（分析化学专业论文）高效液相色谱法分离制备菱角中甾醇类化合物的研究.pdf

摘要 本文首次从野生菱角中提取出甾醇类化合物，经过进一步分离纯化后，用高效液相 色谱法分析鉴定出其中的b 一谷甾醇。 1 分别采用微波法、索氏回流法和超声波法对菱角中的甾醇类化合物进行了提取 研究，通过比较不同提取溶剂和提取方法的提取效果，优选出菱角中甾醇类化合物的最 佳提取条件和提取方法。 2 对菱角中甾醇类化合物的粗提物采用皂化法和硅胶柱色谱法进行了进一步的分 离纯化。比较了两种方法纯化后的甾醇提取物的液相色谱图，确定采用皂化法对甾醇粗 提液进行分离纯化。 3 用薄层色谱法对甾醇标样及纯化后的样品进行了研究，通过比较不同展开剂体 系对样品的分离效果，优选出最佳展开剂体系，确定了菱角中甾醇类化合物的极性，为 甾醇样品的进一步色谱分析提供了选择流动相的依据。 4 考察并优化了流动相组成、流动相配比等色谱分析条件，对纯化后的甾醇样品 进行了液相色谱分析，并确定了其中b 一谷甾醇的含量。 5 对甾醇的抗氧化性进行了研究。采用甲基紫光度法测定f e n t o n 反应产生的0 h ， 研究了甾醇对o h 的清除作用，并同时研究了它对猪油的抗氧化活性。 关键词：菱角：甾醇；p 一谷甾醇；分离纯化；高效液相色谱；抗氧化性 a b s t r a c t w o r k si n c l h d 主n g 像ee x 撒垃t i o no f 髓e r o l sd e 矗v e d 舶mw a l e rc a l 舡d ph a v eb e e nr c p o r t e d i n “sp a p e rf i r s t tt h es t e r o l sa r cs e p e r a t e db y 也eh i 曲p e r f o m a n c ep r e p 砌t i v el i q u i d c h m a t o 鲫h ya r e rp u r i f i e d 1 t h eb e s tc o n d i t i o n sa n dm e t l l o d so fe x 台a c t i 柏gs t e r o l sa f ci n d e n t i 基e dt h r o u 曲 c o m p a r i n gm ce 虢c 乜o fd i 虢r i e n ts 0 1 n t sa n dm 础o d ss u c h 船m i c r o w a v ee x 仃a c t i o n ， s o x 址e tg x t 臻e t i o na n du l 乜瞄。壬l 呈cw a v ee x 髓8 c t l o n 2 t h e 咖r 0 1 sa r cs 印e r a t e da n dp l l r i f i e db ys a p o n i f j c a t i o na n ds i l i c ag e lc h r o m a t o 铲印h y s a p o n 澄c a t i o ni s 也eb e s t 撒e 出o dt op 翻每也ee r u & s 锄p l eo fs t o r o l sb yc o m p a 西n g 趣e c h r o m a t o 目a mo f t w om e t h o d s 3 t h eb e s te ) 【p a n d i n gs o l v e n ts y s t e mu s e di nt h ea n a l y s i so f 甘l 证- l a y e rc a t o 铲a p h y i ss e l e c t e dt h m u 曲c o m p 撕n gm es 印蹦m o no fd i 低r e n ts o l v e n ts y s 钡n s 谢t hd i 甄r e n t p o l 撕移t h er e s u h sn o t0 1 1 1 yc o 耐i n nt b ep o l 撕t yo fs t e r o l si nw a t e rc a l t r o pb u ta l s oc a l lb e u s e dt os e l e 畦怕ec o m p o s 撼o no f m o b i l e 砖a s ei n 像es e p e r a t i o nb yc h r o m a t o 缈p h y 。 4 t h eb e s ts 印e r a t i o nc o n d i t i o no f l l i 曲p e r f b m a n p r e p a r a t i v e1 i q u i dc h m a t o g r a p h y ss e l e c t e da 稿di d e n t i 髓舔啦。毛l 醢c o m p a r 呈n gt h ec o m p o s i n go fm o b i l e 曲a s e ，昼o w a t 。