（微生物学专业论文）天然丙烯基苯化合物微生物转化和代谢的研究.pdf

1 1j 东入学博士学位论文 摘要 精油也称为芳香油，它是以香料植物的花、根、叶、茎等为原料，经蒸馏、 萃取或压榨等t 艺提取的具有香味的油性物质。有些精油的主要成分是具有丙烯 基苯结构的化合物，这些物质通常作为化学法合成香料的起始原料。如果采用微 生物或者酶法转化这类丙烯基苯结构化合物，就有可能得到高附加值的天然生物 香料。丁香酚和异丁香酚是j 香叶油的主要成分，具有典型的丙烯基苯结构，是 合成香兰素的初始物。因此本课题选择这两种化合物作为丙烯基苯化合物的模式 物，筛选能转化此类物质的微生物，以获得有价值的芳香化合物；同时对影响转 化的因素、相关代谢途径、代谢规律及产物分离纯化条件进行了探讨。 本工作通过从果园土样中筛选耐受商浓度丁香酚和异丁香酚的微生物、检验 菌株代谢底物能力，获得了一株能够在l ogl 。1 异丁香酚浓度下生长的菌株h s 8 ， 确定其可以代谢异丁香酚并产生香兰素。菌株h s 8 为典型的杆状菌，无分枝， 多呈二联体；革兰氏染色为阳性；有椭圆形芽孢，芽孢位于菌体的中部；菌株严 格好氧；过氧化氧酶实验、明胶淀粉水解实验、硝酸盐还原实验、v - p 实验和柠 檬酸盐的利用实验均呈阳性反应；能利用d 一葡萄糖、d 一甘露醇、d 木糖和l 一阿 拉伯糖产酸。h s 8 的1 6 sr d n a 序列( g e n b a n ka c c e s s i o nn o d q 3 0 9 3 3 3 ) 与枯 草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 的1 6 sr d n a 序列相似性超过9 9 。根据上述结 果，h s 8 被鉴定为枯草芽孢杆菌，并命名为且s u b t i l i sh s 8 。 初步研究了b s u b t i l i sh s 8 转化异丁香酚的基本特性。异丁香酚对绌胞有毒 性，丑s u b t i l i sh s 8 具有较强的耐受异丁香酚毒性的能力。在0 5 异丁香酚存在 时，h s 8 繁殖能力能够达到正常条件下的8 5 。当异丁香酚浓度超过1 0 时， h s 8 生长受到明显抑制。在2 异丁香酚存在时，不能观察到菌体的生长，显微 镜下观察到菌体发生自溶。h s 8 能够转化1gl 。异丁香酚生成o 2 1gl 。香兰素。 由于bs u b t i l i sh s 8 具有的耐受较高浓度异丁香酚、转化异丁香酚生成香兰素的 特征，该菌株被选择作为本课题研究的主要菌株。 以提高香兰素产量为目标，对h s 8 转化异丁香酚的条件进行厂优化。培养 基的碳氮源选择表明，葡萄糖和蔗糖是菌体生长的最佳碳源，豆饼粉彳i 仅有利于 山东大学博士学位论文 菌体增殖，转化产率也明显优于其它氮源。且s u b t i l i si t s 8 对渗透压敏感，当葡 萄糖浓度增大到2 时，菌体增殖受到抑制。底物的添加量和添加方法影响香兰 素的产量：当异丁香酚的浓度在0 5 1 5 范围内时，生成香兰素的浓度随底物 量增加而增大；当底物浓度超过1 5 ，产：生的香兰索逐渐减少；底物浓度与反 应速度呈难相关，补加底物能使香兰素浓度略有提高。针对异j | 香酚抑制菌体牛 长的特点，微生物转化采用菌体生氏和底物转化两个阶段进行。在菌体生长阶段 不加异丁香酚，在指数生长期后期加入异丁香酚，转入到转化阶段。通过流加糖， 转化前生物量能达到o d7 7 ( 6 2 0r i m ) ，比普通培养的生物量提高一倍。用流加 糖培养的高密度菌体转化异丁香酚，香兰素浓度达到1 3 0gl 。，比普通培养的菌 体转化产香兰素( o 6 7gl 。) 提高9 4 。溶氧和传质效率显著影响香兰素的产率。 采用带挡板的三角瓶强化溶氧，用卵磷脂作为乳化剂增加异丁香酚的分散以提高 传质效果后，转化1 0gl 1 异丁香酚产量提高到2 0 8gl 。向转化反应体系中加入 2gl 。1 的香兰酸能有效抑制香兰素的氧化，香兰素的产量提高了4 1 ，并且溶液 中的香兰酸比初始加入时略有增加。综合采用上述优化的培养基和培养条件， h s 8 转化1 0g l 。1 异_ r 香酚6 天，i 刊时添加2g l 1 香兰酸抑制香兰素降解，香兰素 产量达到2 2 1gl ，摩尔转化率为2 3 。 对h s 8 代谢异丁香酚的酶系进行了初步研究。该酶系是诱导型，胞内酶， 因此转化前要用低浓度的底物添导酶系的生成。 采用气相色谱高分辨质谱联用分析h s 8 转化异丁香酚的产物，对h s 8 代谢 异丁香酚的途径进行了研究。气相色谱检测到三种主要的异丁香酚代谢产物，通 过与标准物质的质谱图对比确定其中两种化合物分别为香兰素和脱氢二聚异丁 香酚。而第三种化合物在数据库中未搜索到完全匹配的物质，我们采用高分辨质 谱分析确定了分子量和分子式，并通过对该物质的裂解研究，结合文献报道，定 性该物质为异丁香酚二醇。本研究首次报道了异丁香酚二醇被检测为枯草芽孢杆 菌代谢异丁香酚到香兰素的中间代谢物。采用h s 8 休止绌胞转化体系对香兰素 及其衍生物代谢进行了研究。综合实验结果，推测了丑s u b t i l i sh s 8 代谢异丁香 酚产香兰素的途径：异丁香酚首先在丙烯基侧链双键处加氧，形成环氧异丁香酚， 环氧化合物水解后形成异丁香酚二醇，进一步代谢生成香兰素。香兰素经香兰酸 生成愈创木酚，或直接还原生成香兰醇。以无细胞提取液作为粗酶检测香兰酸脱 山东人学| 尊士学位沦文 羧酶的酶活性达到5 6 3 ，9n m o lm i n lf m gp r o t e i n ) 。h s 8 代谢异丁香酚产生的香兰 素、香兰酸、愈创木酚在香料产业中都是有价值的化合物。脱氢二聚异丁香酚是 两分子异丁香酚脱氢聚合的产物。本工作苗次确定了脱氧二聚异丁香酚是h s 8 转化异丁香酚生成香兰素的副产物。当脱氢二聚异丁香酚大量生成时，异丁香酚 转化为香兰素的量减少，降低了香兰素的转化率。到目前为止，这是首次较全面 的报道了关于微生物代谢异丁香酚途径的研究。 