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流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 研究生：许莹 指导教师：杨梅副教授 侯冬岩教授 学科专业：有机化学 摘要 固相反应器基于其节省试剂、实验装置简化、操作筒单和提高分析体系灵敏 度等特点，目前已经越来越多地与流动体系相结合并被用于药物分析、环境分析和 生物分子的测定中。 本文将性质稳定且具有强氧化性的铋酸钠粉末固定在硅胶表面制得同相氧化 器，并结合流动技术、流动注射技术以及顺序注射技术，在流动体系中研究了铋酸 钠固相反应器的氧化性能以及在在线药物分析、在线环境分析中的应用潜力，其主 要内容如下： 我们用制各的固定化铋酸钠氧化器在连续流动体系中研究了儿茶酚胺类化合 物肾上腺素与去甲肾上腺素的氧化产物性质。不仅建立了两种化合物的在线可见吸 收光谱分析法，而且还利用其在紫外区吸收波k = 的差异，用双波长法实现了两种化 合物的同时测定。该方法对肾上腺素和去甲肾上腺素线性范围分别为 0 卜l o o g g m l 和0 4 - 6 0 h g m l ，检出限为0 0 6 p g m l 和0 i p g m l 。另外，通过自 制的氧化铝固相萃取柱有效地分离血清中的儿茶酚胺类化合物，从而对血清样品中 的肾上腺素和去甲肾上腺素含量的测定进行了初步探讨，取得了较满意的结果。 利用铋酸钠固相氧化器，并结合流动注射和顺序注射技术，在线定量地生成单 质溴，并基于能量转移机理建立了一种高选择性测定四环素的化学发光新方法。该 方法在流动注射系统中的线性范围为0 卜4 0 p g m l ，对5 9 9 m l 四环素标准溶液进 4 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 行1 1 次测定，计算出方法的相对标准偏差为2 2 3 ，检出限为0 0 6 7 p g m l 。而在 顺序注射操作系统中，此方法盼线性范围为0 0 1 - 6 0 p , g m l ，对5 i t g m l 四环素标准 溶液进行1 1 次测定，计算出方法的相对标准偏差为2 1 5 ，检出限为 5 9 1 0 。峙，m l 。同时通过实验数据的比较也迸一步评价了两种流动技术的灵敏度 和稳定性。将该固相氧化器应用于牛奶中四环素的测定，取得了较满意的结果。 为了进一步验证固相氧化器的可靠性和稳定性，还成功地将其应用于联氨的化 学发光测定新方法的建立中。该方法在0 0 2 5 - 1 5 p , g r n l 。1 范围内对联氨有较好的线 性，对o 5 p , g m l 。的联氨标准溶液进行连续11 次平行测定，相对标准偏差为2 8 8 ， 计算出检出限为8 5 1 03 雌m l l 。将该方法应用丁：饮用水及海水的加标回收率试 验，取得了较满意的结果。 实验结果表明，铋酸钠固相氧化器具备较高的可靠性和稳定性，制各方法简单， 使用寿命较长，氧化范围广泛而且极易与各种流动技术结合，在具有还原性质的 无机物和有机物的在线分析中有广阔的应用前景。 关键词：固相反应器铋酸钠化学发光分光光度流动体系 流动体系中固定化镪酸钠在线氧化性能的研究及应用 第一章绪论 1 1 固相反应器的制备原理及在流动体系中的应用 在流动分析中，大多数情况下使用的是均相反应。因此，要求样品和试剂均为 溶液。如果试剂比较昂贵( 如酶试剂) ，或试剂水溶性很差，或试剂只能以固体形 式存在时，这些试剂就不适用于常规的流动分析中。随着试剂固定化技术的不断发 展，非均相反应也越来越受到人们的关注。所谓试剂固定化是指将参与反应的一种 或几种试剂。通过一定的方法或固定在载体上或直接形成同体颗粒”。在流动体系 中，通过上述的固定化方法制成的崮相反应器在进行异相化学反应时，与均相反应 相比，有如下的优点： ( 1 ) 对于一些复杂的反应体系，往往需要多种试剂加入，有时各种试剂又不 能事先混合，这就需要多道流路，有时甚至是多极混合的多道流路。若将部分试剂 事先制成固相反应器，在流动系统中通过串联多个崮相反应器，简化了流路，减少 了试剂混合管道以及动力泵的使用。 ( 2 ) 试剂的消耗大大减少。在流动分析过程中，有时均相反应没有完全，大 部分试剂没有参加反应就排入废液浪费了。而在含有固相反应器的异相反应中，只 有参加反应的试剂被消耗而排入废液，这样节约了试剂，节省了资源。 ( 3 ) 操作简单、方便。制作好一个固相反应器，可以连续使用上百次，而不 像均相反应那样需要配制大量的溶液。 ( 4 ) 固定以后的试剂在溶液中稳定性增强，试剂集中，局部反应浓度大，使 反应更加安全； 6 流动体系中固定化铋酿钠在线氧化性能的研究及应用 ( 5 ) 流动体系中使用固相反应器往往还能减少样品的轴向扩散，提高灵敏度。 近年来固相反应器的制备主要集中于以下方法： 物理吸附是利用载体自身所具有的吸附性能将被固定试剂吸附在其表面。 k a r g o s h a 2 】在红外振动下将铋酸钠粉末吸附在预先高温处理好的硅胶表面，然后将 固定的铋酸钠装柱制成固相反应器用于流动注射体系。当样品流过固相反应器时， 其中的m n 2 _ 被氧化成m n 0 4 一，通过光度法检测m n 0 4 一含量间接测定了水样中的锰 离子。