a l l ds o o n t h ec o n t e mo f6 一s n o s t e r o lw a sc o i l f i 衄c d 5 t h ea n t i o x y 鬻激i cp r o p e r 哆o f s t e r o l sw a sr e s e a r c h t 通t h es c a 瑚g e d n ge f c to f s t e r o l so nh y d r o x y lr a d i c a l ( o h ) a i l di t si n l l i b i t o r ye f f e c to nl i p i dp e r o x i d a t i o na r es t u d i e d k e yw o r d s ：w a t e rc a l t r o p ；s t e m l s ；p s i t o s t e i 口l ；s e p a r a t i o 珥h i 醢p e r f o m a n c ep r e p a r a t i v e l i q u i dc l l r o m a t o g r a p b y ；a n t i o x y g e n i cp r o p e r t y l i 独创性声明 本人声明所受交的学位论文是本人在导师指导下进行的掰究 工l 牟及取得的研究成果。据我所船，除了文中特别加以标注和致 谢静遗方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得东北廊范大学或其他教育枫构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文馋豢签名： 蔓五l日期：趔：! 学位论文版权使用授权书 本学位论文l 乍者完全了解东北爆范大学有关保壁、使用学位 论文的规定，即：东北师范大学有权傈留并向国家有关部门或机 构送交学位沧文的复印件和磁盘，允许论文被查阅鞠诺阅。本人 授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据痒进行检索，可以采翊影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 ( 镶密的学位论文程解密籍适用本授投书) 学位论文作者签名：霆l 盘_ 指导教廊签名：! 堑塞立 固 期：圣亟：，网期：趋2 ：2 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： ( 一) 植物甾醇研究概况 一、文献综述 甾醇在自然界中分布极广，虽说含量不多，但它具有很高的应用价值，自从在植物 油中发现谷甾醇( s i f o s t e r 0 1 ) 和豆甾醇( s t i g i i 船r 0 1 ) 以来，人们对植物甾醇进行了 广泛深入的研究，特别是六十年代以来，在理论研究和牛产技术，应用等方面有了重大 的进展。目前植物甾醇在甾体药物合成、化妆品、动物生长剂、植物生长激素等方面得 到了广泛应用。由于甾醇属于天然物质，本身无毒性，而且具有乳化性和稳定性等特点， 因此引起各国科学家对甾醇开发应用的重视。 国外多位学者对许多主要植物油中所含的甾醇用气液色谱( g a sl i q u i d c l l r o m t o 胂p h y ，g l c ) 作了分析鉴定。e i s n e r 和f i r e s t o n e 鉴定了九种植物油中甾醇的组 成，发现b 谷甾醇、y - 谷出醇和豆甾醇是主要成分，其中以b - 谷甾醇的含量最高。j a c i n i 等人分析了1 8 种植物油中甾醇成分，发现所研究的所有植物油中均含有菜油甾醇 ( c a m p e s t c f 0 1 ) ，豆甾醇和b 谷甾醇，棕榈的叶和核仁中含有胆甾醇( 胆固醇，c h o 【e s t e f 0 1 ) ， 油菜籽中含有菜子甾醇( b r a s s i c a s t d 0 1 ) ，而向日葵中含有一种未确认的甾醇，其相对保留 体积为1 1 4 ，( 以b 谷甾醇为1 o o ，1 s b 3 0 ) 。 二十世纪六七十年代，从皂化植物油、松浆油、动物油脂及硫酸纤维素皂化物的不 皂化物中一般采用溶齐j 溶解、萃取、蒸馏及结晶的方法提取甾醇。随着分离操作方法的 改进和发明，采用了高真空分子蒸馏技术提取维生素e 和植物甾醇的方法也得到了广泛 的应用，与此同时出现了吸附法配合溶剂提取的工艺方法，引进色谱柱分离的方法简化 了操作步骤，提高了分离效率。到了九十年代超临界流体( s u p e r c d t i c a lf l u i d ) 的出现更是 使提高从复杂体系中提取的甾醇的纯度成为可能。另外，采用微生物培养技术可使一些 甾醇转化为合成其它甾体类药物的重要中间体。 我国对植物笛酵的研究现在大多只停留在对植物甾醇的提取和分析方面，对其活性 成分的具体应用鲜有报道，而日大多数的提取原料是大豆油脱良馏出物。特别是对植物 甾醇类单体的研究，国内几乎空白。 ( 二) 甾醇的结构、性状及理化性质 甾醇( s t e r 0 1 ) 足甾族化台物( s t e r o i d ) 中的一类，是高碳环型一元仲醇。甾醇的主体是 环戊烷并多氢菲的核，分子的基本骨架由三个六元环和一个五元环组成。