（有机化学专业论文）基于有机纳米功能膜的光学生物传感研究.pdf

a b s t r a c t r e c e n t ly ，t h e r eh a sb e e nar a p i dg r o w t hi nt h ed e v e l o p m e n to ft h eh i g h l ys e l e c t i v e a n ds e n s i t i v eo p t i c a ln a n o b i o s e n s o r sb a s e do ng o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e df i l m sf o r d i s e a s ed i a g n o s i s ，d r u gd i s c o v e r y , p r o t e o m i c sa n dm o l e c u l a rb i o l o g y t a k i n gp o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ( p v p ) a sp r o t e c t i v ea g e n ta n ds o d i u mc i t r a t ea s r e d u c i n ga g e n t ，h o m o g e n e o u sg o l ds o l sw e r ep r e p a r e db yc h e m i c a lr e d u c t i o ni nt h i s p a p e r d l - 1 ，4 - d i t h i o t h r e i t o l ( d t t ) w a sf i r s ts e l f - a s s e m b l e do n af l a tg o l dp l a t e e l e c t r o d ew i t has u r f a c ea r e ao f5 m m x 5 m m ，3 - m e r c a p t o p r o p i o n i ca c i dw a sc h o s e nt o b i n dw i t hg o l dp a r t i c st of o r mm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nb i o s e n s o r si nc o m p a r i s o nw i t h t h a to fl c y s t e i n e t h ep r e p a r e dg o l dn a n o p a r t i c l e sw e r ec h a r a c t e r e dw i t hu v - v i sa n d t e m a n dt h e i ra s s e m b l i n gp r o c e s s e sw e r et e s t e db yc y l i cv o l t a m m e t r y b r o k e nt h r o u g ht h et r a d i t i o n a lc a t a l y s i so fe d c n h s ，t h ee d c - d m a pa san i c e c a t a l y s to fi n t e r a c t i o nb e t w e e na m i n oa n dc a r b o n o x y lg r o u p sh a sb e e ne x p l o i t e d t h e n a n o b i o s e n s o r , b a s e do nt h eg o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e dw i t ht h eo r g a n i cf u n c t i o n a l g r o u p sw i t ha c t i v i t yi n c r e a s e d ，e x h i b i t e dd i s t i n c to p t i c a lp r o p e r t i e so fl o c a l i z e ds u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e ( l s p r ) i nv i s i b l ea b s o r p t i o nr e g i o n t h em a x i m u ma d s o r p t i o n a m o u n to fc - m y cm o n o c l o n a la n t i b o d ym o l e c u l eo nt h em o d i f i e dl s p rn a n o b i o s e n s o r w i t ht h en o v e lo r g a n i cf u n c t i o n a ln a n of i l mc o u l dr