（茶学专业论文）绿茶中四种儿茶素单体ec、egc、ecg、egcg和槲皮素单体分离制备.pdf

中文摘要 茶叶是一种富含茶多酚的植物，多酚总量占到了茶叶干重的1 8 - 3 6 。茶叶中 多酚包括儿茶素、黄酮及其苷类、花青素和花白素以及酚酸和缩酚酸等，而其中儿茶 素占到多酚总量的7 0 左右。儿茶素不仅仅对茶叶的滋味具有重要的作用，而且大 量的研究表明儿茶素还具有重要的生物活性，在抗氧化、清除楚自由基、抗茵消炎、 抗病毒，预防心血管疾病、降血压血脂和预防癌症等方面其中重要的功能。由于儿茶 素主要组分结构和物理化学性质比较相似，有效的分离各儿茶素单体有一定的难度。 伴随着儿茶素药理功能研究的不断深入，儿茶素单体分离制备的研究显得更为突出， 因此探寻一种简单易行、成本低廉的儿茶素单体制备方法具有重要的现实意义。本文 在查阅了国内外大量文献基础上，研究了从绿茶中分离制备儿茶素单体的方法。具体 研究内容如下： 1 本论文通过查阅大量文献，对目前国内外已有的分离制备儿茶素单体方法展开 综述。分析比较了硅胶柱层析、凝胶柱层析、高速逆流色谱、制备液相、吸附柱层析 以及多种方法联用的优缺点。制备液相和高速逆流色谱制备纯度高，但是制备量小； 柱层析制备量大但是产品纯度低，需要后续进一步的纯化。此外论文也对茶叶中槲皮 素也进行了综述讨论。 2 试验以市场随机购买绿茶为原料，提取分离制备茶多酚。分析比较绿茶原料 的理化指标和制得多酚的纯度。选取6 个茶样中多酚含量范围为1 5 0 2 - - 2 4 8 9m g g a e 分1 之间。6 种绿茶多酚提取得率为5 3 2 1 2 0 2 ，多酚纯度为6 3 4 8 到6 9 0 8m g g a l e g d 之间。所得多酚中四种主要的表儿茶素e c 、e g c 、e c g 和e g c g 的平均含 量依次为6 o o 、1 1 2 2 、9 1 7 和3 7 3 2 。 3 以9 5 的乙醇为洗脱溶剂，通过s e p h e d e xl h 2 0 柱层析对茶多酚进行粗分 离得到e c 、e g c 、e c g 和e g c g 粗品，粗品纯度依次为7 8 1 6 、7 8 2 6 、8 8 8 3 和9 2 3 3 。其后采用结晶的方法对e c 、e g c 、e g c g 粗品进行纯化，得到的产品其 纯度依次为9 7 2 8 、9 8 1 4 和9 9 1 2 ；对e c g 粗品采取柱层析分离方法纯化，得 到纯度为9 3 3 4 的e c g 产品。纯化过程中e c 、e g c 、e c g 和e g c g 的得率分别为 5 9 6 2 、5 0 7 8 、6 1 8 9 和5 9 6 1 。 4 本试验在研究分离制备儿茶素单体同时，可以分离制备纯度达到9 8 以上的 槲皮素。试验突破了以往先水解芦丁得到槲皮素的方法，为槲皮素的分离制备提供了 一种新的方法参考；此外从茶叶中分离制备槲皮素的报道较少，本文茶叶为原料，对 于如何充分开发和利用茶叶资源提供一条途径。 5 最后论文对分离制备的儿茶素和槲皮素单体进行了波长扫描、1 h n m r 和 1 3 c n m r 检测分析。从而确证了所得的产品为相应单体。 关键词：茶儿茶素：槲皮素：分离制备：s e p h e d e xl h 一2 0 柱层析：结晶： a b s t r a c t t e ai so n eo ft h eo r d i n a r yp l a n t sr i c hc o n t a i n e dp o l y p h e n o l i cc o m p o u n d sw h i c h a c c o u n tf o r1 8 3 6 o ft h et o t a ld r i e dw e i g h to ft e a t e ap o l y p h e n o l si n c l u d ec a t e c h i n s ， f l a v o n o i dg l y c o s i d e s ，f l a v o n o l i d s ，a n t h o c y a n i d i n s ，p h e n o l i ca c i d ，e ta 1 a m o n gt h o s e p o l y p h e n o l s ，c a t e c h i n sa c c o u n tf o rn e a r l y7 0 a n d i ti sa ni m p o r t a n ti n g r e d i e n tt h a ti sv i t a l t ot h ec o l o r , f l a v o ra n dt a s t eo ft e a i na d d i t i o n ，i ti ss h o w e dt h a tc a t e c h i n si sa l li m p o r t a n t n a t u r a lp r o d u c tw i t hm a n yb i o l o g i c a la c t i v i t