c 3 位上连有 一个羟基，c 一1 7 位连有由8 1 0 个碳原子构成的侧链，多数甾醇c 一5 位为双键。甾醇的 这种结构特点决定了它的多方面的生理活性及其广泛用途。c ，3 位羟基是甾醇的重要福 这种结构特点决定了它的多方面的生理活性及其广泛用途。c _ 3 位羟基是甾醇的重要活 性基团，通过它甾醇在自然界形成多种多样的衍生物，如甾醇脂肪酸酯、甾醇阿魏酸酯 f 谷维素、甾醇4 羟基3 甲氧基肉桂酸酯) 、甾醇葡萄糖苷，酰基甾醇葡萄糖苷等。工业 上通过甾醇c 3 位羟基与环氧乙烷、环氧丙烷、环氧乙烯等加成，生成多种表面活性各 异的产品。医药工业上通过微生物发酵，将c 1 7 位连有的侧链切断，制成重要的甾体 药物半合成的中间体，使甾醇尤其是谷甾醇成为当今甾体药物生产的重要原料。 甾醇因其呈固态又俗称固醇，如胆固醇、谷固醇等。天然甾醇种类繁多，现在鉴定 出来的甾醇有2 5 0 种之多，植物油中存在的1 2 8 种得到了明确的鉴定，其中有2 4 种是最 常见的。在植物甾醇分离提取的工艺研究中，最常见的也就是4 种甾醇，其结构式见图 卜l 。当主环和侧链各有一个双键时：r = c 1 3 时为菜籽甾醇，r = c 。h 。时为豆甾醇：侧链全氢 化无双键时：r = c h 。时为菜油甾醇，r - c ：h 。时为b 一谷甾醇。 h 0 图1 14 种常见植物甾醇的结构式 早年根据来源不同，把甾醇分为植物甾醇、动物甾醇和菌类甾醇三大类。植物甾醇 主要有0 谷甾醇( b s “o s t e r 0 1 ) 、菜油甾醇( c 锄p e s t e r 0 1 ) 和豆甾醇( s t i 奎m 埘e m l ) ， 其它还包括燕麦甾醇、菠菜甾醇、钝叶大戟甾醇、芦竹甾醇、环木菠萝烯醇和2 4 亚甲 基环木菠萝醇等，存在于植物的种子中，谷甾醇在人和动物以及微生物、菌类的脂质中 也广泛存在；动物甾醇以胆甾醇( 胆固醇) 为主，存在于动物的组织和细胞之中，在植物 的根、茎、叶、花和种子中也普遍存在；菌类甾醇有麦角甾醇等，存在于霉菌和蘑菇之 中。近代分析表明，胆甾醇在植物的根、茎、叶、花和种子中也普遍存在，在某些油的 总甾醇构成中占8 7 1 0 ，在结合脂蛋白中甚至出现2 “3 6 。同样，谷甾醇在人和 动物以及微生物、菌类的脂质中也广泛存在。 科学研究中，一般按结构类型把甾醇分为4 - 无甲基甾醇、4 一单甲基甾醇和4 ，4 双甲 基甾醇三大类( 见表1 1 ) 。当今开发应用的游离甾醇多为无甲基甾醇，化妆品原料“植 物甾醇”，它是无甲基甾醇的混合物，其中以谷甾醇为主，还含有菜油甾醇和豆甾醇， 美国把从大豆油脱臭馏出物中制取的植物甾醇称为“大豆甾醇”( s o y a s t e r 0 1 ) 。 表1 1 甾醇分类表 4 ，4 一双甲基甾 类名4 无甲基甾醇4 单甲基甾醇 醇 其他名无甲基甾醇、甾醇单甲基甾醇、甲基甾醇双甲基甾醇、三萜烯醇 类型胆甾烷型 4d 一甲基胆甾烷型 羊毛甾烷型 b 谷甾醇、豆甾醇、胆钝叶大戟甾醇、芦竹甾 环木菠萝烯醇、a 一香树精 甾醇举例 甾醇醇 甾醇通常为片状或粉末状白色固体，经溶剂结晶处理的甾醇为白色鳞片状或针状 晶体，其中由乙醇中结晶形成针状或菱片状，由二氯甲烷形成针刺状或长棱晶。甾醇分 子中碳原子数一般为2 7 3 l ，分子量为3 8 6 4 5 6 ，甾醇熔点较高，都在1 0 0 以上，最 高达到2 1 5 。甾醇比重略大于水，如胆甾醇为1 0 3 1 0 7 ，麦角甾醇为1 0 4 。甾醇不 溶于水，可溶于多种有机溶剂。图1 2 所示的是植物甾醇在几种常用有机溶剂中的溶解 度。 甾醇在常用溶剂中的溶解度 图卜2 植物甾醇在各种溶剂中的溶解度曲线 植物甾醇的理化性质主要表现为疏水性，但因其结构上带有羟基基团，因而又具有 亲水性，在同一个物质结构中同时具有亲水基团和亲油集团意味着该物质具有乳化性。 植物甾醇的乳化性可通过对羟基基团进行化学改性而得到改善，植物甾醇具有两性的特 征使得它具有调节和控制反相膜流动相的能力。 ( 三) 甾醇的来源与分布 甾醇因其植物种类、产地、来源不同而含量、组成会不同。一般认为，植物油及其 加工产品是植物甾醇最丰富的自然来源，其次是谷物、谷物副产品和坚果，少量来自水 果和蔬菜。 1 植物油中植物甾醇 在大部份天然植物油中，每千克油中含有1 5 9 植物甾醇。玉米油、菜籽油、米糠 油和小麦胚芽油中含有较多植物甾醇，每千克含有植物甾醇量分别为8 0 9 1 5 5 7 9 ， 5 1 3 9 7 9 9 ，3 2 2 5 9 ，1 9 7 0 9 。 2 谷物中植物甾醇 3 o 9 8 7 6 5 4 3 2 l 0 碾瓣_e善昌，曩)|黼蒜鞋 黑麦、小麦、大麦和燕麦中总甾醇的含量分别为1 ，1 0 0m g k g ，7 6 0m g k g ，8 3 0m g k g 和5 2 0m g 垤。在玉米中为l ，7 8 0m g k g 。几种主要甾醇与植物油相似，以谷甾醇为主。 单甲基甾醇和双甲基甾醇的含量很少。谷物的麸皮和胚芽是植物甾醇优良来源。每千克 小麦麸皮含有总甾醇0 8 9 1 5 4 9 。每千克米糠中含有总甾醇1 3 2 5 9 。在每克小麦胚芽、 小麦麸皮和燕麦麸皮的脂类化合物中，总甾醇的含量分别为4 2 3 8 m g ，4 4 9 2 m g 和9 4 3 m g 。 