本工作同时还筛选到了两株假单胞菌n 1 3 和f 1 3 。菌株n 1 3 属铜绿假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) ，能在1 0gl 。的异】香酚存在时生长。菌株f 1 3 属 恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) ，具有降解阿魏酸的能力。使用h s 8 、n 1 3 和f 1 3 分别代谢多种丙烯基苯化合物，总结了三种微生物代谢丙烯基苯化合物的 规律。结果表明，这三种不同的菌株，都具有只代谢异丁香酚，刁i 能代谢丁香酚 的特征。丁香酚和异r 香酚的差别在f 侧链丙烯基的双键位置，分别侮于1 位和 2 一能。虽然在化学反应中，这两种物质可以异构化，但是在酶催化的反应中，不 同位置的双键在打开时机制可能不尽相同，所以推测催化这对异构物的酶系不是 完全相同，可能存在关键酶的差别。检验结果表明，这三株微生物对香兰素及其 衍生物的代谢存在差异。由于h s 8 和f 1 3 缺乏苯环开环的能力，降解异丁香酚 时能积累香兰素。而n 1 3 能以香兰酸为唯，一碳源生长，所以具有快速降解异丁香 酚的特征，但是不能积累香兰素。这种差别暗示，不同种的微生物菌株在转化异 j 一香酚产生香兰素后，香兰素进一步代谢途径不尽相同，导致香兰素的积累量有 明显差别。如果能在分子水平研究这些差别，将有利于使用基因工程改造微生物， 得到高产香兰素的菌株。h s 8 也能代谢异丁香酚的结构类似物反式茴香脑，暗示 着h s 8 的相关酶系对催化丙烯基苯化合物的侧链双键打开具有普遍的活性。 转化后的发酵液体系复杂，香兰素浓度低，并且与残留的异丁香酚难以实现 分离。目前针对于这种发酵体系的香兰素提取工艺研究还未见报道。本课题针对 发酵液的特点，研究了香兰素的分离纯化工艺。在发酵液的预处理工艺中，采用 1 0 的乙酸乙酯增加细胞的通透性，调整p h 到8 后离心除菌体，使香兰素尽可 能地进入水相。与直接离心萃取相比，香兰素收率提高1 9 4 。实验表明，在酸 性范围内，香兰素的分配系数受p h 值影响很小，因此萃取时不必要过度酸化。 香兰素在p h 6 5 时呈分子状态，亲水性最小，因选择萃取p h 值6 5 。综合考虑 1 1 1 山东人学博士学位沧义 香兰素的分配系数和香兰素与异丁香酚的分离系数，苯和乙酸丁酯是适合的萃取 剂。 香兰素与异丁香酚的结构和理化性质相似，单纯的溶剂萃取彳i 能分离这两种 物质。采用香兰素与亚硫酸氢钠的特征反应，用饱和亚硫酸氢钠将香兰素反萃到 水相，反萃取率达到9 9 以上。由于异丁香酚几乎不溶于水，该反应对纯化香兰 素具有明显的效果。参考萃取法提取香兰素工艺，设计了具有四个操作单元的发 酵液中香兰素分离纯化工艺：1 ) 发酵液的预处理；2 ) 苯萃取香兰素；3 ) 亚硫 酸氢钠反应萃取香兰素到水相：4 ) 酸化后萃取纯化香兰素，真空浓缩，得到香 兰素。按照上述工艺路线，从发酵液分离纯化香兰素，总收率达到6 3 6 。 关键词：丙烯基苯化合物微生物转化代谢途径分析异丁香酚二醇 山东大学博士学位论文 a b s t r a c t e s s e n t i a lo i l ，a l s ok n o w na sf r a g r a n to i l ，i saf r a g r a n to i l ys u b s t a n c ee x t r a c t e df r o m f l o w e r s ，r o o t s ，l e a v e so rs t e m s o fp e r f u m ep l a n t st h r o u g ht h et e c h n i q u e ss u c ha s d i s t i l l a t i o n e x t r a c t i o n a n dc o m p r e s s i o n t h em a i nc o m p o n e n t so fs o m ee s s e n t i a lo i l a r ep r o p e n y l b e n z e n e s t h e s ec o m p o u n d sa r eu s u a l l yu s e da ss t a r t i n gm a t e r i a l st o s y n t h e s i z ef r a g r a n t si n f l a v o ra n df r a g r a n c ei n d u s t r y n a t u r a lf r a g r a n t sw i t hh i g h v a l u e sc o u l d b e o b t a i n e db yb i o t r a n s f o r m a t i o no ft h e s ep r o p e n y l b e n z e n e su s i n g m i c r o b e so re n z y m e s f o re x a m p l e ，e u g e n o la n di s o e u g e n o lw h i c ha r et h em a i n c o m p o n e n t so fc l o v ee s s e n t i a lo i lw i t ht y p i c a lp r o p e n y t b e n z e n e ss t r u c t u r e sa r eu s e da s s t a r t i n gm a t e r i a l st op r o d u c ev a n i l l i ni nf l a v o ra n df r a g r a n c ei n d u s t r y t h e r e f o r e ，i n t h i s p r o j e c t ，w e s e l e