（分析化学专业论文）功能化纳米材料制备及其活体荧光成像研究.pdf

。i i h s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o n o f f u n c t i o n a ln a n o m a t e r i a p p l i c a t i o ni ni nv i v of l u o r e s c e n c ei m a g i n g x i ec a n b s ( h u n a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 9 at h e s i ss u b m i a e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no f t h e r e q u i r e m e n t sf o r t h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e l n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i n t h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o r 馈n gk e m i n p r o f e s s o rh ex i a o x i a o m a y , 2 0 1 1 帅5川6 7m7，09引ii 哪y k射、一1v 譬 ： 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：球) m 日期：2 0 1 1 年岁月，1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在 年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“v ，”) 作者签名： 导师签名： 执幽 磁 日期：2 0 1 1 年譬月 日期：2 0 11 年妫 弓) 日 矿 6，。0 功能化纳米材料制备及其活体荧光成像研究 摘要 实时、准确的观察活体内的生命活动需要各种非侵入式的成像手段。活体荧 光成像因其操作极其简便、结果直观、灵敏度高等优点，已广泛应用于生命科学、 医学研究及药物开发等领域。近年来，具有特定功能化的纳米材料在成像中得到 广泛的应用，尤其是发展生物相容性好、靶向性好、光学特性优良的功能化纳米 材料进行活体荧光成像具有非常重要的意义。本论文瞄准发展功能化纳米材料进 行活体荧光成像这一前沿研究方向，开展荧光纳米材料的制备研究，并利用制备 的荧光纳米材料实现活体荧光成像。主要包括以下三个方面的工作： 一、不同功能化基团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的肿瘤被动靶向活体荧光 成像研究 采用反相微乳液法，制备以钌吡啶为内核材料的羟基、羧基、p e g = 种不同功 能化基团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒，考察它们用于肿瘤被动靶向活体荧光成 像的情况。结果表明，选择接种有r a m o s ( 人b 淋巴瘤细胞) 和c e m ( 人白血病细 胞) 肿瘤的裸鼠为模型，三种不同功能化基团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒经尾 静脉注射后都能很快的被动靶向到肿瘤组织，可以作为一种快速聚集于肿瘤部位 的荧光成像探针。其中p e g 修饰使肿瘤成像的时间延长，更有利于肿瘤成像的长 时间观察。 二、上转换荧光纳米材料的制备研究 利用水热合成法制备稀土离子掺杂的氟钇化钠晶体，考察不同反应条件对合 成这种纳米材料的影响。结果表明分别采用油酸及p e i 两种络合剂为模板都能成 功合成上转换荧光纳米材料，但是相比于p e i 络合剂为模板来说，油酸络合剂为 模板合成的上转换荧光纳米材料荧光更强。在此基础上，选择油酸络合剂为模板 合成上转换荧光纳米材料，进一步考察了反应时间的长短、反应温度的高低、氟 化物的量的多少和稀土离子配比的不同等实验条件对合成上转换荧光纳米材料的 影响，结果表明这些因素都会在一定程度上影响材料的晶体形状、大小、荧光强 度以及光谱性质。这些研究结果为上转换荧光纳米材料的制备提供了理论指导实 践依据。 。一 三、基于上转换荧光纳米材料的活体荧光成像研究 在上章最优化的反应条件下，选择油酸络合剂为模板制备上转换荧光纳米材 料并进行p e g 化修饰后，探索其活体荧光成像研究。结果表明：p e g 修饰的上转换 荧光纳米材料，是一种对机体无明显毒性的生物相容性材料。通过对裸鼠皮下和 肌肉内进行成像，以及经尾静脉注射上转换荧光纳米材料到裸鼠体内进行全身成 i i f 0 像，发现采用本工作制备的上转换荧光纳米材料进行活体荧光成像时，荧光穿透 能力很强，无组织自发荧光，有望发展成一种高穿透、无背景信号的荧光成像探 针。 