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西北大学硕士学位论文 微流控芯片的制作及食品安全检测应用的研究 摘要：本论文由综述和研究报告两部分组成。 第一部分介绍了微流体芯片的制作原理及进展、增强化学发光体系的类型、磁性微粒技术和 自动化检测技术；简要地概括和总结了近年来化学发光免疫分析法与微流控芯片结合分析分 方法的研究进展；展望了以化学发光为检测手段的微流体分析芯片在环境监测、食品安全检 测、疾病检测、新药开发等领域的应用。 我们在微流控芯片制作的实验中发现前烘温度、显影时间是影响最终图形分辨率和高 深宽度比的主要工艺条件，并建立了在实验室制作p d m s 微流控芯片的新方法。s u 一8 光敏胶 前烘温度控制在6 5 。c 烘6 小时、9 5 。c 烘2 小时，曝光时间1 2 1 4 小时，中烘温度控制在6 5 烘5 小时、9 5 。c 烘2 小时，制作的图形具有高的分辨率和深宽比。将p d m s 与固化剂以l o ： 1 的比例混匀，于6 5 c 烘4 0 分钟可使p d m s 进行聚合。该方法用于p d m s 微流控芯片的制作 并用于皮蛋中铅离子的测定，其结果令人满意。 以p d m s 微流控芯片的微通道作为样品通道及检测通道，以蠕动泵作为进样推动力， 并基于过氧化苯甲酰在碱性介质中能直接氧化鲁米诺反应产生强烈的化学发光，建立了一个 高灵敏度，准确，快速，简便测定过氧化苯甲酰的微流控芯片一化学发光检测新方法。利 用该方法测定过氧化苯甲酰。其线性范围为l x l o 。7 l x l 0 4 咖l ，检出限为：1 o 1 0 一g m l ， 对5 o 1 0 6 9 m l 过氧化苯甲酰8 次平行测定的相对标准偏差为2 8 。样品加标回收率为 9 5 7 10 4 4 。 将偶联有o v a c l b 的金磁微粒通过外加磁场固定于玻璃微通道内，并使它同样品中 的c l b 相互竞争和c l b 抗体结合，所结合的抗体与h r p 标记羊抗兔i g g 反应后，利用h r p 催化对碘苯酚增强的鲁米诺过氧化氢体系化学发光，建立了测定尿液中c l b 的流动注射增 强化学发光免疫分析新方法。在选定的实验条件下，化学发光信号与c l b 浓度在1 1 0 1 1 9 m l 一1 x i o 。o g m l 成良好的线性关系，其相关系数为o 9 9 7 1 9 。对同一样品连续1 1 次测 定的相对标准偏差为3 2 。每次分析测定需15m i n 。对尿液中c l b 进行测定，结果比较满 意。本文建立了将外加磁场、玻璃微通道与金磁微粒固相载体相结合测定c l b 的流动注射增 强化学发光免疫分析新方法，以微通道作为免疫反应器和金磁微粒作为载体具有分析速度 快，响应时间短，固相免疫分离自动化的优点。在玻璃微通道内进行物质分离和免疫学反应 所消耗的试剂较少，因此分析速度和响应速度快：以金磁微粒作为固相载体，具有清洗和分 西北大学硕士学位论文 离方便，操作简单的优点。 关键词：微流控芯片化学发光免疫分析p d m ss u 8 光敏胶 i i 西北大学硕士学位论文 r e s e a r c ho fm i c r o f l u i d i cc h i pf a b r i c a t i o na n da p p l i c a t i o ni n f o o ds a f l yd e t e c t i o n a b s t r a e tt h i st h e s i si n c l u d e sar e v i e wa n dar e s e a r c hs e c t i o n i nt h er e v i e w , t h e h i s t o r y ，p r i n c i p l ea n dt y p eo fc h e m l u m i n e s c e n si m m u n o a s s a y ( c l i a ) i si n t r o d u c e d t h ep r o g r e s so fa n a l y s i sm e t h o db a s e do nm i c r o f l u i d i cc h i pa n dc h e m i l u m i n e s c e n s e i m m u n o a s s a yi nr e c e n ty e a r si sp r e s e n t e d m o r e o v e r , t h ea p p l i c a t i o n so fm i c r o f l u i d i c c h i pa n dc l i ai nm a n yf i e l d s ，s u c h a sf o o ds a f t y , e n v i r o n m e n t a la n a l y s i s ，a r e r e v i e w e d t h i sm e t h o dh a sb e c o m ea ni n c r e a s i n g l yp r o m i s