c t e dt h e s et w o c o m p o u n d s a sm o d e ls u b s t a n c e so f p r o p e n y l b e n z e n e s s t r a i n st h a tc a nm e t a b o l i z ea b o v es u b s t a n c e sw e r ei s o l a t e d ，s oa s t oo b t a i nv a l u a b l e f r a g r a n tc o m p o u n d s m e a n w h i l e ，t h ef a c t o r s t h a ta f f e c t e d b i o t r a n s f o r m a t i o n ，m e t a b o l i cp a t h w a y so f , m e t a b o l i c c h a r a c t e r sa n di s o l a t i o no f v a n i l l i nf r o mf e r n l e n t a t i o nb r o t hw e r es t u d i e d ab a c t e r i u m ，d e s i g n a t e da sh s 8 ，w a si s o l a t e df r o ms o i lb a s e do i li t sa b i l i t yt o d e g r a d ei s o e u g e n 0 1 h s 8c o u l dc o n v e r ti s o e u g e n o lt ov a n i l l i n s t r a i nh s 8a p p e a r e da s as t r i c t l ya e r o b i c ，g r a m - p o s i t i v er o dw i t hs p o r e t h i ss t r a i ne x h i b i t e dp o s i t i v e r e a c t i o n sf o rc a t a l a s e ，n i t r a t er e d u c t i o n ，s t a r c hh y d r o l y s i s ，c i t r a t eu t i l i z a t i o n ，a n d v o g e s - p r o s k a u e rt e s t a c i dw a sp r o d u c e df r o md g l u c o s e ，l a r a b i n o s e ，d x y l o s ea n d d - m a n n i t 0 1 t h es t r a i nh a sm o r et h a n9 9 h o m o g e n e i t yw i t l lb a c i l l u ss u b t i l i s a c c o r d i n gt o1 6 sr d n ag e n es e q u e n c i n g b a s e do nt h e s ed a t a ，h s 8w a si d e n t i f i e da s ab a c i l z ss u b t i l 括i a p r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t i o nh a db e e nc a r r i e do u tt os t u d yt h ec h a r a c t e r i s t i c sb y w h i c hs t r a i nh s 8m e t a b o l i z ei s o e u g e n 0 1 i s o e u g e n o li st o x i ct oc e l l s ，b u tt h eg r o w t h o fh s 8w a sb a r e l ya f f e c t e dw i t ht h ep r e s e n c eo f0 5 i s o e u g e n 0 1 t h eg r o w t ho fh s 8 w a ss u p p r e s s e dw h e ni s o e u g e n o ls u r p a s s e s1 o t h eg r o w t ho fh s 8w a st o t a l l y v 山东人学博士学位论文 i i t h i b i t e dw i t ht h ep r e s e n c eo f2 i s o e u g e n 0 1 m e a n w h i l e a u t o l y s i so fc e l l so c c u r r e d h s 8c o u l dm e t a b o l i z e1 g1 i s o e u g e n o la n dp r o d u c ev a n i l l i n d u et oi t sc a p a b i l i t yo f t o l e r a t i n gh i g hc o n c e n t r a t i o ni s o e u g e n o la n dm e t a b o l i z i n gi s o e u g e n o li n t ov a n i l l i n ， h s 8w a ss e l e c t e df o rt h er e s e a r c hi nt h i sp r o j e c t t h eb i o t r a n s f o r m a t i o nw a so p t i m i z e di no r d e rt oi n c r e a s ev a n i