（生态学专业论文）狒蛛科蜘蛛部分类群遗传多样性及系统发育初步分析.pdf

摘要 狒蛛科( t h e r a p h o s i d a e ) 蜘蛛隶属于蜘蛛目( a r a n e a e ) 、后纺亚目( o p i s t h o t h e l a e ) 、 原蛛下目( m y g a l o m o r p h a e ) 。全球已知有1 1 6 属、9 2 0 种，其中中国己记载有5 属1 0 种， 主要分布在海南、广西、云南、贵州、香港、台湾。根据濒危野生动植物国际贸易公 约( c i t e s ) ，狒蛛科蜘蛛所有种均列入保护名录。我们必须保护和可持续利用该类蜘 蛛资源。保护狒蛛科蜘蛛，除了要保护其栖息地外，还必须保护其遗传多样性。对其遗 传多样性和亲缘关系的研究可以为开展狒蛛科蜘蛛人工养殖、濒危动物保护和利用奠定 基础。 本研究采集广西和越南5 个种群的施氏单蛛( h a p l o p e l m as c h m i d t iv o nw i r t h ，1 9 9 1 ) 2 7 头，海南省4 个种群的海南单蛛( h a p l o p e l m ah a i n a n u m ( l i a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) ) 1 7 头， 海南亚龙湾广西缨毛蛛( c h i l o b r a c h y sg u a n g x i e n s i s ( y i n & t a n ，2 0 0 0 ) ) 4 头，越南西贡 柯氏捕鸟蛛( s e l e n o c o s m i ak o v a r i k i ( s c h m i d t & k r a u s e ，1 9 9 5 ) ) 1 头。应用m td n a c o i 和 m td n a d l o o p ( i 编码区) 两个分子标记。 用m td n ac o l 测定了狒蛛科4 种蜘蛛共4 9 个个体m t d n ac o i 部分序列，结合 g e n b a n ka p h o n o p e l m a s pm t d n ac o i 序列，并将a p h o n o p e l m a s p 做外群，采用软件 c l u s t a l x ，m e g a 3 1 ，d n a s lp a u p 对5 种蜘蛛亲缘关系进行聚类分析。同时采用软件 a r l e q u i n 2 0 ，分别对施氏单蛛和海南单蛛进行遗传多样性分析。获得结果如下： 1 根据遗传距离进行系统发育分析，来自广西和越南的施氏单蛛5 个种群聚为一类， 并和海南单蛛的4 个种群聚在一起，互为姊妹群；同属棒刺蛛亚科的广西缨毛蛛和棒刺 蛛属的柯氏捕鸟蛛距离较近，即这两种蜘蛛的亲缘关系较近。作为外群的a p h o n o p e l m a s p 与广西缨毛蛛演化年代较其它种蜘蛛近。 2 施氏单蛛c o i 测定2 7 个序列，界定了1 1 个单倍型，且其中存在6 个共享单倍型， 平均核苷酸差异数k 为1 0 9 0 4 ，核苷酸多样度p i 值为0 0 0 4 ，单倍型多样度h d 值为o 8 1 8 ， 施氏单蛛遗传多样性较高。a m o v a 分析，8 5 0 7 1 的变异来自施氏单蛛种群内个体间， 群体间的遗传变异为总遗传变异的1 6 4 8 3 ，群体内和群体间的遗传变异都极显著。 3 海南单蛛c o i 测定的1 7 条序列，界定了1 4 个单倍型，3 个共享单倍型。平均核苷 酸差异数为6 6 7 0 8 ，核苷酸多样度p i 值为0 0 7 7 ，单倍型多样度h d 值为o 9 7 8 ，海南单 蛛的遗传多样非常高。a m o v a 分析，5 9 8 8 的变异来自海南单蛛种群内个体间，遗传 变异是极显著的。 用m td n a d 1 0 0 p 测定了狒蛛科3 种蜘蛛共4 7 个个体m t d n ad 1 0 0 p 全长序列， 采用与m td n a c 0 1 分析中相同软件进行分析，结果为： 1 、施氏单蛛d l o o p 测定2 6 条序列，界定了6 个单倍型，5 个共享单倍型，平均核 苷酸差异数为1 1 0 5 ，核苷酸多样度p i 值为0 0 0 4 ，单倍型多样度h d 值为0 7 4 5 。a m o v a 分析5 7 3 7 3 的遗传变异存在于群体内个体间，3 8 2 1 9 的遗传变异来自4 个种群间， 遗传分化都是极显著的，但越南和广西两组种群之间无遗传分化现象。进一步证明，产 自我国广西的种类与产自越南的种类为同种，均为施氏单蛛。施氏单蛛遗传多样性较丰 富。 2 、海南单蛛d l o o p 测定1 7 条序列，界定了9 个单倍型，3 个共享单倍型，平均核苷 酸差异数为6 1 5 ，核苷酸多样度p i 值为o 0 0 7 ，单倍型多样度h d 值为0 8 7 5 。5 8 9 3 的 变异来自海南单蛛种群内个体间，遗传变异也是显著的。 