i n ga n a l y s i sm e t h o do w i n g t oi t sn o n r a d i a t i o n ，s i m p l ei n s t r u m e n t a t i o n , h i g hs e n s i t i v i t y , w i d ed y n a m i cr a n g e ， r e p r o d u c i b i l i t y , s i m p l i c i t y a n dr a p i d i t ya n a l y s i s ，i t sa u t o m a t i o nf r o mc o m p u t e r c o n t r 0 1 w ef o u n dt h a tt h em a i nc o n d i t i o na f f e c tt h ed e p t hb r e a d t hr a t i oa n de x a c t i t u d ei s t h et e m p r e t u r eo fp r e r o a s tt i m e s ow ee s t a b l i s h e dam e a n st of r a b r i c a t ep d m s m i c r o f l u i d i cc h i pi nl a b o r a t o r y t h es u 一8p h o t o s e n s i t i v eg l u ei sp r e r o a s t e da t6 5 c f o r6h o u r sa n d9 5 f o r2h o u r s t h e ni ti sr o a s t e da t6 5 f o r5h o u r sa n d9 5 ( 2 f o r 2h o u r sa f t e re x p o s e df o r1 2 1 4h o u r s p d m sm i x e dw i t hc o n d e n s a t ei n1 0 ：1 ，t h e nt h e m i x t u r es o l i d i f yo nt h es u 一8m o u l ds u r f a c ea t6 5 。cf o r4 0m i n u t e s l u m i n o lc a nb eo x i d i z e db yb e n z o y lp e r o x i d e ( b p o ) a n dg e n e r a t eac ls i g n a l i na l k a l i n e m e d i u mi nm i c r o f l u i d i cc h i p ，s oan o v e lm e t h o df o rb p o d e t e c t i o ni sf o u n d e d t h ep r o p o s e d d e t e c t o rf o rt h ed e t e c t i o no fb e n z o y lp e r o x i d eo f f e r st h ea d v a n t a g e so fs e n s i t i v i t y ，s i m p l i c i t y ， a u t o m a t i o na n dr a p i d i t y i ti sa l s oa v a i l a b l ef o ro nl i n ea n a l y s i s t h ep r o p o s e dm e t h o dh a sb e e n a p p l i e ds a t i s f a c t o r i l yt ot h ed e t e r m i n a t i o no fb e n z o y lp e r o x i d ei nw h e a tf l o u n t h es y s t e ms h o w s t h a tt h eb e n z o y lp e r o x i d ei sd e t e c t e dl i n e a r l yi nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m1 1 0 7 1 1 0 。5 g c r n l t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n 仍= 8 ) w a s2 8 f o r5 0 x 1 0 g m l b e n z o y lp e r o x i d e an o v e ls y s t e mf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc l e n b u t e r o l ( c l b ) i nu r i n ew i t hc h e m i l u m i n e s c e n t e n z y m ei m m u n o a s s a ya n d m i c r o f l u i d i cc h i pb a s e do nm a g n e t i cp a r t i c l e sa n dt h ei n d i r e c t c o m p e t i t i v ee l i s a t h el i n e a rr a n g eo f t h i sm e t h o di s lx 1 0 。