关键词：活体荧光成像；二氧化硅荧光纳米颗粒；上转换荧光纳米材料 i i i j a b s t r a c t r e a l - t i m e ，a c c u r a t eo b s e r v a t i o no fl i f ea c t i v i t i e si nv i v on e e d s o fv a r i o u s n o n 。i n v a s i v ei m a g i n gm e t h o d s t h ei nv i v of l u o r e s c e n c ei m a g i n gh a sb e e nw i d e l yu s e d i nt h er e s e a r c hf i e l do fl i f es c i e n c e s ，m e d i c a lr e s e a r c ha n dd r u gd e v e l o p m e n tb e c a u s e o fi t su n i q u ea d v a n t a g e s ，s u c ha s s i m p l eo p e r a t i o n ，i n t u i t i v er e s u l t s ，a n ds e n s i t i v i t y c h a r a c t e r i s t i c sa n ds oo n i nr e c e n ty e a r s ，f u n c t i o n a ln a n o m a t e r i a l sa r ew i d e l yu s e di n i m a g i n g e s p e c i a l l yt h ed e v e l o p m e n to fn a n o m a t e r i a l sw i t hb i o c o m p a t i b i l i t y ，b e r t e r t a r g e t i n ga n de x c e l l e n to p t i c a lp r o p e r t i e s o rf l u o r e s c e n c ei m a g i n gi nv i v oh a sv e r y i m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e a i m i n ga tt h ed e v e l o p m e n to ff u n c t i o n a ln a n o m a t e r i a l sf o ri n v i v of l u o r e s c e n c e i m a g i n g ，t h er e s e a r c ho nt h ep r e p a r a t i o no fn e wf l u o r e s c e n t n a n o m a t e r i a l sa n dt h e i ra p p l i c a t i o ni nf l u o r e s c e n c ei m a g i n gi nv i v oa r ec a r r i e do u ti n t h i st h e s i s t h et h r e ep a n so ft h et h e s i sa r ea sf o l l o w s 1 s t u d yo nt h ep a s s i v et u m o rt a r g e t i n gi nv i v of l u o r e s c e n c e i m a g i n gu s i n g d i f f e r e n tf u n c t i o n a lg r o u p sm o d i f i e ds i l i c af l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e s a f t e rt h et h r e e d i f f e r e n tf u n c t i o n a l g r o u p s m o d i f i e df l u o r e s c e n ts i l i c a n a n o p a r t i c l e s ，i n c l u d i n gh y d r o x y l s i n p s ，e a r b o x y l t e r m i n a t e ds i n p s ( c o o h s i n p s l a n dp o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g ) 一t e r m i n a t e ds i n p s ( p e g s i n p s ) ，h a sb e e np r e p a r e db y u s i n gr e v e r s em i c r o e m u l s i o nm e t h o d ，t h ep a s s i v et u m o rt a r g e t i n gi nv i v of l u o r e s c e n c e i m a g i n gh a sb e e ni n v e s t i g a t e d u s i n gr a m o sa n dc e mt u m o rx e n o g r a f tm o d e l s i 甩 v i v oa n de xv i v oi m a g i n gs t u d i e ss h o w e dt h a tt h et h r e ed i f f e r e n t f u n c t i o n a lg r o u p s m o d i f i e df l u o r e s c e n ts i l i c an a n o p a r t i e l e sw e r ea b l et oq u i c k l ya c c u m u l a t ei nt h et u m o r a r e a ，t h a n k st op a s s i v et u m o rt a r g e t i n ga f t e ri n j e c t i o nv i at h et a i lv e i n t h e r e f o r e ，t h e y c a nb eu s e da s f l u o r e s c e n c ei m a g i n gp r o b e s i n a d d i t i o n ，p e gm o d i f i e ds i l i c a n a n o p a r t i c l e sm a k ei tp o s s i b l ef o ral o n gt i m ei m a g i n g 2 s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o no fu p c o n v e r s i o nn a n o m a t e r i a l s w ep r e p a r e dr a r ee a r t hi o n s d o p e ds o d i u my t t r i u mf l u o r i d ec r y s t a l sb v h y d r o t h e r m a ls y n t h e s i s t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tr e a c t i o nc o n d i t i o n so nt h es y n t h e s i so f s u c hn a n o m a t e r i a l sh a v eb e e n i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t ho l e i ea c i da n d p e i c o m p l e x i n ga g e n tc a nb eu s e da s t e m p l a t e s t o s u c c e s s f u l l ys v n t h e s i z e u p c o n v e r s l o nn a n o m a t e r i a l s b y c o m p a r a s i o n ，t h eu p c o n v e r s i o nn a n o m a t e r i a l s s y n t h e s i z e db yu s i n go l e i ca c i da st e m p l a t ed i s p l a y e dh i g h e rf l u o r e s c e n c ei n t e n s i ty f u r t h e r m o r e ，t h ee o m p l e x i n ga g e n t ，r e a c t i o nt i m e ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，t h ea m o u n to f l v f l u o r i d e 锄dr a r ee a r t hi o nr a t i oa n do t h e re x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw o u l d c h a n g et h e s h a p e ，s i z e ，f l u 。