i e sa n dp h a r m a c o l o g i c a la c t i o n si n c l u d i n g a n t i - o x i d a t i o n ，f r e er a d i c a ls c a v e n g i n g ，c a r d i o v a s c u l a rp r o t e c t i o n ，a n t i i n f l a m m a t i o n ， a n t i a l l e r g y , a n t i v i r u s ，a n t i - t u m o ra n dp r e v e n t i o nc a n c e r , e ta 1 h o w e v e r , i ti sd i f f i c u l tt o i s o l a t ea n dp u r i f yc a t e c h i n sf o rt h er e a s o nt h a tc h e m i c a la n dp h y s i c a lp r o p e r t i e so f i n d i v i d u a lc a t e c h i n sa r es i m i l a r s oh o wt oo b t a i nt h eh i g hp u r i t yc a t e c h i n si sb e c o m i n ga s i g n i f i c a n ts c i e n t i f i cp r o j e c t t h et a s ko ft h i sp a p e rw a ss t u d y i n gt h ep r e p a r a t i o no fh i g h p u r i t yi n d i v i d u a lc a t e c h i n so nt h eb a s i so fp r e v i o u sr e s e a r c h e s 1 t h em e t h o do fi s o l a t i n ga n dp r e p a r i n gc a t e c h i n sa n dr e c e n tr e s e a r c hp r o g r e s sw e r e r e v i e w e db yr e a d i n ga n dc o n s u l t i n gl o t so fp r e v i o u sp a p e r s c o m p a r i n gd i f f e r e n tm e t h o d s o fp r e p a r i n gc a t e c h i n ss u c ha ss i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , s e p h a d e xl h 一2 0c o l u m n c h r o m a t o g r a p h ，h s c c c , p r e p a r a t i v eh p l c , a d s o r p t i o nc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , c ta 1 h s c c ca n dh p l c w a se a s yt og e tt h eh i g hp u r i t yc a t e c h i n sb u tt h ey i e l dr a t ew a sl o w o n t h ec o n t r a r y , t h ey i e l dr a t eo fc o l u m nc h r o m a t o g r a p hw a sh i g l lb u tt h ep u r i t yw a sl o w w h a ti sm o r e ，t h em e t h o do fp r e p a r i n gq u e r c e t i nw a sr e v i e w e di nt h ep a p e r 2 t h ep u r i t ya n dp r o p e r t i e so fc o m m e r c i a lg r e e nt e aa n dt e ap o l y p h e n o l sw e r et e s t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er a n g eo fp o l y p h e n o l sw a sf r o m1 5 0 2 - 2 4 8 9g a e 哲1 t h e y i e l dr a t eo ft e ap o l y p h e n o l se x t r a c t e df r o mg r e e nt e aw a sf r o m5 3 2 t o1 2 0 