l l g m l 一1 1 0 ”g m l ，t h er e c o v e r yo f c l e n b u t e r o li s8 5 1 0 5 ，r s di s3 2 ( n - 1 1 ) a n ds e n s i t i v i t y i s1 1 0 一”g c m l t h ep r o g r e s so f 1 1 1 西北大学硕士学位论文 a n a l y s i sk a nb ef i n i s h e di n1 5m i n u t e s a sa l lt h ep r o g r a ms u c ha se n r i c h m e n to rs a m p l e ，r e a c t i o n ， w a s h i n g ，s e p a r a t i o n ，d e t e c t i o nw e r ed i s p o s e do nt h em a g n e t i cp a r t i c l e s ，t h i sm e t h o dd o e s n tn e e d s p e c i a li n s t r u m e n t sa n dt e c h n i c a lp e r s o n n e l ，t h ea n a l y s i sr e q u i r eal i t t l ev o l u m er e a g e n ta n dt i m e o f d e t e c t i o nb ec u td o w na l s o k e yw o r d s m i r o f l u d i c c h i p ，c h e m i l u m i n e s c e n ti m m u n o a s s a ya n a l y s i s ，p d m s ，s u 一8 p h o t o s e n s i t i v eg l u e 西北大学硕七学位论文 英文缩写 “n s p m m a p d m s p c s u 一8 b p o c l b s a m h r p o 泓 b s a c l p b s 英文缩略表 英文全称 m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s p o l y m e t h y l m e t h a c r y l a l e p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e p o l y c a r b o n a t e s u - 8e p o x yr e s i n b e n z o y lp e r o x i d e c l e n b u t e r 0 1 s u l b u t a m o l h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 0 v a l b u m i n b o v i n es e r t m la l b u m i n c h e m i l u m i n e s c e n t p h o s p h a t es o d i u mb u f f e r e d 中文名称 微全分析系统 聚甲基丙烯酸甲酯 聚二甲基硅氧烷 聚碳酸酯 环氧s u 8 树酯 过氧化苯甲酰 克仑特罗 沙丁氨醇 辣根过氧化物酶 卵清蛋白 牛血清白蛋白 化学发光 磷酸盐缓冲液 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：垄翌爹。指导教师签名： 魑 2 0 呵年月7 日两f 年月f 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：孪蕾赘 二o j - 年b 月7 日 西北大学硕士学位论文 第一部分综述 微流控芯片及化学发光免疫分析法的研究进展 微全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m sg t a s ) 或称芯片实验 室( l a b o r a t o r y o i l a - c h i p 简称l o c ) 的概念是在1 9 9 0 年首次由瑞士g i b a - g e i g y 公司的m a n z 和w i d m e r 提出【l 】。微流控芯片实际上是一个涉及了多个学 科的新领域，它的目标是将分析化学、计算机、微机电加工( m e m s ) 、电子 学、材料科学、生物学及医学相互结合起来，并将整个实验室的功能微型化、 自动化、高度集成化和便携化，从而实现化学分析系统从样品的前处理到分离 再到检测及数据分析的简便操作。 