r e s c e n c ei n t e n s i t y a n ds p e c t r a lp r o p e r t i e s 。ft h ec r y s t a lw h e n 。l e i c a c i dw a ss e l e e t e da st e m p l a t et os y n t h e s i z et h eu p c o n v e r s i o nn a n o m a t e r i a l s 3 s t u d y 。nt h e 切v i ，。f l u 。r e s c e n c ei m a g i n g u s i n gu p c o n v e r s i o n n a n o m a t e r i a l s a r e rs c r e e n i n g t h ee x c e l l e n t c o n d a t i 。nf o r p r e p a r i n g t h eu p c o n v e r s i 。n n a n o m a t e r i a l si nc h a r p t e r2 ，t h e p e gm o d i f i e du p c o n v e r s i o nn a n o m a t e n a l sw e r e p r e p a r e du s i n g o l e i ca c i d a s t e m p l a t e s u b s q u e n t l y , t h e b i o c o m p a t i b i l i t y a n d a p p l i c a t i o no ft h ep r e p a r e dp e g m o d i f i e du p c o n v e r s i o nn a n o m a t e r i a l si nf l u o r e s c e n c e i m a g i n gf 珂v f v dw e r ec a r r i e do u t t h r o u g ht h eb o d yw e i g h tc h a n g e a n a l y s l s ，r e s u l t s d i s p l a y e dt h a tt h eb o d yw e i g h t o ft h em i c ea d m i n i s t r a t e dw i t ht h eu p c o n v e r s l o n n a n o m a t e r i a l sh a sn o tb e e nc h a n g e do b v i o u s l y a n dw e f o u n dt h a tt h i sm a t e r l a lc a nb e u s e di ns u b c u t a n e o u sa n dm u s c l ei m a g i n g ，a n dw h o l eb o d yi m a g i n g ，w i t h o u ti n t e r f f i n g o ft h ea u t o f l u o r e c e n c e t h e r e s u i t si n d i c a t e t h a tt h ep r e p a r e du p c 。n v e r s i o n n a n 。m a t e r i a i sa p p e a ra sv e r yp r o m i s i n gc 。n t r a s ti m a g i n ga g e n t s w i t hh i g hp e n e t r a t i 。n a n dh i g h - c o n t r a s t k e y w o r d s ：f i u 。r e s c e n c e i 忍，i 1 ，。i m a g i n g ；s i l i c a f l u o r e s c e n tn a n 。p a r t i c l e s ； u p c o n v e r s i o nn a n o m a t e r i a l s v 功能化纳米材料制各及其活体荧光成像研究 目录 学位论文原创性申明及学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i v 本文所用英文缩写词表v i i i 第1 章绪论1 1 1 活体荧光成像概述及所面临的挑战1 1 1 1 活体荧光成像概述1 1 1 2 发展活体荧光成像所面临的挑战2 1 2 功能化纳米材料的活体荧光成像的研究现状及发展趋势3 1 2 1 量子点3 1 2 2 包裹染料的纳米颗粒5 1 2 3 碳纳米管、碳量子点、硅量子点9 1 2 4 金、银纳米簇1 l 1 2 5 上转换荧光纳米材料1 2 