e a c h2 4 p g m l t h el s p rb i o s e n s o ri m m o b i l i z e dw i t hc - m y cm o n o c l o n a la n t i b o d yc o u l db eu s e d f o rr e c o g n i t i o no fo n c o g e n eb i o m o l e c u l e ss u c ha sm y cr e c o m b i n a n tp r o t e i n ( p 01 ) w i t ha l o wl i n e a r r e s p o n s er a n g eo f 6 5x10 一一1 3 i t g m l a n dad e t e c t i o nl i m i to f 6 5 x1 0 一i - t g m l n os i g n i f i c a n ti n t e r f e r e n c e sf r o mb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，s w i n e h e m o g l o b u l i n ，b o v i n ea l b u m i n ，t r a n s f e r r i n ，h u m a nh e m o g l o b u l i n ，t h r o m b i n ，l y s o z y m e c o u l db eo b s e r v e d i nc o m p a r i s o nw i t he n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ， t h el s p rn a n o s e n s o rp o s s e s s e dar e c o v e r yo f9 2 3l 一10 9 2 3 f o rd e t e r m i n a t i o no f s a m p l e sc o n t a i n i n gc - m y cp r o t e i nw i t hn i c er e p r o d u c i b i l i t y , s h o w i n gi t sp r o m i s i n g f e a s i b i l i t y m o r e o v e r ，t h ep r e s e n t e dn a n o b i o s e n s o rh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt o d e t e c t i o no fa m o u n to fc m y cp r o t e i ni nt u m o rc e l l s ，s h o w i n gi t sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n i i i na n t i c a n c e rp r e d i c t i v ea n dt h e r a p e u t i cs t r a t e g i e s t h el s p rb i o s e n s o ri m m o b i l i z e dw i t hc - m y cr e c o m b i n a n tp r o t e i nc o u l db eu s e df o r r e c o g n i t i o no fc - m y co n c o g e n er e l a t e db i o m o l e c u l e ss u c ha sd n ap l a s m i dw i t hal o w l i n e a rr e s p o n s er a n g eo f9 0 10 一一1 5 “g m la n dad e t e c t i o nl i m i to f9 0 10 i t g m l n os i g n i f i c a n ti n t e r f e r e n c e sf r o mb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，s w i n eh e m o g l o b u l i n ， b o v i n ea l b u m i n ，t r a n s f e r r i n ，h u m a nh e m o g l o b u l i n ，t h r o m b i n ，l y s o z y m ec o u l db e o b s e r v e d i nc o m p a r i s o nw i t he n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ，t h el s p r n a n o s e n s o rp o s s e s s e dar e c o v e r yo f91 11 112 0 0 f o rd e t e