（分析化学专业论文）核酸探针技术用于mrna检测的研究.pdf

博j j 学位论文 摘要 实时获取r n a 合成、转运、表达、定位的信息对分子生物学、病理生理学、 药物的开发及疾病的诊断等研究都具有重要的推动作用。核酸荧光分子探针为 r n a 研究提供了一种强有力的工具，己为我们提供了大量有关r n a 的基本信息。 但是，如何进一步拓展已有核酸分子探针在生命科学与医学中的应用范围，如何 进一步改进或研制新的核酸分子探针来解决生命研究过程中遇到的新问题，如何 实时、动态、灵敏、准确地获取生命活动相关信息，仍然是分析化学工作者所面 临的重大挑战。 本论文瞄准上述挑战进行研究，结合分子信标和相邻探针技术建立了一系列 检测m r n a 的新方法，主要内容包括： 1 建立了一种直接以m r n a 为模板，基于r e v e r s e 分子信标检测单碱基突变 的新方法。本文以重要的肿瘤相关基因p 5 3 为检测对象，利用t 4d n a 连接酶的 高特异性、以及r n a s eh 对r n a d n a 杂交体中r n a 链的降解作用，结合r e v e r s e 分子信标技术，发展了一种快速检测靶基因m r n a 单碱基突变的新方法。该方法 通过比较分析r n a s eh 作用前后样品中荧光信号的变化，确定是否存在单碱基突 变。这种方法探针设计简单，避免了反转录、p c r 扩增、电泳分离等步骤，检测 结果准确，已应用于细胞总r n a 提取物中目标基因的单碱基错配检测。 2 设计合成了超猝灭分子信标。提高分子信标的猝灭效率是优化分子信标检 测性能，提高其检测灵敏度的有效途径之一。本文设计、合成、纯化了常规分子 信标和超淬灭分子信标，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对产物进行解 析，证明其为目标产物。与相同序列的常规分子信标相比，超淬灭分子信标的信 背比可达到11 2 ，比常规分子信标大约高5 倍，信背比的提高主要是通过降低背 景信号达到的。研究还表明，与荧光基团相邻的末端为c 碱基，或者在探针末端 引入与目标互补的序列，也可以提高超猝灭分子信标的检测灵敏度。 3 建立了基于硫代修饰相邻探针直接检测细胞裂解液中m r n a 的新方法。 常规相邻探针用于生物样品中核酸检测时，有可能被核酸酶降解而产生假阴性信 号。本文设计了一种硫代修饰的相邻探针，并用于细胞裂解液中相关m r n a 的检 测。结果表明，硫代修饰探针可以有效抵御核酸酶的降解作用，降低假阳性信号 及假阴性信号。探针设计简单、灵敏度高、与靶分子作用速度快；检测过程中信 号呈逐渐增强模式、可免除洗脱及分离等步骤。 4 建立了基于分子信标荧光增强速率检测活细胞内m r n a 表达的新方法。 常规分子信标在活细胞内m r n a 表达水平的研究中，由于细胞内核酸酶对分子信 标骨架的降解和破坏作用，常导致假阳性信号的产生，对检测结果的准确性影响 i i 核酸探针技术用于m r n a 检测的研究 较大。本文根据肿瘤抑制基因p 2 l 序列设计合成分子信标，通过显微操作将其注 入p 2 l 表达水平存在差异的两种鼻咽癌细胞内，以活细胞成像方式动态检测了分 子信标进入鼻咽癌细胞后荧光信号的变化。p 2 1 分子信标注入两种细胞后，荧光 信号均逐渐增强，约1 5r a i n 后达到最大值；注入细胞后4r a i n 内，两种细胞间荧 光增强速率存在明显差异，该差异反映了p 2 1m r n a 表达水平的变化趋势，与常 规逆转录p c r ( r t p c r ) 结果相符。在使用分子信标进行活细胞内m r n a 表达水 平的研究中，通过分析荧光增强速率的变化，可有效降低细胞内的酶的影响，提 高检测结果的准确性。 5 建立了基于硫代修饰分子信标检测活细胞内m r n a 表达的新方法。本文 针对分子信标在活细胞检测中所面临的生物稳定性的关键问题，用可抵御核酸酶 切的硫代修饰的d n a 设计合成分子信标探针，提高了细胞内检测结果的准确性， 同时还可保持常规分子信标高选择性、高灵敏度以及无需对多余探针洗脱的优点。 该分子信标已应用于转染g f p 基因前后活细胞内靶g f pm r n a 的实时检测。 关键词：核酸分子探针；分子信标；相邻探针；m r n a ；单碱基突变；活细胞 成像 i i ! 博士学位论文 t h ee s s e n t i a li n f o r m a t i o no n a b s t r a c t l o c a l i z a t i o no b t a i n e di n r e a lt i m e r n as y n t h e s i s ，p r o c e s s i n g ，t r a n s p o r t ，a n d w i l lof f e ru n p r e c e d e n t e do p p o r t u n i t i e sf o r a d v a n c e m e n ti nm o l e c u l a rb i o l o g y ，d i s e a s ep a t h o p h y s i o l o g y ，d r u gd i s c o v e r