（分析化学专业论文）用于α氨基酸检测的新型手性电化学传感器研究.pdf

复a 大学硕卜 文摘要 摘要 手性识别是一种特殊的分子识别。手性识别研究不仅在理论上有助于阐述生 命过程的化学本质和发现新的化学过程；而且在对映体拆分、新药合成、生物传 感器、光电分子器件等方面都具有广泛的应用前景。因此，发展高效的对映体检 测方法，对于推动手性识别的研究具有重要的意义。 本文针对手性识别过程中存在痕量的氨基酸对映体不纯难以检测的问题，研 究旨在发展高选择性、高灵敏度的电化学传感器，以达到提高氨基酸对映体的检 测纯度要求。我们尝试以手性蛋白抗体和手性聚苯胺纳米纤维作为手性选择剂， 分别发展了两种有效的手性识别方法。全文共分为三章，其主要内容如下： 第一章对手性识别的历史及其分离分析方法作了简要的介绍。手性是自然 界中最重要的属性之一，其重要性已经得到整个科学界的认可。目前被普遍认可 的手性识别机理是“三点作用”模型。根据手性选择剂的不同，主要可分为配体 交换、环糊精、手性冠醚、大环糖肽、蛋白质、高分子聚合物和n 一配合物等七 种类型。常用的手性分析技术包括气相色谱，液相色谱等分离技术和圆二色谱， 核磁共振，传感器等。常规的手性分析方法，存在操作费用高、耗时、检测线低 等缺点。我们针对上述存在的不足，发展具有高效、灵敏、操作简单的新型电化 学手性传感器，能够在氨基酸对映体中快速检测的痕量不纯。 第二章建立了一种高立体选择和高灵敏的免疫电容传感器，可用于识别手 性氨基酸。这种传感器的制备首先利用巯基乙酸子组装在金电极表面，经碳二亚 胺活化后进一步共价修饰酪胺，最后将半抗原( 禾氨基d - 苯丙氨酸) 通过重氮 化反应共价固定在电极上。d 氨基酸抗体( a n t i d a a ) 与电极表面固定的半抗原 发生立体选择性地结合，会产生相应的电容变化。采用高灵敏的电位阶跃方法 检测电容变化，检测限可达到5p g m l 的d 氨基酸抗体。此外，利用手性抗体 这种独特的立体选择性采用免疫竞争法，可定量检测非对映体中d 苯丙氨酸的 含量。研究表明采用这种非标记电容免疫手性传感器可以在痕量对映体不纯检测 中有效识别0 0 0 1 的d 苯丙氨酸。 第三章研究报道了可用于识别氨基酸对映体的手性聚苯胺纳米纤维传感 器。这种手性聚苯胺纳米纤维通过两相界面法合成，经过圆二色谱、透射电镜进 行表征。在荧光淬灭实验中，相对于衍生化d 苯丙氨酸，( + ) 聚苯胺导致的衍 复日大学硕r 论文 摘要 生化的l 苯丙氨酸的荧光淬灭更加显著，其选择系数为k 胡幻= 1 5 。同时，电化 学实验中，手性聚苯胺纳米纤维修饰碳电极对衍生化的【广苯丙氨酸的电流响应 值高于对衍生化的d 苯丙氨酸的电流响应值。为了更好的研究手性聚苯胺对氨 基酸的识别性能，在氨基酸的邻苯二甲醛巯基乙醇衍生实验中，还对衍生化条 件等进行了优化选择。 关键词：手性识别，手性免疫传感器，手性聚苯胺纳米纤维，电容免疫传感器 复口大学硕 论文 a b s t r a c t a b s t r a c t c h i r a ld i s c r i m i n a t i o ni sas p e c i a lk i n do fm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n t h es t u d yo f c h i r a lr e c o g n i t i o nn o to n l yt h e o r e t i c a l l yi l l u s t r a t e st h ee s s e n c eo fc h e m i s t r yi nt h ev i t a l p r o c e s s ，b u ta l s oe x h i b i t sp o w e r f u lp o t e n t i a li nm a n ya r e a s ，s u c ha sd i s c o v e r yo fn e w d r u g s , a s s u r a n c eo fp h a r m a c e u t i c a ls a f e t y , p r e p a r a t i o no fn o v e lb i o s e n s o r sa n d c r e a t i o no f o u t s t a n d i n gp h o t o e l e c t r o n i cd e v i c e t h e r e f o r e ， e n a n t i o m e r i c d i s c r i m i n a t i o ni sv e r yi m p o r t a n tf o rt h ec h i r a ld i s c r i m i n a t i o n i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，i no r d e rt od e t e r m i n et h ep u r i t yo fa m i n oa c i de n a n t i o m e r s ， w ei n v e s t