谷物如小麦、黑麦、玉米和黑小麦糊粉层中常含有较大量植物甾烷醇。谷物中结合 形式的甾醇主要以脂肪酸酯、酚酸酯和糖苷的形式存在。黑麦中甾醇酯占总甾醇4 7 ，田 醇糖苷占2 2 。在大麦中这两个数字分别是4 5 和1 4 。小麦中主要含游离甾醇，其百分 含量为5 8 ，而燕麦中主要含甾醇糖苷，其百分含量为4 1 。 3 蔬菜、水果和浆果类植物甾醇 蔬菜、水果和浆果类的食品含水量很高，通常使人认为它们不象谷物那样能成为植 物甾醇的良好来源。近年来这种看法有所改变。芬兰的研究人员经过测定后发现，每干 克新鲜的蔬菜中，总甾醇含量在5 0 3 7 0 m g 之间，若以干基计，则总甾醇含量在2 5 0 4 ，1 0 0 m g 之间，花椰菜中甾醇含量最高。水果和浆果中，每千克湿重含甾醇6 0 7 5 0 g ， 每千克干重含甾醇3 7 0 2 ，9 3 0 m g ，其中大部分在1 ，0 0 0 g 以上。皮和籽通常都不算在可 食用部分之内，事实上它们比可食用部分的甾醇含量更高。在这些甾醇中，谷甾醇含量 最高，平均值为8 2 m g k g ，最高值可达4 8 0 m g k g 。水果中甾醇含量为1 3 4 4 0 m g k g ( 平均 值为1 6 0 m g k g ) 。在水果中存在的甾醇，也同样有游离甾醇、甾醇酯、甾醇糖苷这几种 形式。在不同种类的水果中，这几种形式占有不同的比例。并且受生长条件、成熟度、 组织分布等多种因素的影响。 4 坚果中植物甾醇 对于这方面的研究目前还不是很多。在不同种类的坚果中，甾醇总量在很大一个范 围内变化：2 9 0 2 ，2 0 0m g k g 。根据美国农业部( u s d a ) 的一份资料，花生、腰果和杏仁 中的甾醇含量分别为2 2 0 9 k g ，1 5 8 9 k g ，1 4 3 9 k g 。 目前国内的植物甾醇生产，主要取材于植物油精炼过程中副产品脱臭馏出物。 从资源充分利用和食品营养学的角度来看，其他来源的植物甾醇也同样值得我们重视和 开发。 ( 四) 甾醇的生理活性和应用 1 甾醇的生理活性 1 1 植物甾醇的抗氧化机制 近来，相继有报道表明，许多植物箔醇具有抗氧化能力，这起因于发现橄榄油、玉 米胚芽油、小麦胚芽油及v e n o n i aa n t l i e l m i m i c a 油能使红花籽油在煎炸条件下保护其脂 肪酸不发生氧化降解。目前发现，具抗氧化功能的植物甾醇共同特征是它们分子侧链上 都有一个亚乙基。具有亚乙基侧链植物甾醇的抗氧化效应归因于它们能在2 9 一烯丙基处 4 抉速形成一个自由綦，此盛由基薅帮异构佬为一个叔良由基，该掇自良基比脂肪酸碳中 心自由瑟更稳定，从而阻断了脂肪酸链的氧化反应，其机制可用图1 3 表示。 l 0 0 一毒 热。 图1 3 侧链含溉乙基的甾醇在高温条件下抗脂质氧化的机制 1 2 抗炎和退热作用 d 一谷甾醇对克服由角叉胶在鼠身上诱发的水瓣和出棉籽粉移植引起的肉芽组织 生成，均表现出强烈的抗炎作用。此外，b 一谷甾醇还具有类似阿司匹林( 乙酰水杨酸) 的退热作用，且不会引起溃疡，因此b 一谷甾醇是一种抗炎和退热作用显著、应用安念 的天然药物。豆甾酵和菠菜甾醇也具有抗炎作用。 1 3 降胆甾醇作用 在正常情况下，机体内合成艄甾醇和从食物中摄入胆甾醇，转化为甾体激索或成为 细胞膜的成分，并傻血滚中胆甾藜浓度保持选定。当肝脏因实质憔损坏时，胆缁醇浓度 降低，但i 临床上通常出现的是胆甾醇浓度过高。当从食物中摄入过多胆甾醇后，使体内 胆甾酵超过正常质需范围时，对于机体调节桃熊衰退的人尤其是年龄较大的，肝魁等器 宙对胆甾醇的吸收和排泄的自动调节功能发生障碍，则会导致血清中胆甾醇含量过高， 彤戏高褪溪醇血症鲮高脂血症。其中一部分艟甾醇还会在斑管蠹蘩上产生沉积，致使盘 管内有效流通面积减小，尤其使主动脉变硬、弹性变小，即产生粥样动脉硬化瘢，由此 可迸一步导致高血压和冠心病。入本身不能合成植物甾醇，需从食物中掇入，一般食用 谷物、植物油、各类蔬菜、瓜果和副食品中都含有植物甾醇。植物甾醇的结构跟胆甾醇 相似，在体内的吸收的方式也相同。甾醇酯通过胰脂酶水解成为游离型甾醇被吸收，但 棱甥整醇的吸收率比胆甾醇低得多，一般为5 l o 。 植物甾醇能阻碍胆甾醇吸收，从而起到降低血液中胆甾醇含量的作用，其作用机理 是： ( 1 ) 植物甾醇和植物甾烷醇可将小肠中胆淄醇沉淀下来，使嚣呈现不溶解状态，因 此不能被吸收。 ( 2 ) 胆甾醇能溶解于小肠内腔的胆汁酸微胶束( 主要由胆汁盐和磷脂组成) 是被吸收 的必要条件；而植物甾醇存在可将胆甾醇替换出来，使之不能经胆汁酸微胶束运送到达 h 小肠微绒毛的吸收部位。b 一谷甾醇阻碍胆甾醇吸收作用，主要发生在这一种情况，而 植物甾醇或甾烷醇本身的吸收率很低，即使有少量吸收也会以胆汁酸形式重新分泌出 来。 ( 3 ) 在小肠微绒毛膜吸收胆甾醉时其与胆甾醇相互竞争，阻碍对胆甾醇的吸收。 植物甾醇如b 一谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇不仅对游离态胆甾醇，而且对胆甾醇酯 都有降低作用，并且其本身的游离型和脂肪酸酯型具有相同效果。