l l i np r o d u c t i o n , g l u c o s ea n ds u c r o s ew e r et h eb e s tc a r b o ns o n r c e sf o rc e l lg r o w t h s o y b e a np o w d e r w a sb e t t e rt h a no t h e rn i t r o g e ns o u r c e si np r o m o t i n gb o t hc e l lm u l t i p l i c a t i o na n d t r a n s f o r m i n gr a t e t h ep r o d u c t i o no fv a n i l l i nw a sa f f e c t e db ys u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n a n dt h ew a y so fs u p p l e m e n t w h e ni s o e u g e n o lc o n c e n t r a t i o nr a n g e df r o mo 5 t o 1 5 v a n i l l i np r o d u c t i o ni n c r e a s e da si s o e u g e n o lc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d w h i l e f u t u r ei n c r e a s eo f i s o e u g e n o l c o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e dt h ec o n c e n t r a t i o no f t r a n s f o r m e dv a n i l l i n t h e r ew a sap o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h es u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o na n dt h er e a c t i o nr a t e v a n i l l i np r o d u c t i o nw a ss l i g h t l yi m p r o v e db y f e d - b a t c ha d d i n gs u b s t r a t e ，w h i c hw a sb e t c e rt h a n b a t c ha d d i n ga n dc o n t i n u o u sa d d i n g i s o e u g e n 0 1 t h et r a n s f o r m a t i o nw a sc a r r i e do u ti nt w op h a s ew i mt h ep u r p o s et oa v o i d t h eg r o w t hi n h i b i t o r ye f f e c t so fi s o e u g e n 0 1 i nt h ef i r s ts t e p ，n oi s o e u g e n o lw a sa d d e d t of a c i l i t a t et h es t r a i ng r o w t hf o rt h eb i o m a s sa c c u m u l a t i o n a f t e ri s o e u g e n o lw a s a d d e d ，t h eb i o t r a n s f o r m a t i o np h a s ew a ss t a r t e d f e d b a t c ha d d i n gg l u c o s er e s u l tt h e o dt o7 7 ( 6 2 0u m ) ，w h i c hw a st w of o l do ft h a ti nn o r m a lc u l t u r i n gc o n d i t i o n b i o t r a n s f o r m a t i o nw a sp e r f o r m e db yh i g h - d e n s i t yc e l l s ，a n dv a n i l l i np r o d u c t i o n r e a c h e d1 3 0g1 ，w h i c hw a si n c r e a s e db y9 4 t h a nt h ev a n i l l i np r o d u c to fn o r m a l c u l t u r er o 6 7g1 q ) d i s s o l v e do x y g e na n dm a s st r a n s f e rh a ds i g n i f i c a n te f f e c t so n v a n i l l i ny i e l d t h ep r o d u c t i o nr e a c h e d2 0 8g1 w h e nu s i n gf l a s k sw i t hb a f f l e p l a t et o e n h a n c ed i s s o l v e do x y g e n ，a n du s i n gl e c i t h i na sa ne m u l s i f i e rt oi m p r o v et h e d i s p e r s i o no f i s o e u g e n 0 1 v a n i l l i np r o d