u si n t e g r a t i o np l a s m i dv e c t o rp u c h a t h fw a sc o n s t r u c t e d m u t a n t s t r a i np fw a ss c r e e n e da f t e rp u c _ h a t h fw a st r a n s f o r m e di n t os y n e c h o c o c c u s s p p c c7 9 4 2 t oc o n s t r u c tt h em u t a n tp f l ，ah o m o l o g o u si n t e g r a t i o np l a s m i dp u c f s w h i c hc o n t a i nas t r e p m y c i nr e s i s t a n c eg e n ei n s e r t i n gi nt h eh o m o l o g o u s f r a g m e n ts y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2f e d lw a sc o n s t r u c t e da n du s e dt o t r a n s f o r mm u t a n tp f t h em e t h o do fs i t e d i r e c t e dm u t a t i o no ns y n e c h o c y s i s s p p c c 6 8 0 3p e t fw a sa p p l y e d t oc o n s t r u c t et h em u t a n tp f n “a n dt h e h o m o l o g o u si n t e g r a t i o np l a s m i dv e c t o rp u c h a t h f h o x ew a sa p p l y e dt o c o n s t r u c t et h em u t a n tp f - - h o x e b yt h ec o m p a r a t i v er e s e a r c hb e t w e e nt h e s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 w i l da n dm u t a n t s t r a i n s ，d i s t i n g u i s h a b l e d i f f e r e n c e sw e r eo b s e r v e di nb o t hg r o w t ha n dh y d r o g e np r o d u c t i o n t h e g r o w t hr a t eo ft h em u t a n ts t r a i n sp f ia n dp f n 6 6w e r eg r e a t e rt h a nt h a to f w il ds t r a i ni np h 5b 6 11c u l t u r em e d i u ma n ds m a l l e ri np h 7 一p h11 b g 1 1 h o w e v e rt h em u t a n ts t r a i nj p 鼍一辑o x es h o wq u i t eu n a d a p t e di nb 6 1 1c u l t u r e m e d i u m t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h er e m o d e l i n gi ns y n e c h o c o c c u s s p p c c 7 9 4 2p e t fg e n eh a dc o n s i d e r a b l ee f f e c to nt h ep r o t e i na c t i v i t y ，a n d i ti sp o s s i b l et oi m p r