l a r e d o1 3 1 等人将饱和的碘溶液以较慢的流速泵入一聚乙烯管道中，利用碘与 聚乙烯之间的强烈吸附将碘固定在聚乙烯管壁内，该吸附作用约半小时便可达到饱 和。以此制成的固相反应器可以在线氧化依米丁，通过测定其氧化产物的荧光强度 对该物质的含量进行测定。物理吸附固定化方法操作简便，可以对各种不同的物质 进行固定，应_ j 范围广，缺点在丁对物质的吸附效率不高，固定性差，被| 古i 定试剂 在载体表面上分布不均匀。 聚合包埋是将无机试剂包埋在有机聚合物形成的空间网状结构中。它的适用范 围是粉末状的无机试剂。该固定化方法中常用到的聚合试剂是一种常温下里液态的 聚酯树脂。这类聚酯树脂作为发生聚合反应的单体，在一定盼引发荆作用卜- 发生聚 合反应，形成固体。固定过程是将聚酯树脂溶液( 约l o g ) 放入一硅橡胶制成的烧 杯中，然后加入粉末状的无机试剂以及催化剂( 一般为甲基乙基酮) ，搅拌均匀， 经过3 _ 4 小时的聚合反应，混合物黏度增加，形成块状固体，从而实现固定化。将 该固体取出粉碎到所需大小颗粒，装柱后制成固相反应器。f a t i b e l li t 用上述方法固 定了c u 3 ( p 0 4 ) 2 粉末，制成具有弱氧化性的c u 3 ( p 0 4 ) 2 固相反应器。该固相反应器与 抗坏血酸反应后其中的二价铜就被还原为一价铜离子进入溶液，利用对溶液中的 一价铜离子含量进行光度法检测就可间接测定抗坏血酸的含量。同样，具有弱氧 化性的f e ( o h ) a 固体粉末制成的固相反应器也能与抗坏血酸的含量t ”。除了上述一 7 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 些弱氧化剂以外，有强氧化性的固体粉末也被用来固定，如m a r o l l i n e 川利用聚合 包埋法固定的p b 0 2 反应器将左旋多巴氧化成多巴色素，光度法测定了药物中的左 旋多巴。基于聚合包埋制成的p b o ：固相反应器还可以间接测定蒽丹西酮i ”、氯丙 嗪【8 】、硫醚嚷恻的含量。较p b c h 氧化性稍弱的m n 0 2 也可以被固定并应用于一些有 较强还原性的药物含量的测定。l a h u e r t a ! ”i 等就用聚合包埋制成m n 0 2 固相反应器， 该固相反应器将具有还原性的异烟肼在线还原，被还原的m r l 2 + 通过原子吸收进行 检测后就可以间接测定药物中的异烟肼。吩噻嗪类药物也具有较强的还原性，而且 其氧化产物在可见光范围内有吸收。因此通过光度法可以对这类药物进行检测。 k o j l o 【l l j 等以m n 0 2 固相反应器作为氧化剂，成功地实现了吩噻嗪类药物的光度法 测定。f u s t e r 【j “等将o 5 m h c ! 通过聚合包埋制成的f e ( p 0 4 h 阎相反应器，使该囿相 反应器成为三价铁的稳定来源。通过光度法检测洗脱下来的三价铁与萘啶酮酸和吡 哌酸生成的有色配合物来测定蔡啶酮酸和吡哌酸的含量。从以上实例可以看出，利 用聚酯树脂及其催化剂之间的聚合反应来进行无机试剂的固定化以被广泛的应用 到了流动分析领域。聚合包埋固定方法的突出优势表现在固定试剂牢固程度大大高 于物理吸附，应用范围也比较广，只要在常温下呈固态粉末的无机试剂都可以用该 方法进行固定，而且同定的试剂使用寿命长。但这种固定化方法的缺点在于包埋后 的试剂与溶液的有效接触面积减小，使反应的灵敏度有所降低。 化学沉积是指固定试剂以沉淀形式吸附在载体表面或自身形成固体颗粒。因而 适用于这类固定化方法的无机试剂必须是一些能够以沉淀形式得到的物质。该方法 使用的载体一般是多孔硅胶。其固定过程是在可以发生沉淀反应的溶液与硅胶之间 的不断搅拌中实现的。由于被固定的无机试剂是经过化学反应在线生成的，因而颗 粒非常细小，有利于多孔硅胶对其的吸附，这样得到的固定化试剂牢固性高于物理 吸附。c a n 以及n a i d o o f l 4 肄人先后通过将p b ( c h 3 c o o ) 2 和n a c i o 与硅胶共同搅 拌的方法通过化学沉积固定了p b 0 2 。他们用固定后的p b 0 2 制成固相反应器来氧化 8 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 m b 2 + ，生成的m n 0 4 用光度法检测，从而测定了水中的m n ”。该固相反应器还被 成功用于可待因等药物的检测” 。在有载体参与的化学沉积固定化方法中除了使用 这种常见的惰性载体硅胶以外，其他一些具有活性的金属，如锌粒、铜片等也被 成功用作化学沉积的载体”】。另外化学沉积固定法也可以无需任何载体，而依靠沉 淀自身化学性质形成固体颗粒。y f u s t e r 1 7 1 等人将亚砷酸钠溶解在水中，然后将p h 值调到1 2 5 之后将配置好的c e ( ) 溶液缓慢加入其中，2 4 h 斤生成凝胶状的沉淀， 把沉淀过滤后用蒸馏水洗涤，在空气中干燥，利用亚砷酸钠与c e ( n 地) 2 州0 3 ) 6 在常 温下反应沉积出一种化学组成为c e 0 2 a s 0 3 5 h 2 0 的红黑固体颗粒，无需载体固定 了c e ( ) 。他们用这种固体氧化剂直接氧化盐酸异丙嗪，然后利用光度法测定了 其氧化产物。z h e n g - h u as o n g “”也用同样的固体氧化剂将三氟拉嗪氧化为具有荧 光的物质后以荧光法测其含量。