r m i n a t i o no fs a m p l e s c o n t a i n i n gd n ap l a s m i dw i t hn i c er e p r o d u c i b i l i t y ，s h o w i n gi t sp o t e n t i a la p p l i c a t i o no n b i o m e d i c a la n dm o l e c u l a rb i o l o g y t h el s p rb i o s e n s o ri m m o b i l i z e dw i t hc m y cm o n o c l o n a la n t i b o d yc o u l db eu s e d f o rr e c o g n i t i o no fc - m y co n c o g e n er e l a t e db i o m o l e c u l e ss u c ha sa n t i - m o u s ei g g ( h + l ) a n t i b o d yw i t hal o wl i n e a rr e s p o n s er a n g eo f4 0 x10 一一0 2 0i t g m la n dad e t e c t i o n l i m i to f4 0 x10 一i t g m l n o s i g n i f i c a n ti n t e r f e r e n c e s f r o mb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，s w i n eh e m o g l o b u l i n ，b o v i n ea l b u m i n ，t r a n s f e r r i n ，h u m a nh e m o g l o b u l i n ， t h r o m b i n ，l y s o z y m e c o u l db e o b s e r v e d i n c o m p a r i s o n w i t h e n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ，t h el s p rn a n o s e n s o r p o s s e s s e dar e c o v e r y o f 9 1 0 0 一l1 0 0 0 f o rd e t e r m i n a t i o no fs a m p l e sc o n t a i n i n ga n t i m o u s ei g g ( h + l ) a n t i b o d y w i t hn i c e r e p r o d u c i b i l i t y ，s h o w i n g i t s p o t e n t i a la p p l i c a t i o n o nb i o m e d i c a la n d m o l e c u l a rb i o l o g y k e yw o r d s ：g o l dn a n o p a r t i c l e s ；o r g a n i cf u n c t i o n a lf i l m ；c - m y c ；l s p r ；d n a p l a s m i d i i i 长沙理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名基南为 嗍夕年2 月佃 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权长沙理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囤。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 日期：哕年，；月，。日 日期：吁年2 月。日 易 一 瑶 一 南 皂 2 孤嘧 名 名 堑 参 者 师 佑 影 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 近年来，纳米材料独特的光学、磁学、电子学和力学特性已经受到研究者的 广泛关注。由于纳米尺度的材料和生物高分子、蛋白质、核酸等具有相同的尺寸 量级，因此它们成为了生物科学领域的研究热点。在生物领域中的很多应用，诸 如探测、生物传感、细胞标记、定点诊断、分子动力学研究甚至于基因治疗等， 都是以生物分子和纳米材料之间的相互作用为基础的。而纳米材料中的金属纳米 颗粒的研究也越来越受到重视，因为它是介于金属块和原子之间的中间体，表现 出特别的物理、化学性质，其中金纳米颗粒由于其良好的稳定性、小尺寸效应、 表面效应、光学效应和特殊的生物亲和性，使它成为研究和应用的热点。 1 2 金纳米粒子的概述 金纳米的粒径在1 一1 0 0 n m 之间，而大多数重要的生物分子( 如核酸、蛋白 质等) 的尺寸都在这一范围内，并且金纳米颗粒具有制备简单、良好的生物相容 性和相对较大的比表面积等特点，在构建免疫、酶、d n a 、糖等多种生物传感 器方面发挥了重要的作用。