2 t h e p u r i t yo fp r e p a r a t i v et e ap o l y p h e n o l s ，i nw h i c ht h ec o n t a i no fe c ，e g c ，e c ga n de g c g w a s6 0 0 ，1 1 2 2 ，9 1 7 a n d3 7 3 2 r e s p e c t i v e l y , w a sf r o m6 3 4 8t o6 9 0 8 r a gg a e g 3 c r u d ef r a c t i o n so fe c ，e g c ，e c ga n de g c gw e r eo b t a i n e db yp r e p a r i n gt e a p o l y p h e n o l sw i t ht h e9 5 e t h a n o le l u t i o no ns e p h a d e xl h 一2 0c o l u m n t h eh p l cp u r i t y o ff o u rc r u d ee c ，e g c ，e c ga n de g c gw a s7 8 1 6 ，7 8 2 6 ，8 8 8 3 a n d9 2 3 3 s u b s e q u e n t l y , t h ep u r ef r a c t i o n so fe c , e g c ，a n de g c gw e r eg o t t e nb yc r y s t a l l i z a t i o n w h i l ep u r ee c gw a so b t a i n e db y s e p h a d e xl h 一2 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h t h ep u r i t ya n d t h ey i e l dr a t eo fp u r ee c ，e g c ，e c ga n de g c gw e r e9 7 2 8 5 9 6 2 ，9 8 1 4 5 0 7 8 ， i i i 9 3 3 4 6 1 8 9 ，9 9 1 2 5 9 6 1 4 h i g hp u r i t yq u r e c e t i nw a so b t a i n e db yt h em e t h o dp r o v i d i n gi nt h i sp a p e r a t p r e s e n t ，t h ec o m m o nm e t h o df o rs e p a r a t i n ga n dp r e p a r i n gq u e r c e t i ni sh y d r o l y z i n ga n d r e m o v i n gt h eg l y c o s y lf r o mm t i ne x t r a c t e df r o mt h ep l a n t s m o r e o v e r , t h e r ei ss of e w r e p o r to np r e p a r i n gq u e r c e t i nf r o mt e a i no u rw o r k s ，q u e r c e t i nw a ss e p a r a t e df r o mt e a p o l y p h e n o l sw i t ht h e9 5 e t h a n o le l u t i o no ns e p h a d e xl h - 2 0c o l u m na n df u r t h e rp u r i f i e d b yp r e c i p i t a t i n g a tc o o l r e f r i g e r a t o r o u rr e s e a r c hp r o v i d e do n em e t h o dt op r e p a r e q u e r c e t i nm o n o m e rf r o mg r e e nt e a 5 a tt h ee n do ft h ep a p e r , p r e p a r a t i v ec a t e c h i n sa n dq u e r c t i nw e r ec o n f i r m e db y w a v e l e n g t hs c a n n i n g , 1 h n m ra n d1 3 c - n m r t h ep u r ef o r mo fc a t e c h i n sa n dq u e r c t i n w e r ec o n f i r m e db ya n a l y z i n gt h ee x p e r i m e n td a t e s k e y w o r d s ：c a t e c h i n ，q u e r c e t i n ，s e p a r e t i o na n dp r e p a r e t i o n ，s e p h a d e xl h 2 0c o l u m n c h r o m a t o g r a p h ，c r y s t a l l i z a t i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 第一导师签名： 时间：年 时间：年月日 1 文献综述 1 1 前言 茶叶起源我国云贵高原地区，为多年生常绿叶用作物【l j 。