化学沉积固定方法一方面改善了固定试剂的牢固 性，另一方面也提高了固定化试剂的有效接触面积。但其缺点是固定的对象都是一 些能通过化学反应生成的沉淀，因而应用范围较窄。 化学键合是指被固定的试剂与载体之间是以某种化学键结合起来的。在有机试 剂的固定中由于有机物自身带有丰富的官能团，它们可以和载体表面的官能团以共 价键的形式相互作用；而无机试剂自身没有官能团，它们与载体之间是通过离子键 来实现试剂固定化的。这种固定化方法一般是以离子树脂作为载体，利用阴阳离子 树脂表面所带的电荷与试剃本身所带电荷之间的静电作用来对试剂进行固定化。同 定过程是将所要固定的试剂与树脂共同搅拌约1 2 小时以上，然后过滤，用蒸馏水 洗涤、烘干即可。测定被固定试剂量的最简便方法是计算剩余试剂量。这种固定化 方法的固定化对象限定为液体。m e s t r e 等人用该方法固定了铁氰化钾，利用扑 热息痛能够被铁氰化钾氧化发出微弱荧光，n ，n 二甲基甲酰胺能够使这一荧光强度 人失增强的原理测定了药物扑热息痛的含量。同样，m a r c o l i n o 2 0 1 等人也用该方法 固定了铁氰化钾和鲁米诺，从而建立了测定抗坏血酸的新方法。由于离子键本身能 9 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 量较弱因此利用这种方法固定的试剂牢固性较差，使用寿命较短。但该方法具有 操作过程简单，应用范围广的优点。 1 2 固相反应器在化学发光反应中的应用 化学发光检测方法是基于化学发光现象的一种分析测试方法。化学发光分析方 法与传统的光学分析方法相比较有以下的特点：( 1 ) 检测背景低，不受光源和高温 的影响；( 2 ) 分析物直接参与具有一定特异性的化学发光反应，降低了样品基质的 于扰；( 3 ) 宽的检测范围，一般为3 - 4 个数量级；( 4 ) 化学发光产生的光辐射时间 一般为几秒，因此化学发光方法的检测速度较快，这些优点使化学发光成为良好的 分析检测手段。但是，化学发光法存在一个问题：与其他检测法( 如荧光法、紫外 可见光度法、电导法) 相比，化学发光法是基于化学反应的一种检测手段，因此 需要消耗试剂，除了分析物外，还需要至少一种试剂作为氧化剂或还原剂或催化剂， 这些试剂经过化学发光反应后，均被消耗。另一方面，为了得到好的精密度。化学 发光法经常结合流动注射溶液处理技术。在化学发光流动体系中，需要源源不断把 反应试剂运送到反应区。这样，连续流动的反应试剂会造成大量的实验室废液，造 成试剂浪费和环境问题。所有这些必将限制着化学发光法的广泛应用。特别是在样 品含量相对较少的药物分析中这个问题更为突出。 目前，固相反应器在化学发光法中的应用已经出现了很多报道，下面就按固定 化的对象和固定化常用的载体两方面简要说明固相反应器在化学发光法中的应用。 1 2 1 固定化试剂常用的裁体 固定化试齐j 常用的载体主要有离子交换树脂、凝胶、微( 多) 孔玻璃、硅胶等。 以离子交换树腊为载体的固定他方法。是利用静电力将反应试剂的阴( 阳) 离子 1 0 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 与阴( 阳) 离子交换树脂上的活性基团发生交换，固定在离子交换树脂上制成固定 化试剂。将固定了试剂的树脂填充于玻璃管，连接在流动系统中。利用洗脱液将试 剂洗脱下来，进入流通池与被测物质产生化学发光反应。或者用水作推动液，利用 离子交换作用，使被测物质与发光试剂发生离子交换，被置换出来的发光试剂在流 通池内反应产生发光。以离子交换树脂为载体多使用阴离子交换树脂，常用来固定 鲁米诺、。f e ( c n ) 6 、m n 0 4 、c n 、1 0 4 - 等，而阳离子交换树脂则较少使用，章竹君 所领导的研究所在这方面的工作晟为突出。以离子交换树脂作为载体的化学发光体 系主要有l u m i n 0 1 f e 2 * - 0 2 1 2 1 】、l u m i n o l c u 2 + - c n 【”1 、l u m i n o l c n - + 0 2 l 2 3 1 、 l u m i n 0 1 c u 2 _ c n 。1 2 4 】、苦杏仁甙十b 葡萄糖甙酶口”与l u m i n 0 1 c n 偶合、 h 2 0 2 l u m i n o l - c 0 2 + 1 2 6 j 、尿素十尿素酶与k m n 0 4 | u m i n o l 偶合口1 、d 一氨基酸丰d 氨基 酸氧化酶与l u m i n o l + h 2 0 2 f e ( c n ) 6 3 一偶合 2 s l 、l u m i n o l 一1 0 4 【2 9 】、 l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p t 3 ”、1 0 4 一h 2 0 2 口1 1 、l u m i n 0 1 h 2 0 2 c o ( i i ) 乙醇胺【3 2 l 以及胆同醇一 胆围醇氧化酶与l u m i n o l + h 2 0 2 f e ( c n ) 6 3 。偶合等。所测定物质分别为f e 2 十、c u “、 c n 、苦杏仁甙、n a + 、h 2 0 2 、尿素、d 氢基酸、c 1 。