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浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 酶法合成b 一丙氨酸工艺条件的研究 摘要 本论文研究了大肠杆菌的破壁条件、天门冬氨酸脱羧酶的提取 条件及其细胞的酶学性质，并将其纯化。得到最佳破壁方法为研磨加 i m g m l 溶菌酶，最佳提取介质为p h 8 的0 0 5 m o l l 磷酸缓冲液。最 适温度3 7 c ，最适p h 为7 。在1 0 0 c 下放置l h 酶活为0 ，p h 3 时放 置1 h 酶活仅剩3 3 u 。最佳转化时间2 4 h 。经过盐析、离子交换和凝胶 层析后，酶得到了很好的纯化，由于实验中酶活的损失，最终的酶活 降到了纯化前的3 6 6 。 对工程菌ee o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ip e t 2 8b ( + ) 的固定化条件进行研究， 并研究了固定化细胞的性质。得出最佳的固定化细胞交联的条件为温 度3 0 。c ，p h 5 5 ，时间6 h 。最适温度3 7 c ，最适d h 7 5 ，在p h 2 和 p h ll 的水溶液中浸泡3 0 m i n 仍然具有酶活。在1 0 0 的高温下放置 1 h 后酶活趋近于o 。连续转化三次后仍有接近8 5 的酶活。 对酶法合成p a l a 的工艺条件进行了研究，得到的最佳发酵条件 为接种量0 5 ，发酵温度3 7 ，培养时间2 8 h ，诱导物添加时间3 h ， 诱导物添加浓度4 9 l ，最佳转化条件为底物类型天门冬氨酸氨，底 物浓度0 i m ，转化温度3 7 c ，转化p h 6 的组合，转化时间在，2 4 h 时 达到最高，此后趋于稳定。 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 关键词：1 3 一丙氨酸，分离纯化，固定化，工艺条件 2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 a b s t r a c t s t u d yo ne n z y m a t i cs y n t h e s i so f p - a l a n d 厄 a b s t r a c t i nt h i se x p e r i m e n t , t h ec o n d i t i o n so fb r e a k i n gc e l l - w a l lo fe c o l i ， e x t r a c t i o nt e c h n i q u e so fa s p a r t i ca c i d1 - cd e c a r b o x y l a s ea n dt h ec e l l s z y m o l o g i cp r o p e r t i e sw e r es t u d i e d t h eb e s tm e t h o df o rb r e a k i n gc e l lw a l li s g r i n d i n ga n da d d i n g1m g m ll y s o z y m e f o r l h , t h eb e s tm e d i u mi sp h 8 ，0 0 5m o l lp h o s p h a t eb u f f e r o p t i m u mt e m p e r a t u r ei s3 7 ，a n d o p t i m u mp hi s7 t h ee n z y m ea c t i v 畸f a l lt o0a f t e rt r e a t m e n ti n10 0 w a t e rf o rl h ，t r e a t m e n ti np h 3w a t e rf o r1ht h ee n z y m ea c t i v i t yi so n l y3 3u 2 4hi st h eb e s tt i m eo ft r a n s f o r m a f t e rs a l t i n g - o u t , i o n - e x c h a n g ea n dg e l c h r o m a t o g r a p h y , t h ee n z y m ew a sp u r i f i e dw e l l a st h el o s so fe n z y m e a c t i v i t yi nt h ee x p e r i m e n t , a n dt h ef i n a la c t i v i t yf a l lt o3 6 6 s t u d yo nt h ec o n d i t i o n so ft h ei m m o b i l i z ec e l lo fe c o l ib l 21 ( d e 3 ) p e t 2 8b ，a n ds t u d yt h ep r o p e r t yo ft h ei m m o b i l i z e dc e l l i m m o b i l i z e d c e l lt h a tt h eb e s tc o n d i t i o n sf o rc r o s s l i n k i n gi s3 0 ，p h 5 5 ，6h t h e o p t i m u mt e m p e r a t u r ei s3 7 。