1 3 本文拟开展的工作1 4 第2 章不同功能化基团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的肿瘤被动靶向活体荧光成 像研究1 6 2 1 前言1 6 2 2 实验材料、仪器与方法1 6 2 2 1 材料1 6 2 2 2 仪器17 2 2 3 实验方法1 7 2 3 实验结果与讨论1 9 2 3 1 二氧化硅荧光纳米颗粒的水力半径和z e t a 电位表征1 9 2 3 2 二氧化硅荧光纳米颗粒在水中的光谱表征2 0 2 3 3 三种不同功能化基团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒经尾静脉注射后对 r a m o s 肿瘤的被动靶向成像研究2 0 2 3 4 三种不同功能化基团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒经尾静脉注射后对 c e m 肿瘤的被动靶向成像研究2 3 2 3 5 注射二氧化硅荧光纳米颗粒的裸鼠离体组织器官切片荧光成像研究2 6 2 4 小结2 7 v i 硕士学位论文 第3 章上转换荧光纳米材料的制备研究2 8 3 1 前言2 8 3 2 实验材料、仪器与方法：2 8 3 2 1 材料2 8 3 2 2 仪器2 9 3 2 3 实验方法2 9 3 3 结果与讨论31 3 3 1 络合剂对上转换荧光纳米材料的大小、形状、电位及荧光强度的影响3 1 3 3 2 反应时间对壬二酸修饰的上转换荧光纳米材料的大小、形状及荧光强度 的影响3 3 3 3 3 反应温度对壬二酸修饰的上转换荧光纳米材料的大小、形状及荧光强度 的影响3 4 3 3 4 氟化钠的量对壬二酸修饰的上转换荧光纳米材料的大小、形状及荧光强 度的影响3 6 3 3 5 稀土离子配比对壬二酸修饰的上转换荧光纳米材料的荧光光谱的影响3 7 3 4 小结3 8 第4 章基于上转换荧光纳米材料的活体荧光成像研究3 9 4 1 前言3 9 4 2 实验材料、仪器与方法3 9 4 2 1 材料3 9 4 2 2 仪器3 9 4 2 3 实验方法4 0 4 3 实验结果与讨论4 2 4 3 1 上转换荧光纳米材料的表征4 2 4 3 2 上转换荧光纳米材料对裸鼠体重的影响4 4 4 3 3 上转换荧光纳米材料在裸鼠皮下及肌肉内的荧光成像研究4 4 4 3 4 上转换荧光纳米材料从静脉注射后的全身分布荧光成像研究4 5 4 4 j 、结4 7 结 仑4 9 参考文献，：_ j5 l 致谢5 9 附录a 攻读学位期间所发表的学术论文目录6 0 1 功能化纳米材料制各及其活体荧光成像研究 本文所用英文缩写词表 v i 硕士学位论文 第1 章绪论 随着生物医学的发展，科学家对体内的生命活动越来越感兴趣，而活体内检 验也是生物医学研究的最终验证。实时、准确的观察活体内的生命活动需要各种 非侵入式的成像手段，包括核磁共振成像【1 1 、核素成像【2 1 、超声波成像【3 1 、c t 成 像【4 6 】和光学成像等【。通过这些成像手段，可以在活体水平进行癌症等疾病的发 生与转移研究、器官移植监测研究、干细胞与免疫细胞等的迁移研究、病毒与细 菌的侵染研究、基因表达与基因功能研究、蛋白相互作用研究以及评价基因治疗 与药物治疗等各种治疗效果研究【_ 7 1 。随着2 1 世纪纳米技术的兴起，纳米技术对人 类的生产和生活产生了重大影响【8 1 。同时，越来越多的科研人员将纳米技术应用于 生物医学领域，尤其是作为各种成像手段的显影剂。各种功能化的纳米材料的发 展为活体成像提供了更多、更重要的手段。本章重点综述活体荧光成像的概述和 所面临挑战，以及利用纳米材料进行荧光成像的发展趋势，并在此基础上提出本 论文构思。 1 1 活体荧光成像概述及所面临的挑战 1 1 1 活体荧光成像概述 伴随人类基因组测序的完成和后基因组时代的到来，通过研究核酸蛋白质、 蛋白质蛋白质分子间的相互作用关系来分析肿瘤的发病机理，为实现肿瘤发生的 早期预警、诊断和疗效评估提供了新的契机，与此同时，分子影像学作为一门新 型交叉学科也逐渐发展起来。分子影像学是指在活体状态下，应用影像学方法对 人或动物体内的细胞和分子水平生物学过程进行成像、定性和定量研究【9 j 。借助活 体动物体内成像技术，生命系统内部某些特定的生理或病理过程，如基因表达、 蛋白质之间的相互作用、信号传导、细胞的代谢以及细胞示踪等可变为直观的图 像显现出来。因此，与传统医学影像学相比，分子影像学具有对病变早发现、对 疾病及治疗精确监测的优势和发展前景，该学科已经与分析化学、材料科学、生 物技术等各个学科有效地结合在一起，并得到广大科研人员的关注。根据成像原 理不同，分子成像技术主要分为核磁共振成像【1 0 , 1 1 】、核素成像 1 2 , 1 3 】、超声波成像1 4 】、 c t 成像【1 5 】和光学成像【1 6 , 1 7 j ：斤_ 大类。