y , a n d m e d i c a ld i a g n o s t i c s a sap o w e r f u lt o o l ，n u c l e i ca c i dp r o b e sh a v e b e e nu t i l i z e di n r n a s t u d ya n de x p l o r e dw e a l t ho fe s s e n t i a li n f o r m a t i o no fr n a h o w e v e r ，h o w t o f u r t h e re x t e n dt h ea p p l i c a t i o n so fn u c l e i ca c i dp r o b e si nb i o l o g ya n dm e d i c i n e r e s e a r c h ，h o wt od e v e l o pn o v e ln u c l e i ca c i dp r o b e st or e s o l v en e wp r o b l e m s ，h o wt o g e tt h ed y n a m i cd a t ao ft h e s el i f ep r o c e s s e ss e n s i t i v e l ya n da c c u r a t e l yi nr e a lt i m ea r e s t i l lg r e a tc h a l l e n g e st oa n a l y s t s i n t h i sd i s s e r t a t i o n ，as e r i e so fm r n ad e t e c t i o nm e t h o d sb a s e do nm o l e c u l a r b e a c o na n da d ja c e n tp r o b eh a v e b e e nd e v e l o p e d t h em a i nr e s e a r c h e so ft h i s d i s s e r t a t i o na r es u m m a r i z e da sf o l l o w s 1 r n a t e m p l a t e ds i n g l e - b a s em u t a t i o nd e t e c t i o nb a s e do nt 4d n al i g a s ea n d r e v e r s em o l e c u l a rb e a c o n an o v e lr n a t e m p l a t e ds i n g l e - b a s em u t a t i o nd e t e c t i o n m e t h o dw a sd e v e l o p e da n da p p l i e dt oi d e n t i f i c a t i o no fs i n g l e b a s em u t a t i o ni nc o d o n 2 7 3o ft h ep 53g e n et a k i n ga d v a n t a g eo ft h eh i g hs p e c i f i c i t yo ft 4d n al i g a s ea n dt h e c a p a b i l i t yo fr n a s eh t od i g e s tr n ai nr n a d n ac o m p l e x o n e - b a s em i s m a t c hc a n b ed i s c r i m i n a t e db ya n a l y z i n gt h ec h a n g eo ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yb e f o r ea n da f t e r r n a s ehd i g e s t i o n t h i sm e t h o dh a ss e v e r a la d v a n t a g e sf o rp r a c t i c a la p p l i c a t i o n s ， s u c ha se a s eo fd e s i g no fd e t e c t i o np r o b e s ；d i r e c td i s c r i m i n a t i o no fs i n g l e b a s e m i s m a t c ho ft h er n ae x t r a c t e df r o mc e l l s ；n or e q u i r e m e n to fp c ra m p l i f i c a t i o n ；a n d p e r f o r m a n c eo fh o m o g e n e o u sd e t e c t i o n 2 d e s i g na n ds y n t h e s i so ft h es u p