因此可以用金纳米独特的光学、电学等性质，提高其 检测性能，使其在临床医学、生物芯片等领域发挥其更大的潜力和应用价值。 1 2 1 金溶胶的合成 目前，制备金纳米粒子的方法有许多种，如采用惰性气体蒸发法、金属有 机化合物蒸气合成法、溅射及化学气相沉积法等方法来制备小尺寸、分布范围 窄粒径的纳米粒子或功能化的二维膜材料等。而，这些制备方法都需要特殊的 仪器设备或特殊的前驱体化合物材料。于是，液相化学法如光、热、声、湿化 学还原法及生物合成法等方法近年来大受青睐并得到了非常广泛的应用。这些 方法在金纳米颗粒制备上不仅具有简单、方便、廉价、大量等优点，还具有能 使颗粒尺寸、形态可控的优势【1 1 。 1 2 1 1 模板法 模板合成法是利用孔径为纳米级到微米级的多孔材料为模板，结合化学沉 积、电化学沉积等手段，使物质的原子或离子沉积在模板的孔壁上形成所需要 制备的纳米结构体或纳米管，典型特点为：由模板提供的限域范围比较容易控 制纳米材料的形态和尺寸，因此可制作多种结构的纳米材料。 1 2 1 2 光化学还原法 刘彩红、李正等【2 1 以过渡金属杂多酸p w l l m ( 过渡金属取代的钨磷酸盐) 作光催化剂和还原剂，成功制备了金纳米。分别取5 m l1 1 0 。2 m o l l 的p w ll m ， 10 m l1 10 - 3 m o l l 的h a u c l 4 和2 m l 的异丙醇于烧瓶中，通冷凝水，n 2 保护，剧 烈搅拌条件下，在高压汞灯( 5 0 0 w ) 下，灯管距液面约2 5 c m ，光照一段时间， 撤去光源，此时溶液变为红色，表明已形成了金溶胶。将制得的金溶胶用高速 离心机进行离心分离，以除去体系中的杂多酸，加水超声分散，最后用u v v i s 及t e m 等方法对纳米粒子进行表征。 1 2 1 3 超声化学法 2 0 0 5 年孔明光等【3 1 用声化学法制备出了金纳米粒子。将配制好的h a u c l 4 和 乙二醇溶液倒入1 0 0 m l 的洗气瓶中，然后置于儿3 6 0 超声器中超声波( 单位面积 功率：2 4 w c m 2 ，频率：4 5 + 2 5 k h z ) - - 段时间。实验中，利用循环水控制超声 池中水温始终在2 5 左右；洗气瓶中通入a r 气以避免a u 纳米颗粒被氧化，还能 提高a u c l 4 的还原速率。 1 2 1 4 湿化学还原法 周秋华等【4 1 提出了一种简便的可以在溶液中制备a u 纳米的方法。首先在 3 3 m l9 7 1 1 0 一m o l l h a u c l 4 水溶液中，加入6 5 m l4 9 3x 1 0 m 0 1 l 1 0 d a a p s ( 立方硅氧烷) 溶液，用蒸馏水稀释至7 5 m l ，置于三角烧瓶中混合均匀。再称 18 3 m g 的n a b h 4 ，用蒸馏水溶解，通过搅拌缓慢滴加到三角烧瓶中，溶液颜色 逐渐变成红色，并有大量气泡冒出。滴加完毕后继续搅拌数小时，即制得了 a u o d a a p s 【c ( a u ) = 4 0 0 1 0 一m o l l 1 】的透明金溶胶。 1 2 1 5 磁控溅射法 采用直流磁控溅射仪制备a u 膜，用洁净的载玻片作为衬底，靶材为金靶， 实验过程中，真空控制在1 0 一一1 0 。2 p a ，起辉f e 五, 0 2 6 k v ，电流2 5 m a 。溅射过程 中，所生长的薄膜厚度分别为3 、6 、1 2 和2 4 n m 5 1 。 2 1 2 1 6 电化学法 y u 等【6 】在正胶束的水溶液体系中用电化学还原方法制各出了a u 纳米线。该 方法以金片做阳极，铂片做阴极，进行电化学还原。引入一个形状诱导试剂十 六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 和一个辅助表面活性剂四辛基溴化铵( t c 8 a b ) 到电化学体系中，其中c t a b 既可以作为支持电解质也可以是a u 纳米线的稳定 剂，所得到的纳米线具有比较好的单分散性7 1 。 1 2 2 表面修饰 1 2 2 1 表面修饰的作用与意义 修饰纳米粒子的表面，首先可以保护纳米粒子，其次可以改善纳米颗粒的分 散性，然后还能提高纳米颗粒的表面活性，再次能改变纳米颗粒表面状态，最后 能改善纳米颗粒与分散介质之间的相容性，为纳米材料的自组装奠定基础。纳米 粒子经表面改性后，其分散、吸附、等一系列表面性质都会随之变化，有利于颗 粒的保存、运输以及使用。金纳米颗粒经修饰以后，表面形成一层包覆层。包覆 层的极性端吸附在颗粒的表面，非极性长链则指向溶剂，在一定条件下，有机链 的非极性端结合在一起，能够形成规则排布的二维结构。 1 2 2 2 表面修饰方法 表面物理修饰法 通过涂敷、吸附、包覆等物理手段对微粒表面进行改性，主要有表面吸附 法和表面沉积法【8 1 。 ( 1 ) 表面吸附法，通过范德华力将异质材料吸附到纳米粒子的表面，以防止 纳米颗粒的团聚。如用表面活性剂修饰纳米颗粒，表面活性剂分子就能在颗粒表 面形成一层分子膜，阻碍了纳米颗粒间的相互接触，增大了颗粒间的距离，避免 了架桥羟基和化学键的再次形成。