i g a t e dt h ec h i r a lr e c o g n i t i o np r o c e s sb ym e a n so fe l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s ， a n dg o ts o m es a t i s f a c t o r yr e s u l t so nt h ee s t a b l i s h e dt w oa n a l y t i c a ls y s t e m s t h e d i s s e r t a t i o ni n c l u d e st h r e ec h a p t e r s , a n dt h e ya r ea sf o l l o w i n g i nc h a p t e ro n e ，w eb r i e f l yr e v i e w e dt h ei m p o r t a n c eo fc h i r a lr e c o g n i t i o n ， s u m m a r i z e du ps o m ea n a l y t i c a lm e t h o d sr e p o r t e di n t h i sa r e a , p o i n t e do u tt h e i r a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e sa n dp r o p o s e d o u ro r i g i n a lr e s e a r c hs c h e m ea n d m e t h o d s i n c h a p t e rt w o ，w e d e s c r i b ea h i g h l y e n a n t i o s e l e e t i v ea n ds e n s i t i v e i m m u n o s e n s o rf o r t h ed e t e c t i o no fc h i r a la m i n oa c i d sb a s e do nc a p a c i t i v e m e a s u r e m e n t t h es e n s o rw a sp r e p a r e db yf i r s tb i n d i n gm e r c a p t o a c e t i ca c i dt ot h e s u r f a c eo fag o l de l e c t r o d e , f o l l o w e db ym o d i f i c a t i o nw i t ht y r a m i n eu t i l i z i n g c a r b o d i i m i d ea c t i v a t i o n t h eh a p t e n4 - a m i n o - d p h e n y l a l a n i n ew a st h e nc o v a l e o t l y i m m o b i l i z e do n t ot h ee l e c t r o d eb yd i a z o t i z a t i o n s t e r e o s e l e c t i v eb i n d i n go fa n a n t i - d - a m i n oa c i da n t i b o d yt ot h eh a p t e n - m o d i f i e ds e n s o rs u r f a c er e s u l t e di n c a p a c i t a n c ec h a n g e st h a tw e r ed e t e c t e dw i t hh i g hs e n s i t i v i t yb yap o t e n t i o s t a t i cs t e p m e t h o d u s i n gc a p a c i t a n c em e a s u r e m e n t , d e t e c t i o nl i m i t so f5p go fa n t i b o d y m l w e r ea t t a i n e d t h ee x q u i s i t es t e r e o s e l e c t i v i t yo ft h ea n t i b o d yw a sa l s ou t i l i z e di na c o m p e t i t i v es e t u pt oq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o no ft h ea n a l y t e d - p h e n y l a l a n i n ei nn o n r a c e m i cs a m p l e sc o n t a i n i n gb e t he n a n t i