e r q u e n c h e rm o l e c u l a rb e a c o n i m p r o v i n gt h e q u e n c h i n ge f f i c i e n c y i so n eo ft h eu s e f u l s t r a t e g i e s t o i m p r o v e t h e s i g n a l t o b a c k g r o u n dr a t i oa n d t oo p t i m i z et h es e n s i t i v i t yo ft h em o l e c u l a rb e a c o n i n t h i sw o r k ，n o r m a lm o l e c u l a rb e a c o na n ds u p e r q u e n c h e rm o l e c u l a rb e a c o nw e r e s y n t h e s i z e da n dp u r i f i e du s i n gt h ed n aa u t o s y n t h e s i z e ra n dl i q u i dc h r o m a t o g r a m t h ep r o d u c t sw e r ei d e n t i f i e db ym a l d i t o f m s o u rr e s u l t ss h o w e dt h a t ，t h e s i g n a l t o b a c k g r o u n dr a t i oo fs u p e r q u e n c h e rm o l e c u l a rb e a c o nw a s1 12 ，w h i c hi s 5 t i m e sh i g h e rt h a nt h a to fn o r m a lm o l e c u l a rb e a c o nw i t ht h es a m es e q u e n c e t h e s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e ds i g n a l t o - - b a c k g r o u n dr a t i oo ft h es u p e r q u e n c h e rm o l e c u l a r b e a c o nw a sd u et ot h ed e c r e a s i n go ft h eb a c k g r o u n ds i g n a lo ft h ep r o b e c h o o s i n g i v c y t i d i n ea st h ef i n a ln u c l e o t i d eb a s en e x tt o t h e f l u o r o p h o r e ， o rl e to n ea r mo f m o l e c u i a rb e a c o n b e c o m p l e m e n t a r y t ot h e t a r g e t c a nf u r t h e r i n c r e a s et h e s i g n a l - t o - b a c k g r o u n dr a t i oo ft h es u p e r q u e n c h e r t o o l e c u l a r b e a c o n j u e t e c t l o no fn u c l e i ca c i d i nc e l l l y s a t eu s i n gp h o s p h o r o t h i o a t e - m o d i f i e d a d j a c e n t p r o b e i n0 r d e rt o e l i m i n a t et h e f a l s e n e g a t i v es i g n a l s r e s u i t i n gf r o m n u c l e a s ed e g r a d a t i o no ft h ec o n v e n i e n ta d j a c e n tp r o b ei n b i o l o g i c a ls a m p l ea n a l y s i s ， p h o s p h o r o t h i o a t em o d i f i e da d j a c e n tp r o b ew a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d f o rm r n a d e t e c t i o ni nc e l l l y s a t e r e s u l t ss h o w e dt h a tp h o s p h o r o t h i o a t e m o d i f i e da d i a c e n t p r o b ec a ne f f i c