我国是最早发现，栽培 和利用茶叶的国家，茶是由茶树( c a m e l l i as i n e n s i s l 徊jk u n t z ) 加工而成的，从最初 药用到现在作为饮料，茶叶已经被人类利用的几千年，茶叶现在已经成为仅次于水之 后的世界流行饮料之一2 一】。茶按照加工工艺可分为绿茶、红茶、青茶、白茶、黄茶 和黑茶六大类；按照发酵程度的不同可以将茶叶分为发酵茶( 如红茶) 、半发酵茶( 如 乌龙茶) 和不发酵茶( 如绿茶) 。由于绿茶加工过程中采用了高温杀青使酶失活，因 此绿茶保留了茶鲜叶中大部分物质【4 。j 。 目前从茶叶中已经分离、鉴定的已知化合物有7 0 0 多种，其中包括初级代谢产物 蛋白质、糖类、脂类以及次级代谢产物，如多酚、色素、茶氨酸、生物碱、芳香物质、 皂甙等。茶叶中的多酚类物质占茶叶干重的1 8 - 3 6 ，主要包括黄烷醇类、黄酮和 黄酮醇类( 如槲皮素、杨梅素和山柰素以及他们的苷类物质) 、花青素和花白素以及 酚酸和缩酚酸。多酚类物质主要为儿茶素类( 黄烷醇类，结构如图1 所示) ，其含量 占干重的1 2 - - 2 4 ，占多酚总量的7 0 - - 8 0 。儿茶素类物质主体为表儿茶素( e c ) 、 表没食子儿茶素( e g c ) 、表儿茶素没食子酸酯( e c g ) 、表没食子儿茶素没食子酸 酯( e g c g ) 。此外，还含有少量的( + ) g c 、g c g 、c g 、( + ) c 。在儿茶素类物质当 中，e g c g 和e c g 为主要组分，它们分别占儿茶素总量的5 0 和1 5 左右【1 1 。 o h h “o r 2 g = o h 图1茶叶中四种主要儿茶素的化学结构 f i g 1s t r u c t u r e so ff o u rm a j o rc a t e c h i n si nt e a 注：1r t = r 2 = h e p i c a t e e h i n ( e c ) 2r t = o h ，r 2 = he p i g a l l o c a t e c h i n ( e g c ) 3r i = h ，r 2 = g e p i c a t e c h i n - 3 - g a l l a t e ( e c g ) 4r 1 = o h ，r 2 = ge p i g a l l o c a t e c h i n - 3 - g a l l a t e ( e g c g ) g = - o a n o y l ( 没食子酰基) 近年来科学研究表明茶叶中还存在少量的甲基化修饰的儿茶素类物质。1 9 9 9 年日 本学者m i t s u a k is a n o 首次从乌龙茶中分离纯化得到了没食子基团上羟基被甲基化的 两种e g c g 甲基化儿茶素 6 1 。2 0 0 0 年m a r im a e d a y a m a m o t o 从日本b e n i h o m a r e 、b e n i f u k i 和t o n c h i n 乌龙茶中分离e g c g 的甲基化产物【刀，同年m a s a z u m is u z u k i 也从 b e n i h o m a r ea n dt o n gt i n gt e a 中分离得到儿茶素的甲基化产物【8 】o2 0 0 8 年周蓓等人依次 从龙井茶、云南大叶绿茶、雨花茶、金坛雀舌绿茶和铁观音检测到了e g c g 和e c g 甲 基化物质【9 】o 1 2 茶叶中儿茶素的生物活性 流行病学调查和现代药理学研究表明饮茶对人体健康具有积极作用，茶叶中含有 的多酚、茶色素和黄酮类物质具有明显的抗衰老、抗氧化，抗血脂，抑菌杀菌、抗过 敏、防止动脉粥样化、抗辐射等方面具有重要的作用【1 0 1 。大量的动物试验表明的茶叶 中儿茶素类的物质是一种较好的天然活性物质，现对已有的研究结果综述如下。 1 2 1 清除自由基和抗氧化作用 研究表明儿茶素具有明显的抗氧化作用，是一种优良的天然抗氧化剂。松崎秒 子等【1 1 】研究了四种儿茶素对猪油的抗氧化能力，结果显示儿茶素的抗氧化能力的强弱 顺序为：e g c g e g c e c g e c 。陈留记【1 2 】等研究了儿茶素b 环上的羟基通过接收自 由基团而变成羰基，从而发挥清除自由基的作用。