ca n dp h 7 5 l a yt h ei m m o b i l i z e dc e l li np h 2 a n dp h ilw a t e r3 0r a i ns t i l lr e s e r v ee n z y m ea c t i v i t y l a yi ti n10 0 w a t e r f o rl ht h ee n z y m ea c t i v i t ya p p r o a c ht o0 a f t e rt h r e ec o n s e c u t i v et r a n s f o r m s t i l lr e s e l v ea b o u t8 5 o ft h ee n z y m ea c t i v i t y s t u d yo nt h ep r o c e s sc o n d i t i o n so fe n z y m a t i cs y n t h e s i so fp - a l a t h e b e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si s ：i n o c u l a t i o n0 5 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e 2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 a b s t r a ( ：t 3 7 ，2 8hi n c u b a t i o nt i m e ，i n d u c e db ya d d i n gt i m e3bi n d u c e d c o n c e n t r a t i o n4g l t h eb e s tt r a n s f o r m a t i o nc o n d i t i o n si s ：s u b s t r a t et y p e o fa s p a r t a t ea m m o n i a , s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o no f0 1 m ，t r a n s f o r m t e m p e r a t u r e3 7 ，p h 6 ，t r a n s f o r m i n gt i m ei s2 4h ，a f t e r2 4 ht h ep e a ka r e ao f p - a l ab e g i nt os t a b l y k e yw o r d s ：- a l a n i n e ，p u r i f i c a t i o n , i m m o b i l i z a t i o n , p r o c e s sc o n d i t i o n s i v 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 作者签名卸伏牛 日期嘭年舌月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：彳卿。呔讳 日期：好年多月7 日 翩獬2 妊扬醐：j 年月日 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 第一章综述 1 1 天门冬氨酸与b 一丙氨酸及天门冬氨酸e 1 一脱羧酶简介 1 1 1 天门冬氨酸简介 h o v 曼n h 渺2 h h o c c c 渺h 5 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 1 1 21 3 一丙氨酸简介 p - 丙氨酸( b e t a - a l a n i n e ) ，又称为3 氨基丙酸( 3 a m i n o p r o p a n o i ca c i d ) 、3 - 氨 基丙酸，呈白色棱状结晶或正交双锥体结晶，晶体常温下稳定，但在空气中易吸 潮，需干燥保存【5 1 1 6 1 。b 丙氨酸无毒，略带甜味，加热分解温度为1 9 7 1 9 8 c ，熔 点( m p ) 为2 0 0 。i s - 丙氨酸溶于水，微溶于甲醇和乙醇，不溶于乙醚和丙酮。 2 5 c 水溶液中溶解度为5 5 5 9 ，等电点p i 为6 9 。 h 2 h 2 n c o i l c c o h 心 图1 - 29 - 丙氨酸分子结构 f i g 1 - 2p - a l a n i n es m a c m r a lf o r m u l a b 丙氨酸是自然界中唯一存在的b 型氨基酸，它是一种非蛋白氨基酸，1 9 7 2 年由r o s s 和m o n r o e 在尿嘧啶的降解产物中发现的。b 丙氨酸的生理功能主要是 作为代谢的中间产物，它广泛存在于动物、植物、微生物的代谢过程中，对生物 体的生长和发育起着必不可少的作用。 在哺乳动物的神经系统中，它可作为大脑中的神经传递者；离子通道的激活 作用；用于合成神经系统中的二肽，如肌肽，鹅肌肽等；在s n c d ( s a e r a ld o r s a l c o m m i s s u r a ln u c l e u s ) 的系统中，肛丙氨酸是一种有效的神经传递素 刁。b 丙氨酸还 用于刺激胶原质及核酸的合成；它可从分子水平上来抗衰老，是人体自体免疫的 有效保护者。b 丙氨酸是活性生物体内泛酸和辅酶a 生物合成的关键中间体 8 】。 b 丙氨酸的另一个生理功能是它有一种促进黑色素形成的作用。这在有色的生 物体内都普遍的存在。此外，它对节肢动物外壳的形成起了非常重要的作用。n a d a 和n b a n e 是壳质骨化的前体，而p 丙氨酸是n a d a 和n b a n e 合成的前体【9 】。 在药学领域，b 丙氨酸能抑制由组织缺氧引起的钠的积累，因此p 丙氨酸可 用于肝脏移植，震荡引起的肝损伤等。b 一丙氨酸还可作为药剂制备中的沉淀剂，水 的净化絮凝剂。在精细化工领域，p 丙氨酸是混旋泛酸钙的中间体，电镀缓蚀剂， k n o e v e n a g e l 缩合反应的催化剂 5 1 。 6 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 1 1 3 天门冬氨酸q 一脱羧酶简介 l - 天冬氨酸a 脱羧酶( l a s p a r t a t e - a d e c a r b o x y l a s e ，e c 4 1 1 n ，缩写为p a n d ， a d c ) 又称l 天冬氨酸1 脱羧酶，能催化脱去l 天门冬氨酸的a 羧基，生成p 丙 氨酸。