关键词：狒蛛科，m td n ac o i ，m td n a d 1 0 0 p ，遗传多样性，系统发育 i l a b s t r a c t t h es p i d e r st h e r a p h o s i d a eb e l o n gt oo r d e ra r a n e a e ，s u b o r d e ro p i s t h o t h e l a e ，i n f r a o r d e r m y g a l o m o r p h a e t h e r ea r e1 16 9 e n u s e s ，9 2 0s p e c i e sk n o w ni nt h ew o r l d ，a m o n go fw h i c h ， c h i n ah a sr e c o r e d5g e n u s e s ，10s p e c i e s ，w h i c hm a i n l yl o c a t e di nh a i n a n ，g u a n g x i ，y u n n a n ， g u i z h o u ，h o n gk o n ga n dt a i w a n a c c o r d i n gt o ”e n d a n g e r e ds p e c i e so fw i l df a u n aa n d f l o r ai n t e m a t i o n a lt r a d ec o n v e n t i o n ”( c i t e s ) ，a l ls p e c i e so ft h ef a m i l yt h e r a p h o s i d a ea r e i n c l u d e di nt h ep r o t e c t i o no ft h er o s t e r t h e yh a v et ob ep r o t e c t e da n db es u s t a i n a b l e u t i l i z a t i o na sn a t u r a lr e s o u r c e s i no r d e rt op r o t e c tt h e s es p i d e r so ft h e r a p h o s i d a e ，i na d d i t i o n t ot h ep r o t e c t i o no ft h e i rh a b i t a t s ，i ti sa l s on e c e s s a r yt op r o t e c tt h e i rg e n e t i cd i v e r s i t y s t u d y o nt h eg e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e n e t i cr e l a t i o n s h i pc a nl a yt h ef o u n d a t i o nt h a tc u l t u r e do ft h e s p i d e r st h e r a p h o s i d a e ，p r o t e c tt h e s ee n d a n g e r e da n i m a l s i np r e s e n ts t u d y , w ec o l l e c t e d2 7i n d i v i d u a l so ff i v ep o p u l a t i o n so f s c h m i d t if r o m g u a n g x ia n dv i e t n a m 17i n d i v i d u a l so ff o u rp o p u l a t i o n so fh h a i n a n u mf r o mh a i n a n p r o v i n c e ，4i n d i v i d u a l sc g u a n g x i e n s i sf r o m y a l o n gb a y , h a i n a np r o v i n c e ，1i n d i v i d u a l s k o v a r i k ia n da n a l y s e dg e n e t i cd i v e r s i t ya n dp h y l o g e n yo ft h es p e c i e s ，u s i n gb o mm td n a c o ia n dm td n ad l o o p ( n o n - c o d i n gr e g i o n ) a sm o l e c u l a rm a r k e r s m a j o rc o n c l u t i o n sa r e f o l l o w i n g ： 1 p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f5 s p e c i e so fs p i d e r sb yg e n e t i cd i s t a n c e ，h s c h m i d t ia n d h h a i n a n u mi sas i s t e rg r o u p ，a n dc l u s t e rt o g e t h e re a c ho t h e r g e n e t i cd i s t a n c ea n dg e n e t i c r e l a t i o n s h i po fcg u a n g x i e n s i sa n ds k o v a r i k ia r ec l o s e r a sao u t g r o u pa p h o n o p e l m a s p ， e v o l u t i o nt i m eo fo u t g r o u pa n dc g u a n g x i e n s i si ss h o r t e rt h a nt h eo t h e rs p e c i e s 2 2 7 且s c h m i d t ic o is e q u e n c e s ，d e f i n e dt h e1 1 h a p l o t y p e s ，t h e r e a r es i xs h a r e d h a p l o t y p e s t h ea v e r a g en u m b e ro fn u c l e o t i d ed i f f e r e n c e sf o r1 0 9 0 4 ，n u c l e o t i d ed i v e r s i t y v a l u ef o r0 0 0 4 ，h a p l o t y p ed i v e r s i t yv a l u ef o ro 。