o v et h eb i o p h o t o h y d r o g e np r o d u c t i o na c t i v i t yi n s y n e c h o c o c c u 量s p p c c 7 9 4 2b yp e t fg e n er e m o d e l a t i o n i nt h iss t u d y ，w eo b t a i n e ds y n e c h o c o c c u sp c c 7 9 4 2p o t f m u t a n ts t r a i n s i to f f e r e dt h ep l a t f o r mf o rf u r t h e rr e s e a r c ho np h o t o b i o l o g i c a lh y d r o g e n p r o d u c t i o no fc y a n o b a c t e r i a k e yw o r d s ：s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 ； 2 f e 一2 s f e r r e d o x i mg e n em u t a t i o n 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ：她、 。p6 年9 月 目 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“4 ”) 日期：娜年富月夕日 日期：砌石年阴) 日 厦门人学硕士学位论文 1 刖吾 1 1 概述 能源是经济发展的坚强后盾。2 0 世纪中后期，全球性的经济发展使得能供与能 耗间的缺口进一步加大，以石油、煤、天然气为主的传统能源的有限性及其利用 过程所引发的后续环境污染和室温效应“”等问题更加突出了传统能源结构的局限 性。因此，人类在未来的发展道路上，必须寻求新的更为有效的可利用能源，以满 足逐渐工业化的经济发展需求。 1 1 1 氮能 氢气具有广泛的用途。作为一种重要的化工原料，氢气可用于合成氨工业、制 造盐酸以及合成甲酵、人造石油等。目前，全世界生产的氢气约有2 3 用于合成氨 工业。石油工业上的许多工艺过程，如加氢裂化，加氢精制、加氢脱硫、催化加氢 等，均需用氢气作为还原剂。氢氧焰能产生3 0 0 0 的高温，可用于熔融和切割金属。 在食品和冶金工业上，氢气也有广泛的用途。 随着科学技术的发展，氢气的利用越加广泛。自氢气用作a 一2 火箭发动机的液 体推进剂开始，1 9 6 0 年液氢被首次用作航天动力燃料。之后氢成为火箭领域的常用 燃料。1 9 7 6 年5 月，美国研制出一种以氢气作燃料的汽车，氢第一次作为气体燃料， 被应用在汽车上。后来，日本也研制成功一种以液态氢为动力的汽车。7 0 年代末期， 前联邦德国的奔驰汽车公司对氢气汽车进行试验。他们仅用了5k g 氢气，就使汽 车行驶了1 1 0l 谧，并确定了以氢气作为汽车燃料的种种优势，如：清洁，在低温下 容易发动，对发动机的腐蚀作用小，以及氢能量利用率高，可简化现有汽车的构造 等等。自此，氢气作为传统化石燃料的重要替代能源，对其开发利用的研究在许多 发达国家逐步启动。目前，科学界普遍认为，氢能量密度高、燃烧后的残余能量少、 产物不具有污染性，并具有可储存性，氢能作为一种绿色的可再生能源，将是2 1 世纪能源结构体系中的重要支柱之一。 1 1 2 氯的制备 氢是自然界中储量最丰富的元素之一。在水、天然气、石油、生物质及其他富 氢有机物中，都储存大量的化合态氢，它们都是氢的重要来源。目前氢的制备丰要 厦门大学硕士学位论文 包括化石燃料制氢、电解水制氢和生物制氢等途径。 ( 1 ) 煤气化：煤在高温高压下与气化剂转化成气体产物。气体产物中含有占气 体总体积的3 0 3 9 的氢气组分。 ( 2 ) 天然气烃类物质的氧化：该法是在催化剂存在下与水蒸气反应制得氢气。 ( 3 ) 重油部分氧化：由重油与水蒸气及氧气反应制得含氢的气体产物。气体产 物中氢气体积占4 6 。 ( 4 ) 水电解制氢：水电解制氢是氢与氧燃烧反应生成水的逆过程。提供电能使 水分解制得氢气效率一般为7 5 8 0 。 