、b r 、n o 。、s 0 4 。、异烟肼、 肾上腺素、异丙( 去甲) 肾上腺索、胆固醇等。 溶胶- 凝胶以其体系纯度高、均匀性强、处理温度低、反应条件易于控制等优 点，已在许多领域得到了广泛应用，特别是在生物分子和某些无机试剂的固定化中 1 应用更多。在化学发光试剂的固定化中采用溶胶凝胶制备固定化试剂时多采用 醇盐前驱体的水解聚合，再在适宜环境中干燥、老化。例如袁道强【3 习等首先在硅酸 乙酯中加入乙醇、水和盐酸，然后搅拌形成溶胶，再将所要固定的葡萄糖氧化酶加 入溶胶中形成搀杂溶胶，然后在搀杂溶胶中加入一定粒径的分子筛，在4 c 下静置， 溶胶成为干胶。这样葡萄糖氧化酶就搀杂在凝胶中构成固定化试剂。目前溶胶凝胶 技术已广泛用于生物传感器中f 3 s - 3 6 1 。在化学发光试剂的固定化中常用的凝胶前驱体 有硅酸甲酯、硅酸乙酯、琼脂糖等，所测定的物质有h 2 0 2 【3 7 】、胆碱o ”、碱性磷酸 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 酯酶、葡萄耱【删和淀粉等h ”。 微孔玻璃是富含s i 0 2 的硼硅酸盐玻璃，可以制成管、片、粉末状。在分析化学 中微孔玻璃是微滤、超级过滤以及色层分离中经常使用的性能良好的分离介质和吸 收介质，其表面经过处理或修饰后多用作传感器的衬基物质或衬托材料。在化学发 光分析中，以微孔玻璃为载体的固定化技术通常用于偶合化学发光分析。采用微孔 玻璃作为载体或衬基所固定的化学发光试剂常见的有鲁米诺( 以戊二醛为偶联 剂) 4 2 】、辣根过氧化物酶、谷氢酸氧化酶】、丙氨酸转氨酶”、葡萄糖氧化酶【4 6 】、 氨基酸氧化酶 4 7 】、乙醇氧化酶”等。用于测定乙醇、天冬氨酸、l 丙氨酸、a 一酮 戊二酸、l 谷氨酸、葡萄糖、d 氨基酸、屎酸等。 其它固定化学发光试剂的载体如封满良口1 1 等将甲壳质沉积在硅胶上作载体固 定h r p 和d 一氨基酸氧化酶用于测定血清中的d 氨基酸。j i a nw a n g 4 9 1 等以硅胶为 载体同定鲁米诺及氯化高铁血红素用于化学发光法测定h 2 0 2 。k r i c k a 【5 0 】等将h r p 通过卵白素生物素固定在硝化纤维膜上，制成过氧化氢传感器。s a n f e l i u 【5 ”等通过 把鲁米诺固定在放置于光电倍增管前的水凝胶或聚合体的吸附剂涂层内，研究了用 于氧和二氧化氮的发光的化学传感器。以氟代多羟基低聚物作为固定鲁米诺、k o h 和f e 2 ( s 0 4 ) 3 的支持基体用于测定氧，可以测定氮气中2 4 p p m 的氧。j i a n x i ud u s 2 1 将一种多层酶组装物固定在一种光学纤维表面。利用这种固定化技术伟6 造了一种基 于化学发光的光纤光学生物传感器，用于检测有机磷杀虫剂。 1 - 2 2 固定化对象 1 利用自身发光反应测定反应物时，固定另一种反应物 如果利用自身化学发光测定某一种反应物贝0 固定另外的反应物。例如李保新 1 2 流动体系中圃定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 等4 5 ”利用溶胶凝胶技术将h r p 固定，然后涂在流通池的内壁形成敏感膜，根据鲁米 诺h 2 0 2 - h r p 化学发光反应，结合流动注射分析技术，研制了用于测定h 2 0 2 的传感 器。 2 利用自身发光反应测定催化糊或抑制剂时，固定一种或所有反应物。 王昌福等”】将鲁米诺和高锰酸钾分别固定在d 2 0 1 型大孔阴离子交换树脂上， 混合装填于玻璃管。将此装填有固定化试剂的玻璃管连接在流路中，当洗脱液流过 玻璃管时，鲁米诺和高锰酸钾被洗脱下来并与另一流路中的抗坏血酸混合进入检测 器的流通池中，由于抗坏血酸对l u m i n o l k m n o 。这一发光反应具有抑制作用，因此 会引起发光信号强度的变化，据此可以检测一定浓度范围的抗坏血酸。陈浩汉【”】 利用同样的固定方法，根据c u 2 + 对l u m i n 0 1 k m n o t 发光反应的抑制作用实现了铜 的测定，检出限为2 1 0 ”g m l 。 3 利用敏化反应测定发光效率不高的反应物时可以将反应物或敏化剂固定。 章竹君和秦伟【5 6 1 等将氧化剂高锰酸钾和敏化剂核黄素磷酸盐固定在阴离子交 换树脂上制成固相反应器，当亚硫酸根离子通过时产生发光信号，从而实现亚硫酸 根的测定。 4 利用偶合反应进行测定时，可以将两个反应的一种或多种反应物固定，实现被 分析物的测定。 彭友元o ”1 等利用菠菜组织制备草酸氧化酶柱，将鲁米诺、c 0 2 + 分别固定在阴离 子交换树脂和阳离子交换树脂上，当含有草酸盐的样品通过草酸氧化酶柱时，可生 成h 2 0 2 ，然后与从离子交换树脂柱中洗脱下来的鲁米诺和c 0 2 + _ l y 合并产生化学发 光，从而实现了草酸盐的测定。检出限2 0 1 0 7 m o l l ，线性范围4 o 1 0 1 o 1 3 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 1 0 。4 m o l l 。马丽娟和章竹君等人口8 啪用弱酸型阳离子交换树脂( d 1 5 1 ) 固定f e 3 + ，阴 离子交换树脂( a m b e r l y s t a 一2 7 ) 1 蜀定鲁米诺，然后分别装入内径为3 m i n ，体积为 0 6 m l 的玻璃管中。