其次，表面活性剂还能够降低表面张力，减少 毛细管的吸附力。最后，通过加入高分子表面活性剂还能够起到一定的空间位阻 作用。 ( 2 ) 表面沉积法，将一种物质沉积到纳米颗粒的表面，形成与颗粒表面无化 学结合的异质型包覆层。利用溶胶可实现对纳米颗粒的包覆，改善纳米粒子的性 能。 表面化学修饰法 表面化学修饰【9 1 是通过纳米粒子表面原子与修饰剂分子发生化学反应，改变 其表面结构和性能的方法，是实现纳米粒子分散和复合等功能的重要手段。常用 的表面化学修饰耦合方法如下图所示，均采用e d c n h s 催化活化。 孓雕一一一 n ，s s u 口删驴 h 图1 1 典型的表面化学修饰耦合方法 其它还有硅烷基化方法等。 ( 1 ) 酯化反应法，金属氧化物与醇的反应也称作酯化反应，利用酯化作用对 纳米微粒表面修饰的改性最重要可以使原来亲水疏油的表面变成亲油疏水的表 面。适用于表面为弱酸性或中性的纳米颗粒，例如f e 2 0 3 、z n o 、a 1 2 0 3 、s i 0 2 等。 下图如s i 0 2 ，醇的羟基与二氧化硅的表面羟基反应脱掉一分子水，达到表面接枝 的目的。反应的方程式为： l + r 一洲一彳一。一r + 心。 这样r 基团接到s i 0 2 的表面，由于r 基团是亲油性的，因此增加了极性s i 0 2 纳米颗粒与有机物的湿润度。为了使反应可以朝着正方向进行，关键在于能够及 时将反应生成的水引出。 ( 2 ) 偶联剂法，偶联剂是一种同时能与无机物和有机物分别反应的功能基团 的化合物，它的分子量不大。偶联剂分子一般具有两种基团，一种能与无机纳米 颗粒表面进行化学反应，另一种能与有机物反应。将纳米颗粒表面经偶联剂处理 后能够使其与有机物具有较好的相容性。硅烷偶联剂是比较常见的偶联剂，对于 ho lsl 修饰表面含有羟基的纳米颗粒很有作用。 有机表面改性剂一般由亲水的极性基团和亲油的非极性基团构成，王慧玲采 用乙烯基三乙氧基硅烷( v t e s ) 进行处理，其反应机理为： o 。c 2 h 5 三s _ 。h + 2 h c c h s c 2 3 一三s i 一。一 i 一洲一c 一2 + c z 呐h o c 2 h 5 而用三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷处理的反应机理为： 三s _ o h + c i s i ( c h 3 ) 3 一三s i o s i ( c h 3 ) 3 + h c l i h 2 三s i 一。h + 3 h c s - n k h 3 ) ：一2 三s i 一。一s i - ( c h 3 ) 。+ n h 。 三s i o h + 3 h c s - n s i ( c h 3 ) 2 + 三s i o s i - ( c h 3 ) 3 + n h 3t 从上述反应过程可以看出：采用乙烯基三乙氧基硅烷对颗粒表面进行改性 时，副产物为乙醇气体，可用水对其进行吸收，因此，不会对设备产生腐蚀， 也不会对环境产生污染。 ( 3 ) 表面接枝改性法，表面接枝改性法分为：偶联接枝法一一纳米粒子表 面官能团与高分子直接反应实现接枝，该方法的优点是接枝的量可以控制，而且 效率比较高。聚合生长接枝法一一单体在纳米颗粒表面开始聚合诱发生长，形 成对纳米粒子的包覆，该方法的优点是接枝率较高。聚合与表面接枝同步法一 一单体在引发剂作用下完成聚合的同时被纳米粒子表面强自由基捕获，形成高分 子链与纳米颗粒表面的化学键合。 表面接枝改性充分发挥了无机纳米颗粒与高分子颗粒各自的优点，可充分实 现功能材料的优化设计。此外，纳米粒子的表面经过接枝后，大大提高了它在有 机溶剂和高分子中的分散性，可制备纳米粉高含量、高均匀分布的复合材料。 1 2 2 3 其他方法 除上述几种传统方法之外，表面修饰还可以采用一些其他的方法。 ( 1 ) 气相沉积法 主要包括气相化学沉积法和雾化液滴沉积法，都是通过过饱和体系中的改性 剂在颗粒表面发生聚集，从而形成对颗粒的包覆作用。气相化学沉积法是通过气 相中的化学反应生成改性杂质微核或分子，通过在颗粒表面的沉积作用或者通过 与颗粒表面分子之间的化学键合，形成致密均匀的薄膜包覆。雾化液滴沉积法是 将改性剂通过雾化喷嘴产生形成的微小液滴分散于颗粒表面，通过热空气或冷空 气的流化作用，在颗粒表面凝集或沉积结晶形成表面包覆【1 0 】。 ( 2 ) 超临界流体快速膨胀法 流体在超临界的状态下具有液相的强溶解能力和气相的高扩散性质的特点。 超i 临界流体快速膨胀包覆法是利用超临晃流体在流化床的快速膨胀作用下，使需 要改性的微核在颗粒表面形成均匀的薄膜包裹。通过控制膨胀前的温度、包覆时 间等因素的影响，从而控制包覆的致密度与包覆的厚度。由于超临界流体快速膨 胀后的溶剂能够同溶质颗粒很容易也很快速地彻底分离，因此，不会给产物带来 任何污染【1 1 1 。 ( 3 ) 沉淀法 沉淀法是通过向溶液中加入沉淀剂( 如氨水) 或引发体系中沉淀剂的生成， 从而能够使需要改性的离子发生沉淀反应，在颗粒表面进行析出，从而对颗粒 进行包裹【1 2 】。通过调节反应体系温度、蒸发溶剂等物理方法可增大沉淀生成物 的过饱和度，通过对体系的p h 值进行调节能够控制金属离子的水解反应，进 行沉淀包覆【1 3 】。