传统的化石燃料制氢、电解水制氢过程都存在高能耗低产率问题，使得氢的生 产成本较高，而且化石燃料制氢过程所排放的终产物易造成二次污染，从根本上看 不适于氢制备的产业化。而生物制氢被认为是氢产业化生产最有前景的途径。 1 2 生物制氧 1 9 3 1 年，s t e p h e n s o n 等“1 首次报道了在细菌中含有氢酶( h y d r o g e n a s e ) ，这种酶 可催化氢的氧化和质子的还原反应。之后，6 a f f r o n ”1 提出以水光解产氢为基础的生 物制氢方法，并首先开展了相关研究；g e s t 等“1 证实了光合细菌( r h o d o s p i r i l l u m r u b r u m ) 能在光照厌氧条件下分解有机物产生氢气的特性。2 0 世纪7 0 年代和9 0 年代 能源危机的出现”1 以及全球气候与环境的恶化，引发了牛物制氢研究的热潮，并取 得了丰硕的成果。 目前用于生物制氢研究的微生物丰要有两个类群：1 、包括真核藻类、蓝藻和光 合细菌在内的光合微生物；2 、不需光的兼性厌氧和专性厌氧发酵产氢细菌。 1 2 1 光合细菌的光发酵产氯 1 2 1 1 光合细菌的光合产氢 光合细菌是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物，含有光合色 素系统i ，能以太阳光作为能源，利用无机物或有机物作为底物进行不产氧的光合作 用。光照放氢是光合细菌以有机物、还原态无机硫化物为供氢体，太阳能为能源， 将有机物分解伴随光合磷酸化偶联于固氮酶的放氢作用( 图1 ) ”。光是光合细菌光 发酵产氢途径的必备条件，不同光源、光照强度和光照时间都会影响光能转化效率， 厦l j 大学硕士学位论文 从而最终影响光产氢。1 。v a s i l y e v a 等“”用分子生物学方法通过p u f 脚基因突变改 变捕光色素蛋白复合体( l hi 和l h ) 含量，使得r b s p h a e r o i d o s p 3 变异株产氢 速率和光能转化效率提高。同时，氢供体对光合细菌光放氢活性也有显著的影响， b a b o s a 等。”认为这可能与氢供体的结构以及菌株t t 身进化过程的酶系发育有关。 图1 光合细菌光合产氢示意图 f i g 1p r o c e s so fp h o t o h y d r o g e np r o d u c t i o nb yp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a 1 2 1 2 光合细菌的暗发酵制氢 光合细菌不仅具有光放氢能力。在黑暗厌氧条件下，光合细菌也能以葡萄糖、有 机酸、酵类物质产生h ：。这种黑暗条件下的产氢是由氢酶催化，产氢机锖4 与厌氧细 菌类似。 与固氮酶催化的光放氢相比，氢酶催化的产氢不需要光能，所以暗发酵产氢技术 在工艺上比光发酵产氢更为简单。但由于黑暗条件下有机物分解不彻底，故产氢效率 较低( 如图2 ) 。w a k a y a r a a “”和m a t s u n a g a “”证实，利用光台细菌的光发酵和暗发酵 产氢的双重特性，采用光暗交替的方法促进了r b s p h a e r o i d e sr v 菌株和非硫光合 细菌r h o d o v u l u ms p n k p b1 6 0 4 7 1 r 产氢效率的提高。 1 2 1 3 光合细菌和发酵产氢细菌的耦联产氢 鉴于厌氧发酵产氢细菌和光合细菌在产氢过程中产物和底物利用的特性，有些 研究者提出以非光合细菌和光合细菌混合系统进行糕联的制氢方式，以提高产氢的 速率和产率。非光合细菌可利用各种形式的大分子有机物来发酵产氢，并且不需要 光照，发酵生成的有机酸可被光合细菌作为电子供体利用来产氢“。这两类细菌的 组合不但减少了光台细菌的光能需求，同时也提高了氢气的产量，因此这种耦联产氢 是最理想的微生物产氢模式( 如图3 ) ，但有关这两类菌在系统中的平衡及合适的培养 一一一蘸蒸 一一一纛一 _i；|黧1；|嚣繁纛一膝瞧攘纛黧鬻鬟一纛羹黍囊 厦门大学硕十学位论文 条件、制氢工艺等尚需进一步的研究。 