选用o 0 2 m o f l , 的h c l 、o 0 0 2 m o l l 的n a 3 p 0 4 作为洗脱液，分 别定量地把f e ”和l u m i n o l 从树脂上洗脱下来，f e ”与还原型辅酶i 反应生成f e “， 进而与l u m i n o l 发生化学发光反应，从而间接测定还原型辅酶l ，检出限为5 5 1 0 - 3 m o i l 。 1 ，3 化学发光在药物分析中的应用 利用化学发光进行药物分析和药理学研究已经成为化学发光应用最为广泛的 领域之一，灵敏度离、检测快速的化学发光分析方法为药物分析特别是临床分析提 供了强有力的手段，随着其他分析技术如流动注射和色谱的发展，化学发光在药物 分析中的应用将更为广泛。 近年来药物分析中应用较广的化学发光体系有鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 5 9 1 、光泽精 ( l u c i g e n i n ) 【6 0 】、过氧化草酸酯( p e r o x y o x a l a t e s ) j a i l 、洛粉碱( l o p h i n e ) 【6 ”、吖 啶酯( a c r i d i n i u me x t e r ) i ”1 、三( 2 ，2 - 联吡啶) 钉( ) ( t r i s ( 2 2 - b i p y r i d y l ) r u t h e n i u m ( g ) ) 州和1 ，2 - 二氧杂环丁烷类( a d a m a n t y ld i o x t a n e s ) 5 埒。利用化 学发光进行药物分析的方法主要分为直接化学发光分析和间接化学发光分析。 1 3 1 直接化擘发光法 直接化学发光法是分析物分子( 药物) 通过氧化还原反应，产生激发态产物， 辐射跃迁返回基态时产生化学发光进而进行检测的方法。如下式所示： e x c i t i a t i o nr e a c t i o n ：a + b - + c 1 4 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 d e e x c i t i a t i o ne a e t i o n ：c _ + c + h v 下面将常见的化学发光分析方法总结于表卜1 。 表卜1 药物的直接化学发光测定 1 3 2 间接化擘发光法 间接分析主要是基于分析物对于已有化学发光体系的增敏或抑制作用，从而根 据发光强度的增强或降低间接测定分析物的方法。反应过程如下 1 5 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 e n e r g y t r a n s f e rs t e p ：c + f + c + f r e e x c t a t i o nr e a c t i o n ：f + 叶f + h v 其中c 为激发态分子，物质分子f 一般为可以吸收辐射能量的具有荧光活性 的物质。药物分析方法中，可以通过转移化学反应所释放的能量生成激发态物质， 产生化学发光。这一类反应在药物分析中的应用归纳如表卜2 。 表卜2 药物的间接化学发光测定 分析药物化学发光试剂检测范围样品 文献 煎萱星主 甲硫昧唑 旺! 比堕唑 己烯雌酚 阿莫西林 阿齐霉素 多巴胺 肾上腺素 维生素b 维生素 黄连素 氨比西林 头孢菌素 利血平 核黄素 l m m i n o l - h 2 0 2 l u m i n o l - h 2 0 2 l u m i n o l h z 0 2 l u m i n o l h 2 0 2 l u m i n o l - h 2 0 2 l u m i n o l - h 2 0 2 l u m i n o l - k f e ( c n ) 6 l u m i n o l - k 3 f e ( c n ) 6 l u m i n o l - k 3 f e ( c n ) 6 l u m i n o l - k 3 f c n ) 6 l u m i n o l - k 3 f e ( c n ) 5 l u m i n 0 1 1 0 十 l u m i n 0 1 1 0 l u m i n o l - n b s l u m i n 0 1 1 0 + 2 - 1 0 0 p g m l 1 3 - 1 2 0 “gm l - 1 0 0 1 1 2 1 t g m l 1 0 i - 1 5 0 p g m l - 0 1 p g m l - 1 1 n gm l 1 4n g m l - o 4 u g m l 一1 0 0 5 - 1 0n g m l 1 0 0 1 1 5 p g + m l 。1 0 1 p , gm l ，1 0 叭- 1 5 雌n 1 l 。1 0 0 5 3 0 0a g m l 。1 0 0 2 - 1 咤m l 。