u c t i o nw a s i n c r e a s e db y4 1 w i t ha d d i t i o no f 2 g1 v a n i l l i ca c i di n t ot h et r a n s f o r m i n gs y s t e mt oi n h i b i tv a n i l l i nf u r t h e ro x i d a t i o n ， w h i c hi sa c c o m p a n i e db ys l i g h t l yi n c r e a s e dv a n i l l i ca c i dc o m p a r e dw i t ht h ei n i t i a l i n p u t b a s e do nt h eo p t i m i z e dc u l t u r i n gm e d i u ma n dc o n d i t i o n sa b o v e ，1 0g1 1 i s o e u g e n o la n d2g 1 1v a n i l l i ca c i dw e r ea d d e ds i m u l t a n e o u s l ya f t e rs t r a i nc u l t u r i n g v i 山东大学博士学位论文 s t e p ，a n dv a n i l l i np r o d u c t i o nr e a c h e d2 2 1 91 。a f t e r6d a y s b i o t r a n s f o r m a t i o n t h ee n z y m es y s t e mo fh s 8i n v o l v e di ni s o e u g e n o lm e t a b o l i s mw a ss t u d i e d t h e e n z y m es y s t e mw a si n d u c i b l e ，i n t r a c e l l u l a re n z y m e s t h e r e f o r e ，l o wc o n c e n t r a t i o no f s u b s t r a t ew a sn e e d e db e f o r et r a n s f o r m a t i o ni no r d e rt oi n d u c et h ef o r m a t i o no ft h e e n z y m es y s t e m t h em e t a b o l i cp a t h w a yo fi s o e u g e n o li ns t r a i nh s 8w a ss t u d i e db ya n a l y z i n g m e t a b o l i t e su s i n gg c h r m s t h r e em a i nm e t a b o l i t e sw e r ed e t e c t e db yg c ，v a n i l l i n ， i s o e u g e n o l d i o la n dd e h y d r o d i i s o e u g e n 0 1 i s o e u g e n o l d i o lw a sq u a n t i f i e db yh r m s s of a ra sw ek n o w n t h i si st h ef i r s tt i m et or e p o r tt oi d e n t i f yi s o e u g e n o l - d i o la sa l l i n t e r m e d i a t em e t a b o l i t ei nt r a n s f o r m i n gi s o e u g e n o lt ov a n i l l i nb ya nb a c i l l u ss u b t i l i s s t r a i n r e s t i n gc e l l so fh s 8w a su s e dt os t u d yt h em e t a b o l i s mo fv a n i l l i na n di t s d e r i v a t i v e s a c c o r d i n gt ot h ea b o v ed a t a ，t h ei s o e u g e n o lm e t a b o l i cp a t h w a yo fh s 8 w a ss u p p o s e d ：i s o e u g e n o lw a sc o n v e r t e dt ov a n i l l i nv i ai s o e u g e n o l d i o l ，a n dv a n i l l i n w a st h e nm e t a b o l i z e dv i av a n i l l i ca c i dt og u a i a c o lb ys t r a i nh s 8 m e a n w h i l e ，t r a d eo f v a n i l l y la l c o h o lw h i c hw a sf o r m e db yd e o x i d i z a t i o no fv a n i l l i nw a sd e t e c t e d t h e v a n i l l i ca c i dd e c a r b o x y l a s ea c t i v i t yr e a c h e d5 6 3 9n m o lm i n l ( m gp r o t e i n ) 1i n c e l l f r e ee x t r a c t t h em e t