沉淀法包覆的关键需要控制溶液中离子浓度和沉淀剂的释放剂 量和速度，使反应生成的改性剂在体系中有一定的过饱和度，又没有超过临界 的饱和度，从而以被包裹颗粒为核发生沉淀析出，不然会导致大量沉淀物的生 成，而不是均匀包覆在颗粒表面【1 4 】。 依据沉淀方式的不同可分为：直接沉淀法、水热法、水解法、共沉淀法、均 相沉淀法等。直接沉淀法通过溶液中离子发生沉淀反应直接生成包覆物。水解法 是通过调节体系的p h 值，控制离子水解生成沉淀包覆物。水热法借助在水热的 条件下被改性颗粒表面具有高活性，从而能够在表面沉积。共沉淀法通过控制沉 淀反应条件，使溶液中多种金属离子以一定的顺序或者组成在被包覆颗粒表面沉 淀析出。均相沉淀法改善了沉淀剂直接加入会导致包覆不均匀的缺点，从而引发 体系中化学反应生成沉淀剂。而是通过改变化学反应条件来调节控制沉淀剂的释 放速度，可以避免沉淀剂浓度的不均匀的缺点，从而有利于颗粒均匀致密的包覆。 沉淀法能够便利地通过控制体系中金属离子浓度以及沉淀剂的释放剂量和速度， 6 因此，比较适合对超细材料进行无机改性剂包覆。该方法引起很多材料工作者的 极大兴趣。 ( 4 ) 非均匀形核法 非均匀形核法根据l a m e r 结晶过程的理论，利用改性剂粒子在被包覆基体上 的非均匀的生长来形成包覆层。这种技术的关键在于控制溶液中改性剂的浓度， 使其介于均相成核所需的临界浓度和非均形核所需的临界浓度之间【16 1 。这种方 法可以精确控制包覆层的化学组成和膜的厚度。非均匀形核法是沉淀法包覆中的 一种比较特殊的方法，单独列出来的目的是为了可以强调其非均匀形核机理【1 5 】。 在非均匀形核临界浓度与均相成核临界浓度之间形成的是一种无定形包覆层，而 在均相成核临界浓度与临界饱和浓度之间形成的是一种多晶相包覆层，如果高于 临界饱和浓度就会形成大量的沉淀物，不会再对颗粒进行包覆。通过对无定形包 覆与多晶相包覆进行比较，前者更易实现包覆层的均匀、致密。因此，对基于非 均匀形核机理的沉淀法包覆于材料的包覆的改性，则更具有显示意义。为了使体 系顺利发生非均匀形核应保证以下条件：成核与生长过程中分散体系具有一定 稳定性；改性剂成核与生长过程的分离；被包覆颗粒的比表面积足以满足非 均匀形核所需，从而可以避免改性剂的偏析或生成沉淀的现象发生【 1 。 1 2 3 金纳米粒子的表征 金纳米粒子的表征方法可以分为直接法和问接法，表征金纳米粒子最直接方 法有以下六种： 扫描电子显微镜( s e m ) 和光学显微镜及透射电镜相比，扫描电镜具有以下特点： ( 1 ) 能够直接观察样品表面的结构，样品的尺寸可大至l2 0 m m x 8 0 m m x 5 0 m m 。 ( 2 ) 样品制备过程简单，不用切成薄片。 ( 3 ) 样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转，因此，可以从各种 角度对样品进行观察。 ( 4 ) 景深大，图象富有立体感。扫描电镜的景深较光学显微镜大几百倍， 比透射电镜大几十倍。 7 ( 5 ) 图象的放大范围广，分辨率也比较高。可放大十几倍到几十万倍， 它基本上包括了从放大镜、光学显微镜直到透射电镜的放大范围。分辨率介 于光学显微镜与透射电镜之问，可达3 n m 。 ( 6 ) 电子束对样品的损伤与污染程度较小。 ( 7 ) 在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分 析。 透射电子显微镜( t e m ) 透射电子显微技术是以电子束作照明源，由电磁透镜聚焦成像的电子光学分 析技术，其分辨率大约为1 n m 。用透射电子显微镜可以研究纳米材料的结晶情况， 观察纳米粒子的形貌、分散情况，测量和评估纳米粒子的粒径。这是表征纳米金 的有效方法之一，能准确、直观地测出纳米金的形貌、粒径大小。 扫描隧道显微镜( s t m ) 扫描隧道显微镜( s t m ) 仪器本身具有的诸多优点，使它在研究物质表面结 构、生物样品及微电子技术等领域中成为很有效的实验工具。例如生物学家们研 究单个的蛋白质分子或d n a 分子；材料学家们考察晶体中原子尺度上的缺陷； 微电子器件工程师们设计厚度仅为几十个原子的电路图等，都可利用s t m 仪器。 在扫描隧道显微镜问世之前，这些微观世界还只能用一些烦琐的、往往是破坏性 的方法来进行观测。而s t m 则是对样品表面进行无损探测，避免了使样品发生变 化，也无需使样品受破坏性的高能辐射作用。另外，任何借助透镜来对光或其它 辐射进行聚焦的显微镜都不可避免的受到一条根本限制：光的衍射现象。由于光 的衍射，尺寸小于光波长一半的细节在显微镜下将变得模糊。而s t m 则能够轻而 易举地克服这种限制，因而可获得原子级的高分辨率。目前最小的扫描隧道显微 镜尺寸仅为1 2 5 i t m ，而最大的扫描范围可达1 0 0 m 。 原子力显微镜( a f m ) 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 是一种具有原子分辨率的表 面形貌、电磁性能分析的重要仪器。 场离子显微镜( f i m ) 由米勒在2 0 世纪5 0 年代开创的场离子显微镜及其有关技术，是一种原子 直接成像方法，能清晰地显示样品表层的原子排列和缺陷，并在此基础上进 一步发展到利用原子探针鉴定其中单个原子的元素类别。