l u oy f t l 3 】研究了四种儿茶素对超 氧阴离子的清除能力e g c g e c g e g c e c ，同时研究表明当四种儿茶素e g c g ：e c g ： e g c ：e c 的混合比例为3 ：3 ：1 ：l 的时候，清除自由基的效果达到最佳。l e esr 【1 4 】研究 了e g c g 对脂质过氧化的鼠脑抑制作用，能有效预防由于氧化作用对鼠脑产生的伤 害。 1 2 2 抑制肿瘤和防止辐射的作用 1 9 9 7 生l z j a n k u nj 【1 5 】在n a t u r e 杂志上发表了一片题目为“w h yd r i n k i n gg r e e nt e ac o u l d p r e v e n tc a n c e r ”的文章。该文章指出人类癌症需要蛋白质酶入侵细胞从而诱导肿瘤， 其中这个关键的酶是尿激酶( u p a ) 。试验比较- f e g c g 和阿米洛利对这个酶的抑制作 用，e g c g 虽然比阿米洛利作用小，但是人们每天的饮茶量保证了人体摄入了大量的 e g c g ，从而能够起到癌症预防作用。f u j i l 【ih 【1 6 1 7 】研究发现e g c g 抑制肿瘤坏死因子 - a 基因表达的细胞和从细胞中释放出来，同时研究发现经常喝绿茶可以减少乳腺癌患 2 者的发病率。f ucy 【1 8 1 、符移才【1 9 】和b r e i t f e l l n e rs 【2 0 】等人分别研究t ) l 茶素在抗紫外 辐射所引起的动物组织损伤中的作用，结果表明儿茶素有良好的抗辐射作用，对动物 组织能够起到保护作用。 1 2 3 艾滋病防治和抗菌作用 体外研究发现，茶多酚对艾滋病c m d s ) 病毒具有相当强的阻断作用，可有效 抑制a i d s 病毒的增殖，其阻断能力是国际上通用的治疗a i d s 药物a z t2 0 3 0 倍 【2 1 2 2 j 。研究发现，e g c g 可通过抑制h 1 糖蛋i 兰1 1 2 0 与t 细胞上c d 4 分子的结合，从 而起到抗h i v 1 病毒的作用【2 3 】。f u k a ik 和s a k a n a k as t 2 4 ，2 5 】等研究表明儿茶素还具有抑 制其他病原真菌的作用。 1 2 4 降脂、降血压和预防心血管疾病 s a n gkn 研究小组通过动物实验和流行病学研究表明，儿茶素可以降低血清中胆 固醇和甘油三酯的水平，抑制小肠对脂类物质的吸收，增加其排泄，从而预防冠心病 的发生【2 6 2 7 1 。此外儿茶素类物质还可以改善血管内皮细胞功能，扩张血管，降低血 压，从而达到预防心血管疾病的目的【硼。 1 。2 5 防治糖尿病作用 研究发现，儿茶素中的e g c g 可抑制糖异生过程中关键酶类磷酸烯醇式丙 酮酸羧激酶( p e p c k ) 的活性，激活胰岛素受体的酪氨酸磷酸化，并可增加磷酸肌醇3 激酶( p i 3 k ) 和丝裂原活化蛋白激酶( 脚k s ) 的活性，诱导一种胰岛素敏感的核 转录因子f o x o l a 的蛋白磷酸化，从而部分替代胰岛素的功能，起到降血糖作用，从 而达到防治糖尿病的功效【2 9 矧。 1 2 6 解毒和解酒功能 茶多酚对重金属有很强的吸附作用，因此多饮茶可减轻食物中重金属的毒害作 用。另外喝茶能使酒精随尿液迅速排出体外，同时绿茶中的儿茶素可以显著抑制长期 饮酒所引起的大鼠肝细胞膜的脂质过氧化作用，从而缓解和消除酒精毒害【3 1 1 。儿茶 素也可以使烟草中的有毒物质“尼古丁”沉淀，并从小便中排出体外，而且还能清除 烟气中的自由基，降低烟气对人体的毒害作用【3 2 3 3 】。2 0 0 7 年s y e ddn 研究发现e g c g 具有解烟毒的功效。e g c g 可以抑制吸烟所引起的核转录因子n f - k a p p a b 、 p 1 3 k a k t m t o r 和m a p k s 信号途径的激活，有效抑制吸烟引起的n h b e 细胞( 正 3 常人支气管上皮细胞) 的炎症发生，抑制细胞增殖和血管增生，预防肺癌的发生【3 4 1 。 1 3 儿茶素的分离与制备 由于儿茶素主要组分结构和物理化学性质比较相似，要想有效的分离各儿茶素单 体有一定的难度。但伴随着儿茶素药理功能研究的不断深入，儿茶素单体分离制备的 研究显得更为重要，越来越受到人们的关注。到目前为止，诸多研究人员对儿茶素单 体的分离制备方法做了大量的研究，如纤维素柱层析、s e p h a d e xl h 2 0 柱层析、硅胶 柱层析和高速逆流色谱等。 1 3 1 纤维素柱层析分离 v u a t a z l t 3 5 l 等利用纤维素分配特性进行儿茶素单体的分离。将茶叶乙酸乙酯的粗 提物1 9 和4 9 用水湿润的纤维粉拌匀后上纤维素柱( 3 x 6 8 c m ) ，依次用水饱和的丙酸 乙酯与石油醚( 9 ：1 ) 、水饱和的丙酸乙酯、水饱和的乙酸乙酯等进行洗脱。结果发 现，e c g 和e g c g 主要被丙酸乙酯与石油醚洗脱，( + ) c 和e c 主要被丙酸乙酯所洗脱， 而( + ) g c 和e g c 主要被乙酸乙酯所洗脱下来的。最后分别采用在水甲醇、二氯甲僦 乙酸乙酯和二氯甲烷中进行结晶纯化，得到各主要儿茶素单体。 