该酶是一个四聚体，有四个假折叠的旋转对称体。电子密度分析显示具有 催化能力的丙酮酰基存在于三个活性位点，位于第四个活性位点的是一个酯基， 这个酯基是自身催化加工形成丙酮酰基的中介。在蛋白链的9 、i i 、5 4 、5 7 和5 8 位分别是赖氨酸，组氨酸，精氨酸，苏氨酸和酪氨酸残基，而且绝对保守，在p a n d 催化反应时发挥重要作用。 p a n d 只能以l 天门冬氨酸为底物，专一性很强。酶的反应常数在不同的实验 条件下测得的结果有所区别。w t u i a m s o n 等【lo 】报道用同位素标记法，在4 2 、 o i m o l l 磷酸钾缓冲液( p h 7 5 ) 、5 m m o f le d t a 、i m m o l ll - 天门冬氨酸的反应条 件下反应2 0 m i n ，e c o l iwp a r d ) 的米氏常数k m 值是1 6 0 p m o l l 。c r o n a n t l l 】研究指出 用同位素标记法，在3 7 、o i m o f l 磷酸钾缓冲液( p h 6 8 ) 、2 3 p m o f ll - 天门冬氨 酸的反应条件下反应1 2 h ，e c o l iwp a n d 的米氏常数k m 值约为8 0 “m o l l 。r a m j e e 等【1 2 谰荧光胺衍生l 天门冬氨酸和b 丙氨酸再经瑚? l c 分析，重组e c o i ld h 5 a p a n ) 的米氏常数k i n 和转换数k c a t 分别为1 5 1 - 4 - 1 6l j s n o l l 和0 5 7 s 一。c h o p r a g ： 1 3 】用相 同的h p l c 分析重组m t u b e r c u l o s i sp a n d 的酶活，动力学参数k m 和k c a t 分别为 219 6 b m o l l l 并；f 1 0 6 5 s 。 p a n ) 的最适温度和最适p h 值随菌种而异。据报道e c o l ip a n d 的最适温度是 5 5 c 1 0 1 ，而c g l u t a m i c u m 和m t u b e r c u l o s i sp a n d 的最适温度是3 7 , c 1 4 , 1 s 。 w i l i i a m s o n 等1 明报道e c o l ip a n d 的最适p h 范围为p h 6 8 7 5 。c r 岫一1 1 1 深入研究 发现e c o l ip a n d 的最佳p h 值是7 5 ，在p h 6 8 和8 0 溶液中的反应速率约为p h 7 5 的6 0 。c h o p r a 掣1 6 】发现m t u b e r c u l o s i s 中p a n d 的最佳p h 值是7 0 。 各种能与羰基反应的试剂，如n a b i - h 、d 一环丝氨酸、胼、苯肼等对p a n d 均有 抑制作用，其中羟胺是最有效的抑制剂。6 0 l a n o n 羟胺对p a n d 有8 1 抑制率【1 0 1 1 1 。 这说明p a n i ) 有羰基化合物作为活性基团。w i l l i a m s o n 等证明p a r d ) 活性中心的羰基 本质上是一个丙酮酰基残基。l 谷氨酸、琥珀酸、草酰乙酸、l 丝氨酸、l 广半胱氨 酸、p 羟基d l - 天冬氨酸、d 丝氨酸等l 天门冬氨酸的结构类似物都是该酶的竞争 性抑制剂，而l - 天门冬氨酸的立体异构体d 天门冬氨酸既不是底物也不是酶活抑 7 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 制剂。浓度为1 0 m m 0 儿的单价离子如l i + 、n a + 、n h 4 + 、k + 和二价离子如m n 2 + 、m 矿、 c a 2 + 、f e 2 + 、c 0 2 + 不抑f l ；l j p a n d 酶活，但浓度为2 0 0 m m o l l 的k c l 对p a n d 有6 3 的抑 制作用，1 0 m m o l l 的c u c l 2 对p a n d 有8 8 的抑制作用【l o 】。 d 天门冬氨酸可以用作药物合成的前体、中间体；可以改善食物中蛋白质的 质地，提高味觉；d 天门冬氨酸的n 酰基衍生物可以用作食品防腐剂。p a r t d 可以 拆分d l - 天门冬氨酸制备d 天门冬氨酸和p 一丙氨酸，反应基本上是不可逆的，因而 可以实现产物的高转化率，并得到两个高附加值产物【1 6 1 。c o a 参与构成酰基载体 蛋白，该蛋白作用合成的长链脂肪酸和聚酮化合物在m t u b e r c u l o s i s 发病机理和生 长中发挥重要作用，所以p a n d 可作为药物作用靶标，造成细菌泛酸饥渴而死，是 治疗肺结核的新方法，但目前还没有实际应用，需要深入研究。p a n d 作为其它病 源微生物如h p y l o r i 的药物靶标也在研究。 1 2 酶的提取与纯化 1 2 1 酶的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则 溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋 白质及酶。 1 2 1 1 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用 的溶剂，通常用量是原材料体积的1 - 5 倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白 质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随 着温度的升高而增大，温度高有利于溶解、缩短提取时间。另一方面，温度升高 会使蛋白质变性失活，因此，提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5 以下) 操作。 为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂( 如二异丙基氟磷 酸，碘乙酸等) 。 