含植物甾醇的大豆油 不皂化物也是一种降血脂药。 1 4 皮肤保健和美容作用 甾醇具有消除皮肤角质化的作用，化妆品中添加甾醇后，皮肤卫生保健和美容功效 更为显著。那是由于甾醇具有较好的生理活性和表面活性，此取决于烃链与分子问的内 聚力和甾醇分子对c 1 9 上角甲基呈顺式的c 3 位b 型羟基的空间化学性质。甾醇具有 较强的皮肤渗透性和促进皮脂分泌、保持湿润和柔软的生理活性，因此甾醇具有防止皮 肤干燥和硬化以及使已角质化的皮肤恢复柔软的功能。 1 5 促进动物生长，增进健康作用 植物甾醇和植物生长激素与能在水中形成分子膜的脂质结合，生成植物激素。植物 甾醇核糖核蛋白，这种复合物具有促进动物性蛋白质合成功能，且增加了原植物激素 对环境温度、动物体温和体内分解的稳定性，因而是一种新型的动物生长激素。其中植 物甾醇主要指b 一谷甾醇，同时也包括菜油甾醇和豆甾醇。 1 6 抗癌作用 研究证明，植物甾醇对机体某些癌症的发生和发展有一定抑制作用，如乳腺癌、胃 癌、肠癌等。 乳腺癌：a w a d 等用含2 植物甾醇、胆甾醇的饲料饲养s c i d 小鼠1 5 d 后，在小鼠 靠近右侧腹股沟的乳腺脂肪垫处接种肿瘤，8 周后，两组动物体重和食物消耗量无差别， 但植物甾醇组小鼠的肿瘤直径仅为胆甾醇组的6 7 ( p 提取时间 微 波功率。 综合分析正交实验结果并考虑成本因素，确定最佳提取工艺条件为：微波功率为 4 2 0 w ，提取时间为6 0 s ，料液比为1 ；5 。 4 对比实验 采用超声波提取法和索氏回流提取法得到的提取结果与微波提取法的提取结果同 列于表2 5 。由表2 5 可见，与超声波法及索氏回流法相比，微波法提取菱角中甾醇类化 合物的提取时间由1 6 h 减少为6 0 s ，而提取量提高了1 3 左右。从节能、技术经济和资 源综合利用的角度来看，微波法优于超声波法和索氏回流法。 表2 5 对比实验 5 菱角中总甾醇含量的测定 按上述最佳条件，采用微波提取法对菱角壳和菱角仁样品中植物甾醇进行了提取， 其总甾醇含量的测定结果见表2 6 。 表2 6 总甾醇含量 6 回收率的测定 配置一定量浓度的甾醇标准样品溶液，按照上述方法进行回收率实验，平行三次测 定，所得结果见表2 7 。由表2 7 数据可以得到该方法的平均回收率为9 1 6 。 表2 7 回收率测定结果 ( 三) 小结 本文采用不同提取溶剂( 乙醇、石油醚、乙酸乙酯) 及方法( 水浴回流提取法，超 声波提取法，微波提取法) 对菱角中甾醇类化合物进行提取，并对提取工艺进行了优选， 以植物甾醇为检测指标，紫外分光光度法测定了总甾醇的含量，结论如下： 1 与超声波法及索氏回流法相比，微波法提取菱角中甾醇类化合物的提取时间由 1 6 h 减少为6 0 s ，而提取率提高了1 3 左右。从节能、技术经济和资源综合利用的角 度来看，微波法优于超声波法和索氏回流法。 2 微波提取甾醇的最佳工艺条件为：以9 5 乙醇为提取剂，在微波功率4 2 0 w ，料液比 l ：5 的条件下提取6 0 s ，提取次数为2 次。 3 影响微波提取甾醇的主要因素依次为：料液比 提取时间 微波功率。 4 在最佳提取条件下得到菱角皮中总甾醇含量为o 6 2 4 m g g ，菱角仁中总甾醇含量 为o 8 1 3m g g 。该方法的平均回收率为9 1 6 。 三、菱角中甾醇类化合物的初步分离与提纯研究 天然产物孛所会各类化合物缀多，缳戒复杂，因此在甾醇豹粮提物中常常瀛有其豫 种类的化合物，这种复杂的样品如果直接进行色谱分离将非常耗时、耗力，影响甾醇的 分离制备效果及其纯度。为毡本文分别采闵毫亿法和硅胶柱色谱法，对菱角中的甾醇粗 提物进行进一步的分离纯化，为用色谱法分离制备甾醇组分创造了条件。 ( 一) 实验部分 l 。主要仪器 电热恒瀑水浴锅( 北京长源实验设餐厂) r e 一5 2 从旋转蒸发器( 上海振捷实验设备有限公司) u v 一2 4 5 0 紫外可见分光光度计( 岛滓有限公司) s 舱一c 水浴恒温振荡器( 众坛市江南仪器厂) 硅胶分离拄( 2 5 0 2 5 黼) 2 试剂 。 氢氧化钾，乙醇，乙醚，无水硫酸钠，浓盐酸，硅胶g ，石油醚，乙酸乙酯，丙酮， 以上试剂均为分析纯。二次水( 臼制) 。 3 皂化法分离纯纯甾醇粗提物 3 1 分离流程 取一定量甾醇提取液，浓缩，加入8 0 l i l ll h l o l ，l 氨氧化钾一乙醇溶液，加热回流1 h ， 蒸去乙醇，加水缛皂化液。 用少量乙醚多次萃取臻化液，真至乙醚溶液无色，合并乙醚提取液，依次用水和5 k o 王溶液洗涤，震本洗至中性，羁收乙醚，然后用无水硫酸钠予燥，鼹至l 非囊佬液。 将非皂化液减压浓缩，定容，进行色谱分析。 4 硅胶柱色谱法分离纯化甾醇粗提物 4 1 硅胶的预处理 4 1 1 活化 将层柝蠲硅胶用浓盐酸浸泡过夜，然詹用蒸馏水洗至中性，干燥后予1 1 0 活诧2 h 。 4 1 2 装柱 将适量洗脱剂装入柱内，然稻将活化好的硅胶与适量洗脱液调成混悬液连续不断地 慢慢倒入柱内，同时将下端活塞打开，使洗脱剂慢慢流出，带动吸附剂缓慢沉于柱的下 端。待加完硅胶后，继续使洗脱剂流出，直到吸附剂的沉降不再变动，加压使硅胶装填 紧密。