1 0 9 n g m l 1 1 0 - 3 0 0r i g m l - 1 0 0 4 2 0 0n g m l 1 1 6 药剂80 药剂81 药剂82 药剂83 药剂84 药剂、尿液8 5 药剂86 药剂 8 7 药剂88 药剂89 药剂 9 0 药剂 9 1 药剂 9 2 药剂 9 3 药剂、尿液9 4 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 芸香苷 v b l 窒卫重 特布他林 髭里些噬 病毒唑 巡 异烟肼 氨茶碱 氨甲苯酸 降糖灵 托普霉素 甲福明 鄢可丁 篮羞缝 氧氟沙星 罂粟碱 酪氨酸 阴环素 l 岫i n 0 1 1 0 l u m i n 0 1 ，i o l t m l i n 0 1 1 0 + l u m i n o l - k m n 0 4 l u m i n o j - k m n o a l u m i n o l - n a 2 s 2 0 4 l u m i n o l - c r 2 0 7 2 一 l u m i n o l - n b s l u m i n o l - n b s l u r a i n o l - n b s l u m i n 0 1 n b s l u m i n o 卜n b s l u m l n o 卜n b s s o ，2 - k m n 0 4 s 吗2 - - m o , s o ，2 - k m n 0 4 s 0 3 t 0 4 s 2 - k m n 0 4 c n - - h 2 0 2 0 1 - 3 0l a g m l 1 3 3 p m 0 1 l l 6 7 n m 0 1 l - 1 0 1 5 0n g i 心1 0 5 - 5 0 0r i g m l 。l 1 8 8 - 2 0 0n g m l 。1 0 0 1 1 峙m l 1 5 0 p g m l - l 5 0n g m l 。1 2 0 n g m l l 1 p 昏m l _ 1 o 1 - 7 p g m l 。 8 - 6 0 0n g m l 1 2 n g m l 1 0 2 - 1 0 0 m g l 1 0 0 0 7 - 3 0 i t g m l 1 0 0 2 - 2 0 t a n o l ，l 1 0 0 0 0 9 1 0 i l m d l l 0 0 0 1 1 0 芦n 0 1 l 。1 0 2 - 1 0 p m 0 1 l _ 1 4 - 2 8 u m 0 1 l 。1 2 0 0 n m 0 1 l l 5 9 m 0 1 l 1 药剂、屎液9 5 药剂、屎液9 6 药剂、尿液9 7 药剂、屎液9 8 药剂 9 9 药剂、尿液1 0 0 药剂、屎液1 0 1 血浆 1 0 2 血浆 1 0 3 药剂 1 0 4 药剂 1 0 5 药剂、血清1 0 6 药剂 1 0 7 模拟样品 1 0 8 药剂，尿样1 0 9 药剂、屎样1 1 0 药剂 1 1 1 药剂 1 1 2 药剂 1 1 3 综上所述，固相反应器基于其节省试剂、实验装置简化、操作简单和提商分析 体系灵敏度等特点，目前已经越来越多地通过与流动体系相结合被用于药物分析、 环境分析和生物分子的测定中。尤其引起我们注意的是一些具有氧化性的难溶的无 机化合物通过固定化方法制成的固相反应器被成功应用到了流动体系中，如p b 0 2 、 1 7 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 m n 0 2 等。 铋被认为是一种相对无毒的重金属，其无机化合物铋酸钠是一种难溶于水的黄 色或褐色粉末。在酸性介质中，b i ( v ) 易被还原为b i ( ) ，其标准电极电位为+ 1 8 v 。 尽管铋酸钠具有非常强的氧化性，但其在实际中的应用没有得到足够的重视，目前 仅仅被用于少数的有机合成中“。而在分析化学中，由于其在常温下难溶于水的 性质，很大程度上限制了铋酸钠的应用。 近几年，由于固相反应器与流动技术的发展，铋酸钠逐渐受到分析工作者的关 注。从前面的讨论中也可以看出，固相反应器是异相反应体系的核心部分，其中的 固体试剂应该有足够的反应速度和适当的物理特性，这样的固体试剂才可以用作固 相反应器，而铋酸钠的性状完全符合这种要求。“i r i s 等人通过切成小块的 1 5 9 c r - 1 21 1 型海绵与1 5 9 n a b i 0 3 粉末的连续搅拌的方法，固定了铋酸钠并制成固 相反应器。利用铋酸钠在酸性反应介质中可以氧化亚硫酸钠产生弱化学发光，而吡 哌酸可以侵该体系的化学法光信号显著增强这一现象，结合流动注射技术建立了药 物中吡哌酸的化学发光测定方法。k a r g o s h ak 1 2 1 在红外振动下将铋酸钠粉末吸附在 预先高温处理搞好的硅胶表面，然后将固定的铋酸钠装柱制成固相反应器用于流动 注射体系。当样品流过圃相反应器时，其中的m n 2 + 被氧化成m n 0 4 ，通过光度法检 测h 佃o 。含量间接测定了水样中的锰离子。 本文将性质稳定且具有强氧化性的铋酸钠粉末固定在硅胶表面制得闭相氧化 器，并结合流动技术、流动注射技术以及顺序注射技术，在流动体系中研究了铋酸 钠固相反应器的氧化性能以及在在线药物分析、在线环境分析中的应用潜力。 s o r o u r a f l d i n ”q 等利用铋酸钠粉末氧化儿茶酚胺生成有色氧化产物的性质，建立了 几茶酚胺药物的分光光度检测方法。