由于光合细菌可利用太阳能降解转化有机物或有机污染物牛产氢能，从而在光 合产氢过程中能将太阳能利用、氢气产生、有机废物利用等有机结合，且其产氢代 谢产生的副产物可进一步开发为可降解塑料等高值化产品聚1 3 一羟基丁酸( p h b ) “， 避免造成二次污染的优势，因此在生物制氢技术上具有巨大的应用潜力。 1 2 2 厌氧和兼性厌氧细菌的暗发酵产氢 发酵细菌的产氢速率较高，其发酵条件要求较低，具有直接应用前景，是目前 产业化制氢的首选方式。但纯菌种发酵、产氢活性低以及细胞固定化技术一直是工 业化生产的主要制约因素。我国在细菌发酵制氢方面的研究发展较快，特别是哈尔 f i g 2l i 曲t d a r kc y c l ef o rh y d r o g e np r o d u c t i o nb yp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a 厦大学硕士学位论文 图3 光合细菌和发酵产氢细菌的耦联制氢 f i g 3h y d r o g e np r o d u c t i o nf r o ma n a e r o b i cb a c t e r i aa n dp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a 滨工业大学采用的非固定化菌种制氢技术，突破了以往生物制氢技术必须采用纯菌 种和固定技术的局限，首次实现中试规模连续流持续产氢，在产业化制氢研究道路 上迈出坚实的一步。 厌氧细菌由于体内缺乏氧化磷酸化系统，体内有机物分解沿底物水平磷酸化进 行，因此在氢酶催化的产氢过程中，氢酶是作为发酵产生的还原物的最终电子受体 而起作用的。在产氨过程中，氢酶主要通过丙酮酸脱羧途径和辅酶i 的氧化与还原 平衡调节途径产氢“6 ，释放体内过多的还原力，以保证细菌生理代谢过程的正常 进行。e m p 途径中的丙酮酸脱羧产氢。该途径中厌氧细菌氧化还原产生的过剩电 子( e - ) 通过电子载体铁氧还蛋白的介导传递给氢酶。产氢过程发生于丙酮酸脱羧 作用中。辅酶i 的氧化与还原平衡调节产氢。厌氧细菌在产酸过程中存在n a d h + h + 的再生和消耗，保证n a d h + h + n a d + 平衡。如果n a d h + h + 消耗过程相对慢于 形成过程时，会产生n a d h + h + 的积累。此时发酵细菌可以通过释放 k 的方式将过 量的n a d h + h + 氧化还原：n a d h + h + 斗h 。+ n a n + 。发酵细菌的己糖单磷酸盐途径能 使细胞从葡萄糖的降解中获取更多的还原型n a d h ，同时产生更多的c o ：，c o ：会通过 生成延胡索酸或琥珀酸的反应消耗还原力n a d h ，从而表现出c o 。对产氢的抑制“。 厦门大学硕上学位论文 1 2 3 真核藻类和蓝藻的光合制氢 许多蓝藻和真核藻类体内具有能进行光合作用的完整光合色素系统( p si ，p s i i ) ，同时又具有能还原质子而产氢的氢酶，能进行产氢代谢。因而利用藻类或者 蓝藻的光解水制氧倍受青睐( 如图4 ) 。 图4 利用藻类和蓝藻的光解水制氢模式图 f i g 4 s h e m eo f b i o p h o t o l y s i sh y d r o g e np r o d u c t i o nb ya l g a ea n dc y a n o b a c t e r i a 1 2 3 1 真核藻类的光生物制氢 1 9 4 2 年g a f f r o n 等“”首先发现绿藻s c e n e d e s 埘u so b l i q u u s 既能在固定c o ，时氧 化分子氢提供还原力又可以在光照的时候产生分予氢。这个光生物制氢史上的重要 发现，引起了许多科学工作者对绿藻光生物制氢研究的兴趣。此后，美国、曰本、 德国等一些发达国家投入大量的资金用于开展有关于藻类产氢机制的研究以及产氢 效率的提高。 利用藻类光合制氢研究较多的是绿藻。这些藻类属真核生物，含光合系统p si 和p si i ，不含固氮酶，产氢代谢由体内的氢酶。”调节。放氢反应主要从两条途径进 行。一条途径是葡萄糖等底物经分解代谢产生还原剂作为电子供体，电子传递途径是 电子供体一p si f d 一氢酶一h 。，同时伴随有c 0 ：产生。