微流控芯片与微阵列芯片( m i c r o a r r a yc h i p s ) 或称生物芯片( b i o c h i p s ) 都属于l o c 范畴，但是很多人都将微流控芯片和生物芯片的概念混为一谈，或 者认为微流控芯片是生物芯片的部分。实际上二者涉及的是两个完全不同的 学科技术领域吼生物芯片比微流控芯片发展早4 - 5 年，它的概念最初来自计算 机芯片。芯片分析的实质是在数平方厘米的基片表面上有序地点阵了一系列固 定于一定位置的可寻址的识别分子。结合或反应在相同条件下进行。反应结果 可通过同位素法、化学发光法、荧光法或酶标法显示，然后通过高精密的扫描 仪技术记录，并利用计算机软件分析数据。由于最初的生物芯片主要目标是用 于d n a 序列的测定、基因表达谱鉴定和基因突变体的检测和分析，所以它又 被称为d n a 芯片或基因芯片 3 1 。但目前这一技术己扩展至免疫反应、受体结合 等非核酸领域，所以按现状改称生物芯片更能符合发展趋势。 而微流控芯片则是在9 0 年代初、中期发展起来的。它以分析化学为基础， 以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要 应用对象，是当前微全分析系统发展的重点。它的目标是将整个实验室的功 能，包括采样、稀释、加样及进样、分离、清洗、检测等步骤在同一个芯片上 实现，一片芯片可以重复多次使用。由于各种功能的集成，导致了芯片分析仪 器体积的缩小，它必然显著的降低了制造成本，便于运输与搬运，同时也节省 了实验室的空间、省电和节约了一些贵重试剂的消耗。并且它的体积小、重量 轻、操作简便，可多通量检测这些特点，适用于药物筛选、环境监测、食品安 西北大学硕士学位论文 全检测、生物战剂侦检和天体生物学研究1 4 0 】。因而它比生物芯片具有更广泛 的适用及应用前景。尽管如此，二者功能上依然各有所长，它们之间是相互补 充的，不能归结为谁包含谁，而应该使其协调发展。表l 是微流控芯片和生物 芯片之间的主要区别。 表1 微流控芯片与生物芯片的比较【2 在m a n z 提出微全分析系统的开始几年内，这一领域并没有受到到人们太多 的关注，但是自从1 9 9 4 年首届岍a s 会议在荷兰的e n c h e d e 举行以后，对微流 控芯片的全面发展起到了巨大的推动作用。美国加州大学b e r k e l e y 分校的 m a t h i e s 于1 9 9 5 年将d n a 测序与微流控芯片相互结合起来1 4 】，实现了d n a 的 高速测序。1 9 9 9 年惠普和c a l i p e r 两家公司联合研制的首台商品化微流控芯片分 析仪开始在市场上销售，这更加增加了人们对微流控芯片前景的认识，同时也 暗示了它所具有的商业价值。 1 微流控芯片的材料 用于制造微流控芯片的材料比较多，包括无机材料( 如单晶硅、石英、玻 璃、金属) 和有机聚合物( 如聚甲基丙烯酸甲酯p m m a 、聚碳酸酯p c 、聚二 甲基硅氧烷p d m s 、环氧树酯等) 。 1 1 硅材料 西北丈学硕士学位论文 硅片上加工微流体芯，应用的是微电子学的光刻技术，其工艺成熟，并且 硅具有良好的热稳定性和惰性。但是硅材料成本较高、不透光、电绝缘性不 好，因此限制了它在微流控芯片中的应用。 1 2 玻璃和石英 由于玻璃和石英具有良好的透光性和电渗性质，利用光刻和蚀刻技术就可 以将设计好的微通道图形刻蚀在玻璃或石英上，因而这种材料已广泛的应用于 微流控芯片的研究。刘金华等在玻璃上制作了如图l 所示的p c r 扩增芯片，在 4 9 分钟内完成了2 4 个循环，并成功的扩增了浓度为i n g 1 0 0 n l 的 一d n a 1 ， 它与传统的p c r 扩增仪相比较，实现了扩增速度快、交叉污染小、芯片可以重 复使用和操作简便等优点。 进样口 出口 退火 延伸 变性 o a m a s a h i k oh a s h i m o t o 等在石英上制作微流控芯片，以化学发光为检测手段 对赖氨酸和甘氨酸进行了测定，其赖氨酸的检测下限达到1 0 m ，而c a 的检测 限甚至达到0 4 f m o l i l ”。但是随着人们对p t a s 芯片的更深入研究之后，石 英、玻璃、硅片等材料不断的暴露出了它们各自的局限性：石英及玻璃芯片的 制造工艺复杂、技术要求和成本较高、过程极缓慢，且需要有相应的清洁房间 及设施，密封管道的过程复杂、耗时，在玻璃芯片上加工迸样及废液出口比较 困难，容易造成芯片破碎，硅片不透光，是半导体材料，耐酸碱性能较差，在 一些条件下( 如高电场驱动) 不适用于分离和检测，而且硅片的价格昂贵。相 对而言，有机聚合物基材比玻璃和硅材料具有易成型制造、易更换、不易碎、 赢器i 西北大学硕士学位论文 耐酸碱性强、成本低等优点，在i t - t a s 研究领域内日益受到重视，逐步成为微 流控芯片的首选材料【限1 4 1 。 1 3 高分子聚合物 有机聚合物材料比较多，它们的化学性质也不尽相同，所以在选择高分子 材料时要根据工艺条件。