此时再在吸附剂上面加小片滤纸，将多余洗脱剂放出至高出吸附剂面1 c m 为止。 4 2 静态吸附最佳条件的确立 4 2 1 吸附、解吸计算公式 吸附率= ( c o c 1 ) ，c o r l 0 0 解吸率= 【c 2 ( c o c 1 ) r1 0 0 式中：c o 为初始溶液浓度，l g m l ； c 1 为硅胶吸附平衡后溶液浓度，m g m 1 c 2 为解吸液中溶液浓度，m g m l ： ( 1 ) ( 2 ) 4 2 2 最佳吸附时间的选择 称取硅胶5 0 9 ，加入3 0 m lo 2 5 m g m 1 甾醇标准溶液，振荡。每隔1 h 移取出2 m 1 上清液，测定吸光度，计算吸附率。以时间为横坐标，吸附率为纵坐标得静态吸附等温 曲线。 4 2 3 最佳吸附温度的选择 分别称取5 份硅胶( 各5 9 ) ，加入3 0 m lo 2 5 m g m l 甾醇标准溶液。分别在2 5 、3 0 、 3 5 、4 0 恒温条件下振荡3 h ，测定吸光度，计算吸附率。以温度为横坐标，吸附率为纵 坐标作温度与吸附率的关系图。 4 2 4 最佳硅胶用量的选择 称取0 2 、o 5 、o 8 、1 o g 硅胶，分别加入8 m 10 2 5 m g m 1 甾醇标准溶液，恒温振 荡3 h ，测吸光度，计算吸附率。以硅胶量为横坐标，吸附率为纵坐标作图。 4 3 静态解吸最佳条件的确立 称取硅胶4 0 o g ，加入6 4 0 m 1o 2 5 m g m 1 甾醇标准溶液，振荡3 h 使充分吸附。滤去 溶液后，称取吸附完全的硅胶5 o g ，加入不同类型的洗脱剂，在2 5 下振荡4 h 解吸。 测定解吸液的吸光度，计算解吸率。 4 4 实际样品的动态分离 依据静态分离条件，对甾醇粗提物进行动态分离。将甾醇粗提液置于分液漏斗中， 打开活塞迅速全部加于柱顶端。充分吸附后，将吸附饱和的硅胶用石油醚丙酮( 9 ：1 ) 洗 脱剂进行洗脱，控制流速在0 5 m l m i n 左右。收集洗脱液，进行色谱分析。 ( 二) 结果与讨论 1 皂化法分离纯化甾醇粗提物 粗提物中对甾醇测定产生影响的物质很多，由于甾醇类物质不会被皂化，因此可以 2 2 利用皂化的方法分离干扰测定的组分。非皂化组分( 主要为甾醇和烃类) 存在于液相中。 通过实验得出萃取4 6 次乙醚层已达到无色，可咀将皂化产物与非皂化产物完全分离。 2 硅胶柱色谱法分离纯化甾醇粗提物 2 1 吸附时间的确定 图3 1 为硅胶柱的静态吸附等温曲线。从图中可以看出，在卜2 小时内甾醇吸附较 快，2 4 小时吸附缓慢，在3 小时内吸附基本达到了平衡，随着时间的继续增加，吸附 率基本不变。吸附主要以物理吸附为主，伴随化学吸附的过程，进行较缓慢。该曲线符 合l a n g 叫i r 型曲线，属于单分子吸附类型。实验表明吸附时间以3 h 为宜。 图3 1 静态吸附等温曲线 2 2 吸附温度对吸附效果的影响 图3 2 为温度与吸附率的关系。实验中分别在2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 五个温度条件 下进行了吸附研究，从图中可以看出在3 0 时吸附率达到最高。对一定的吸附体系来说， 吸附剂对液体的吸附量r 为温度和溶液中吸附质浓度的函数，即r = f ( t ，c ) ，所以温度 升高有利于吸附量的提高，但吸附反应是放热反应，达到了吸附平衡后再升高温度，会 导致解吸速率加大，不利于吸附，因此吸附温度要适当。本实验选择在室温条件进行。 爨 褂 普 督 图3 - 2 温度对吸附效果的影响 2 3 2 3 硅胶用量对吸附率的影响 图3 3 为硅胶用量与吸附率的关系图。从图中可以看出，在样品浓度一定的条件下， 随着硅胶量的增加，吸附率变大，硅胶用量在1 0 0 一3 0 0 倍范围内吸附率变化较快，3 0 0 一5 0 0 倍范围内变化缓慢，几乎达到了平衡。这是因为对于一定量的吸附质来说，吸附剂用量 增大意味着吸附比表面增大，吸附质在吸附剂上的分布较松散，从而吸附剂对吸附质的 物理作用和化学作用加强，吸附量增加。但吸附剂用量过多会导致成本增高，吸附选择 性差，所以吸附剂的用量要适当。通过实验确定硅胶用量与吸附质比例为1 ：3 0 0 时达 到较好的吸附效果。 图3 3 硅胶量与吸附率的关系 2 4 洗脱剂种类对解吸率的影响 图3 4 为不同洗脱剂与解吸率的关系图。由图中结果可以看出，以石油醚乙酸乙酯 ( 1 1 ：1 ) 为洗脱剂时解吸率仅为6 1 4 5 ，以石油醚丙酮( 9 ：1 ) 为洗脱剂时解吸率达 到8 3 1 7 。 化合物经硅胶吸附之后，根据吸附能力强弱不同而选用不同的洗脱剂。溶剂的洗脱 能力主要取决于溶剂的极性，可根据溶剂的介电常数( ) 作大致判断。常用溶剂的介 电常数大小顺序是：水 甲醇 乙醇 丙酮 乙酸乙酯 乙醚 苯 石油醚。对于极性 吸附剂硅胶来说，溶剂的介电常数越大，极性也越大，洗脱能力就越强。因此，以石油 醚丙酮为洗脱剂时的解吸率要大于以石油醚乙酸乙酯为洗脱剂时的解吸率。 3 两种方法分离纯化甾醇的色谱图比较 将皂化法和硅胶柱色谱法分离纯化所得甾醇提取物进行液相色谱分析，色谱图如图 3 5 、3 6 所示。 