另一条途径是光解水产氢， 电子传递途径是：h ：o p s i i p si f d 一氢酶一h ：，同时伴随着0 ：的生成( 如图5 ) 。 光水解产氢途径是藻体直接利用太阳能，以水为底物的产氢。产氢过程所用的原料为 6 厦f j 大学颂j 学位论文 水，其来源十分丰富，是一种理想的制氢方法。但是，水分解产生的晚会抑制氢酶的 活性。“，因此利用藻类等进行直接光解水( d i r e c tb i o p h o t o l y s i sp r o c e s s ) 产氢尚 有较大的难度。 图5 绿藻的光解水制氢电子传递途径 f 垃5e l e c t r o nt r a n s f e rp a t h w a yo fb i o p h o t o l y s i sh y d r o g e np r o d u c t i o ni na l g a e 目前主要采用间接生物光解水( i n d i r e c tb i o p h o t o l y s i sp r o c e s s ) 产氢方式， 在时间上或是空间上将产h 。和产0 。过程分离开，以解决氢酶对氧敏感的问题。一 步法问接生物光解水( o n e s t a g ei n d i r e c tb i o p h o t o l y s i sp r o c e s s ) 产氢：采用脱 硫的培养基抑制p s 的作用，进而抑制了氧的产生，解除氧对产氢酶的抑制，从而 实现持续产氢。两步法间接生物光解水( t w o s t a g ei n d i r e c tb j o p h o t o l y s i sp r o c e s s ) 产氢：将微生物体的培养过程和微生物的产氢隔离开来在第一阶段进行普通的 光合作用，微生物体不断增殖，并积累大量有机物质第二阶段是光驱动产氢，该过程 处在无氧条件下，首先在暗处诱导氢酶的合成，然后辅以适当的光照，以提供产氢所 需的能量。总之微藻光水解制氢的研究近来有较大进展，但与实用运用还有较大的距 离。特别是在微藻的光能利用率。2 2 “、0 2 对氢酶的抑制”“，光生物反应器构建等问 题上还需要更进一步的深入研究“。 1 2 3 2 蓝藻的光生物制氢 在光合生物制氢的研究中，蓝藻也是应用较多的光合生物类群。如a n e b e e n a c y l i n d r i c a l 、a n e b a e t l aa z 0 1 e e 。2 、d n e b a e n as i a n e s i s t 2 、勋i r u l i n a 口l ar 7 厦门大学硕士学位论文 e n s i s 等。1 都先后被应用于光生物制氢研究。 蓝藻是一类由单细胞或由多细胞组成的群体或丝状体的原始的原核生物，是地 球早期大气中氧气的主要贡献者之一。蓝藻是一类特殊的原核微生物，具有原核生 物和植物的一些特征：细胞不含细胞核、叶绿体及线粒体等双膜结构的细胞器，染 色体d n a 裸露，细胞壁结构为g 。；光台色素主要是叶绿素a 、b 胡萝 素和藻胆色素； 光合系统类似于高等植物，具光合系统i ( p si ) 和光合系统( p si i ) ，定位于类囊 体膜上，进行产氧的光合作用。 由于蓝藻在细胞结构、代谢、遗传和进化等方面都表现出独特的性质以及在生 物圈中所扮演的重要角色，多年来被广泛地用于研究光合作用、固氮作用、叶绿体 起源以及植物进化等重大生物学课题。同时，随着分子生物学研究的深入开展，蓝 藻成为基因工程重要的受体菌之一。1 9 9 6 年集胞藻p c c 6 8 0 3 基因组全序列的测定 。，以及之后的g o e o b a c t e rv i o a c e u sp c c 7 4 2 1 ，n o s t o cs p p c c7 1 2 0 ， t h e z t n o s y n e c h o c o c c u se l o n g a t u s b p l 、聚球藻砸- 1 8 1 0 2 和聚球藻p c c 7 9 4 2 基因组测 序工作的开展，为蓝藻基因工程的进一步发展奠定了坚实的基础。在光合生物制氢 的研究中，蓝藻是既可以产氢o 。”1 ( 如图6 所示) 又可以进行光合作用的原核微生 物。它的培养条件粗放，适合于大规模培养，低成本运转，因而被认为是良好的生物 制氢微生物。 