i e n t l yr e d u c et h ef a l s e p o s i t i v ea n d f a l s e n e e a t i v es i g n a l sr e s u i t i n g f r o mn u c l e a s e d e g r a d a t i o n ，t h u s ，i m p r o v i n gt h ea c c u r a c yi nm r n ad e t e c t i o ni n b i o l o g i c a ls a m p l e s p h o s p h o r o t h i o a t em o d i f i e da d j a c e n t p r o b e sa r ee a s yt od e s i g n ， v e r ys e n s l t l v ea n ds e l e c t i v ei nm o n i t o r i n gn u c l e i ca c i d t a r g e t s ，e a s yt oh y b r i dt ot h e t a r g e ts e q u e n c e ，a n da l l o wr a p i dd e t e c t i o ni nc o m p i e x s i g n a l i n ga p p r o a c hi su s e dt od e t e c tt h e u n b o u n dp r o b e s a v o i d e d s a m p l em a t r i x a st h el i g h t u p p r e s e n c eo ft a r g e t s e q u e n c e ，r e m o v i n go f a r en o tn e c e s s a r ya n dt e d i o u sw a s h i n ga n d s e p a r a t i n gp r o c e d u r e sa r e 4 m o n i t o r i n gp 2 lm r n a e x p r e s s i o ni nl i v i n gc e l lb a s e do nm o l e c u l a r b e a c o n 龇r e s c e n c el n c r e a s i n gr a t e t h en o r m a lm o l e c u l a rb e a c o n st e n d t og e n e r a t ef a l s e p o s i t i v es l g n a i sd u et on u c l e a s e d e g r a d a t i o n ，w h e nu s e df o ri n t r a c e l l u l a r m r n a e x p r e s s i o nl e v e la n a l y s i s as p e c i f i cm o l e c u l a rb e a c o n ( p 2 1 m b ) f o rt h ei m p o r t a n t t u m o rs u p p r e s s o rg e n ep 2 1h a sb e e n d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h ef l u o r e s c e n c e s i g n a lw a sd e t e c t e di nr e a l - t i m ea f t e r i n j e c t i n gt h ep 21m bi n t on a s o p h a r y n g e a l c a r c l n o m ac e na n dp 3 3 - t r a n s f e c t e d n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m ac e l l i nb o t hc a s e s t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e s a c h i e v e dm a x i m u mi na b o u t15m i n u t e h o w e v e r - t h e f l u o r e s c e n c e l n c r e a s i n gr a t ew i t h i n 4m i n u t e s r i g h ta f t e rm i c r o i n j e c t i o n w a s s l g n l n c a n t l yd i f f e r e mb e t w e e nt h e s et w oc e l l l i n e s ，i n d i c a t i n gd i f f e r e n tp 2lm r n a e x p r e s s i o nl e v e l s t h er e s u l t so b t a i n e di nt h er e a l t i m ed e t e c t i o nw e r e a l s ov a l i d a t e d b yr t - p c r a n a l y s i s 。