818 ，h s c h m i d t ih a sh i 出g e n e t i cd i v e r s i t y b y a m o v aa n a l y s i s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e n e t i cv a r i a t i o nw a s8 5 0 71 w i t h i n p o p u l a t i o n s ，16 4 8 3 a m o n gp o p u l a t i o n s ，b o t ho fg e n e t i cv a r i a t i o na r es i g n i f i c a n t 3 1 7hh a i n a n u mc o i s e q u e n c e s ，d e f i n e dt h e1 4h a p l o t y p e s ，t h e r ea r e3s h a r e dh a p l o t y p e s t h ea v e r a g en u m b e ro fn u c l e o t i d ed i f f e r e n c e sf o r6 6 7 0 8 ，n u c l e o t i d ed i v e r s i t yv a l u ef o r o 0 7 7 ， h a p l o t y p ed i v e r s i t yv a l u ef o r0 9 7 8 ，h h a i n a n u mh a sm u c hh i g h e rg e n e t i cd i v e r s i t y a m o v a i i i a n a l y s i s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e n e t i cv a r i a t i o nw a s5 9 8 8 w i t h i np o p u l a t i o n so f h h a i n a n u m ，t h eg e n e t i cv a r i a t i o ni ss i g n i f i c a n t 4 7i n d i v i d u a l so ft h r e es p e c i e so ft h es p i d e r st h e r a p h o s i d a ef u l l l e n g t hs e q u e n c eb ym t d n a d l o o p ，t h ea n a l y s i ss o f f w a r e s a r et h et h es a m es o f t w a r eo fm td n ac o i t h er e s u l t sa s f o l l o w s ： 1 2 6h s c h m i d t id l o o ps e q u e n c e s ，d e f i n e ds i xh a p l o t y p e s ，t h e r ea r e 5s h a r e dh a p l o t y e s ，t h e a v e r a g en u m b e ro fn u c l e o t i d ed i f f e r e n c e sf o r1 10 5 ，n u c l e o t i d ed i v e r s i t yv a l u ef o r0 0 0 4 ， h a p l o t y p ed i v e r s i t yv a l u ef o r0 7 4 5 b ya m o v aa n a l y s i s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e n e t i c v a r i a t i o nw a s5 7 3 7 3 w i t h i np o p u l a t i o n s ，3 8 219 a m o n gf o u rp o p u l a t i o n s ，b o t ho fg e n e t i c v a r i a t i o na r es i g n i f i c a n t t h eg e n e t i cv a r i a t i o ni sn o td i f f e r e n c e sp o p u l a t i o nf r o mb e t w e e n g u a n g x ia n dv i e t n a m h s c h m i d t i sh a v er i c hg e n e t i cd i v e r s i t y 2 17 h h a i n a n u md l o o ps e q u e n c e s ，d e f i n e dt h e9h