蓝藻的产氢途径主要通过两种方式：耦联于光反应的固氮酶催化的光放氢和厌 图6 蓝藻缅胞内存的在氢代谢途径简圉 f i g 6s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f h y d r o g e nm e t a b o l i s mi nc y a n o b a e t e r i a 厦门大学硕士学位论文 氧条件下氢酶催化的暗放氢。“。与蓝藻氢代谢相关的酶有i 司氮酶( n i t r o g e n a s e ) 和 两种功能不同的n i f e - 氢酶：吸氢氢酶( u p t a k eh y d r o g e n a s e ) 和双向氯酶 ( b i d i r e c t i o n a lh y d r o g e n a s e ) 。 固氮酶是一个金属酶复合体，由m o f e 蛋白( q ，b 。) 和f e 蛋白( y ，) 组成。 复合体中的这三个蛋白亚基分别由n i f d ( q 亚基) 和n i f k ( 0 亚基) ，月打( y 亚 基) 三个基因编码( 如图7 所示) 。 目前已知的固氮蓝藻中都含有吸氢氢酶“1 。吸氢氢酶一般存在于丝状蓝藻异 形胞的类囊体膜上，在固氮蓝藻中该酶能重新利用由固氮反应所产生的也，通过h ： 的氧化将电子传递给光合作用电子传递链或是呼吸作用电子传递链，从而回收能量 并除去固氮酶周围的0 ，防止固氮酶遇氧失活，同时为圆氮酶或者体内其它代谢提供 还原力。7 1 。在非固氨蓝藻中，吸氢酶存在与否还有很大的争议“1 。1 9 9 5 年c a r r a s c o 等”“首先报道了a n a b a e n ap c c7 1 2 0 中吸氢酶大小亚基基因的编码和重组过程，随 后又有多种固氮蓝藻中的吸氢酶基因被克隆。在蓝藻中其吸氢酶大亚基和小亚基基 因均具有很高的保守性。2 1 。研究蓝藻吸氢酶具有重要的应用价值，因为吸氢酶的 失活“。4 ”可以直接提高藻体的放氢活性。 双向氢酶，是一种可溶性或具有松散膜结合结构的氢酶，具有对氧的敏感性， 对h 。的高亲和性及对高温的耐受性三大特征一3 。在蓝藻的营养细胞和异形胞中， 双向氢酶不仅可以催化产氢也可以吸氢( 主要是催化放h z ) 。结构上，双向氢酶由 氢酶和硫辛酰胺脱氢酶组成四聚体结构，其中氢酶的生理功能是催化放氢或者吸氢， 由h o x y 和h o x h 基因编码，硫辛酰胺脱氢酶的两个亚基则分别由h o x f 和h o x u 基因编码( 如图7 ) 。蓝藻的双向氢酶有的定位于蓝藻细胞的细胞质中”1 ，有的与 类囊体膜相连，而有的双向氢酶则不是简单的溶解于细胞质中，而是与细胞质膜具 有一定的联系。对于双向氢酶的功能目前还没有非常明确的看法，普遍认为双向 氢酶在厌氧环境下参与调节代谢过程产生的过剩还原力。a p p e l 1 则提出双向氢酶在 光合作用电了传递系统中具有电了流阀门的作用。 利用蓝藻的光合制氢主要存在问题是氧对产氢的抑制、吸氢酶的吸氢反应以及 蓝藻产氢效率较低。固氮酶催化的放氢反应是一个能量消耗过程“，在最适牛理 厦门大学硕士学位论文 条件下，通过固氮酶的电了流约有2 5 被用来还原质了生成h ，”。由于胞内吸氢 酶的存在，部分氢被重吸收和利用。相比之下，由双向氢酶催化的产氢反应能量转 换效率较高。目前蓝藻将太阳能转化为氢能的效率最高为0 3 3 ”。进一步提高蓝 藻的产氢活性是蓝藻光解水制氢的关键环节，包括：光反应器的工艺优化、蓝 藻产氢条件的进一步优化“、具高效光能转换效率“、高效光合电子传递效率 以及高产氢活性和耐氧氢酶的藻株构建。 j 一一一一一、 p s ； 3 5b h 姊l 斗2 升+ 2 0 ：6 0 8 晰 u p 协k eh y d r c a g e n a s e b i d i r e c t i o n j a l h y d r o g e n 一竺 ”、强h o x ，。hl 震j m o x ：_ p h、。：# ， ：。，一， 薰瓣 鬻i “k ， 、一v ， h y d 州：o l a 砷“抽 图7 参与氢代谢的固氮酶、吸氢酶和双向氢酶 f i g 7e n z y m e sd i r e c t l yi n v o l v e di nh y d r o g e nm e t a b o l i s mi nc y a n o b a c t e r i a 1 3 蓝藻的光合传递链 蓝藻是一类能进行产氧光合作用的原核生物。