石油醚乙酸乙酯石油醚丙酮 洗脱剂种类 图3 4 不同洗脱剂与解吸率的关系图 图3 5 皂化法分离纯化所得甾醇样品液相色谱图 图3 6 硅胶柱色谱法分离纯化所得甾醇样品液相色谱图 阳；0 一摹)|静蓉眭 比较图3 5 和图3 6 可以看出，经皂化法分离纯化后所得的甾醇样品舍有的干扰组 分较少，更易于进行色谱分析，因此本实验均采用皂化法分离纯化甾醇提取物。 ( 三) 小结 本章分别采用皂化法和硅胶柱色谱法对菱角甾醇粗提物进行了分离纯化，并通过液 相色谱图比较了两种方法的分离纯化效果。结果表明皂化法分离纯化后所得甾醇样品含 有较少的干扰组分，易于进一步进行色谱分析。 四、菱角中甾醇类化合物的薄层色谱分离研究 薄层色谱( t h i n _ l a y e rc l 啪m a t o g r a p h y ，t l c ) 又称薄层层析，出现在2 0 世纪4 0 年代，是一种液相色谱，通常是将固定相均匀地涂在玻璃、金属或塑料等表面上，形成 薄层，试样点在薄层的一端，流动相借毛细作用流经固定相，使被分离的物质保留在固 定相上。薄层色谱因一次性使用固定相，污染少，样品处理简单，流动相可选择范围宽， 展开时间短等特点，被广泛应用于天然有机化合物的提取分离中。本文通过选择极性不 同的展开系统，对菱角中提取出的甾醇化合物进行了研究。 ( 一) 实验部分 1 试剂 层析硅胶板( 硅胶g 。板，青岛海洋化工厂) 。植物甾醇标准品( 含b 一谷甾醇6 0 左右，西安蓝天生物有限公司) ；石油醚( 6 0 9 0 ) ，乙酸乙酯，甲酸，正己烷，乙 醚，甲苯，苯，乙醇，浓硫酸，以上试剂均为分析纯。 2 实验方法 2 1 展开剂的选择 参照文献中对天然产物中甾醇类化合物的薄层色谱分离研究，选择以下几种展开剂 系统。 ( 1 ) 石油醚：乙酸乙酯：甲酸( 5 ：1 ：o 0 6 ) ( 2 ) 正己烷：乙醚( 7 ：3 ) ( 3 ) 甲苯：乙酸乙酯( 4 ：1 ) ( 4 ) 苯：乙酸乙酯( 9 ：1 ) 2 2 提取物的薄层展开实验 2 2 1 硅胶板的活化预处理 取1 0 0 2 0 0 m m 的硅胶g 层析板，在使用前放入烘箱，在1 1 5 左右活化1 h 。 2 2 2 薄层实验 分别取甾醇标准溶液及提取液1 0ul ，在硅胶板距下端1 c 左右处用毛细管点样针 点样，待点样点晾干后分别置于上述展开系统中，待溶剂前沿离薄层板顶端1c m 左右时 将硅胶板取出，晾干。喷1 0 的硫酸乙醇溶液，于1 0 5 烘箱种烘烤4 m i n ，观察斑点的 颜色及分离情况。计算比穆值。 比移僮r f = 原点中心至斑点中心的距离艨点中心至溶荆前沿的距离 ( 二) 结果与讨论 1 展开剂的选择 展开剂即展开所用的溶剂系统，也称流动相。展歼剂的主要任务是溶解被分离的物 质、在吸附刻上转移被分离物质，搜各组分的r f 僮在o 2 o 8 之闻，并融被分离物矮 要有适当的选择性。展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂。对于难分离的化合物， 经常要用二元或三元甚至多元溶帮组成的混合展开荆。垂予菱角中提取所得的搽醇样菇 组成较复杂，因此逸择二元或三元展开体系进行实验。 图4 一l 为菱角皮乙醇提取液在不同展开剂中的薄层色谱图。通过比较样品在4 种展 开剂中的展开效果可以看出，在第l 、2 、4 种展开系统中，样品没有被分开，在甲苯： 乙酸乙酯( 4 ：1 ) 展开系统中，样品的分离效果较好。 l234 图4 一l 菱受皮乙醇提取渡在不同震开剂中的薄层色谱图 2 样品的薄层色谱分离 在吸附薄层色谱法中，样品的分离是由于不同组分与吸附剂的吸附解吸能力不同引 起豹，分离效果主要决定予吸附荆的极性、吸驸剂的活度和被分离物质的极性。 图4 2 、图4 3 和图4 4 分别为不间提取方法所得样品的薄层色谱分离图。从图中 结果可以看出，采用不同提取方法所褥提取物均在与对照晶相应位置出褒相同颜色斑点 ( 斑点呈淡红色，底板呈蘸黑色) ，说明其中均含有甾醇类化合物。对比三种方法所得 提取物的薄屡色谱醋还可以看出，微波法提取所得样品中所含有效成分最多。 1 甾醇标样2 菱角皮乙醇提取液 3 。菱角仁乙醇提取液4 菱角皮石油醚提取液 图4 2 索氏回流法提取所得甾醇样品薄层色谱图 ilfi 一一一一一 l 2 3 4 1 甾醇标样2 菱受皮乙醇稳取液 3 。菱角仁乙醇提取液4 菱角皮石油醚提取液 图4 3 超声波法提取所得甾醇样品薄层色潜图 小n n 一 123 1 甾醇标样2 菱角皮乙醇提取液3 菱角仁己醇提取液 图4 4 微波法提取所得甾醇样品薄层色谱图 表4 1 、4 2 、4 - 3 为菱角提取物薄层色谱分离实验的r f 值，均在0 2 0 8 范围内， 效果较好，般来讲，在吸附薄层上物质的r r 值与物质的极性有关，极性小的物质往 往走在前面，r f 值较高；反之极性大的物质rr 值较低。从图中斑点及r f 值可以看h ， 甾醇在提取物所含成分巾r f 值较小，擞性较人。这也可以为f 一步的色谱分析作指导。 