场离子显微镜技术 的主要优点在于表面原子的直接成像。但是由于参与成像的原子数量有限， 因而场离子显微镜只能研究在大块样品内分布均匀和密度较高的结构细节， 否则观察到某一现象的几率有限。此外在成像场强作用下，样品经受着极高 的应力，可能使样品发生组织结构的变化，如位错形核或重新排列、产生高 密度的假象空位或形变孪晶，甚至引起样品的崩裂。 间接表征金纳米颗粒的方法有以下四种重要方法： x 射线衍射( x r d ) x r d 是鉴定物质晶相的有效手段，通过x 射线衍射图谱可以确定纳米单元的 结构参数，获得纳米粒子或基体近邻原子排布的变化情况：也可以确定纳米粒子 的粒径分布、体积分数和粒子基体界面面积、粒子排布造成的干涉效应；还可 以分析晶体的结构。现已研究出来的纳米银大多数呈多晶结构，但也有少数单晶 结构。 电子自旋共振( e s r ) e s r 能够应用在固态物理即能够辨识与定量自由基分子( 即带有不成对 电子的分子) 、用于侦测反应路径的化学、标记生物性自旋探子的生物医学 等多个领域。 表面增强拉曼散射( s e r s ) 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 是一种研究表面分子的重要工具，可以用于表征 金属纳米粒子的光学性质，是界面现象现场研究的重要手段。所谓表面增强拉曼 散射( s e r s ) 现象，即在某些金属表面，表面吸附物种的拉曼散射信号能被异常 地增强，可高达1 0 4 10 6 倍。19 7 4 年，f l e i s e h m a n n 等【1 8 】首次在电化学粗糙的银电 极表面发现了吡啶的拉曼信号。当时他们认为拉曼信号是由电化学粗糙使得电极 表面积的大幅度增加所引起的。随后，19 7 7 年，v a nd u y n e 和j e a n m a i r e 等【1 9 】证明 粗糙电极的表面积只增加了几倍到几十倍，而实际得到吡啶在粗糙电极表面的信 号比通过分子计算得到的信号强l o s 1 0 6 倍。c r e i g h t o n 等人【2 0 】随后也得到类似的 结果。种种证据表明这种表面上的强烈拉曼信号是由拉曼散射效应自身产生的， 这种巨大的增强效应以后就被称为表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，s e r s ) 。 9 紫外可见光谱 紫外可见分光光度法是利用物质的分子吸收2 0 0 8 0 0 n m 光谱区的辐射来 进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电 子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性和定量分析。 通过以上手段可以获得金纳米微粒的形态、结构、电子能级等有用的信息。 1 3 局域表面等离子体共振概述 1 3 1s p r 概述 表面等离子共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 生物传感器是2 0 世纪8 0 年 代出现的一种生物传感器技术，是一种物理光学现象。它在进行生物分子相互作 用分析( b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o na n a l y s i s ，b i a ) 方面具有其它技术无法比拟的优 点，其发展非常迅速，因此，受到越来越多科研人员的关注和重视。 目前，基于s p r 技术的生物传感器，由于能实时监测生物分子间相互作用， 且具有无需标记、灵敏度高、无损伤检测、检测快捷方便、不需预处理、样品用 量少、应用范围广等优点，己被广泛运用于药物筛选、遗传分析、酶分析、环境 检测、生命科学研究、食品安全等领域，并且显示出广阔的应用| j 景。 1 3 2s p r 的基本原理 表面等离子共振( s p r ) 是一种物理光学现象。如下图1 2 ，当入射光在玻璃 ( 或其它高折射率介质) 界面处发生全反射的时候，会产生消逝场，这种消逝场 能够引发金属表面的自由电子产生表面等离子体共振。发生共振时，界面处的全 反射条件将被破坏，入射光能量被转移到表面等离子体波( s u r f a c ep l a s m o n w a v e ，s p w ) 中【2 1 1 ，从而导致反射光强度会在传播过程中下降，其中，使反射 光完全消失的入射光角度称为共振角( s p ra n g l e ) 2 2 , 2 3 1 ，这种现象称作衰减全 反射( a t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o n ，a t r ) 现象。共振角随着金属的膜表面的介质 折射率发生改变而改变，而折射率的变化与结合在金属表面的分子的质量成正比 2 4 - 2 6 】。因此可以通过获取生物反应过程中s p r 角的动态变化，就能够得到生 物分子之间相互作用的特异性信号。 1 0 r 、 a n t i b o d y 。警过= ：巴= m 帅f 2 2 2 2 2 圈i2 表面等离子共振传感原理示意圈 33s p r 技术的特点 ( 1 ) s p r 对样品的折射率非常灵敏敏感，因此待测物尢需标已。