a b o l i t e so fi s o e u g e n o lb yh s 8 ，s u c ha sv a n i l l i n ，v a n i l l i ca c i d a n dg u a i a c o l ，a r ea l lv a l u a b l ec o m p o u n d si nf l a g r a n c ei n d u s t r y d e h y d r o d i i s o e u g e n o l w a sd e t e c t e d a s am e t a b o l i t eo f i s o e u g e n o l ，w h i c h w a s p r o d u c e d f r o m b i p o l y m e r i z a t i o no fi s o e u g e n 0 1 d e h y d r o d i i s o e u g e n o lw a sad e a d e n dp r o d u c t ，w h i c h c o u l dn o tb ec o n v e r t e dt ov a n i l l i n w eh a v eo b t a i n e do t h e rt w op s e u d o m o n a ss p n 1 3a n df 1 3 s t r a i nn dw a s i d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ，a n dc o u l dg r o ww i t ht h ep r e s e n c eo f10g1 1 i s o e u g e n 0 1 s t r a i nf 13w a si d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a sp u t i d a , a n dh a dt h ea b i l i t yt o d e g r a d ef e m l i ca c i d t h em e t a b o l i s mo ft h e s et h r e es t r a i n si nm e t a b o l i z i n ge u g e n o l ， i s o e u g e n o l ，v a n i l l i na n di t sd e r i v a t i v e sw e r ei n v e s t i g a t e d a tl a s t ，w ep r o p o s e da c o m m o nr u l ei nm e t a b o l i z i n gp r o p e n y l b e n z e n e so fe s s e n t i a lo i l b ym i c r o b e s d a t a d e m o n s t r a t e dt h a ta l lt h e s et h r e es t r a i n sc o u l do n l ym e t a b o l i z e i s o e u g e n o lb u tn o t e u g e n 0 1 e u g e n o li st h ei s o m e ro f i s o e u g e n o l ，w i t has h i f to f t h ed o u b l eb o n do f t h e v i i 山东大学博士学位论文 p r o p e n y ls i d ec h a i nt op o s i t i o n2 t h u s ，t h es i d ec h a i ns h o r t e n i n gm e c h a n i s m sm i g h t b ed i f f e r e n t e n z y m es y s t e m si n v o l v e di no p e n i n gd o u b l eb o n d so fl - p r o p e n es i d e c h a i na n d2 - p r o p e n es i d ec h a i nm a yb en o ti d e n t i c a l ，a n dd i f f e r e n tk e ye n z y m e sm i g h t b ei n v o l v e d i tw a sd e t e c t e dt h a tt h e s et h r e es t r a i n ss e l e c t e db yi i si n t h i ss t u d yh a d d i 仃e r e n tm e t a b o l i s m st o w a r d sv a n i l l i na n di t sd e r i v a t i v e s t h em a r k e dv a n i l l i n a c c u m u l a t i o no fs t a i nh s 3m a df 1 3c a nb ea s c r i b e dt ot h ei n c a p a b i l i t y o f r i n g c l e a v a g eo fv a n i l l i n b u tn 1 3c o u l du s ev a n i l l i ca c i da st h e s o l ec a r b o ns o u r c e ，s o i th a dah i g hm e t a b o l i cr a t ea n dt h e r ew a sn ov a n i l l i na c c u m u l a t i o n t h e s er e s u l t s i m p l