表4 1 索氏提取甾醇的薄层色谱r f 值 样品编号 1234 r f 值 o 5 0 30 4 9 70 5 0 3o 4 9 7 0 6 2 4o 6 2 7 o 6 8 5o 6 9 4 表4 2 超声波提取甾醇的薄层色谱r f 值 样品编号 1234 r f 值 0 3 5 5o 3 4 0o 3 5 80 3 3 3 o5 1 20 5 0 6 o 5 9 6 表4 3 微波提取瑙醇的薄层色谇竿卧值 样6 编号 123 r f 值 0 4 6 90 4 6 104 7 3 o 5 7 9o 5 8 3 o6 2 8 ( 三) 小结 1 通过比较不同展开剂体系对样品的分离效果，优进出摄侍展开剖体系甲苯：乙 酸乙酯( 4 ；1 ) ，定性鉴定了箔醇类化合物的存在。 2 利用此展丌系统，分别对不同提取方法得到的剐醇提取物进行了薄层色谱分析， 进一步证明了微波法提取掰醇所古有效成分较多。并确定了甾醇类化合物的极性，为甾 醇样品的分析制备提供了选择流动相的依据。 五、高效液相色谱法分析菱角中的甾醇类化合物 高效液相色谱法( h i 曲p e 晌m a n c el i q u i dc h m m a t o g r a p h y ，h p l c ) 是2 0 世纪6 0 年代中期吸收了普通液相色谱和气相色谱的优点，经过适当改进之后发展起来的。当各 组分从检测器中流出时，由于检测过程是非破坏性的，经过检测的洗提液可以依次收集 起来，挥去溶剂制成纯品。本章利用高教制备液相色谱对菱角提取物中的甾醇类化合物 进行了分析研究。 ( 一) 实验部分 1 主要仪器 l c 8 a 高效液相制备色谱仪( 日本岛津) ，包括：l c 一8 a 高压输液泵；s l c 一8 a 控制 系统；s i l 一8 a 自动进样器；s p d 一6 a v 紫外一可见检测器( 1 9 0 一8 0 0 n m ) ；cr 7 a 记录打印 系统。 s y z _ b 型石英亚沸高纯水蒸馏器( 江苏宜兴新建勤华石英玻璃仪器厂) s b 3 2 0 0 型超声波提取器( 上海，b r a n s o n ) 2 试剂 甲醇，无水乙醇均为优级醇。二次水( 自制) 。 3 色谱分析条件 色谱柱：h r c o d s 拄( 1 5 0 i 工啪4 6 m mi d ) 流动相：a 一二次水，b 一甲醇( 进行等度洗脱) 流动相流速：a o0 4 1 1 1 i m i n ，b o 9 6 m i m i n 检测波长：2 1 0 衄 柱温：室温( 2 2 2 6 ) 进样量：1 0 p 1 4 甾醇的定性与定量分析 4 1 定性分析 分别取2 m g m l 酯醇标样溶液及甾醇提取样品进行高效液相色谱分析，以保留时间 为定性指标进行定性分析。 为定性指标进行定性分析。 2 定量分析 2 1 线性回归方程的建立 分别精密量取2 m g m l 的对照品溶液o 2 ，o 6 ，1 o ，3 o ，5 o ，l o o ，1 5 0 ，2 0 o 斗1 ， 挠行高效液相色谱分析，测得其峰面积值，以峰面积值a 对进样量c ( ) 进行阐归， 导线性回归方程。 2 。2 甾醇含最测定 分剐取菱角皮及菱角仁的甾酵提取液各1 0 眦，进行高效液相色谱分析，测得其峰面 只值，代入线性回归方程，得出其中甾酵含量。 精密度测定 用上述色谱分析方法平行测定菱角皮及菱角仁提取液各5 次，分别求得甾醇含量， 臣均值及r s d 僮。 ( 二) 结果与讨论 最佳色谱分析条件的选择 l 色谱桂的选择 由于甾醇结构上带有羟纂基团，因而具有亲水性，并且甾醇易溶于多种有机溶剂。 ；合实验条件，教采用反相色谱柱。 ，2 漉动捆组成及配比的选择 根据待分离的样品的特性，选用不同的改性剂，以使流动相在满足一定的分离度的 目提下，极性适当，浚脱能力强，糖度低，且安念毒性小等。为此我们考察了甲醵，乙 g ，两种溶剂的特性以及它们分别与水组成的流动相的极性等物质。三神溶剂体系的物 性质参数列于表5 一l 。 表5 一l 苓丽溶帮靛特性参数比较 参数 溶剂强度参数 极性参数糙度溶解度参数 溶八 s o 6 n 水 2 11 0 2o 8 9 甲醇o 9 51 2 95 10 。5 4 乙腈 0 6 51 1 85 8o 3 4 o 表示溶剂的洗脱强度，eo 值越大，溶剂与吸附剂的亲和能力越强，越易从吸 玎萼裁上将被吸附豹溶质洗脱下来，都对溶质靛洗脱能力越强，扶蔼使溶质在固定捐上 拘容量因k 愈小。溶解度参数6 是溶剂与溶质分子间作用力的总量度，在反相液液色 簧中，溶剂的6 值愈大，其洗脱强度愈小，会使溶质在固定相的容量因子k 变大。p 3 2 是极性参数，既麓表示每种溶剂的洗脱强度豹大小，又能反映每种溶剂豹选择经。在 反相液液分配色谱中，p7 值愈大，洗脱强度愈小，被洗脱溶质的容量因子k7 愈大。粘 度系数r i 是影响色谱分离的主要参数，当溶剂的秸度大时，会降低溶质在流动相中 的扩散系数及在两相问的传质速度，并降低了柱子的渗透性，导致柱效的下降和分析 时间的延长。综合考虑以上因紊并参照文献，我选用水一甲酵体系作为流动相。改变 滚动相中水和甲辞的配比，流动相的性质睫之改变。表5 2 给出了流动相的极性和 粘度随甲醇和水的配比改变而变化的情况。 表5 2 不同比例溶剂的极性和粘度的比较 流动相中甲醇与水的配比( v v ) 参数 0 9 6 ：0