1 2 1 - 2 有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、 稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的 8 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。 丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，是因为丁醇亲 脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会 引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的p h 及温度选择范围较广，也适用于动植 物及微生物材料。 1 2 1 3 提取液的p h 值和盐浓度的选择 酶是具有等电点的两性电解质，提取液的p h 值应选择在偏离等电点两侧的p h 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生 变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提 取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 稀浓度盐可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋 白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量n a c l 等中性盐，一般以0 1 5 摩尔升浓度为宣。缓冲液常采用0 0 2 0 0 5 m 磷酸盐和碳 酸盐等渗盐溶液。 1 2 2 酶的纯化 1 2 2 1 根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1 2 2 1 1 蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高， 蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度呈不同 程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的 盐离子( 如硫酸铵的s 0 4 2 和嘞有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层， 使之“失水一，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液p h 在蛋白质等电 点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐 浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉 淀。 影响盐析的因素有：1 温度：除对温度敏感的蛋白质在低温( 4 ) 操作外， 一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质( 如血红蛋 白、肌红蛋白、清蛋白) 在较高的温度下( 2 5 c ) 比o 时溶解度更低，更容易盐 9 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 析。2 p h 值：大多数蛋白质在等电点时，在浓盐溶液中的溶介度最低。3 蛋白质 浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来( 共 沉现象) 。因此在盐析前样品要加生理盐水稀释，使蛋白质含量在2 5 3 0 。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸 钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大( 2 5 时饱和 溶液为4 1 m ，即7 6 7 克升；0 时饱和溶解度为3 9 m ，即6 7 6 克升) ，在这一溶 解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其 他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的p h 常在4 5 5 5 之间，当用其他p h 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析， 即把蛋白质溶液装入透析袋内( 常用的是玻璃纸) ，用缓冲液进行透析，并不断的 更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖 凝胶g 2 5 或g 5 0 过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 1 2 2 1 2 等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋 白质的等电点有差别，可利用调节溶液的p h 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀， 但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 1 2 2 1 3 低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低 并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 1 2 2 2 根据蛋白质分子大小不同的分离方法 1 2 2 2 1 透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜， 而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。 