a p l o t y p e s ，t h e r ea r e3s h a r e dh a p l o t y p e s t h ea v e r a g en u m b e ro fn u c l e o t i d ed i f f e r e n c e s6 15 ，n u c l e o t i d ed i v e r s i t yv a l u ef o r o 0 0 7 h a p l o t y p ed i v e r s i t yv a l u ef o ro 8 7 5 a m o v aa n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e n e t i c v a r i a t i o nw a s5 8 9 3 w i t h i np o p u l a t i o n so f h h a i n a n u m ，t h eg e n e t i cv a r i a t i o ni ss i g n i f i c a n t k e yw o r d s ：t h e r a p h o s i d a e ，m i t o c h o n d r i a ld n ac o i ，m i t o c h o n d r i a ld n ad l o o p ，g e n e t i c d i v e r s i t y ，p h y l o g e n e t i c i v 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：年月日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： 一文献综述 文献综述 1 1 遗传多样性的概念及其意义 生物多样性( b i o l o g i c a ld i v e r s i t y ，b i o d i v e r s i t y ) ，通常是指生命有机体及其借以存在 的生态复合体的多样性和变异性【l 】，是所有生物种内遗传变异和它们的生存环境的总 称。研究的范围包括有植物、动物、微生物物种及它们所拥有的基因和其所有的生态系 统1 2 1 ，是生命有机体的种类和变异性及其借以存在的生态的复合体。生物多样性包括物 种多样性( s p e c i e sd i v e r s i t y ) 、遗传多样。l 生( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 和生态系统多样性( e c o s y s t e m d i v e r s i t y ) 和景观多样性四个层次【3 】。 遗传多样性( h e r e d i t yd i v e r s i t y ) 或称基因多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 是生物多样性的 核心和重要组成部分，是遗传信息的总和，具体表现在种内或种间外部形态特征、核型 特征( 染色体数目、形态、分布特征等) 、基因表达产物( 蛋白) 以及d n a 水平的多样性。 遗传多样性的产生是由于遗传信息在外界或内在的因素作用下，在复制过程中出现差错 ( 如d n a 片段的倒位、易位、缺失或转座等) ，从而导致了不同程度的遗传变异。遗传 多样性最直接的表达形式就是遗传变异的高低。然而对任何一个物种来说，个体的生命 是短暂的，由个体构成的物种或种群系统在时间上连续不断才是进化的基本单位。这些 种群或种群系统在自然界中有其特定的分布格局，故遗传多样性不仅包括变异水平的高 低，也包括变异的分布格局，即种群的遗传结构。种内遗传变异的大小和种群的遗传结 构共同决定了一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力【4 】。遗传多样性的研究具有重 要的理论意义和实际意义。首先，遗传多样性是物种生存和发展的前提。遗传多样性越 高或遗传变异越丰富，对环境的适应力就越强，越容易扩展其分布范围，遗传变异的大 小与进化速率成正比，因此对遗传多样性的研究有利于了解物种或种群的进化历史、分 类地位和相互关系，也能进一步分析其潜力，有利于对物种濒危灭绝原因及过程的探讨。 其次，对遗传多样性的认识是各分支学科的背景材料，能为资源的保存、利用、保种特 别是育种和遗传改良提供理论依据 1 2 遗传多样性的研究方法 从远古时代开始饲养动物起，人们就开始了对生物遗传多样性的认识和利用。但将 这个问题进行科学的总结并提高到理论高度进行系统化论述的首推达尔文的物种起 湖北大学硕七学位论文 源，随着生物学，尤其是遗传学和分子生物学的发展，检测遗传多样性的方法也逐步 发展和完善起来。遗传多样性研究的方法主要包括四个：形态学标记( m o r p h o l o g i c a l m a r k e r ) ；细胞学标记( c y t o l o g i c a im a r k e r ) ；生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r ) 和分子标记 ( m o l e c u l a rm a r k e r ) 。 1 2 1 形态学标记 从形态学或表型性状上来检测遗传变异是最古老也最简易的方法。传统的检测方法 是根据个体间的形态差异( 毛色、体重、体尺等) 来区分某些特殊个体的。由于表型和基 因型之间存在着基因表达、调控、个体发育等复杂的中间环节，根据表型上的差异来反 应基因型上的差异就成为用形态学方法检测遗传多样性的关键所在。