其中，光学成像，特别是活体荧光成像相对于 其他的一些活体成像手段具有监测灵敏、成像迅速、可同时观测多分子事件、无 放射性危害等优点，是分子成像研究中应用非常广泛的一种分子成像方法。 活体荧光成像是利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监 测活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以实时、原位地观测 功能化纳米材料制各及活体荧光成像研究 活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物 学过程。相对于其他的活体成像手段，活体荧光成像具有检测灵敏度高、时间分 辨率高、无电离辐射【l 引、实验操作简单、所得结果直观等独特的优势，近年来不 断地被应用于肿瘤的诊断、纳米材料的生物相容性研究、医学研究及药物开发等 方面。如本研究小组利用三种不同功能化二氧化硅荧光纳米颗粒为荧光探针，考 察了它们在活体内的分布与代谢过程【1 9 1 。 1 1 2 发展活体荧光成像所面临的挑战 活体荧光成像技术已广泛应用于生物医学领域研究，但是要实现医学临床诊 断还有待进一步改进。影响活体荧光成像技术发展的关键因素有：分子靶点、成 像探针、信号放大策略以及图像采集设备等。其中，成像探针对活体荧光成像的 影响尤为重要，发展适合的成像探针成为了当前材料研究和化学研究的一个研究 热点【2 们。活体荧光成像探针主要有：荧光蛋白、荧光染料和荧光纳米颗粒。但是， 现在常用的活体荧光成像探针大多数为传统的有机染料分子。而有机染料分子有 着其本身性质决定的一些缺点，如光稳定性差、灵敏度不高、疏水性强和靶向性 差等。 1 1 2 1 光稳定性差 利用荧光探针进行活体荧光成像时，需要荧光探针在激发光照射下产生荧光， 并且荧光在一定时间内保持稳定，不能很快地被光漂白。然而传统的有机染料分 子如罗丹明、f i t c 、c y 3 等都容易在激发光的照射下被漂白而无法达到成像效果 【2 1 1 。因此，发展具有高的光稳定性的成像探针是非常有必要的。一些荧光纳米材 料如量子点、包裹染料的纳米颗粒、贵金属纳米簇和上转换荧光纳米材料等具有 比有机染料分子更好的光稳定性。 1 1 2 2 灵敏度低 灵敏度在荧光成像探针研究中是另一个重要的考察因素。传统的荧光染料分 子在进行成像时，通常是少数几个荧光分子对应一个检测目标，荧光强度十分有 限，因此其检测灵敏度也有限。然而，将几千个甚至几万个荧光分子包裹于一个 纳米颗粒内对目标进行定位，这样荧光强度将大大提高，检测灵敏度也得到相应 提高【2 2 1 。 1 1 2 3 亲水性差 因为生物体内大多是亲水环境，所以进行成像的荧光探针以亲水的方式进入 生物体内为最佳。然而，大部分具有较好荧光性质的荧光染料都是疏水的，很难 直接用于活体成像研究，更加无法在实际中应用。利用纳米材料将这些疏水性的 2 硕士学位论文 分子包裹于其内部，再进行体内的运输和成像，将很好地解决这个难题。 1 1 2 4 靶向性差 最大限度减少对非肿瘤组织的伤害，即具有对肿瘤的靶向性，是对肿瘤等疾 病进行成像诊断的一个重要原则。在利用传统染料进行活体荧光成像时，由于染 料分子在体内的循环而导致全身均有荧光，背景信号高。然而利用纳米材料包裹 荧光染料分子，由于肿瘤的增强渗透和保持效应( e p r 效应) 而使得一定大小的 纳米材料在肿瘤组织中积累而实现被动靶向；同时，还可对纳米材料表面进行特 异性识别生物分子的修饰( 如肿瘤特异性抗体、多肽、a p t a m e r 等) ，从而实现对 肿瘤的主动靶向作用1 2 3 1 。 基于以上荧光染料分子在成像中所面临的挑战，以及近年来所发展的功能化 纳米材料在生物医学研究中所展示的应用前景，发展光稳定好、灵敏度高、亲水 性好且靶向性好的纳米荧光探针对于活体荧光成像研究具有十分重要的意义。 1 2 功能化纳米材料的活体荧光成像研究现状及发展趋势 二十一世纪以来，纳米材料、纳米器件等在生物医学研究中展示了重要的应 用前景和广阔的发展空间，尤其对活体的荧光成像、药物输送和治疗等方面产生 了重大影响。一系列新型的用于活体荧光成像的功能化纳米材料得到了不断地发 展和完善，主要有量子点、包裹染料的纳米颗粒、碳纳米管、碳量子点、硅量子7 点、金属纳米簇和上转换荧光纳米材料等。 1 2 1 量子点 量子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) 是一种由i i v i 族或i i i v 族元素组成的纳米 颗粒，其粒径一般介于1 1 0n m 之间。量子点具有较高的摩尔吸光系数，且其激 发光谱范围很广，然而其发射光谱很窄且可以通过调节量子点的大小从紫外区一 直红移到近红外光区。同时，量子点具有较高的荧光量子产率、较强的抗光漂白 性、较大的斯托克斯位移等特性，这些优良的性质使得量子点已广泛用于各种荧 光分析和活体荧光成像中【2 4 埘】，并逐渐向多功能、多模式成像发展，以及改善量 子点本身以更好适应活体荧光成像研究。 