1 3 2s e p h a d e xl h 2 0 凝胶柱层析分离 凝胶柱层析是利用凝胶把物质按分子大小的不同进行分离的一种方法。s e p h a d e x l h 2 0 是凝胶s e p h a d e xg 2 5 经羟丙基化处理后的产物，与s e p h a d e xg 2 5 羟基总数不 变，但多了许多丙基，使得此凝胶具有轻微的疏水性( 反相吸附效果) ，这就扩大了 凝胶的应用范围，使其不仅可分离水溶性物质，也可分离脂溶性的物质。除具备一般 的分子筛作用外，s e p h a d e xl h 2 0 在极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常还起到 反相分配色谱的作用【弧翊。 1 3 2 1 柱层析分离结合结晶纯化 c h e nc h u n g w e n 和h oc h i t a n g 【3 8 】将茶叶的乙酸乙酯提取物用s e p h a d e xl h 2 0 柱分离( 5 x 9 5 c m ) ，9 5 乙醇洗脱，洗脱速度2 m l m i n ，分别得至u e c g 、e g c 和e g c g ， 经h p l c 检测，各单体的纯度均在9 7 以上。z h un a n q u n 等人【3 9 】将1 0 9 茶多酚粗品上 s e p h a d e xl h 2 0 柱( 3 8 x 4 5 7 e r a ) 分离，同样采用9 5 的乙醇洗脱，最后得到7 0 0 m g 的 e g c 和1 3 0 0 m g i 拘e g c g ，纯度均在9 8 ( i - i p l c ) 以上。 r o b e r t s o n a 脚j 和o p i e s hc 等人f 4 1 l 将儿茶素粗提物用甲醇溶解后，上s e p h a d e x 4 l h 2 0 柱分离( 5 x 9 5 c m ) ，洗脱液为氯仿一甲醇一汽油的混合液( 1 ：2 ：1 ，v v v ) ，e c g 和e g c g 能有效分离，而( + ) c 和e c 、( + ) - g c 和e g c 未完全分开。其中e c g 和e g c g 分 别在甲醇二氯甲烷和水中结晶得到纯品。 r y o y a s u s 【4 2 1 ) 羽s e p h a d e xl h 2 0 ( 5 x 4 5 c m ) 分离2 0 l 茶素的粗提物，4 0 的丙酮 洗脱，得到含有e c g 和e g c g 混合组分的儿茶素，再经s e p h a d e xl h 2 0 柱分离 ( 3 3 x 8 5 c m ，甲醇：正己聪乙酸乙酯：水的混合液( 1 0 0 ：3 0 ：2 5 ：5 ，v v v ) 洗脱分离， 得至i j e c g 、e g c g 、x 和y ，然后对x 和y 再进行s e p h a d e xl h 2 0 柱分离，在甲醇水中 结晶得到甲基化的儿茶素没食子酸酯( - ) - e p i c a t e c h i n 3 ( 3 - o - m e t h y l g a l l a t e ) 和 ( 一) - e p i g a l l o c a t e c h i n 一3 - o o m e t h y l g a l l a t e ) 。 s u s a n n e v 等人【4 3 1 将6 5 9 儿茶素粗品上s e p h a d e xl h 2 0 柱( 1 0 x 7 8 c m ) 分离，用9 5 的乙醇洗脱，得到相应儿茶素粗品，再经硅胶柱二次分离和结晶纯化后，得到了高纯 度的e c 、e g c 、e c g 和e g c g 单体。 1 3 2 2 柱层析分离结合半制备型液相柱纯化 r y s z a r d a 【删将5 0 0 m g 儿茶素粗品溶解后上s 印h a d e xl h 2 0 柱分离( 1 6 x 9 0 c m ) 。 洗脱剂为乙醇，流速1 2 m l m i n ，得到四个含有儿茶素的部分。然后将这四个部分分 别进行半制备液相色谱进行纯化( 础m1 0 2 5 5 c m 的r p - 1 8 色谱柱；流动相为水：乙 腈：甲醇：乙酸= 7 9 5 ：1 8 ：2 ：0 。5 ) ，最后得到四种高纯度儿茶素e c 、e g c 、e c g 和e g c g 。 王洪新等人【4 5 】将1 0 9 儿茶素粗提物上s e p h a d e xl h 2 0 柱( 2 5 x 7 5 c m ) ，依次用水 和3 0 、4 5 、6 0 、8 0 丙酮依次洗脱。含有儿茶素的组分再经半制备h p l c 纯化后， 得到7 种纯度均在9 9 以上的儿茶素单体e g c 、 ( + ) c 、e c 、e g c g 、e c g 、( + ) g c g 和( + ) c g 。 1 3 3 硅胶柱层析分离 硅胶层析的原理是利用不同物质的极性大小来分离的。硅胶表面带有羟基，能与 极性物质形成氢键，极性越强的物质与硅胶吸附得越牢固，极性越若吸附也越若。