1 2 2 2 2 凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有 效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝胶( s e p h a d e xg e d ) 和琼脂糖凝胶( a g a r o s eg e l ) 。 1 2 2 3 根据蛋白质带电性质进行分离 1 0 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 蛋白质在不同p h 环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 1 2 2 3 1 电泳法 各种蛋白质在同一p h 条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率 不同从而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为 载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的p h 梯度，当带一定电 荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的p h 位置就停止，此法可用于分析和 制备各种蛋白质。 1 2 2 3 2 离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂( 如：羧甲基纤维素；c m - 纤维素) 和阴离子交换 剂( 二，乙氨基乙基纤维素；d e a e 纤维素) ，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换 层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用 改变p h 或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。 1 2 2 4 根据配体特异性的分离方法一亲和色谱法 亲和层析法( a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ) 是分离蛋白质的一种极为有效的方法， 它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中 分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体( l i g a n d ) 的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的 混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分 离( s e p a r a t i o n ) ，提纯( p u r i f i c a t i o n ) 和鉴定( c h a r a c t e r i z a t i o n ) 是生物化学中重 要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混 合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。 1 3 固定化技术 酶的化学本质是蛋白质，其催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件 温和、环保无污染等特点。但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有 机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物等物质，纯化困难，不 能重复使用。为了克服这些问题，酶固定化技术于2 0 世纪6 0 年代应运而生并发展 起来。它是模拟体内酶的作用方式( 体内酶多与膜类物质相结合并进行特有的催 化反应) ，通过化学或物理的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及长时间重复使用的一种交 叉学科技术。目前，对固定化酶方面的研究已得到了长足的发展，在理论研究和 应用研究方面取得了许多重要成果。 1 3 1 吸附法忉 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的 方法。只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能 制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。包括物理吸 附法和离子结合法。 物理吸附法( p h y s i c a la d s o r p t i o n ) 是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶 性载体的方法。常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空 玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。 离子结合法( i o nb i n d i n g ) 是指在适宜的p h 和离子强度条件下，利用酶的侧链 解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法( 离子键) 。 最常用的交换剂有c m 纤维素、d e a e 纤维素、d e a e 葡聚糖凝胶等。其他 离子交换剂还有各种合成的树脂如a m b e r l i t ex e 9 7 、d o w ex - 5 0 等。离子交换剂 的吸附容量一般大于物理吸附剂。 影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素：1 p h ：影响载体和酶阴电筒父化，从而 影响酶吸附。