o m e r so ft h i sa m i n o a c i d t r a c ei m p u r i t i e so fd p h e n y l a l a n i n ea sl o wa s0 0 0 1 c o u l db ed e t e c t e d i nc h a p t e rt h r e e ，c h i r a ip o l y a n i l i n e “+ ) c p a i , oc o u l dd i s c r i m i n a t et h ed e r i v a t e 复口大学硕十论文 a b s t r a c t d l - p h e ( o p a l - p h e ) b yf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ga n de l e c t r o a n a l y t i c a lm e t h o d s o p t i c a lp o l y a n i l i n ew i t hn a n o f i b e r ss t r u c t u r ew e r es y n t h e s i z e db yi n t e f f a c i a lm e t h o d a n dc h a r a c t e r i z e db yc i r c u l a rd i c h r o i s ma n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o m i c r o s c o p y i tc o u l d r e s u l ti nm u c hm o r ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gt oo p a - l - p h et h a no p a d p h e ，t h e s e l e c t i v ec o e f f i c i e n tkw a s1 5 a d d i t i o n a l l y , ( + ) - c p a nw a sm o d i f i e do ne l e c t r o d e a n di t o ，a n ds t u d i e dt h er e c o g n i t i o no fp h eb yt h ea m p e r o m e t r i cm e t h o d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ec u r r e n tr e s p o n s eo fl - p h ew a sh i g h e rt h a nd p h e t h ec o n d i t i o n so f t h ed e r i v a t i o nw e r es t u d i e di no r d e rt ob e t t e rr e s e a r c ht h ed i s c r i m i n a t i o no fp h e k e y w o r d s ：c h i r a ld i s c r i m i n a t i o n ，c n a n t i o s e l e c t i v e i m m u n o s e n s o lo p t i c a la c t i v e p o l y a n i l i n e ，c a p a c i t i v ei m m u n o s e n s o r 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：更生美 论文使用授权声明 日期：乏! 里z 笪! 应 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：二泄导师签名：独日期： 复巨大学硕十论文第一幸 第一章前言 1 手性的概念 所谓手性是指因碳原予连接的4 个原子或基团在空间排布上可以以两种形 式形成不同结构的对映体，互成镜像，彼此对称但不重合。同一化合物的两个对 映体可使偏振光向相反的方向偏转，故又称光学异构体或光学活性化合物，现在 则称为手性化合物。简单的说，手性就是指一个物体不论是通过平移或者旋转都 不能与其镜像重合的性质【1 】，如f i g 1 所示。 f i g 1t h ec h i r a i t yo fe n 蚰t i o m e r s 手性是自然界中最重要的属性之一。作为生命活动重要基础的氨基酸以及生 物大分子，譬如蛋白质、多糖、核酸等，几乎全是手性的。其中，组成蛋白质的 2 1 种必需氨基酸都具有相同的手性特征l 型构型；而碳水化合物大多具有d 型构型【2 l 。近来，人们发现在各种各样的蔬菜和水果中也存在着一些d 型的氨基 酸，如在新鲜的植物汁中存在着o 6 - 3 8 的d 一丙氨酣】。由于生物分子普遍 具有手性的现象，因此，在生命活动中分子手性识别将起着极为重要的作用。 