i e dt h a td i f f e r e n tr e a c t i o no nv a n i l l i n ，m i g h ta f f e c tt h ev a n i l l i np r o d u c tr a t e t h e m o l e c u l er e s e a r c ho nt h e s ed i f f e r e n c e sw i l lh e l pt oo b t a i ns t r a i n sw i t hh i g hv a n i l l i n p r o d u c t i o nb yg e n e t i ce n g i n e e r i n g h s 8a l s om e t a b o l i z e da n e t h o l e ，w h i c hw a sa n a n a l o go fi s o e u g e n o lw i t h2 - p r o p e ns i d ec h a i n ，i m p l y i n gt h a tt h ee n z y m es y s t e mi n s t a i nh s 8h a sc o m m o na c t i v i t yt om e t a b o l i z e2 - p r o p e n y l b e n z e n e sc o m p o u n d s t h es y s t e mo fb i o t r a n s f o r m a t i o nb r o t hw a sc o m p l i c a t e dw h e nt h er e a c t i o nw a s f i n i s h e d t h ev a n i l l i nc o n c e n t r a t i o nw a sl o w , m a di tw a sd i f f i c u l tt ob es e p a r a t e df r o m t h er u d i m e n t a r yi s o e u g e n 0 1 s of a r , t h e r ea r ev e r yf e wr e p o r t sa b o u tt h ep r o c e s so f e x t r a c t i n gv a n i l l i nf r o mt h ec u l t u r eb r o t ho f b i o t r a n s f o r m a t i o n o u rp r o j e c t so p t i m i z e d t h ep r o c e s so fe x t r a c t i n ga n dp u r i f y i n gv a n i l l i na c c o r d i n gt ot h ec h a r a c t e r i s t i c so f b i o t r a n s f o r m a t i o nb r o t h b e c a u s ev a n i l l i nw a sl i g h t l yd i s s o l v e di nw a t e r , 10 e t h y l a c e t a t ew a su s e dt oi n c r e a s et h ep e r m e a b i l i t yo fc e l lm e m b r a n ei nt h ep r e t r e a t m e n to f c u l t u r eb r o t h i tm a d ev a n i l l i nd i s s o l v e di nw a t e rp h a s ea sm u c ha sp o s s i b l eb y a d j u s t i n gp hv a l u et o8 c e l l sw e r er e m o v e db yc e n t r i f u g e d i ti n c r e a s e dt h ey i e l do f v a n i l l i nb y19 - 4 m o r et h a nt h a to f w i t h o u tp r e t r e a t m e n t t h ee x p e r i m e n t si n d i c a t e d t h a tt h ed i s t r i b u t i o nc o e f f i c i e n to fv a n i l l i nw a sa l m o s tu n a f f e c t e db yp hv a l u ew i t h i n t h er a n g eo f p hf r o m4t o7 ，s oi tw a sn o tn e c e s s a r yt oa c i d i f yf o re x t r a c t i o n v a n i l l i n w a si nm o l e c u l a rf o r m sa tp h 6 5 ，t h e r ef o rp h 6 5w a ss e l e c t e dt oa d j u s tb e f o r e e x t r a c t i o n w ec h o s et h eb e n z e n ea se x t r a c t i o ns o l v e n tb a s e do nt h ed i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n to fv a n i l l i na n dt h ee x t r a c t i o nc o e f f i c i e n tb e t w e e nv a n i l l i na