在此基础上，我们用制备的固定化铋酸钠氧化 器，在连续流动体系中研究了儿茶酚胺类化合物肾上腺素与去甲肾上腺素的氧化产 1 8 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 物性质。不仅建立了两种化合物的在线可见吸收光谱分析法，而且还利用其在紫外 区吸收波长的差异，用双波长法实现了两种化合物的选择性测定。同时我们注意到 在化学发光反应中单质澳一宜无法像k m n o n b s 、k 3 f e ( c n 、等其他强氧化剂 一样被广泛应用，究其原因主要是由于单质溴存在着以下几个问题：第一，溴单质 不稳定，需要不断的对其进行定量。第二，溴单质溶液刺激性强且容易挥发，易 对环境及人体造成危害。郑行望【嘲等人利用在线电解生成单质溴进行了几种药物的 测定，但这种溴单质的电化学制备使得仪器系统更为复杂，不利于分析装置的小型 化。本实验利用铋酸钠固相氧化器，并结合流动注射和顺序注射技术，在线定量地 生成单质溴，解决了以往方法所存在的问题，并基于能量转移机理，建立了四环囊 和联氨的化学发光测定新方法。 实验结果表明，铋酸钠固相氧化器具备较高的可靠性和稳定性，制备方法简单， 使用寿命较长，氧化范围较广，而且极易与各种流动技术结合，在具有还原性质的 无机物和有机物的在线分析中有广黼的应用前景。 1 9 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 第二章铋酸钠固相反应器在线氧化儿茶酚胺分光光度分析体 系研究 2 1 引言 儿茶酚胺( c a t e c h o l a m i n e s ，c h ) 是低分子量物质，由儿茶酚( 邻苯二酚) 及胺组 成。c a 作为人体内非常重要的神经递质和激素物质，主要分布于交感神经细胞、 肾上腺髓质和中枢神经系统在心血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏、平滑肌 等组织系统的生理活动中起着重要的调控作用。它们不仅直接参与对血压、心率、 呼吸和睡眠等植物神经功能的生理调控，而且还与一些功能性疾病如神经分裂症、 忧郁症以及器质性病变的出现有关”。因此检测脑、血液、尿、组织中这类微量 神经递质，对研究其活动机理和有关疾病的诊断有重要意义同时也为此类药物的 质量控制提供方法”。 去甲肾上腺素( n o r e p i n e p h r i n e ，n e ) 和肾上腺素( e p i n e p h r i n e ，e p ) 是人体中摄 重要的c a 类物质。肾上腺素对受体和8 受体都有激活作用能够使心肌收缩加强， 心率加快，心肌耗氧量增加。在临床上肾上腺素药物常用于抢救过敏性休克及心脏 骤停，此外还有松弛气管和胃肠道平滑肌的作用；去甲肾上腺素是中枢神经系统和 节后交感神经的一种神经递质，主要激活o 【受体，而对b 受体激活作用很弱，具有 很强的血管收缩作用，能使全身小动脉与小静脉收缩，外周阻力增高，血压上升。 医疗上常用其重酒石酸盐用于治疗高血压以及改善休克时的组织血液供应“”1 。它 们的分子结构见下图： 2 0 流动体系中崮定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 h h o c h c h 2 n h 2 肾e 腺素 去甲肾匕腺素 由于肾上腺素具有邻苯二酚的骨架，且在a 位上有一个c h ( 叫) 一基团，这决 定了它容易氧化的性质，而肾上腺素的各种生物学功用多与其氧化反应有关。 儿茶酚胺的分析研究始于2 0 世纪4 0 年代，随着人们对儿茶酚胺类物质研究的 深入，已经报道了许多测定方法，有放射酶学法“、色谱法。2 “、电分析方法“2 ” 以及稀土离子荧光探针法“等，其中色谱和电分析方法较为常见。几茶酚胺类物 质的分光光度检测方法大体可分为三种“2 ”2 ，一是用氧化剂将儿茶酚胺类化合物 氧化为有色基团，这类氧化剂有高碘酸盐、n a w o , 等，二是通过增加其共轭结构来 增强物质的吸光度，三是以儿茶酚胺作为其它反应的催化剂，间接测定儿茶酚氨的 含量。近几年来，对于分光光度法的应用，基本没有脱离过去的检测方法，只是从 操作技术上进行了改进，如离子交换柱“，流动注射“2 ，停流注射”“的应用。 铋酸钠作为一种强氧化剂在酸性介质中能氧化肾上腺素和去甲肾上腺素等儿 茶酚胺类物质，其产物在可见区有较强吸收。曾经有报道利用该反应通过分光光度 法准确检测儿茶酚胺从而解决了在紫外区检测时潜在的干扰问题，取得了较好的效 果【l ”】。但是该方法需要离心、过滤等复杂的预处理步骤来去除不溶于水的铋酸钠 对测定的影响。如果把试剂固定化技术和固体氧化剂引入到流动体系中，有效的利 用固相反应器进行异相反应，可以很好的解决铋酸钠的难溶性问题。另外，肾上腺 素和去甲肾上腺素的氧化产物在可见区的吸收峰非常接近。所以只能对单一组分进 行定量。如何进行两种组分的同时测定，也是亟待解决的问题。而我们研究发现， 2 1 漉动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 它们在紫外区的最大吸收波长有较大的差异，两个吸收蜂有1 3 n 的差别，可以利用 双波长法同时对两种组分进行定量分析。 本文将性质稳定且具有强氧化性的铋酸钠粉末固定在硅胶表面制得固相氧化 器，并结合流动技术，实现了儿茶酚胺类药物的在线分光光度测定，并对该体系的 氧化机理进行了探讨。