再 用不同极性的溶剂对硅胶进行洗脱的时候，溶剂极性越强，越容易洗脱与硅胶吸附的 物质，极性弱的溶剂洗脱能力越差【矧。 r y s z a r d a 【4 7 】将1 9 儿茶素粗提物溶解上硅胶柱( 3 0 x 6 0 c r a ) 分离，氯仿：甲醇： 水( 6 5 ：3 5 ：1 0 ，v 、，v ) 洗脱，最后得n 6 个组分。其中，组分含有e c ，组分含有 e c 和e g c ，组分含有e g c ，组分v 含有e g c 、e c g 和e g c g ，组分含有e g c g 。 5 然后用半制备型的i - i p l c 对含有儿茶素的组分进行纯化，最后得到e c 5 6 m g ， e g c l 6 4 m g ，e c g 6 2 m g ，e g c g l 3 2 m g a c h a nt a k h a n g n a i l l _ , a mw a i h a r t 4 8 1 2 0 0 7 年获得一项新颖的分离制备e g c g 的专利， 其分离过程也是通过硅胶柱来完成的。首先将绿茶中的儿茶素进行过乙酰化，再经乙 酸乙酯提取，浓缩干燥后上硅胶柱分离，用正己烷：乙酸乙酯( 1 ：2 ，v v ) 洗脱，分 别得到e g c g 、e c g 、e g c 和e c 的过乙酸酯组分，e g c g 和e g c 的过乙酸酯产率分别 为3 4 、1 1 ，其它两种物质产率低于0 0 1 。e g c g 的过乙酸酯经脱酯还原后得到 e g c g 粗品，再经硅胶柱纯化，得至) j e g c g 单体。其过乙酸酯化和脱酯化反应分别如 图2 和3 所示。 绿茶粉器必 图2 儿茶素的过乙酰化反应过程( c h a r tt a k h a n g 等，2 0 0 7 ) f i g 2m o d i f i c a t i o no fc a t e c h i n sb ya c e t y l a t i o n ( c h a r tt a k - h a n g e aa l2 0 0 7 ) 图3e g c g 的脱酰基还原反应过程( c h a nt a k - h a n g 等，2 0 0 7 ) f i g 3r e a c t i o no fr e m o v i n ga c e t y lg r o u po fe g c g ( c h a nt a k - h a n g c aa l2 0 0 7 ) 1 3 4 高速逆流色谱分离 逆流色谱技术( c o u n t e rc u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，简称c c c ) 是2 0 世纪7 0 年代发 展起来的一种液一液分配色谱新技术，可以在短时间内实现高效分离和制备。由于该 6 、一 技术为液液分配体系，可避免样品和固定相之间的不可逆吸附，且回收方便等优点， 业已广泛应用于天然产物的提取分离制备【4 9 ，5 0 l 。 杜琪珍等【5 1 1 分别采用单台高速逆流色谱和双机串联逆流色谱法来分离茶叶中的 儿茶素。采用单台高速逆流色谱分离7 0 0 m g j l 茶素粗提物时，分离得至u e g c 、e g c g 、 ( + ) g c g 、e c g ，以及( + ) c 和e c 的混合物。当采用双机串联分离系统后，分离3 9 j h 茶素粗品，得至u e g c g 、( + ) g c g 、e c g 、e g c ，纯度均在7 5 以上。经甲醇乙醚混 合液结晶，单体纯度均达9 7 以上。 张莹f 5 2 】等人用高速逆流色谱分离儿茶素采用两组溶剂系统，一组是石油醚乙酸 乙酯- 水( o 2 ：1 ：2 ，v v v ) ；另一组是正丁醇乙酸乙酯- 水( o 2 ：1 ：2 ，v v v ) 系统。进样量为4 9 绿茶提取物。用前一组溶剂系统，e c 、e g c g 、g c g 和e c g 得到了很好的分离，每一 种单体的纯度达到了9 8 ，其中e g c g 达到9 9 ；用后一组溶剂系统，e g c 和c 得到 了分离，纯度达到9 2 ，其中e g c g 单体得到1 2 9 。 c a ox u e 1 i 等【5 3 】以茶多酚为原料用高速逆流色谱进行两步分离。第一步：用乙酸 乙酯甲醇水混合溶剂将e g c g 分离出来，在分离时候逐渐增加甲醇的量，乙酸乙酯 甲醇水的体积比由2 5 ：1 ：2 5 变化至l j l o ：l ：l o ：第二步：将柱子里面的液体全部推出，浓 缩后再用高速逆流色谱分离，此时的溶剂系统为正己烷乙酸乙酯水( 1 ：4 ：5 ，v v v ) ， 最后依次得到g c g 和e c g 。通过该法1 9 茶多酚最后可分离得到e g c g 2 7 5 m g 、 g c g l 4 0 m g 和e c g l 3 0 m g ，纯度均在9 8 以上。 