2 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。3 蛋白质浓度： 若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。4 温度：蛋 白质往往是随温度上升而减少吸附。5 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速 度要比小分子慢得多。6 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多 孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。 吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯 化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。吸附法 的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验 性强。 1 2 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 1 3 2 包埋法 包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。( 如将聚合物的单体和 酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到 固定化的目的) 。 1 3 2 1 凝胶包埋法 这是将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。聚丙烯酰胺包埋是最常用的 包埋法：先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚 合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。在包埋 的同时使酶共价偶联到高聚物上，它的机械强度高，可以减少酶的脱落。海藻酸 钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子c a 2 + 、矿凝胶 化，操作简单经济。k - 角叉莱胶( 卡拉胶) 冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。 包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰 胺法好。胶原和明胶也是常用的包埋载体。还有聚乙烯醇包埋法。 1 3 2 2 微囊化包埋法 微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于 医学治疗，中空纤维主要适于工业使用。界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法， 它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包 埋。界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。所得的微囊外观好，但不稳定， 有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。 包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的 固定化方法。 包埋法的缺点是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底 物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散 阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。 1 3 3 共价偶联法 是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相 支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上( 借助共价 键将酶的非活性必需的侧链基团和载体的功能基团进行偶连) 。 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 共价偶联法中的几个影响因素：1 载体的物化性质要求载体亲水，并且有一 定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。2 偶联反 应的反应条件必须在温和p h 、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。3 所选择的偶 联反应对酶的其它功能基团副反应尽可能少。4 酶固定化后的构型，尽量减少载 体的空间位阻对酶活力的影响。 共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用， 是目前应用和报道得最多的一类方法。共价偶联法的缺点也很明显。载体活化的 操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。 同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。 1 3 4 交联法 共价交联法的基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向的交 联网状结构。交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白 间或酶分子与载体间进行胶联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络 结构的固定化酶。能起交联作用的试剂很多，但目前常用的交联试剂是戊二醛和 双耦联苯胺2 ，2 二磺酸。