一股来说，高分子材料具有价格便宜、光学性质优 良、加工成型容易，适合于制作一次性的微流控分析芯片。在选择高分子材料 时应注意聚合物有良好的光学性质、容易被加工、在所采用的实验条件下是惰 性的、有好的电绝缘性和热稳定性、表面能被修饰。有机聚合物材料比较多， 但所选择的有机聚合物材料应具有以下特点：可加工性、光学特性好、惰性 强、热和电性质、可退火键合及表面易修饰性。到目前为止，能够成功的用于 微流控芯片制作的有机物聚合材料主要有：聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 、工程塑 料、聚甲基丙烯酸甲酯( 嘲a ) 、聚已酸丙酯( p o l y c a p r o l a c t o n e ) 、聚苯乙 烯( p o l y s t y r e n e ) 等。比较常用的有机材料是p d m s ，由于它可以通过模塑法 加工芯片、透光性较好、具有一定期化学惰性、无毒、价格低廉、p d m s 固化后 就具有一定的粘附力，因此可以简单的通过分子间的引力自然粘合而成为具有 密封通道的微芯片，这种微通道很容易清洗。但不耐高压，当用泵进样品液 时，如果压力太大，微芯片粘合部位就会裂开从而产生渗漏现象，因此这种粘 合称为非永久性封合。d u f f y i 蟮1 等采用了高真空氧等离子处理p d m s 表面，使其 表面憎水性增强，从而实现了p d l d s 图2 未经等离子处理的p d m s 芯片键合图3 经等离子处理的p d m s 芯片键合 西北太学硕士学位论文 芯片的永久性键合，而被广泛的用于制备微流控芯片。沈德新1 1 6 1 等人将刚从模 具上剥落下来的两片新鲜p d m s 基片放入等离子发生设备的石英腔内，在中度真 空度下加高压1 4 0 0 2 0 0 0 v 使腔内的氧起辉，并利用氧等离子体对芯片表面轰击 5 4 0 秒，将氧等离子处理好的p d m s 芯片组件现场键合，1 0 0 。c 保持1 小时即可 实现永久性键合，同时也改善了微通道表面的亲水性。图2 与图3 分别是p d m s 在氧等离子体处理前后键合的电子显微镜扫描图”6 1 。 2 微流控芯片的制作技术 要通过微流控芯片进行样品的前处理、分离、反应和检测的前提条件就是 按设计好的图形加工出精密度高的芯片，但是由于用于微流控芯片制作的材料 比较多它们的化学性质也千差万别，因此加工微流控芯片的方法也就比较 多，各种方法也不尽相同。表2 列举了一些常用的有机聚合物材料和微制造技 术的对比。 表2微流控芯片制作方法及材料 加工深度u 管道精度u 加工技术管道光洁度深宽比适用材料 mm u g a 工艺1 0 0 00 1好极高脚o da 活性离石英、玻璃 1 0 01较好较高 子蚀刻硅片 聚苯乙烯 激光烧蚀1 0 0i一般较高 p m m a 注射成模 1 0 0 02一般 目p d m s p d m s 印刻与压印 1 0 0 02较差极高 p m m a 2 1 光刻和蚀刻技术 西北大学硕士学位论文 最初在硅片或玻璃上制作微流控分析芯片的微通道采用了现代微电子加工 的所广泛使用的光刻( 1 i t h o g r a p h y ) 和化学湿腐蚀蚀刻技术( e t c h i n 1 0 1 。光刻与 蚀刻技术主要由薄膜沉积、光刻、蚀刻三个程序组成。 首先在基片上通过氧化、化学气相沉积、蒸发、溅射等方法沉积形成一定 厚度的薄膜，在薄膜表面用甩胶机均匀的覆盖上一层光刻胶，加热处理后，通 过c a d l e d i t 等软件设计曝光掩膜在紫外光下曝光，并将图形转移到光胶层 上，用显影液溶解并清洗掉未曝光的光胶层( 负光刻胶) 或已曝光的光胶层 ( 正光刻胶) ，除掉光胶层并暴露出的基片上的平面二维图形用h f h n 0 3 或 h f ，n 地f 腐蚀出具有一定深度的微通道。 蚀刻工艺可分为湿法刻蚀和干法刻蚀两种，湿法刻蚀所用的刻蚀剂为水溶 液，例如在玻璃和石英的湿法刻蚀时常用含氢氟酸的溶液它只能各向同性刻 蚀i m 诤】。即刻蚀剂从基片表面开始向下腐蚀的速率与在其他各方向大至相同。 因此在加工较深的微通道时，随着通道深度的增加，它的宽度比光掩膜的宽度 大，并且通道两侧壁也会变的不平行，呈现出上宽下窄。干法刻蚀是指刻蚀气 体分子在高频电磁场作用下发生碰撞，产生由离子、自由电子、分子、中性的 游离基组成的等离子体，由于它们的性质很活泼，所以和基片材料之问发生化 学反应而达到刻蚀目的。h eb 等( 排2 1 通过干法刻蚀在玻璃、石英材料上成功加 工了毛细管电泳和色谱微芯片。 2 2 激光烧蚀法 聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯等有机高分子材料，在激光作用下可降解成 易挥发的小分子。将激光通过光刻掩膜聚焦于高分子材料上，并可调整曝光强 度以控制微通道的烧蚀深度，使光刻按照掩膜的设计在高分子材料的特定区域 内发生激光溅射，同时用压力吹去降解产物，得到带有微通道的基片，将它和 另一片打好进样1 2 1 与废液出1 2 1 的盖片加热键合就得到了所需要的芯片【2 2 】。用这 种方法制作微流控芯片，其步骤简便，精度高，不需要超净环境。