1 3 5 吸附树脂柱层析分离 瑞士r o c h e 公司2 0 0 3 年获得一项利用吸附树脂柱层析技术分离制备e g c g 的专 利 5 4 1 ，该专利用p o l y a m i d e l l 、a m b e r l i t ex a d 7 和a m b e r c h r o mc g 7 1 c 为柱填料来分 离儿茶素单体e g c g 。4 0 0 9 的茶多酚( 内含1 5 2 5 9 e g c g ) 上a m b e r l i t ex a d - 7 柱 ( 1 5 x 2 0 0 c m ) 分离，用水和异丙醇混合液洗脱( 9 ：l ，v v ) ，最后得至s j l l 2 9 纯度为9 2 1 的e g c g 单体。当使用a m b e r c h r o mc g 7 1 c 柱层析分离时( 2 2 x 2 0 0 c m ) ，2 0 9 茶多酚 经水和乙醇混合液( 9 ：1 ，v v ) 洗脱后，得到纯度为9 7 的e g c g 3 4 9 。使用p o l y a m i d e l l 为填料时，3 9 茶多酚上柱( 5 x 3 6 c m ) 分离，分别用5 0 0 m l 乙酸乙酯、1 0 0 0 m l 的乙酸 乙酯和乙醇( 8 5 ：1 5 ，v v ) 、1 0 0 0 m l 的乙酸乙酯和乙醇( 7 ：3 ，v 加) 和2 0 0 0 i 】也的乙 酸乙酯和乙醇( 1 ：1 ，v v ) 洗脱，得到含有e g c g 的洗脱液5 5 0 m l ，浓缩干燥后得到 e g c g 单体8 4 1 m g ，经液相检测纯度为9 6 。r o c h e 公司通过此类吸附柱层析技术，并 7 集成膜过滤等技术【5 5 1 ，业已实现e g c g 的工业化生产。膜富集原理见图4 ，含有e g c g 洗脱液加入到物料桶1 中，经泵2 抽到膜装置3 中，经膜分离后，不能透过的e g c g 回 到物料桶1 中，能透过去的小分子进入盛料桶4 中。经过多次循环后，浓度为0 6 3 9 l 的e g c g 洗脱液2 6 3 l 浓缩到2 0 6 l 。经检测，渗透液中无e g c g ，e g c g 的产率为9 5 ， 截留率为9 9 9 9 。 v rr e t e n t a t er e t u r n 1 s t o r a g ev e s s e lf o rc o n c e n t r a t ea n d o rf e e ds o l u t i o n 2 p u m p 3m e m b r a n em o d u l e 4 p e r m e a t ev e s s e l 图4e g c g 的膜富集示意图 f i g 。4s c h e m a t i cd i a g r a mf o rc o n c e n t r a t i n ge g c gb ym e m b r a n ef i l t e r a t i o n 以上总结t j l 茶素单体分离纯化的一些方法，目前以s e p h a d e xl h 2 0 和高速逆流 色谱为主要分离制备技术。两者方法各有其优缺点：s e p h a d e xl h 2 0 材料昂贵，目前 5 0 0 9s e p h a d e xl h 2 0 市场价格达到一万元以上，而且分离制备时间相对较长。高速逆 流色谱分离效果较好，得到的儿茶素单体的纯度较高，分离时间相对要短，但是目前 市场上的高速逆流色谱仪仍为分析型，制备量较少，最大也仅为克级。而采用a m b e r l i t e x a d 7 柱层析分离儿茶素量大，而且r o c h e 公司已经采用该方法工业化生产e g c g ， 但是对于分离其它的儿茶素条件还不成熟。 1 4 槲皮素概述 1 4 1 槲皮素的结构、分布和含量 槲皮素( q u e r c e t i n ) ，化学名为3 ，3 ，4 ，5 ，7 - 五羟基黄酮( 3 ，3 ，4 t ，5 ， 7 - p c n t a h y d r o x y f l a v o n e ) ，多以黄酮苷的形式( 芦丁) 存在于多种植物中( 图5 ) 。许 8 多中草药如槐米、侧柏叶、高良姜、款冬花、桑寄生、三七、银杏等均含此成分，其 中槲皮素在槐花米中含量高达4 左右1 5 6 1 。在茶叶中大部分槲皮素与糖结合形成苷， 结合的糖不同和连接的位置不同( 多数在3 位羟基上) 因而形成不同的苷如槲皮素 3 o 鼠李糖苷、槲皮素3 o 葡糖糖苷、槲皮素3 o 葡糖糖等等，另外茶叶还存在少 量游离态的槲皮素，已有研究表明在一芽三叶的茶鲜叶中，槲皮素的含量为 2 7 2 4 8 4 m g g 5 7 1 。 h h h o h o hoo ho 芦丁( r u t i n ) 槲皮素( q u e r c e t i n ) 图5 芦丁和槲皮素的化学结构式 f i g 5c h e m i c a ls t r u c t u r e so fl u t i na n dq u e r c e t i n 注：r h a = r h a m n o s e ，鼠李糖；g = g l u c o s e ，葡萄糖 h 1 4 2 槲皮紊的药理功能 近年来槲皮素的药理功能已经成为国内外学者