交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的 是使酶紧紧地结合于载体上。 共价交联法的四种形式： 1 酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液p n 和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。 操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。 2 酶辅助蛋白交联：当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体蛋白来 增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体 蛋白即辅助 蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。 3 吸附交联法：此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其 他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶 也可称为壳状固定化酶。 4 载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其 中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。 1 4 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 1 3 5 结晶法 结晶法固定化酶包括以下两种方法： 1 先结晶，然后用戊二醛进行交联。 2 先制酶集聚( 沉淀) ，然后用戊二醛交联。 1 3 6 新型酶固定化方法 开发新型酶固定化方法的原则是：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化， 尽量减少或避免酶活力的损失。通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可制 备高活性固定化酶。m o h y 等【1 8 】以1 3 7 c s 为辐射源，通过y 一射线引发将甲基丙烯酸 甲酯接枝共聚于尼龙膜表面，经进一步活化，用于青霉素酰化酶的固定。光偶联 法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由 于条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。l i 等【1 9 1 利用含芳香叠氮基的光活性 酯，在远紫外光辐照下，叠氮基光解生成氮烯与p e s 膜表面的c - h 键间发生插入 反应形成仲胺，将脲酶共价键合到p e s 膜的表面。等离子体是高度激发的原子、 分子、离子以及自由基的聚集体，大量的等离子体常在室温下存在。载体材料表 面可以由等离子体进行有用修饰【2 0 】【2 1 1 ，从而引入活性基团。p u l e o 等【捌将钛合金 t i 一6 a l 一4 v 表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛 合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油 接枝，进而将溶茵酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上 的固定化。 1 3 7 固定化细胞载体及其影响条件 1 3 7 1 天然高分子载体 天然高分子载体包括海藻酸盐、明胶、卡拉胶、海绵等。 1 3 7 1 1 海藻酸盐载体 ，海藻酸盐是一种广泛应用的固定化介质，具有化学稳定性好、无毒、包埋效 率高且价格低廉等优点。 mb e c e r r a 2 3 等利用海藻酸钠为载体，以氯化钙为交联剂包埋乳酸克鲁维酵母 1 5 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 细胞，研究了海藻酸钠珠体的结构与直径对酶活的影响，发现珠体的直径越小， 酶活越高，直径为0 5 5 m m 的珠体细胞酶活是5 m m 的珠体细胞的1 4 倍。 m o n i c ah e r r e r o 2 4 等利用海藻酸钙为载体固定酒类酒球菌细胞对苹果汁进行 乳酸发酵，所使用的海藻酸钠浓度为2 1 ，氯化钙浓度为3 ，所获得的凝胶颗粒 直径为2 9 衄，结果发现，产生的乙醇浓度比游离细胞产生的乙醇浓度大。 海藻酸钙包埋细胞时，凝胶颗粒易发生破损、软化等问题，凝胶颗粒的稳定 性和机械强度较差，不利于固定化细胞的多次利用。 宋向阳【2 5 】等以树干毕赤酵母( p i c h i a s t i p i t i s ) 为发酵菌株，利用海藻酸锰凝 胶代替海藻酸钙，采用混合糖为发酵底物。结果表明，海藻酸锰树干毕赤固定化 增殖酵母细胞能使戊糖和己糖同步发酵，海藻酸锰凝胶耐磷酸盐能力是海藻酸钙 凝胶的3 倍。 董新姣【凋通过海藻酸钙加活性碳的方法对酵母菌进行固定化。结果表明，当 三者配比为海藻酸钠3 ：活性碳1 0 ：氯化钙4 时制得的凝胶颗粒机械强度好， 经久耐用。 1 3 7 1 2 聚乙烯醇、卡拉胶、明胶等载体 郑孝贤【2 7 】等以聚乙烯醇( p v a ) 复合凝胶为载体，利用冻融法固定产旷葡萄糖转 苷酶的黑曲霉细胞。细胞经过固定化后，可以重复多次对甲基旷d - 葡萄糖苷进行水 解反应，酶活力回收率高达2 5 0 ，而且方法简便，成本低廉，操作简单。固定化细 胞机械性能好，更加耐热耐酸，其稳定性大大提高，能满足工业应用要求。 刘阳、曹军卫、翟超【勰】对诱变过的米曲霉菌株用8 明胶包埋，0 1 戊二醛交 联1 2 h 。制得的固定化细胞酶活力为8 1 9 9 u g 。结果表明用明胶一戊二醛法固定米 曲霉菌丝球，方法简便，制备成本低廉，固定化细胞机械性能良好，其酶更加耐 热，并且热稳定性大为提高。 余冬生、邱蔚然等 2 9 】研究用k 卡拉胶、魔芋多糖复合载体固定酵母的条件， 通过正交实验确定了r 卡拉胶、魔芋多糖和去离子水用量。