但是它需要 紫外激光器，对设备的要求较高。在激光的作用下，加工微通道时溅射出的微 粒被压力吹起，随着激光束在基片上移动时，这些微粒又在其后产生的微通道 表面沉积，因而随着加工深度的增加，产生的微粒就越多，微粒在通道内沉积 的也相对多一些，微通道底部的不平整度比较明显。所以激光烧蚀技术幽1 虽然 西北大学硕士学位论文 可以制出深宽比很高的微通道，但其通道内壁却极为粗糙，在进行样品分离检 测的过程中，很容易产生残留现象，并且很难将其清洗干净。 2 3 热压法 热压法主要利用了有机材料的玻璃转化温度，它所应用的压力均匀，因而 可以制作出的微通道产生的变形较小，同时可以制出深宽比极高的微通道，但 是在分离芯片和模具的时候容易在转角处损坏。热压法通常利用光刻和蚀刻的 技术在硅片上加工阳模。将阳模与有机材料夹在一起加热，在均匀的压力和热 的作用下使有机材料上形成与阳模互补的微流控芯片通道。在加压的条件下， 将阳模和刻有通道的基片起冷却后脱模，就得到了所需要的微流控芯片。 c h a n 等 2 4 1 采用压印的方法制作了p d m s 微流控芯片，并且和质谱联用进行了老 鼠血清白蛋白的分析。e f f e n h a u s e r 等【2 5 】通过压印的方法制作了集成毛细管电 泳微芯片，在d n a 片段上插入染料和荧光标记物，其检出限达到了1 0 。8 m 。 2 4l i g a 技术 l i g a 技术是种新的微细加工方法，它由光刻、电铸和塑铸三个环节组成 【2 ”。第一步为同步辐射x 光深层光刻，将光掩膜上的图形转移到几百微米厚 的光刻胶上，从面得到一个与掩膜结构相同，厚度几百微米的三维立体结构。 由于光刻胶是涂在有很好导电性能的金属膜上，因此电铸可利用光胶层下面的 金属作为电极进行电镀，将显影后的光刻胶图形上的间隙用金属填充，形成一 个与光刻胶图形凹凸互补的金属模具，然后将光刻胶及附着的基底材料除掉。 最后通过l i g a 所使用的标准注塑机，将高分子材料加热到玻璃态温度以上， 通过金属注塑版上的f l , 孑l 将它们注入金属模具的腔体内，在抽真空条件下冷却 脱模就得到了与掩膜结构相同的芯片。许多热塑性高分子材料，如聚甲基丙烯 酸甲酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等都可作为塑铸的材料。 2 5 模塑法 模塑法首先用光刻和蚀刻的方法先制出通道部位突起的阳模，然后在阳模 上浇注液态的高分子材料通过加热固化。将固化后的高分子材料从阳模上剥 落下来后就得到了具有微通道的基片，将基片与盖片以一定方式封接后就制得 西北大学硕士学位论文 了高分子聚合物微流控芯片。常用的浇注材料为p d m s ，通过模塑法1 2 9 1 ，将 p d m s 及固化剂按一定的比例混合后的液体注入负模板中，等其固化后再从负板 上剥落下来进行封合。m a r t i n 等口0 】在p d m s 上制作分离及注射管道，然后用玻 璃作盖板，形成了可逆密封，从而避免了高温键合。y a nl i u 等【3o l 在p d m s 的微 芯片管道中通过动态涂覆p b ( p o l y b r e n e ) 和d s ( d e x t r a ns u i f a t e ) ，在一定p h 值下得到了稳定的电渗流，考察了电渗流和p h 的关系以及涂覆前后电渗流的变 化。d u l l y 等使用快速成模的方法在不到2 4 小时就制出了p d m s 的微流控芯 片，并对氨基酸、蛋白质、d n a 片段进行了分析，得到了和常规毛细管电泳方 法可比的结果。微通道的阳模的制作材料也比较多，如硅材料、玻璃、环氧基 s u 一8 光刻胶。s u 一8 实际上是一种环氧型的近紫外光负光刻胶，来源于橡胶工 业中环氧s u - 8 树脂。由于每个分子中都含有8 个环氧基，所以叫s u 8 光刻 胶。目前商业化的s u - 8 胶主要有美国m i c r o l i t h o g r a p h yc h e m i c a l 公司生产的 s u 一8 系列胶。其结构如图4 所示。 图4s u 8 结构图 s u 一8 胶同其它的光刻胶相比较有许多的优点：在甩胶机上能够铺较厚的 胶，从而能满足高深宽比的应用需求。有资料介绍用s u 8 胶可以得到近l c m 的厚度3 3 】，而在这种情况下所得的图形边缘几乎是垂直的。因此它在高深宽 比的应用中比较好控制；它在自然光下很难发生反应，只在紫外光下才会曝 光，所以操作过程很简便，同时在不需要专门的曝光机的条件下，在实验室中 用普通紫外灭菌灯就可以完成曝光；s u 一8 胶在近紫外光范围内光吸收极低，因 西北大学硕士学位论文 此在高深度上能够很好的控制曝光的均一性；此光刻胶在烘干过程中具有自平 整能力【3 4 】，因而也消除了边缘的水珠效应，表面比较平整光滑，光掩膜与胶之 间接触的较严密，所以光刻出来精度高，所以这几年来它成为m e m n s 微结构 研究的一个热点。l u n g - j i e hy a n g 利用s u 8 胶制作微流控芯片，在3 6 帅、8 0 r t m 和1 2 5 n 宽的微通道内壁凹陷程度小于1 0 n m ，其微通道粗糙偏差在7 之内。 