因为量子点的粒径一般均在1 1 0n m ，所以其在体内的循环时间较长。量子点 在用于活体荧光成像时对肿瘤部位具有较好的靶向性。如图1 1 所示【2 引，量子点 对肿瘤的靶向识别有两种不同的原理：一种为被动靶向作用，根据肿瘤组织血管 的e p r 效应使得一定粒径的纳米颗粒能随着血液循环在肿瘤组织中积累下来，从 而实现量子点对肿瘤的被动靶向荧光成像( 左) ；另一种为主动靶向作用，即在量子 点上修饰不同的对肿瘤组织有特异性识别的抗体、多肽或其他生物分子而实现对 3 功能化纳米材料制各及活体荧光成像研究 肿瘤的主动靶向荧光成像( 右) 2 9 - 3 1 】。 n i e 等2 8 1 报道了修饰了特异性抗体的量子点和未修饰特异性抗体的量子点对 肿瘤的靶向荧光成像效果，这一研究将量子点成功地引入活体荧光成像领域，表 明量子点有望成为肿瘤荧光检测的有效探针。 二= 二二鳊巍，黼晰謦。搠麟麟黼甜”啪懈嘲麟_ 嘲船_ 鼢一谚。删”一工i 。i ”删- i 簪a 臻 哮 牵 静 唪 _ 辫群 磺 私 # _ # _ d 。一 ，要番iendotheliml c e l t - q d - p e g l o n g - 一 稻蝴臀7 ”蠲盟缨留飞m 矗 肇c - m 臀嚯辫- e 气嚣篱 = = 鳊燮 q 女h a t _ 磷自自镕# 辫# _ _ 嗤，榭】匿v * * 辨t “# 7 _ _ # # 审n ”管酮删苫8 ”。囊”9 蛾”沁”? ： 移母 囊e要rtc；othel|a cellsqd-targeting p r o e m ) ，一 i 厕呖炒獯鍪搿器飞貂珏 豢。簟蓝端，髦5 涵塞，歹 图1 1 生物交联的量子点对肿瘤的被动( 左) 及主动( 右) 靶向示意图【2 8 】 随着研究的深入，量子点逐渐应用于多功能、多模式成像。p a r k 等【3 2 】发展了 一种多功能量子点成像探针。在医学应用时，靶向给药、成像和治疗等多种功能 集合于一个大分子结构将带来很多方便。考虑到量子点独特的发光特性及脂质体 优良的生物相容性，该小组研究出一种结合量子点的免疫脂质体纳米颗粒( q d i l n a n o p a r t i c l e ) 。如图1 2 a 所示，量子点与靶向抗体通过p e g 连接于脂质体，水溶 性药物包裹于脂质体内。药代动力学及成像结果显示，这种颗粒能很好的进入细 胞并同时进行成像与治疗。如图1 2 b 所示，颗粒经尾静脉注射3 0h 后，颗粒对肿 瘤的活体荧光靶向成像效果明显。从组织切片成像结果看出，量子点的红色荧光 与d a p i 细胞核染料的蓝色荧光有部分叠加，表明颗粒成功进入肿瘤细胞。最近， t a v i t i a n 等【33 】用f 1 8 标记聚乙二醇磷脂量子点胶束，用于核素及荧光双模式成像。 y o n g 等【3 4 】制备了一种锰掺杂的近红外量子点，用于胰腺癌的核磁共振及荧光双模 式成像。 b 图1 2q d i l 颗粒的示意图及活体荧光成像图1 3 2 】 a ：q d - i l 颗粒的示意图；b ：m c f 7 肿瘤裸鼠的活体荧光成像图及肿瘤组织切片图 4 硕士学位论文 虽然量子点具有很多优点，但是其生物毒性也不容忽视。量子点的组成成分 之一镉，对生物体具有很大的毒性，限制了量子点的医学应用。因此，最近无镉 量子点的合成及活体应用研究越来越多【3 5 , 3 6 】。r e i s s 等【3 5 】制备了c u i n s 2 z n s 核壳 纳米晶体并应用于活体荧光成像研究。这一系列纳米颗粒尺寸均一，分别在5 5 0 r t m 8 1 5n m 有强的荧光发射峰。如图1 3 所示，量子点经尾静脉注射入正常小鼠体 内，在全身可看到很强的荧光，且不同组织对量子点的吸收不同。 2 嘲 。i 一- - 一一m 葶， 一_ 一ii 圣 图1 3 活体荧光成像图【3 5 】 a ：不同时刻的荧光成像图；b ：离体组织荧光成像图：c ：不同组织的荧光量化图 近十年来，一维半导体纳米结构得到广泛关注。相对于量子点，量子棒具有 更大的吸收截面和表面积，s t o k e s 位移依赖于棒的长径比，发射光可用外加电场 可逆的控制开关等优点，p r a s a d 等【3 7 1 将功能化的半导体量子棒用于活体肿瘤靶向 成像研究。量子棒用磷脂p e g 胶束包裹，交联上r g d 多肽，作为标记肿瘤的靶 向探针，用于皮下及原位胰腺肿瘤成像。由于r g d 多肽对肿瘤细胞表面的整联蛋 白旺、，p ，的特异识别，修饰上p e g 可以增加血液循环时间和防止被肝脏等内皮网状 组织吸收，这种量子棒的肿瘤靶向成像效果显著。 1 2 2 包裹染料的纳米颗粒 包裹染料的纳米颗粒是指一些负载有机荧光染料分子的无机纳米颗粒或多聚 生物大分子纳米颗粒【3 8 】，如二氧化硅纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒和脂蛋白纳米颗 c 姗 伽 舢 咖 姗 姗 伽 iic暑量。ocp霉毒三k 功能化纳米材料制备及活体荧光成像研究 粒等。