远在3 亿年前的地质年代，就发 现蓝藻存在的痕迹“。因此，认为蓝藻是地球上最早出现的具有产氧能力的有机体， 对之后的好氧生物的出现及其进化具有深远的意义。 厦门火学硕士学位论文 1 3 1 蓝藻的光合电子传递途径 蓝藻的光合作用过程类似于真核藻类和绿色植物。光系统元件及其光合电子传 递体定位于类囊体膜上。与真核藻类和绿色植物不同的是蓝藻的天线色素系统中含 有藻胆蛋白体“”。蓝藻光反应过程中的电子传递途径如图8 所示。在电子传递过程 中p s i i ( p 6 8 0 ) 和p si ( p 7 0 0 ) 驱动电子流动并产生电予能势跃迁，电子沿着电子 传递体氧化还原势逐步降低的方向流动。 在光合作用的光反应阶段，p s h 光解水产生0 2 、质子( h + ) 和电子( e 一) ，并通 过类囊膜上的光电子传递链传递e 一还原n a d p + ，产生的n a d p h 用于c 仉还原。 下p 却附慵神 图8 蓝藻光合类囊膜上的光系统利光合电子传递体 f i g 8 p h o t o s y s t e m ( p s i i a n d p si ) a n d t h ec o m p o n e n t s o f e l e c t r o n t r a n s p o r ts y s t e mo nt h et h y l a k o i dm e m b r a n e so f c y a n o b a c t e f i a ，3 2 光系统 光系统i i ( p s i i ) 是一个跨膜的多亚基蛋白复合体。蓝藻的p s i i 与外围的天线 色素系统紧密相连。蓝藻的外围天线色素系统由别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白和藻红蛋白 构成。p s i i 利用外围的天线色素系统吸收流入光反应中心的光能驱动水的分解和 质体醌的还原。 蓝藻的p s i i 由大约2 0 个亚基组成”“，形成对称的同型二聚体结构，其上有一 个质体醌( p l a s t o q u i n o n e ，p q ) 结合位点。p s i i 包含了至少九种的氧化还原反应成 厦门大学硕 学位论文 分：叶绿素，脱镁叶绿素( p h e ) ，质体醌，酪氨酸，m n ，f e ，细胞色素岛。( c y t c 。) ， 类胡萝p 素和组氨酸”。这些氧化还原辅因子分布在单独的亚基上，或者与不同的 亚基结合，或者形成单独的亚基( 如c y t c 。) 。构成蓝藻p s i i 的d 1 ( p s b a ) 和d 2 ( p s b d ) 亚基，与定位于其上的氧化还原辅因子形成反应中心，驱动水的光解和质 体醌的还原。其中c p 4 3 ( p s b c ) 和c p 4 7 ( p s b b ) 亚基结合有叶绿素分子，是p s i i 内 部的天线色素蛋白。构成蓝藻p s 的其它亚基还有细胞色素魄。* 亚基，细胞色素 岛5 90 亚基( p s b ea n dp s b f ) ，p s b h ，p s b i ，p s b j ，p s b k ，p s b l ，p s b m ，p s b np s b w ，p s b 、 p s b o 、p s b u 亚基和细胞色素岛j 。( p s b g ) 亚基等。由p s b o 、p s b u 、p s b v 亚基构成的产 氧复合体( o e c ) ，含有一个( m n + ) 。簇。p s b o 存在于所有的产氧光合作用有机体中1 ， 结构上具有很强的保守特征”。p s b u 和p s b v 是蓝藻特有的亚基，而植物含有的是 p s b p 和p s b o t 6 7 “，但在一些特殊环境中，蓝藻也存在类似于p s b p 和p s b q 的蛋白”“。 蓝藻的p si i 结构及其水光解后质体醌还原过程如图9 所示。水光解和氧产生由产氧 复合体( o e c ) 所催化。o e c 裂解2 分子水产生分子0 。、4 个h + 和4 e 一。