s u 一8 胶可将环氧s u - 8 树脂溶解在百万分之一的丁内酯中，然后再加入 s u 8 树脂重量1 0 的光引发剂三苯基硫盐。溶剂的量决定了光刻胶的最终 粘度，而粘度的大小决定了光刻胶所能达到厚度范围。粘度越大，可达到的厚 度越厚，反之则薄。如表3 就是m i c r o c h e m 公司几种系列s u 一8 光刻胶固形物含 量与粘度之间的关系： 表3s u 一8 胶几种系列的特性 s u 8 胶光刻的机理实际就是当光刻胶受到紫外光的照射后，其中的光引发剂 三苯基硫盐吸收光子后产生光化学反应而生成一种强酸。而这种强酸正好是 s u 8 胶环氧基之间交联的催化剂。所以当紫外光通过光掩膜上透光部位照射到 光刻胶上，由于受到光照区域的胶产生了强酸，在随后的中烘过程中强酸催化 s u 8 胶的环氧基产生交联，这种交联以链式增长方式进行，再通过扩展交联成 网络结构并最终形成一种大分子。而没有受到光照的区域则不产生强酸，因而 环氧基之间也不能形成交联。然后通过显影液进行显影处理，交联成网络结构 的大分子不溶于显影液而留在基片上，而未经曝光的区域，s u - 8 光刻胶没有发 生交联，测溶于显影液而被清洗掉，从而在基片上形成了光掩膜的反图形。 3 微流控芯片的键合 西北大学硕士学位论文 通过微加工制作的微流控芯片基片必须与盖片相键合在一起才能成为完整 的芯片，而键合的好坏关系到芯片是否渗漏及能否再重复使用。常用的键合方 法有热键合、阳极键合、低温键合和黏合等。 3 1 阳极键合 阳极键合主要用于含钠的玻璃片和硅片的键合。将玻璃和硅片或两片玻璃夹 在铂金板之间并加热到4 0 0 6 0 0 的温度，夹紧后在铂金板上通以5 0 0 1 5 0 0 v 的 高压时，玻璃中的钠离子从玻璃硅界面处向阴极移动，从而在界面的玻璃一侧 形成负电荷区，在硅片一侧则形成正电荷区，玻璃与硅片之间通过正负电荷的 静电吸引力而紧密结合在一起并生成一层氧化物而使基片与盖片达到封接的目 的。文献3 5 1 报导了在玻璃表面沉积上一层薄膜材料如多晶硅、氮化硅等作为中 间层，在7 0 0 v 的电场下，升温至4 0 0 ( 7 时，可使两块玻璃片键合。因其键台温 度低于玻璃软化点温度，所以有效的防止了键合温度过高而导致的通道变形甚 至塌陷。也有文献【3 6 】报道，两块玻璃片在5 0 0 7 6 0 v 的电场下，升温到5 0 0 。c 时 不需要在玻璃表面沉积中间层而使其键合。 3 2 热键合 玻璃和硅材质的微流控芯片一般通过热键合方法封合，将加工好的基片和 盖片洗净，通常用新配制的3 0 h 2 0 2 ：h 2 s 0 4 = 1 ：3 溶液处理盖片与底片，烘干对 齐贴紧后平放在高温炉中，在基片与盖片上施加一定的压力；加热使其键盘 合。硅片在高温炉中加热到8 0 0 1 0 0 0 c 时再退火，界面上会发生如下的化学反 应： s i 一睁一h h o _ 一s i s i _ 卜s i + h ：0 从而使两块硅片牢固地键合在一起。通过这种方法可以将表面有二氧化硅保护 层的硅片键合在一起，也可将多晶硅薄膜与单晶硅片键合在一起 3 7 3 8 。 s i m p s o n 3 9 1 将高温炉以1 0 c m i n 升温，在6 2 06 c 时保温3 5 小时，再以1 0 。c m i n 的速率降温而实现了玻璃芯片的键合。 3 3 低温键合 在通常情况下，用于制作微流控芯片的有机高分子聚合物材料大多数在 西北大学硕士学位论文 1 2 0 c 一1 8 0 c 之间呈软化状态，因此在较低的温度下就可使聚合物基片与盖片达 到软化，在它们的分界面处，盖片与基片相互扩散，冷却后达到封合的目的。 m a r t y n o v al1 4 0 j 等人将刻有微通道的聚甲基丙烯酸甲酯基片与盖片对齐贴紧后 夹紧，放置于烘箱中1 0 8 。c 保温l o m i n ，可使它们封合在一起。但是在聚合物的 玻璃态温度时，芯片中的微通道会发生变形，为了克服这一缺点，有人在聚合 物表面涂上一层低玻璃态温度的其它聚合物【2 ，这样就大大降低了高聚物的热 键台温度，从而在远远低于高聚物微流控芯片软化温度的条件下实现低温热封 合。 4 微流控芯片的检测系统 微流控芯片将被分析样品处理后进行定性或定量测定，需要有好的检测器 才能实现微流控分析系统的高灵敏度、快速响应及少的试剂消耗。与传统的仪 器分析系统相比，在微流控芯片的分析过程中，可供检测的样品进样体积微 小，并且检测区域也非常小；微通道体积小，因而试剂与样品的混合、反应、 分离等过程往往在很短的时间内完成。因此，微流控芯片分析系统对检测器有 一些特殊的要求：应具有高的灵敏度和信噪比；较快的响应速度；特殊的结 构，易于改造，并与微通道尺度相匹配；体积小，便于携带：生产成本低。 4 1 荧光检测系统 由于微通道的截面较小，普通的紫外检测方法难以实现，因此在微流控芯 片分析系统中常用激光诱导荧光检测器( l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 。常 用的激光器为氩离子激光器、氦氖激光器、固态泵激光器、半导体激光器等。 