ft h ei n i t i a lf l u o r e s c e n e ei n c r e a s i n gr a t ec a n e f f i c i e n t l vr e d u c e t h en u c l e a s ed e g r a d a t i o na n d i m p r o v et h ea c c u r a c yi nl i v i n gc e l lm r n a d e t e c t i o n ，- m r n ad e t e c t i o ni n l i v i n gc e l l u s i n gp h o s p h o r o t h i o a t e m o d i f i e dm o l e c u l a r b e a c o n i no r d e rt or e s o l v et h ei n t r a c e l l u l a r b i o s t a b i l i 够p r o b l e mo fm o l e c u l a rb e a c o n s p h o s p h o r o t h l o a t em o d i f i e dd n a ，w h i c h c a ne f f i c i e n t l yi m p r o v et h en u c l e a s er e s i s 溉eo f m e b a c k b 0 咀eo ft h e d n a ， w e r ec h o s e n t o d e s i g na n ds y n t h e s i z em o l e c u l a rb e a c o n s 上j h o s p h o r o t h i o a t em o d i f i e dm o l e c u l a rb e a c o nc a ne f f i c i e n t l yi m p r o v et h e a c c u r a c vi n l i v i n gc e l im r n ad e t e c t i o nw h i l ek e e p i n gt h e a d v a n t a g e so fm 0 1 e c u l a r b e a c o n s s u c h v 博l ：学位论文 a se x c e l l e n ts e l e c t i v i t y ，h i g hs e n s i t i v i t y , a n dw i t h o u t s e p a r a t i o nd e t e c t i o n ，a n dh a s b e e na p p l i e di nr e a lt i m ed e t e c t i o no fg f pm r n ai nc o s - 7c e l la n dg f pt a n s f e c t e d c o s 7c e l l k e yw o r d s ： n u c l e i ca c i dp r o b e ；m o l e c u l a rb e a c o n ；a d j a c e n tp r o b e ；m r n a ； s i n g l eb a s em u t a t i o n ；l i v i n gc e l li m a g i n g v i 核酸探针技术用于m r n a 榆测的研究 本文所用英文缩写词表 x 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签缸习象讧乞日期：灿孑年堋乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密叫。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：歹移乞日期：翮年肛月夕日 勒签名：址日期：嘶年f2 ，月岁目 博l j 学位论文 1 1m r n a 检测的重要性 第1 章绪论 r n a 既担负着贮藏和转移遗传信息的功能，又能作为核酶直接在细胞内发挥 代谢作用【。美国科学杂志连续三年( 2 0 0 1 2 0 0 3 年) 将有关r n a 的研究成 果列为年度十大科学成就之一【2 4 j 。遗传信息从d n a 到蛋白质的转移过程中，r n a 并非只是起简单的传递遗传信息作用，r n a 可通过各种剪接、编辑和再编码方式， 调控基因表达的方向，调控遗传信息，从而实现对生物发育及分化的调控1 5 ，6 j 。 m r n a 作为d n a 的“信使”和蛋白质合成的“模板 ，在基因遗传活动中起着更 为重要的作用。因此，m r n a 研究不仅对人类了解基因组的结构及功能具有重要 意义，而且对疾病发生机制研究和疾病的防治亦具有重要的价值。 