用扫描电子显微镜观 察了固定化酵母冷冻前后的形态变化，固定化酵母多次使用后，其生物合成胞二 磷酸胆碱( c d p c ) 的活性仍较高。 1 3 7 2 合成高分子载体 天然高分子载体，虽然无毒性，传质性能好，但机械强度低，在厌氧条件下 1 6 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 易被微生物分解，寿命短。因此可以利用合成高分子载体，常见的载体有聚乙烯 醇、聚丙烯酰胺等。 蔡军、商亚非、抄冬枝 3 0 】通过选择与所固定细胞表面所带相反电荷的聚丙烯 酰胺，制成聚丙烯酰胺一海藻酸钡复合凝胶，并与普通海藻酸钡凝胶进行比较结果 证明，聚丙烯酰胺固定化细胞，能提高腈水合酶的利用率3 0 3 ，并且凝胶的机械 强度，使用寿命，酶活稳定性等性质也优于普通海藻酸钡凝胶。 用聚丙烯酰胺凝胶在包埋细胞时，由于交联过程中的放热以及交联试剂本身 的毒性，细胞在固定化过程中往往失活。聚乙烯醇凝胶是目前国内外研究最为广 泛的一种包埋固定化载体，它具有强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性强、 对细胞无毒且价格低廉等一系列优点，因而具有很大的利用价值。 刘智敏等【3 1 】用聚乙烯醇固定枯草杆菌用于生产旷淀粉酶发现使用1 0 的p v a 的硼酸，包埋菌量为4 8 时聚乙烯醇凝胶机械强度大，产酶能力高。 由于聚乙烯醇凝胶颗粒具有非常强的附聚倾向，在制各珠体时比较困难。有 些学者 3 2 】【3 3 】成功地运用了以聚乙烯醇为载体主要成分，适量添加少量海藻酸钠和 活性炭等物质。其优点是可克服两颗粒之间的粘连现象，有助于颗粒成型，改善 通透性，增加固定化颗粒的孔隙，达到吸附和包埋的双重效果。 吕晓猛【蚓通过加入海藻酸钠的方法来降低制备聚乙烯醇珠体的难度。研究结 果表明，在聚乙烯醇浓度为1 0 ，氯化钙的浓度为2 时来包埋细胞，获得的珠体 具有较高的活性、较好的强度及传质性能。 童群义等【3 5 】采用聚乙烯醇一卡拉胶混合载体进行实验，研究发现在聚乙烯醇浓 度为1 0 ，卡拉胶浓度为o 5 ，成型剂的p h 值为6 4 ，包埋菌体量为0 5 9 g ，固 定时间为3 6 h 时，固定化细胞具有较好的机械强度和较高的酶活力。 、 1 3 7 3 无机载体 无机载体如多孔陶珠、氧化铝、活性炭等，具有机械强度大、对微生物无毒 性、不易被微生物分解、耐酸碱、成本低、寿命长等特性，因而也是一类重要的 载体材料。 廖朝晖 3 6 】等采用中国景德镇陶瓷经特殊工艺制备出具有5 3 3 9 气孔率和5 1 8 u m 孔径的球形和拉西格环为载体，研究了固定化酵母细胞发酵动力学。实验结 果表明：固定化细胞的球形和拉西格环陶瓷载体的发酵动力学常数与粒径大小存 1 7 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 在明显差异；固定化细胞系统的动力学常数还受到内扩散和外扩散的影响。 程江峰，何国庆【3 7 】将陶瓷拉西环固定化酵母细胞应用于啤酒的连续后发酵。 实验结果表明优化工艺条件后发酵时间可大为缩短。此外，啤酒的主要理化指标 还揭示：采用固定化酵母细胞进行后发酵的新工艺不会影响啤酒的品质。 i s o n oy a s u y u k i 3 8 】采用氧化铝颗粒固定化酿酒酵母，进行分批发酵蔗糖的研 究，最优p h 值为4 ，这一p h 值有利于减少杂菌污染，同时可以促进酵母细胞与氧 化铝颗粒之间的吸附。 m a l l o u c h o sa 【3 9 】等用葡萄皮固定酿酒酵母a x a z l ，葡萄糖和果糖的吸收率和 酒精生产率，在各种温度( 5 2 5 ) 下都比游离细胞快，温度降低酒精产量略有 增加，5 c 的酒精最大产量为0 4 5 9 g 。温度增加酒精的比生产率增加，在2 5 ， 固定化细胞的比生产率比游离细胞大4 倍。用葡萄皮固定化酵母可以加速葡萄酒 酿造，增加酒的香味。 1 3 8 酶的定向固定化及多酶共固技术 传统的酶固定化方法存在的缺点是酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性 位点不能充分暴露，而且酶的固定化量降低【加】，因此定向固定化酶技术将成为今 后固定化酶研究的热点。为了消除因扩散而导致的胰凝乳蛋白酶对蛋白水解的动 力学限制，b li k o v d 等【4 l 】将胰凝乳蛋白酶通过适当的多克隆抗体固定在无孔羟烷基 异丁酸酯的改良微球上。z u z a n a 等 4 2 】用高碘酸钠活化半乳糖氧化酶的糖链，并通 过活化的糖链将半乳糖氧化酶定向固定。由于大分子底物容易接近酶的活性位点， 因而催化动力学参数得到了改善。 为了充分发挥不同酶的各自优势，把不同来源的酶与整个细胞的生物催化性 能相结合，实现多酶共固或整个细胞的固定化，也日益受到研究者的重视。p a l 等 4 3 】将a 一葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶固定于乳胶膜，并将此膜用作生态友好酶乳胶 膜反应器。a t i a m 】用聚乙烯亚胺的氨基彻底覆盖多孔乙醛酸琼脂表面的醛基，并 以此为载体进行环己酮单加氧酶( c h m o ) 和葡萄糖一6 一磷酸脱氢酶( g 一6 一p d h ) 共价 共固的研究。 浙江工业大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文 1 3 9 改性载体及新型载体固定化酶 载体对固定化酶有较大影响，要制得理想的固定化酶，既要选用合理有效的 固定化方法，同时又要有良好的载体。理想的载体要具备良好的机械强度、高结 合能力、物理和化学稳定性及抗微生物降解性等特性。利用性能优良的天然载体， 或借助现代技术对传统载体进行改性及合成新型载体材料等可以改进酶的固定化 技术。 1 3 9 1 改性载体固定化酶 载体改性的实质是通过表面涂层或表面吸附等物理方法以及接枝、聚合等化 学方法实现载体表面物理性质或化学结构的改变。d s o u z a 等【4 5 】将稻壳用聚乙烯涂 层，然后将转化酶吸附