复日大学硕 论文第一章 2 手性研究的现状 早在十九世纪初期，人们就观察到手性现象。l o u i sp a s t e u r 首先在1 8 4 8 年， 采用手工方法分离出单一的手性异构体，即结晶态的酒石酸钠盐的对映异构体 【5 j 。目前手性科学和技术研究已经引起科学界与工业界高度关注，并成为国际科 学家研究的热点。在二十世纪的最后二十年里，手性科学受到了科学界的普遍重 视，为此专门创刊了两本学术杂志手性( c h i r a l i t y ) 和四面体：不对称 ( t e t r a h e d r o n ：a s y m m e t r y ) ，而且，定期分别在美国和欧洲召开一次美国手性 ( c h i r a lu s a ) 和欧洲手性( c h i r a le u r o p e ) 国际专题研讨会。2 0 0 1 年1 0 月1 0 日，瑞典皇家科学院宣布将2 0 0 1 年诺贝尔化学奖一半奖金授予美国科学家威 廉诺尔斯与日本科学家野依良治，以表彰他们在“手性催化氢化反应”领域所 作的贡献；奖金的另一半授予美国科学家巴里夏普莱斯，以表彰他在“手性催 化氧化反应”领域所作的贡献。他们的成就，可以用一个共同的词语概括“手 性催化”。手性催化其实只是手性技术的一个组成部分，这充分反映了社会对科 学家们从事手性技术研究的肯定1 6 l 。 在非手性环境中，手性异构体被看作是同一物质。但是在手性环境中，特别 是手性化合物相互作用时，手性对映异构体往往表现出不同的特性，有时甚至表 现出截然相反的性质，可以认为是两种不同的化学物质闭。例如，r 一天门冬酰 胺是甜味的，是优良的甜味剂，而s 天门冬酰胺却是苦味的。香芹醇是r 构型 的，具有薄荷香味，而其s 对映体却具有霉味。农药氰戊菊酯有两个手性碳原 子，共有四个手性异构体，其中【s ，s 】型具有高的杀虫活性。而【r r 】型的对映体 不仅杀虫活性低，而且对作物的叶子有白化药害。 对于手性药物而言，即使是微量的对映体不纯，也可能引起严重的药物和毒 理的副反应。最典型的例子就是“反应停( t h a l i d o m i d e ) 。2 0 世纪5 0 年代中期， 德国c h e m i eg u n e nt h a l 公司以消旋体上市的t h a l i d o m i d e , 作为镇痛剂用于预防 孕妇妊娠期的恶心生理反应。研究发现，怀孕后3 个月服用此药会引起胎儿海豹 畸形。据统计，由“反应停”导致畸形的案例，全世界有1 7 0 0 0 多例，是上个世 纪最大的药害事件之一。直到1 9 7 9 年，德国波恩大学研究人员对该药进行了研 究和拆分，发现只有r 型对映体具有镇痛药效，而s 型对映体非但没有这种药 效，反而具有致畸的毒害作用1 6 】。因此，美国f d a 在1 9 9 2 年发布的手性药物l 临 2 复巨大学硕 论文 第一帝 床研究指导原则中规定，在美国上市的所有消旋体类新药，申报者必须提供药物 中所包含对映体的各自的药理作用、毒副反应和临床效果的报告。对已批准的消 旋体药物的单一异构体可考虑认定为新的化学实体【“。 手性技术研究及手性药物开发已经发展成为当今世界新药发展的重要领域。 目前单一对映体药物在新药市场的分额已由十年前的一2 0 上升为- 7 5 ，年销售 额就已超过1 6 0 0 亿美元【2 l o 美国f d a 在1 9 9 8 2 0 0 1 年期间，给出了如下数据： 5 2 是非手性的，3 0 是单一对映体且具有多个手性中心，7 是单一对映体具有 一个手性中心，4 是混合非对映体 8 1 。英国给出的1 9 9 6 2 0 0 0 年数据分析表明了 相似的情况。到2 0 0 3 年，9 0 的热门市售药品是手性物质，其中6 0 以上是单 一对映体药物。越来越多的事例表明，立体化学纯药物的应用是更加有利的，因 为这将减少药剂总量、简化药剂响应关系、排除分子相互作用的可变性以及达到 毒害作用最小化。这些药物被分离成单一对映体后，所预期的药效会得到响应的 提高【1 0 1 。 手性识别研究不仅对进一步从理论上阐述生命过程的化学本质，发现新的化 学过程具有重要理论意义，而且还在对映体拆分，新的特效药及药物载体的发现， 生物传感器以及贮藏、输送能量、信息处理的光电分子器件等方面展示了诱人的 应用前景。因此，对映体的拆分与识别对于生命科学和药物化学研究以及人类的 健康具有十分重要的意义【1 1 】。 3 手性识别原理 手性识别是通过手性选择剂( 主体分子) 对被研究的手性化合物( 客体分子) 进行选择性识别或结合的过程，以达到手性化合物识别、分析或分离的目的。手 性识别的关键是一对对映体分子分别与手性选择体生成两种不同的非对映体化 合物。由于形成的这两种非对映的“对映体手性选择体化合物”具有不同的g i b b s 能量，从而使得手性识别得以实现。1 9 3 3 年，e a s s o n 和s t e d m a n 在研究定量化 结构与活性关系( q u a n t i t a t i v es t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ) 时，认为只有当不对 称药物和目标分子之间的三点作用能量达到最小化，才能形成最稳定的化合物。 