m r n a 的研究离不开m r n a 的检测，其重要性主要表现在以下几个方面： ( 1 ) 对m r n a 进行系统有效的检测和分析可促进人们更为深入地了解和认 识基因，同时也为挖掘基因的应用潜力提供了可能。贮藏在任何基因中的生物信 息都必须首先被转录生成r n a ，才能得到表达。但此时的r n a 并不能立即作为 模板指导多肽的合成，它必须通过剪切、拼接等编辑过程形成成熟的m r n a ，才 能发挥其生物学效应。因此，仅仅了解遗传信息的贮存者d n a 的序列信息是不 够的，我们必须积极开展m r n a 的研究工作，只有这样才能更为全面、深入地认 识和了解基因。 ( 2 ) 许多遗传性疾病、传染性疾病、癌症的发生都与生物体内特定基因结构 的改变或者是外源基因的入侵密切相关。通过m r n a 分析进行基因诊断，一方面 可了解体内重要的疾病相关基因的表达、结构是否发生了改变，另一方面可以了 解外源基因是否入侵，这可以克服常规临床诊断的缺陷，将诊断水平提高到分子 水平。通过基因诊断，人类对病因的了解将更为深入，且可根据检测结果采取相 应措施，有效预防或减轻它们对机体造成的危害1 7 1 。 ( 3 ) 通过检测分析m r n a ，可了解药物作用所导致的细胞内基因表达变化情 况，从而对药物的靶点和效果做出判断和评价，缩短药物研制时间，减少药物研 制费用0 2 , 1 3 】。细胞受到外界刺激或药物作用时，常导致某些基因表达水平的改变， 此时d n a 序列本身并未发生变化。通过检测分析m r n a 表达的变化，可以获取 该药物作用时细胞中表达水平发生相应改变的基因的相关信息，这比仅研究药物 作用时细胞周期、生长、凋亡等相关生物学性状的改变更为准确( 因为不同的基 因表达的变化都可能会导致细胞同一生物学性状的改变) 。这将有效缩短药物作用 核酸探针技术用j - m r n a 检测的研究 的靶基因的寻找过程，使对药物的作用效果的评判更为客观和准确，缩短研制时 间。 ( 4 ) 通过核酸的检测和分析，使人类直接对目的基因进行改造或在特定细胞 内引入特定基因成为可能，基因治疗呈现出广阔前景【1 4 。1 7 1 。 鉴于m r n a 研究的重要性，目前已发展了许多用于m r n a 检测的技术，下面 对这些技术进行简要介绍。 1 2 经典的m r n a 检测方法 1 2 1 反转录p c r 反转录p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r t - p c r ) 是将病 毒或组织细胞内特定的m r n a 片段反转录成e d n a ，然后进行聚合酶链式扩增以 检测相关m r n a 的技术1 8 五0 1 。检测过程中，检测目标呈几何倍数扩增，检测灵敏 度高，可用于细胞中基因表达水平、细胞中r n a 病毒含量的检测。r t p c r 技术 的难点在于：p c r 的线性扩增范围难以确定；反转录过程在3 7 4 2 。c 条件下，温 度较低容易造成非特异产物；扩增产物通常需要电泳检测和测序鉴定。该方法实 验成本相对较高、周期较长，环节较多，容易造成污染从而影响检测结果的准确 性 2 1 , 2 2 】。 1 2 2 实时荧光定量p c r 实时荧光定量p c r ( r e a l t i m eo p c r ) 是一种荧光定量p c r 技术【2 3 彩】，是指 在p c r 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个p c r 进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 2 6 , 2 7 1 。实时荧光定量p c r 借助 荧光信号来检测p c r 产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以采集p c r 过 程中每个循环的数据，建立实时扩增曲线，准确地确定c t 值( 每个反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循坏数) ，从而根据c t 值确定起始d n a 拷贝 数，实现定量检测，较以往常用的终点定量的方法更加准确。实时荧光p c r 扩增 与检测在密闭的p c r 管中完成，减少了实验过程中污染的可能性，且无需进行电 泳和放射性操作。该技术不仅实现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且与常规p c r 相比，具有特异性更强、污染更少、自动化程度高等特点【27 1 。但是，实时荧光定 量p c r 所需成本较高，检测结果有时可能会受到反转录效率和扩增效率的影响， 且难以进行高通量检测。 1 2 3n o r t h e r n 印迹法 n o r t h e r n 印迹法( n o r t h e r nb l o t ) 是放射性探针检测法的典型代表，这种方法 专门用于检测m r n a 的表达水平。放射性探针检测法是将放射性元素预先标记在 博l j 学位论文 核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸掺入到探针分子中或将标记的 核苷酸基团交换到探针分子上的方法1 2 s , 2 9 】。