产生的 0 。与分布在p s i i 周围的类胡萝h 素结合并迅速扩散，避免造成p s i i 氧损伤。4h + 直接进入类囊膜内水相。4 e 一通过d l 上酪氨酸残基t y r z 的介导传递给p 6 8 0 。p 6 8 0 吸收光能转变成激发态p 6 8 0 ，驱动电子传递到结合在叭上的p h e 。电子通过p h e 斗 q a 辛q b 斗p q 途径传递到分布在类囊膜间隙的p q 分子。o e c 催化中心结构示意图如 图1 0 所示。 图9 蓝藻p s i i 结构模式及其电予传递途径 f i g 9s h c e m eo f t h ep si ic o m p l e xa n dt h ee l e c t r o n t r a n s f e r 厦门大学倾十学位论文 图1 0 产氧复合体( 0 e c ) 结构示意图 f i g 10s t r u c t u r a lp a t t e r no fo e c 1 3 3 质体醌和细胞色素6 f 复合体 在光合电子传递链上质体醌( p q ) 是一一个可移动的小分子电子传递成分。p q 随机 的与p si i 特定位点结合，在q b 结合位点上p si i 通过传递2 个电子和两个质子将p q 还原成p o h 。( p l a s t o q u i n 0 1 ) ，并从p s 上解离下来。之后p q h 。也以扩散的形式随机 性的结合到细胞色素b f 复合体( c y t o c h r o m e6 ，c o m p l e x ，c y t b y ) 的p q h ：结合位 点上。 图1 1 细胞色素b 蝮合体结构模式图 f i g 11s c h e m eo f t h ec y t o c h r o m e 可c o m p l e x c y t 6 ，将p q h 。氧化形成p q 进入下一轮反应1 ，两个质子最终释放到膜内。在 结构和作用机制上c y t 6 ，与线粒体和细菌中的c y t 由。的具有很大相似性“。c y t 6 ，是一个膜结合态复合体( 如图1 1 所示) ，包括四个主要的蛋白亚基c y t 魄、i v 厦门大学硕士学位论文 业基( s u b u n i ti v ) 、一个铁硫蛋白( f e - sp r o t e i n ) 、c y t ，和一些数目不等的小 分子量亚基”，并结合三个血红素分子、一个铁硫中心、一个叶绿素分子和一个类胡 萝h 素”6 。c y t b f 上有一个p q 也结合位点和个结合质体蓝素( p l a s t o c y a n i n ， p c ) 或细胞色素岛( c y t o c h r o m e 岛，c y t 的的位点，分别催化p q h ：的氧化复位和 p c 或c y t c e 的还原，同时将电子从p q t t 。传递到p c 或c y t c 。 光反应过程中，c y t b f 的一个很独特的功能体现在介导光能在p si 和p si i 上 的分配调节。蓝藻中藻胆蛋白( p b s ) 作为主要光能捕获体，其吸收的光能流向p si 和 p s i i 反应中心。7 。蓝藻具有p si 和p s i i 的能念调节机制，调节p b s 流向p si 和 p si i 的能量分配，保证p si 和p si i 中光能量体系的平衡”“。在植物和绿藻中，这 种能念调节是通过天线色素系统的叶绿素a b 蛋白复合体l h cl i 可逆磷酸化进行的 ”1 。催化l h c i i 磷酸化的蛋白激酶定位在类囊膜上，酶的激活需要质体醌氧还池( p q p 0 0 1 ) ”】和c y tb f 的联合介导”“1 。蓝藻中p si 和p s 的能态调节机制尚未完全明 确，但是p qp o o l 和c y tb f 在能态调节过程中起到了重要作用”。 1 3 4 质体蓝素( p l a s t o c y a n i n ) 和细胞色素c 。( c y t o c h r o m eo 质体蓝素( p l a s t o c y a n i n ，p c ) 和细胞色素c 。( c y t o c h r o m e ，c y l o 介导c y t b y 和p 7 0 0 间的电子传递。c y t 岛是一个携带