一般只有其中一个对映体药物分子可以跟目标分子形成最稳定化合物，这就可以 解释一对不对称药物之间不同的生理活性【1 2 1 。1 5 年后，o g s t o n 在手性酶反应研 3 复口大学硕f 论文 第一章 究中运用了这种三点作用模型【1 3 】。后来，d a l g i e s h 将其应用到薄层色谱t l c 研 究中i 州。这个模型解释了两个对映体与手性选择体发生“三点作用“时，会发 生不同的结合作用。f i g 2 a 表明，一个对映体具有的三个取代基团能够同时跟手 性选择体的三个位点以最佳方式发生相互作用。而它的镜像分子不管如何旋转， 如f i g 2 b ，都最多只能跟手性选择体的两个位点相作用嘲。 f i g 2t h et h r e 圮p o i n ti n t e r a c t i o nm o d e l d a t ao b t a i n e df i o ma r t i c l e5 在最初的三点作用模型中，一般认为所有( 三个) 反应位点的相互作用都是 吸引力。三点作用模式的关键在于，必须至少同时发生三种相互作用，同时要求 对映体分子的立体中心至少存在三个不同的取代基团。从现代分离观点看，尽管 排斥力和吸引力是相对的，但是，从立体化学来看，排斥力和吸引力一样需要考 虑。例如，如果其中一个位点有很强的吸引力，其足以能够促使形成至少一个可 能的非对映的“配合物”， 尽管其它两个位点表现出排斥作用【1 5 】。如果三个位 点的作用都是吸引力，那么对映体将必然牢固的与手性选择体相结合。取代基团 的两种不同的作用力只会增加“选择体配合物“的能量，不会影响手性效率。 4 复巨大学硕士论文 第一章 3 1 手性识别过程中的分子间相互作用 两个对映体和手性选择体之间的分子作用，包括库仑力，氢键作用力，眦 相互作用，以及分子间离子偶极作用，偶极一偶极相互作用和偶极诱导偶极作用 等，如表1 所示。 t a b l e1 c h a r a c t e r i s t i c so f m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n s f r o ma r t i c l e5 作用力强度方向范围( d ) 库仑力很强吸引或排斥 中( 1 d 2 ) 氢键很强吸引 长 空间位阻很强排斥 很短 丌玎 强吸引或排斥中 离子偶极作用 强吸引短 偶极偶极相互作用瞬时吸引 短( 1 d 3 ) 偶极诱导偶极作用弱 吸引 很短( 1 ，d 6 ) 伦敦力或范德华力很弱吸引 很短( 1 西 其中，库仑力是最强的作用力( 例如，盐具有很高的内聚力) 。氢键作用力 存在于氢氧基中带正电荷的氢原子与氢氧基中带负电的氧原子或氨基基团中带 负电荷的氧原子或氮原子之间。氢键作用力很强，因为负位点跟氢原子牢固地结 合，耗掉了残余的排斥电子。空间位阻取决于每个原子或原子基团的本质大小， 是排斥性的，并且在短距离内非常强。 肌相互作用：当具有舻电子的分子( 主要是芳环) 聚集的时候，能够发现 丌丌相互作用。当它的取代基团是富电子基团时，芳基结构是“受体，或一 酸，主要是n 0 2 基团。当它的取代基团是缺电子基团时，比如萘基，就是丌给 体，或碱。在手性识别机理中，作用非常受人关注。对映体中的一个丌 受体基团可以与手性选择体中的n 给体基团作用。 在极化环境下，分子间会存在离子一偶极作用，偶极偶极相互作用和偶极诱 导偶极作用。离子和带有部分电荷的极化分子之间的最强的是离子偶极作用，之 所以具有吸引性是因为稳定的偶极结构包括部分正电荷和等量的负电荷。同样的 复口大学硕十论文 第一章 原因，偶极。偶极相互作用也是吸引性的，尽管它比离子偶极作用弱。稳定的极 化分子和由电场诱导产生的偶极是相对较弱的。范德化力是分子间作用力最弱 的。 3 2 常用的手性选择剂及其手性识别机制 对映体的分离总是包含手性选择剂，即一种纯手性试剂与手性分子的相互作 用，这是手性分离和手性识别的理论基础1 5 1 。一般来说，主客体之间产生手性识 别作用，必须具备以下4 个基本条件：1 ) 主客体之间必须存在非共价键作用力 的协同作用，如氢键、疏水作用、范德华力等，而且其中有一种作用必须与手性 相关。2 ) 当主客体之间发生相互作用时，主体的手性基团与客体分子之间立体 效应对手性识别产生极大影响，因此手性基团大小适当极为重要。3 ) 主体必须 具有适当的刚柔性。当主体分子的柔性过大，经过自身构像的调整，既能配合 r 构型的客体，又能配合s 构型的客体，也不能产生手性识别。4 ) 主客体大小 尺寸几何形状的互补，在识别过程中也起至关重要的作用【1 1 l t a b l e 2c i l i r a ls e l e c t o r sa n dt h em e c h a n i s m 手性选择体反应机理主要作用力 配体交换非对映异构体选择体金属离子分析化合物库伦力或取向力 环糊精 包含配合物氢键 手性冠醚包含性配合物离子极化 大环糖肽多重结合位点各种作用力 蛋白质多重结合位点各种作用力 多糖衍生物螺旋状结构 氢键、偶极性或空间位阳 高分子聚合物非对映异构的选择体分析物 氢键 配合物瞬时的三点作用，选择体分析物结合 了【 分子印迹聚合物分子印记特异性结合与印迹形状相关 手性选择剂的种类繁多，发展迅速。