这也避免 了昂贵的标记和纯化工作。此外，一些标记物具有毒性或放射性，这样不再对样 品进行标记就u r 以避免环境污染并且町以增强实验的安全性能。 ( 2 ) 在线检测s p r 技术能动志地监测生物分_ ，相互识别的过程，为疾病的及 时发现和治疗提供了比较好的条件。 ( 3 ) 检测的灵敏度根高，检测范围町咀n o0 1n g m l ，甚至低到g g m l 。 ( 4 ) 是一种无损伤检测s p r 。因此也适用r 不透明、混浊或者其他有色溶液 的检测。 ( 5 ) 检测过程非常迅速，测试时间比较短，能够再生。 ( 6 ) 稳定性和重现性都还比较好。 ( 7 ) 样品用量非常少，一个样品仅需要l p g 蛋白。 ( 8 ) 对复合物的定量测定分析不会干扰反应过程的平衡。 ( 9 ) 实验的应用范围非常广泛不仅可检测抗原抗体、生物索亲和素之日j 的特 异性识别，蛋白质和d n a 等其他大分子之间的相互识别也可以。 ( 1 0 ) 一般情况f 是不需对样品进行预处理，节省了大量的实验操作时间， 减少操作的复杂性。 l3 4 l s p r 概述 在s p r 技术的r 趋发展成熟的今天，它依然具有以下系列不足之处：f 1 ) 样品 的组成、环境的温度对反应影响比较大：( 2 ) 检测范围比较狭窄，只能检测大分 子物质； ( 3 ) 灵敏度不高；( 4 ) 比较难区分非特异性吸附；( 5 ) 一扶只能检测一 个样品，h i 能同时多个检测多个样品；( 6 ) 仪器体积庞太：( 7 ) 成本较高等。鉴于 这些不足，一种基于s p r 新技术的一局域化表面等离子体共振( l o c a l i z e ds u r f a c e p a s m o nr e s o n a n c e ，l s p r ) 技术就应运而生了。 局域化表面等离子体共振( l s p r ) 是会属自由电子的一种共振现象它能 够发生在余属纳米结构中l s p r 对纳米例子周围的介质环境十分敏感，颗粒周 围吸附的生物分子将导致l s p r 的共振波长发生红移。于是，基于l s p r 技术能够 实现检测仪器体积小、系统设置简单、灵敏度较高的生物传感器。由于l s p r 中 的消光现象是由于纳米粒子对光的散射和吸收造成的，因此l s p r 的实现不需要 表面等离于体共振那样庞大的装置。 仉i ： +k ，r 1i 圉13 基于球形纳米颗粒的局域表面等离于共振示意图 l s p r 传感器除了具备了s p r 传感器的所有优点之外，还具备了以下几个特 点：( 1 ) 体积小、系统设置相对简单。( 2 ) 抗干扰能力比较强、价格相对比较便宜。 ( 3 ) 灵敏度更高，能够检测小分子之间的反应，并且能够同时检测多个样品。正 由于l s p r 有诸此多优点，于是，l s p r 技术正作为一种新兴领域广泛应用于药物 筛选、临床诊断、食品分析、环境监控以及膜生物学等领域。 1 3 5l s p r 基本原理 当局部表面等离子体( l o c a l i z e ds u r f a c ep l a s m o n s ，l s p s ) 被入射光激发，引 起局部表面等离子体发生共振时，能够导致反射光能量降低，且该金属纳米结构 表面的局部电场增强，表现出比较强的表面等离子体吸收现象。 当入射光子的频率与金属纳米颗粒中的自由电子发生共振时，会产生l s p r 。 最简单的纳米颗粒光学响应模型是m i e 理论，具体形式如下所示【2 7 】： 阶，2 等 赤 其中，e ( 九) 是消光量，九是入射光的波长，1 3 m 表示金属纳米球体周围介质的 介电常数( 假设为正常数，且与波长不相关) ；n a 表示纳米颗粒的局域密度；i 表示金属纳米球体介电常数的虚部；即为吸收和散射的综合；a 表示为金属纳 米球体的半径；，表示金属纳米球体介电常数的实部。从式中可以看出，当分母 中( 8 ，+ 2 m ) 2 接近零时，达到l s p r 的共振条件。 从这个最初始的模型中，可以明显地看出，掩埋于外界介电环境中的金属纳 米球体颗粒的l s p r 光谱特性取决于以下几个方面，纳米颗粒材料1 3 i 、纳米颗粒 材料1 3 ，、纳米颗粒的半径a 以及纳米颗粒所处在环境的介电常数m 。接下来更 深入的研究表明，当纳米颗粒不是球形的时候，一般具体实验也是这种情况的发 生，吸收光谱的变化就会取决于纳米颗粒粒径、形状等。在这种情况下，分母中 的共振项为：( ，- i - ) c m ) 2 式子中，) c 是用来描述纳米颗粒形貌比例的形状因子。 假如球体颗粒的材料是理想的自由电子，可以由d r u d e 模型表示： 1 3 1 = l - 南 ( 2 ) 式中，p 表示金属的衰减频率，也就是金属的共振频率【28 1 ，可由下式表示： =(ne(0p 2 m e o ) 1 7 2 ( 3 )= ( 2 z ( 3 ) 其中，n 表示自由电子密度，m 表示电子的质量。 在可见光和紫外波段范围内，r 4 7 8 ，国药集团) ，聚乙烯吡咯烷酮( p v p ，k 3 0 ，国 药集团) ，1 乙基( 3 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