在这一类纳米荧光探针中，有机荧光染料分子大多数被纳米颗粒包裹于其 中，或通过化学键交联在颗粒内部。利用这类纳米荧光探针作为成像造影剂有其 独特的优点：首先，由于纳米颗粒对内部所包裹荧光染料的保护作用，使其荧光 稳定性增强，并且防止其被外界环境所降解；其次，因为一个纳米颗粒内所包裹 的荧光分子往往多达几千甚至几万个，其荧光强度大大提高，从而提高检测灵敏 度；同时，由于纳米颗粒的表面效应使得该类纳米探针更容易被修饰和交联上生 物分子如多肽、抗体和d n a 等【3 9 4 1 1 。 ll n i nt a ) i 5l 耵f a l3l t rf a 、6h rf b l2 4h rf 鑫1 2m m ( a ) 1 。5h r ( a )3h r ( a )5 6h r ( b ) 2 4h r ( a ) lm i n 强) 1 5h r ( a )3h r ( a )5 3h r ( b 2 4h r 仇) 图1 4 活体荧光生物分布图1 4 2 】 尾静脉注射不同功能化基团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的活体生物分布图。a ：o h s i n p s ； b ：c o o h s i n p s ；c ：p e g s i n p s 箭头所指为：肾脏( k ) ，肝脏( l ) ，膀胱( u b ) 由于二氧化硅纳米颗粒的生物相容性好、制备简单及表面易修饰等优良性质， 在活体荧光成像中应用较多。s c h e r m a n 等【4 2 】发展了一种长荧光寿命的二氧化硅纳 米颗粒，并研究了其在体内的分布和对肺癌组织的活体荧光成像。本研究小组【1 9 】 研究了表面不同功能化基团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的活体生物效应。如图 1 4 所示，二氧化硅荧光纳米颗粒( o h s i n p s ) 颗粒与羧基修饰的二氧化硅荧光纳 6 硕士学位论文 米颗粒( c o o h s i n p s ) 经尾静脉注射后，都能够立即到达裸鼠全身，但是随着颗 粒在血液中不断的循环，颗粒开始慢慢聚集于肾脏、肝脏，并且主要聚集在肝脏。 聚乙二醇修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒( p e g s i n p s ) 静脉注射后，立即到达裸鼠 全身，5h 内仍在全身血液中循环，没有明显聚集于某个特定的器官，说明p e g 修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒能够大大降低被内皮网状系统的吞噬。从活体成像 图中还可以看出，注射o h s i n p s 、c o o h s i n p s 、p e g s i n p s 的裸鼠膀胱处都能 清楚地看到与荧光纳米颗粒相同的红色荧光信号；从排尿动态过程分析来看，随 着纳米颗粒注射入体内时间的延长，膀胱的荧光强度不断地增强，推测4 5n m 左 右的二氧化硅荧光纳米颗粒可以通过肾脏排泄出体外。 另外，本研究小组【4 3 j 开展了磷酸化亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒的活体荧光成 像及光动力学治疗研究。如图1 5 所示，磷酸化亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒在皮下 和全身均能观察到较强的近红外荧光，可以用于活体近红外荧光成像。且磷酸化 亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒主要分布于肾脏，肝脏等，能通过泌尿系统排出体外。 光动力学治疗结果表明磷酸化亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒在活体荧光成像的辅助 下，通过光照能对注射有纳米颗粒的肿瘤产生了较好的杀伤作用，且光照和纳米 颗粒对于细胞杀伤缺一不可。 、 b a c o n t r o l s u b c u t a n e o u s l yi n j e c t i o n 爨2 弱 1 6 4 o 图1 5 活体荧光成像图【4 3 】 a ：皮下注射不同浓度的磷酸化亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒的活体荧光成像图。e l , ，4 4 m g m l ；b ，4 4m g m l ；b ：尾静脉注射磷酸化亚甲基蓝二氧化硅纳米颗粒的活体荧光成像图 磷酸钙是经过美国食品和药物管理局认证的一种可用于临床的无机物质【4 4 1 ， 因此，利用包裹荧光染料的磷酸钙纳米颗粒( i c g c p n p s ) 对进行活体荧光成像 7 缓鬻簟 功能化纳米材料制备及活体荧光成像研究 研究也成为该类荧光纳米颗粒的一个发展方向。a d a