自从1 9 6 6 年，g i l - a v 等人首次介绍了 可再生性n - 三氟乙酰基l 异亮氨酸十二烷醇酯作为气相色谱手性固定相后，已 经发展了大量的手性选择刹1 6 。常用的手性选择剂包括配体交换，环糊精，手 性冠醚，大环糖肽类抗生素，蛋白质大分子以及手性聚合物等多种类型。我们对 这些常用手性选择剂的反应机理和主要作用力进行了简单总结，如表2 所示。 6 复臣大学烦 论文第一章 ( 1 ) 配体交换( l i g a n de x c h a n g e ) 手性配体交换色谱是d a v a n k o v 等人在1 9 世纪6 0 年代末7 0 年代初提出来 的，用于分离外消旋化合物【1 7 。2 0 1 。它能很好的分离手性天然产物和合成产物，例 如1 1 氨基酸、羟基酸、氨基醇等，是最早的液相色谱技术。h a m i l t o n 等研究合 成的金属铜配合物，两个邻二氮杂菲配体与一价铜离子作用后形成带有两个氨基 甲基吡啶的配合体，再以合适的结构与二羧基酸作用形成配合物，如图f i g 3 。这 种配合物的手性属性已经通过1 h n m r 光谱得到证实【2 1 2 2 1 。这类手性配体交换 的基本机理是，在合适的条件下，金属离子如c u ( i i ) 与对映体和手性选择体作用 形成三重配合物，其手性选择性在于三重配合物的热力学稳定性不同，分析物 r s 型对映体形成的三重配合物热力学稳定性差别非常大，使得两种对映体得以 分开。手性配体交换可以跟电迁移分离技术、色谱技术联合使用。利用配体交换 技术，s c h m i d 和g u b i t z 成功的在电泳技术中分离了十种未修饰的芳环氨基酸外 消旋体，此实验结果表明，所有的d 型对映体都比l 型对映体移动的快i 矧。 、p o 酉1 0 巴 心, 0 0 、q f i g 3a s s e m b l yo ft h et w op h e n a n t h r o l i n e a l m s a r o u n dac o p p e ri o nb r i n g st w o a m i d o p i c o l i n em o i e t i e si n t oas u i t a b l ec o n f i g u r a t i o nf o rb i n d i n gd i c a r b o x y l i ca c i d s d a t ef r o ma r t i c l e2 2 ( 2 ) 环糊精( c y c i o d e x t r i n c d ) c d 是一类由不同数且的互为倚式构象吡喃葡萄糖单元以o 1 ，4 - 糖苷键键 7 复日大学碗十论文 第一章 连而成的环状低聚糖，常见的为6 ，7 ，8 聚体，即q ，p ，y c d ，其具有截锥 式的圆形空腔构型笼状结构。环糊精分子中的葡萄糖单元在2 ，3 位有仲羟基， 它们排列在圆筒形空腔的大口端，6 位有伯羟基，它们位于空腔的小口端，因此， 内部电子云密度较高，具有疏水性，而外部具有亲水性。每个葡萄糖单元具有5 个手性中心，由n 个葡萄糖单元组成的c d 就具有5 n 个手性中心，为手性识别 提供了良好的手性环境。c d 作为手性固定相对手性物质的选择性主要受到空穴 大小，环糊精( d ，8 ，y c d ) 的含量以及2 ，3 ，6 - 位置上葡萄糖取代的影响 【矾瑚。为了实现手性分离，手性化合物分子必须进入环糊精分子疏水性的空腔内， 其极性基团必须与环糊精分子空腔边缘的羟基发生氢键作用。因此，c d 及其衍 生物作为手性选择剂，首先会与大小，立体构型合适的手性分子形成主客体包合 物，然后利用对映体与c d 所形成的包合物的稳定常数不同进行分离。据统计， 在2 0 0 1 年1 月份至2 0 0 4 年的1 月份期间，环糊精作为手性固定相，在气相色谱 中用于识别分离手性物质的比例几乎达到了9 0 【1 7 1 。s i c f a n - v a ns t a d e n 等基于 c d 制备了一种具有立体选择性的电势膜，研究了环糊精从d 组氨酸中识别l 广 组氨酸1 2 6 j 。 f i g 4t h es t r u c t u r eo fc y c l o d e x t r i n 8 复日人学硕 论文 第一章 ( 3 ) 手性冠醚( c r o w ne t h e r s ) 冠醚是大环聚醚类物质，分子结构为中间是空穴的平面结构，其空穴能跟离 子化的氨基n h 3 + 相匹配吼因此分离对映体的机制与环糊精相似，即能与分子 大小相当的客体分子形成包含物。此外，必需的两种分子间作用是空间位阻和疏 水作用，这发生在冠醚取代基和客体分子取代基之间。手性冠醚分子只能在低 p h 的时候识别带有氨基基团的手性分子【5 1 。这类化合物中1 8 冠6 四羧酸可分离 氨基酸、多巴胺、二肽等多种含氨基的对映体。1 8 冠6 四羧酸分子含有6 个通 过乙烯桥结合的氧原子，手性识别是通过4 个垂直于平面的羰基实现的，它的环 内腔通过氢键等作用，能够与铵离子及伯胺离子形成包合物，从而使对映体得以 分离。