其基本原理是带有标记的单链d n a 和r n a 探针能与解链后的靶d n a 或r n a 进行杂交，形成稳定双链结构，间接 地使目标序列带上标记探针所具有的信号。如果无目标序列存在，则无杂交混合 物形成，故不能检测出信号。核酸杂交可以有多种组合，如r n a r n a ；i a d n a ； d n a d n a 。 n o r t h e r n 印迹法遵循碱基互补配对原则，直接对样品中靶序列进行测定，特 异性强，重复性好，检测结果准确可靠。但这种方法存在操作过程复杂，条件苛 刻，检测灵敏度较低( 最敏感的核酸探针仅能检出10 3 1 0 4 拷贝的靶分子) ，还 容易造成放射性污染等不足。 1 2 4 原位杂交 原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，i s h ) ，也称作杂交组织化学或细胞学杂交， 是一种能够从形态学上证明特异性的r n a 序列存在于特定细胞、组织、或染色 体中的技术【3 0 m 】。其原理是含有互补序列的被标记的单链d n a 或r n a 片段在适 当的条件下与细胞的r n a 杂交形成稳定的杂交体。通过检测标记探针所发出的 信号及其空间分布达到定位检测目标r n a 的目的。 由于放射性探针检测法存在放射污染的缺陷，原位杂交检测中使用的多为非 放射性标记核酸探针，常用的有生物素标记核酸探针、辣根过氧化物酶标记核酸 探针、地高辛标记核酸探针。非放射性标记核酸探针检测操作简便，安全，快速， 但是特异性不高，而且灵敏度略低，重复性较差。 1 2 5 核糖核酸酶保护分析 核糖核酸酶( r n a s e ) 保护分析是近年发展的一种m r n a 定量分析方法【3 3 , 3 4 j 。 其基本原理是利用r n a s ea 降解单链r n a ，但不降解双链r n a 的特性，将标记 的r n a 探针与待测r n a 样品在液相杂交，形成双链r n a ，被保护起来；未结合 的单链r n a 则被r n a s ea 或r n a s et 1 消化降解，通过电泳检测仅见双链r n a 。 该方法灵敏度比n o r t h e r n 杂交高，分析数据真实可靠，可以对多基因表达产物进 行同步检测，但操作复杂、时间长，限制了该方法的广泛应用。 1 2 6 基因表达系列分析 基因表达系列分析( s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 是近几年来发 展的一种快速分析基因表达信息的技术【3 5 , 3 6 】。其检测原理是从每个转录本特定位 置截取1 0 1 1b p 的序列作为s a g e 标签。通过测序检测特定标签的出现数目， 就可以反映它所代表的转录本的表达丰度。为了克服这种基于测序的方法可能存 在的通量限制，s a g e 采取了系列化处理，从而测得的每个序列可以包含2 5 5 0 核酸探针技术用- 1 二m r n a 柃测的f j f 究 个标签。它的显著特点是能够大量获取基因组范围基因表达的类别与丰度，已成 功地应用于各种不同来源样品的转录本研究和m r n a 表达检测。 1 2 7 基因表达谱芯片检测技术 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的，都是应用已知核 酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定 量分析。该技术可将大量的核酸分子同时固定在载体上，一次检测、分析大量的 d n a r n a ，解决了传统核酸印迹杂交检测目标分子数量少、自动化程度低、成本 高、效率低等不足，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛 选与检测分析。使用基因芯片技术可实现对基因表达的个体特异性、组织特异性、 发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性等的综合分析，可 开展基因间相互作用关系的研究p 7 。4 0 。 1 2 8 活细胞内m r n a 检测的常用技术 上述m r n a 检测分析方法一般都需要预先对组织或细胞样品进行裂解或固 定处理，无法实时获取细胞内m r n a 表达变化的动态信息。为了获取细胞内 m r n a 合成、转运、定位等重要生物信息，在活细胞水平对m r n a 进行监测逐渐 受到研究人员的重视，目前活细胞内m r n a 检测的常用技术有m s 2 g f p 标记法、 m r n a 直接标记法。 m s 2 g f p 标记法是指由于噬菌体包膜蛋白( m s 2c o a tp r o t e i n ) 可识别r n a 中的由2 1 个碱基组成，呈茎环结构的序列，并与之特异性结合，利用基因工程技 术，可以构建含有m s 2 包膜蛋白和绿色荧光蛋白( g f p ) 融合蛋白的基因，且可 在目标m r n a 中引入多个m s 2 的识别位点，当目标基因表达时，m s 2 g f p 就可 以与之特异性结合，每个目标m r n a 分子上可以连接多个g f p 分子，通过检测 g f p 的荧光信号的变化情况即可获取目标m r n a 的表达、转运等相关信息1 4 卜4 6 | 。 