实验中我们还发现，n e 和e p 的氧化产物不但在可见区4 8 4 n m 和4 8 7 n m 处有较强的吸收，在紫外区也存在着两个更强的吸收峰( 2 8 2 n m 和2 9 5 n m ) ， 两个峰有1 3 n m 的差异可以利用双波长法实现对两种组分的同时测定。在可见区的 测定主要用于对单一组分的测定，适用于测定的样晶主要为禽干扰较少的药物制 剂。该方法对肾上腺素和去甲肾上腺素线性范围分别为0 1l o o d g m l 和 0 4 - 6 0 p g m l ，检出限为0 0 6 和0 1 p g m l ，通过检测针剂中的肾上腺素及去甲肾上腺 素的含量对该方法的可靠性进行了验证，结果令人满意。而对于复杂的生物样品或 药物中同类组分的同时测定，以往方法中通常利用色谱法来分离各组分再对其进行 检测“”1 ，本文利用双波长法实现了对肾上腺素和去甲肾上腺素两种组分的选择性 测定，使整个检测系统较以往的方法更为简便、快捷和廉价。方法的线性范围分别 为o 5 - 1 0 0 p g m l 和卜6 0 p g m l ，捡出限为0 1 3 腭d m l 和0 3 l 峙佃l 。另外，通过自制 的氧化铝圆相萃取柱有效分离血清中的儿茶酚胺类化合物，从而利用该体系对血清 样品中的肾上腺索和去甲肾上腺素含量的测定进行了初步研究，结果令人满意。 2 2 实验部分 2 2 1 试剂 去甲肾上腺素( s i g m a ) 储备液2 m g m l ；准确称取l o o m ge p ，溶于水中，再用 水定容至5 0 m l ；置于4 c 保存。工作液用p h = 4 的缓冲溶液稀释；肾上腺素( s i g m a ) 储备液l m g m l ：准确称取5 0 m ge p ，溶于水中，再用水定容至5 0 m l ；置于4 保存。 流动体系中固定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 工作液用p h = 4 的缓冲溶液稀释；铋酸钠n a b i o s ( m e r c k ) ；缓冲溶液( p h = 4 ) ；量取 i m o l l c i g c o o n a 和0 i m o l l 儿s 0 。按体积比1 ：4 混合摇匀，用酸度笔测量p h 为4 ： h 2 s 0 4 溶液( 2 m o l l ) ； 实验用健康血清( 校卫生所提供) 本实验所用药品皆为分析纯，所用水为二次蒸馏水。 2 2 2 仪器与设备 w 一2 4 0 紫外可见分光光度计( 日本岛滓) ：精密p h 酸度笔( 江苏江分电分析 仪器有限公司) ；l d b h 电子蠕动泵( 浙江省象山定山仪器厂) ；q l 一9 0 1 漩涡混 合器( 麒麟医用仪器厂) ；k d c 一1 6 h 高速离心机( 科大创新股份有限公司中佳分公 司) ：b s 2 1 0 s 型电子天平( 北京赛多利斯天平有限公司) ：微量移液器( g i l s o n ， 法国) 。 2 2 3 铋酸钠固相氧化柱制备 直接用铋酸钠装柱时，由于铋酸钠颗粒太小，难于固定在反应器中，并且使溶 液通过固相反应器时会受到很大的阻力，对流动分析会产生不利影响。另外，铋酸 钠的流失很严重，影响整个测定。因此应选用适当的载体来固定铋酸钠。离子交换 树脂对反应体系中的某些试剂离子也会产生吸附，适用范围较窄，而用微孔玻璃和 凝胶作为铋酸钠载体程序相对复杂，所以本实验选用廉价、性质稳定的硅胶来固定 铋酸钠。 称取在1 0 0 0 c 处理3 小时的硅胶( 1 0 0 2 0 0 目) 5 9 ，然后加入1 9 固体铋酸钠 粉末，连续搅拌3 0 m i n 。称取固定有铋酸钠粉末的硅胶颗粒l o o m g ，装入一段的聚 流动体系中周定化铋酸钠在线氧化性能的研究及应用 四氟乙烯管( 2 m 7 c m ) ，用玻璃棉堵塞两端以防试剂流失。固定柱使用前，以 1 1 2 m l m i n 的流速，先用水冲洗1 5 r a i n ，再用p h = 4 的缓冲溶液冲洗1 5 m i n ，以平 衡固体柱。 2 2 4 氧化铝固相萃取柱制备 2 2 4 1 氧化铝的活化 用去离子水将酸性氧化铝浸泡ih 再用2 m o l l 的h c l 浸泡4 h ，最后用去离子 水洗至中性，在烘箱内1 0 0 烘干2 4 h 后保存在干燥器内，备用。 2 2 4 2 固相萃取拄的制作 取一段聚四氟乙烯管( 3 m m x7 c m ) ，填入5 0 m g 的活性氧化铝，在管两端填入少 量的玻璃棉，防止氧化铝漏出，即得到氧化铝固相萃取柱。 2 2 5 实验步骤： s w 图1 固相反应器流动系统检测装置 f i g 1 s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h ef l o ws y s t e m 、v i m s o l i dr c a c t o x s ：s a m p l e ，p ：p u m p , s p o ：s o l i dp h a s eo x i d a n t ，f c ， f l o wc e l l d ：d e t e c t e r ，w ：w a s t e 分别取适量去甲肾上腺素、肾上腺素于1 盘l 离心管中，用p h ：4 缓冲溶液定容至 l m l ，摇匀。按图1 所示，利用蠕动泵推动试液以1 1 2 m l