k c i ih i r o s e 等研究发现1 8 冠6 四羧酸作为手性固定相能够有效识别2 5 种氨基化合物、2 0 种氨基酸、5 种氨基醇和2 种亲脂性胺吲。 ( 4 ) 大环糖肽类抗生素 大环糖肽类抗生素含有多个手性中心、氢键基团、芳香环及疏水篮状结构， 各基团之间相互靠得很紧，可以提供手性识别所需要的各种相互作用。此外，这 类物质除了具有疏水性，还有亲水性，在一定程度上增加了它的水溶性。大环糖 肽类抗生素手性选择剂和手性物质之间的相互作用主要是离子键作用，其他作 用，比如氢键、空间位阻等作用相对不显著。常见的这类手性试剂有利福霉素等 【嚣捌。 f i g 5 t h es t r u c t u r eo fn f a m y c i n 9 复日大学硕十论文 第一章 御蛋白质大分子 大分子和超大分子螺旋手性物质是一类非常重要的识别手性物质，其具有独 特手性。例如生物大分子中的蛋白质。这些独特的螺旋结构在分子识别、复制和 催化活性中扮演了非常重要的作用。蛋白质或糖蛋白是由氨基酸、糖构成的一类 复杂的高分子聚合物，具有独特的一级、二级、三级结构特征，所含手性亚单元 和糖都具有手性特异型，因而许多蛋白质分子对手性分子具有很强的识别能力。 蛋白质的手性识别主要是通过疏水作用，静电作用和氢键进行手性拆分。如血清 白蛋白( b s a ) ，已经广泛用于多种手性物质的分离分析1 2 9 1 。 旧手性聚合物 这类手性选择剂包括两类不同来源的聚合物。一类是天然的多糖衍生物，包 括纤维素和直链淀粉，是由d 葡萄糖以a 1 ，4 糖苷键或b 1 ，4 - 糖苷键相连而 形成的线型聚合物，由于葡萄糖单元的手性，每个聚合物链均具有沿着纤维素主 链存在的一个螺旋形的沟槽。对映体进入沟中，主要通过吸引和包合作用实现对 映异构体的拆分，它们可直接或经衍生后直接用作固定相i 冽。 f i g 6 as c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no ft h ef o r m a t i o no fo n e h a n d e ds u p e r e o i l e ds t r u c t u r eb y h i e r a r c h i c a ls e l f - a s s e m b l yo fp h t h a l o e y a n i n e1 bt e mi m a g eo fl e f t h a n d e ds u p e r c o i l e da g g r e g a t e so f1 d a t af r o ma r t i c l e3 5 1 0 复且丈学硕i 沦文 第章 另一类是合成的螺旋状高分子聚合物。螺旋状聚乙烯甲基丙烯酸酯是第一种 能够分离限量对映体的手性聚合物。目前为止，已经成功制备了许多因其单一螺 旋性具有光学活性的螺旋聚合物i a o - 3 4 1 。手性识别主要是由于手性聚合物的高度有 序结构和立体效应而产生拆分作用，如聚酰胺类，聚氨酯类以及聚甲基丙烯酸酯 等。如f i g 6 所示，具有4 个苯冠醚的酞菁染料衍生物通过( s t o c k i n g i n t e r a c t i o n ) 作用形成了右手螺旋光纤物质，这些光纤物质进一步形成了左手螺 旋的超大螺旋物质【3 5 】。f e n n i r i 等发现另一种具有氢键的杂环分子形成的六角形 “盘型”螺旋聚合物体在手性氨基酸体系中可以检测到小的对映体不平衡，这种超 分子可以用作识别氨基酸的手性传感探针【觚明。 ( 7 ) 刷型手性选择剂 。刷型”手性选择剂作为手性选择剂是2 0 世纪6 0 年代由p i r k l e 等人发明的 h p l c 中非常重要的一类手性选择剂。这类手性选择剂是将单分子层的手性有机 分子通过适宜的连接基团健合到硅胶载体上而制的，一般至少含有下列一种官能 团：“吸电子或丌给电子的芳基团，在手性识别过程中发生电荷相互作 用；能形成氢键的原子或基团；能发生偶极偶极相互作用的极性健或基团； 能提供具有立体排斥、范德华相互作用、构型控制的一类较大的非极性基团 例。以n ( 3 ，5 二硝基苯甲酰) 亮氨酸、甘氨酸等键合到氨丙基硅胶上形成手 性固定相是一类常见的丌吸电子手性选择剂例。 此外，除了上述七种手性选择剂，还有分子印迹材料、表面活性剂等很多其 它手性选择剂用于识别和分离手性物质。 4 手性识别的分析方法 手性识别的方法一般是基于手性识别的原理，即通过手性选择剂( 主体分子) 对被研究的手性化合物( 客体分子) 进行选择性识别或结合的过程，以达到手性 化合物分析或分离的目的。根据分析的目的不同，手性识别方法可分为手性分离 和手性检测两种类型。常用的手性分离方法：包括气相色谱( g c ) 、高效液相色 谱( h p l c ) 、电泳( c e ) 等；常用的手性检测方法：有圆二色谱( c d ) ，核磁 共振( n m r ) 、质谱( m s ) 、传感器( s e n s o r ) 等。下面将分别对手性分离和检 l l 复臣人学硕i j 论文第一章 测方法进行简单的介绍。 4 1 手性分离方法 4 1 1 气相色谱( g c ) 气相色谱拆分对映体，可通过衍生化生成非对映体，或者使用手性固定相来 分离识别手性分子【3 9 】。