该方法的不足之处在于：必须首先通过生物工程构建融合蛋白，而且在目标m r n a 分子上必须要有与融合蛋白特异性结合的序列存在；游离的g f p 分子可能会对检 测带来干扰信号；融合蛋白作为报告分子，体积相对较大可能会影响蛋白质与识 别序列的结合1 4 。 m r n a 直接标记法是将直接标记的m r n a 分子通过注射或转染的方式将其传 送到目标细胞内。通过监测标记在m r n a 分子上的信号，了解目标m r n a 分子 在细胞内的活动、定位情况【4 弘5 0 j 。该方法特异性好，数据信号便于处理；其不足 之处在于标记的m r n a 分子可能会影响细胞内正常的生理状态，另外由于进入细 胞内标记的m r n a 分子数目较多，其拷贝数一般都会超过细胞内相应m r n a 分 子表达的拷贝数，因此，所监测到的信息与细胞内源性信息存在一定的差异【4 7 1 。 博上学位论文 1 3 荧光标记核酸分子探针技术在m r n a 检测中的应用 经典的m r n a 检测方法各具优点，并且在生物医学领域、基础和临床研究中 正发挥着巨大的作用。但是，这些方法仍存在操作步骤复杂或费用昂贵等不足之 处。如何改进现有技术、探索新途径，建立费用低、结果可靠、操作方便的新型 检测技术是迫切需要解决的问题。基于荧光标记的核酸荧光分子探针( 特别是基 于荧光共振能量转移原理设计的核酸荧光分子探针) 由于具有背景较低、灵敏度 高、操作简易、适合于活体实时分析等优点，在m r n a 定量检测、基因突变研究、 活细胞内m r n a 检测等领域逐渐引起研究人员的重视。 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 理论由 f 6 r s t e r 等人于1 9 4 8 年首先提出1 5 。该理论认为，一对合适的荧光物质可以构成一 个能量供体( d o n o r ) 和能量受体( a e c e p t o r ) 对，它们之间由于偶极一偶极的相互作 用，激发供体分子的光子能量h v 可能被传递至受体分子，然后受体分子通过发射 出光子h v ( h v h v ) 而松弛。直观表现就是供体和受体之间在合适的距离内( 1 l o n m ) ，以供体的激发光激发，供体产生的荧光强度比它单独存在时要低得多，而 受体发射的荧光强度却大大增加，同时伴随它们的荧光寿命的相应缩短和延长。 能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的 跃迁偶极相对取向、供体与受体的距离等有关。f r e t 效率可根据f 6 r s t e r 公式：e = r 0 6 ( r 0 6 + r 6 ) 来计算，其中r o 为能量转移效率为5 0 时供体基团与受体之间的距 离，r 则是实际情况下两个荧光团之间的距离，在一定范围内，基团间的距离对荧 光共振能量转移效率具有很大的影响。f r e t 已被广泛用于生物大分子结构、性质、 反应机理以及定量分析等方面的研究1 5 2 , 5 3 】。下面将简要介绍几种典型的、应用较 广泛的基于荧光共振能量转移原理设计的核酸荧光分子探针。 1 3 1t a q m a n 探针 t a q m a n 探针上世纪九十年代初由r o c h e 公司发明，属典型f r e t 探针 5 4 1 。 t a q m a n 探针与待测目标链的部分序列完全匹配，长度在2 0 到3 0 个碱基之间， 探针的5 末端标记一个荧光基团，3 末端连有一个荧光猝灭基团。当探针与靶序 列配对杂交时，荧光基团与猝灭基团发生f r e t ，导致荧光猝灭。引物延伸时， 聚合酶的5 3 外切酶活性将探针切断，使荧光基团与猝灭基团分开，荧光恢复发 出荧光信号【5 5 巧7 1 。t a q m a n 探针使得聚合酶链式反应过程的实时监测得以实现， 提高了p c r 过程的定量精度，在科学研究和临床诊断中得到广泛应用 5 5 - 6 4 。其不 足之处在于：为了保持探针与目标杂交的稳定性探针的长度一般在2 0 个碱基以 上，其长度限制了能量转移的效率；通过酶的外切活性切断探针产生信号，定量 检测结果受到酶活性的影响；探针的线性序列构型难以区别单碱基突变。 核酸探针技术用于m r n a 检测的研究 p o l y m e r i z a t i o n 囝= r e p o r t e r 彩= q u e n c h e r c l e a v a g e 图1 1t a q m a n 探针原理图【5 4 i 1 3 2 相邻探针 相邻探针，由两条标记有荧光基团的单链d n a 组成，其中一条探针在3 端 标记一种荧光基团，另一条则在其5 端标记另一种荧光基团【6 5 1 。这两条探针的序 列和目标物的序列配对且相邻，靶序列存在时，探针和目标分子杂交，使得标记 在探针上的两种荧光基团靠近而发生能量转移，通过检测杂交前后二者荧光强度 之比可求出能量转移效率。检测结果中，信号强度与目标物的量成正比，已在 d n a 、r n a 、蛋白质检测、及活细胞内m r n a 分析等领域得到