根据不同的检测方式可分为激光共聚焦检测、激光激发c c d 检测、激光激发光 电倍增管检测等。l i f 具有极高的灵敏度【4 l 】，一股可达到1 0 母m o l l 一1 0 - 1 2 m o l l ，是目前最灵敏的检测方法之一。同时，l 1 f 检测方法还具有良好的选 择性和较宽的线性范围，并且许多生化样品物质如蛋白质、氨基酸、d n a 等可 以标记上荧光物质而被检测出，因此在微流控分析芯片中，l i f 检测方法是一 种应用最早、至今仍然广泛被使用的检测方法。e f f e n h a u s e r 等【4 2 】将光子记数技 术与激光诱导荧光检测方法相结合，并采用这种技术对聚二甲基硅氧烷 ( p d m s ) 芯片电泳分离的6 0 3 b pd n a 片限制片断( 用y o y o 1 标记) 进行了 西北大学硕士学位论文 检测，首次在微流控芯片上对大分子d n a 进行了单分子检测，并达到了1 0 2 1 m o l 水平的检测限。f i s t e r 等【4 3 1 采用二极管作为激光器的激发光源和双脉冲计 数的方法，对经微流控芯片电泳分离的罗丹明6 g 和罗丹明b 检测的浓度检测 限分别达到了1 7 1 0 。5 m o v l 和8 5 x 1 0 。1 5 m o l l ，从而实现了小分子物质的超高 灵敏度的检测。 4 2 电化学检测系统 电化学检测是一大类检测方法，包括安培法、循环伏安法、电势法、电导 法等。电化学是将电极作为传感器，直接将待检测溶液中的成分的化学信号转 变成为电信号。电化学检测器可以做得很小，甚至可以集成在芯片上，待检测 的样品也不需要标记，成本降低。因而这种检测方法应用于微流控芯片，能够 实现整个系统的微型化和便携化。1 9 9 8 年，w o o l e y 等h 4 1 首次报道了以安培检 测器来检测毛细管电泳芯片上分离的成分。金亚等1 4 5 】以光刻法制作了集成有1 3 1 tm 宽的p t 超微电极的玻璃微流控芯片，在优化了电极体系和分离电压后，成 功的将多巴胺和多巴克的混合物分离开，并通过超微电极在柱端检测到己分离 的神经递质。2 0 0 0 年t a n t r a 和m a n z t 4 6 1 报道了与芯片流通池集成于一体的b a 2 + 离子选择性微电极。该微流控芯片刻有一条u 形通道和一条直线形通道。u 形 通道内充有能响应b a 2 + 离子的溶剂高聚物膜，直线形通道为试样通道，u 形通 道的底部与直线形通道的中部由一短通道相连( 短通道内填有液体接界膜) 。 在u 形通道的一端储液池加入内参比溶液并插入一支微a g a g c l 参比电极，在 试样通道的出口储液池中也插入支微a g a g c l 参比电极，即构成了测定b a ” 离子的微流控电位检测器。当试样溶液用注射泵输入试样通道流经u 形通道的 液体接界膜，b a 2 + 离子扩散进入敏感高聚物而产生电位信号。该电位检测器在 1 0 1 m o l l 一1 0 6m o l l 浓度范围内对b a 2 + 离子呈线性响应，b a 2 + 离子浓度在1 0 1 m o i l - 一1 0 。4 m o l l 内信号在数秒钟内即可稳定。 4 3 质谱检测系统 质谱作为一种分析手段，它能够提供试样中生物大分子的基本结构和定量 信息。通过为质谱提供良好的样品前处理和分离过程，可大大的提高检测的信 西北大学硕士学位论文 噪比。因而质谱在微流控分析芯片领域内表现出了极大的应用前景和良好的技 术可行性。 徽流控芯片与质谱结合的最重要部分就是其接口问题。虽然它是整个分析 系统中极微小的一部分，但它是整个系统的关键所在。k a r g e r 4 7 1 和j m r a m s e y 4 8 】率先意识到芯片质谱联用技术在现代生物样品分析中的发展前景， 以此展开了基础性研究工作，他们采用从芯片末端流出的液滴直接在静电的作 用下喷雾进入离- t n 洲；f i g e y s t 4 9 - 5 1 1 和p i n t odm 【5 2 】等使用毛细管将芯片 和质谱连接起来。各种方式都各有其优缺点。在质谱与微流体芯片的连用中，常 常有研究者仅将芯片作为一个进样装置，但质谱虽然可以同时对几种成分进行分 析，检测复杂的样品时如果没有预分离就往往会造成信号下降或是背景化学噪音， 而如果能够利用芯片进行分离或预处理则可降低干扰，改善峰形。尽管目前芯片 质谱联用有某些应用上的优越性，但是质谱仪的体积庞大，它对整个系统的微 型化和便携化是一个不利因素。 4 4 化学发光检测系统 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，简称c l ) 是在没有光、电、磁、声、热 源激发的情况下，由物质间的氧化而反应产生的一种光辐射。以此为基础的化 学发光分析，由于可以进行发射光子计量，又没有外来激发光源存在时散射光 背景的干扰，因而具有很高的灵敏度( 检出限达1 0 。2 1 0 。2 1m 0 1 ) ，很宽的线 性范围( 3 6 个数量级) ，近年来它的应用发展很快，覆盖的范围也很广泛。微 流体芯片能利用微细加工技术制作零死体积的柱后反应器从而避免分离效率下 降这些问题，因此微流体芯片利用化学发