其缺点是识别范围有限，只能用于具有挥发性、或衍生 后具有挥发性、且热稳定性好的手性客体分子分离。z a w i r s k a - w o j t a s i a k 利用气 相色谱技术对可食用的各种蘑菇中的1 辛烯3 醇进行了研究，发现r - 1 辛烯3 醇是主要的存在形式，且其光学纯度能够达到9 8 5 【柏1 。s i l v e s t r i n i 等采用气相 色谱法对一些手性和非手性单萜类物质进行了分离分析【4 1 1 。 4 1 2 高效液相色谱( h p l c ) 目前对手性药物的分离分析方法，大多是采用手性固定相高效液相色谱法。 该法具有不需要衍生化、不改变组分结构等显著优点。缺点是该法需要消耗大量 的有机溶剂、操作费用高而且存在污染，且每类手性柱能分离样品的种类有限。 k h a n 等通过高效液相色谱法对夫罗曲坦进行了手性分离分析，r 夫罗曲坦中含 有1 ( w w ) 的s 夫罗曲坦能够被很好的识别出来 4 2 1 。g i k a 等采用高效液相色 谱法研究了d l - 甲状腺氨酸的分离和定量分析，其对映体不纯可以达到o 1 【4 3 l 。 4 1 3 超临界流体色谱( s f c ) 超临界流体的密度与液体相似，溶解能力强，适于分离气相色谱难于分离的 一些难挥发物质和热稳定性差的物质，分离度高，分析速度快，但是不能用于分 离强极性和离子型手性药物的分析t i l t 。t o r i b i o 等利用超临界流体色谱对奥美拉 唑( o m e p r a z o l e ) 的对映体m 】和手性亚砜1 4 5 1 进行了分离分析。 4 1 4 毛细管电泳( c e ) 毛细管电泳法是根据电荷离子在毛细管中以电场力为推动力，按淌度差别进 行分离的技术，具有分离效率高，速度快，操作模式多等特点。毛细管电泳法测 定对映体过量值( e c ) 受很多因素的影响，如分离效率，灵敏度，检测限以及 复日人学硕十论文 第一幸 动力学线性范围瞰l 。目前，电泳方法已经成功的应用到识别对映体纯度的研究 中。c h e n g 等介绍了一种柱头衍生方法，研究报道了氨基酸的对映体过量值e e 能够达小于1 4 6 1 。 4 2 手性检测方法 4 2 1 圆二色谱法( c d ) 圆二色谱原理是基于在对左，右偏振光吸收能力不同的基础上建立起来的一 种特殊的吸收光谱，是研究生物分子和手性化合物结构和功能的重要工具。1 9 8 0 年，d r a k e 等首次使用圆二色谱检测器，在液相色谱上实现了手性化合物的分离 及纯度的测定m 。随着现代技术的发展，圆二色谱检测器与其他检测器相结合， 能够分离分析很多种具有光学活性的物质，这是一种最直观最简单的识别技术。 z h a n g 等利用高效液相色谱圆二色谱检测器快速筛选手性柱，确定手性化合物流 出顺序和光学活性【携】。 4 2 2 核磁共振( n 帆) 核磁共振吸收光谱( n m r ) 是研究各类立体化学过程一种的有效方法，其 在手性中的具体应用包括：鉴定各种有机物分子的化学结构和立体结构，立体化 学的动力学及机理研究，测定手性化合物的纯度和绝对构型方面，以及在手性识 9 j 机理等t y i s 4 9 j 。l o v e l y 等报道了1 8 冠醚衍生物对吡咯烷的n m r 手性识别 s o l 。 c o m a s s e t o 等人研究报道了手性碲二茂铁作为手性试剂在n m r 方法中识别手性 对应体的纯度【5 ”。 4 2 3 质谱( ) 质谱技术由于具有质量分辨，信息量大，样品量少，灵敏等优点，近年来在 生命科学的许多领域得到广泛应用 5 2 1 。各种质谱技术为研究药物一受体相互作用， 药物光学纯度测定提供了有力的工具。在体系中引入手性环境，并与对映体发生 立体选择性反应或通过非共价相互作用形成非对映体异构体复合物后，含有手性 对映体的复合物离子因具有不同的离子化效率和碎裂行为，从而在质谱上表现出 手性差异【郢j 。k i m 等研究报道了气相色谱质谱连用技术对( r ) ( s ) 6 一o 一 复日大学硕 ：论文 第一章 d e s m e t h y l n a p r o x e n 对映体的测定和识别【5 4 】。 4 2 4 传感器( s e n s o r ) 化学传感器是应用化学反应产生的电化学现象及根据化学反应产生的各种 信息( 如光效应、热效应、场效应和质量变化等) 来设计的各种精密而灵敏的探 测装置。根据换能器原理的不同可以分为光学传感器、电化学传感器、质量传感 器，生物传感器等。其工作原理为待测物经扩散作用与选择性薄膜接触，经分子 识别，发生化学反应产生的信息被相应的化学或物理的功能器转变成可定量或可 处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，便可知道待测物质的各种信息。 光学传感器( o p t ie als e n s o r ) ：光学传感器是根据化学反应中的光信号( 振 幅，频率，波长，偏振等) 进行分析的一类传感器。其工作原理一般基于荧光标 记体系和直接的光学识别体系。近年来，在生物和化学领域得到了快速发展和应 用。g i l b e