通常所用的表型性 状主要有两种，一种是符合孟德尔遗传规律的单基因性状，另一类是多基因决定的数量 性状。由于第一类表型性状数量较少，且由单基因决定，易受环境条件、人为因素、测 量工具及基因显、隐性等因素的影响，遗传表达不稳定，因此，在有些情况下并不能完 全真实全面地反映遗传多样性。而数量遗传性状的研究由来已久，但是由于存在环境因 素参与的基因型与表现型之间复杂的表达调控，再加上个体发育等一系列复杂的中间环 节，使得更深层次的研究较为困难。 1 2 2 细胞学水平 细胞学水平上对生物遗传变异的研究，主要是通过染色体组型分析和染色体分带技 术实现的。染色体组型或称核型是把动植物、真菌等的某一个或某一群体的体细胞内整 套染色体，按染色体的相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等参数将所有染色 体系统排列，可代表一个物种的染色体特征。染色体分带技术是将某物种染色体制片用 不同物化手段处理，再用不同染料染色，在荧光激发下染色体臂会显示出不同的带数， 如g 带( g i e m s ab a n d i n g ) ，c 带( c o n s t i t u t i v eh e t e r o c h r o m a t i nb a n d i n g ) ，n 带( n u c l e o l a r o r g a n i z e rr e g i o nb a n d i n g ) 等，可明确鉴别许多物种核型中的任意一条染色体。染色体是 遗传物质的载体，染色体结构和数目的变异是生物遗传变异的重要来源。染色体数目的 变异包括整倍体变异和非整倍体变异，染色体结构的变异包括缺失、重复、倒位、易位。 染色体的多态性是生物对环境条件的适应和长期自然选择进化的结果。染色体原位杂交 ( c h r o m o s o m ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 是细胞学方法和分子杂交技术相结合的产物，是指 利用特异性核苷酸片段作探针，直接同染色体上的d n a 片段杂交，在染色体上显示特 2 一文献综述 异的d n a 或r n a 。最初是采用放射性同位素标记探针，杂交后通过放射自显影显示杂 交信号，最近主要发展以非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异性核酸片段，杂 交信号经酶联显色或荧光显示的杂交技术，特别是荧光原位杂交技术( f l u o r e s c e n c ei n s i r eh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 1 5 - 7 】。原位杂交的优点是准确直观，在用整个基因组d n a 或基 因组特异重复序列作探针时，可以明显区分不同的物种的染色体组成，在鉴定染色体构 型和结构变异、物种起源演化方面有重要作用【8 】。 随着染色体研究技术的发展也显示了它的缺点：细胞学标记材料需要花费较大的人 力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难 以用细胞学方法进行检测。 1 2 3 生化标记 生化标记主要是用生物大分子或生物化合物作为遗传标记的方法，一般是用酶 进行标记。由于蛋白质分子比酚类化合物、黄酮类化合物、糖苷分子的分离和检测更加 简单快捷，因而成为有用且可靠的遗传标记。用作遗传标记的蛋白质通常分为酶蛋白质 和非酶蛋白质两种。蛋白质是基因表达的产物，与形态性状、细胞学特征相比，数量上 更丰富，受环境影响更小，能更好的反映遗传多态性，因此蛋白质标记是一种较好的遗 传标记，已被广泛应用于物种起源和进化研究、种质鉴定、分类和抗病性筛选等领域。 但蛋白质标记仍存在许多不足，如每一种同工酶标记都需要特殊的显色方法和技术，最 关键的不足是其标记的数量还比较有限。虽然至今发展的酶系统大约可以鉴定1 0 0 多个 位点，但在某特定的动物群体中，仅有1 0 2 0 种同工酶，大约3 0 4 0 个等位基因可表现 出多态性，这样的数目还远远不能满足标记辅助育种的需要。 由于其经济方便、易于操作，受到广泛应用，特别是在品种质量纯度鉴定以及动植 物群体遗传结构研究方面。其缺点是实验结果随动植物不同发育时期、器官及环境而变 化，可利用的遗传位点比较少，对电泳分析的样品要求较高。 1 2 4 分子标记 分子遗传标记是指d n a 水平的遗传标记，故亦称d n a 分子标记，包括核d n a 标 记和线粒体d n a 标记。d n a 分子标记是在二十世纪八十年代后兴起的，它是d n a 水 平上遗传多态性的直接反映。d n a 水平的遗传多态性表现为核苷酸的序列的任何差异， 哪怕是单个核苷酸的变异，因此，只有分子水平的遗传标记才能更直接、更客观地反应 3 湖北大学硕士学位论文 生物的遗传变异情况。分子标记多态性可反映基因组d n a 的差异程度，它具有如下特 点：揭示变异的本质，以核苷酸碱基序列的形式表现，不存在表达与否、表达量是否 受影响的问题；多态性高，存在许多等位变异；标记数量极多，遍布整个基因组； 分子标记为中立性位点，与不良性状无必然连锁，许多标记表现为共显性，能区分纯 合基因型和杂合基因型。目前，d n a 标记已广泛地应用于种质研究、遗传图谱构建、 目的基因定位和分子辅助选择等各个方面。d n a 分子标记的种类繁多，但依其使用的 分子生物技术方法不同，大致可分为四大类： 1 2 4 1 基于s o u t h e r n 杂交技术的分子标记 该技术利用限制性内切酶酶解不同生物体d n a 分子后，用特异探针进行s o u t h e r n 杂交，通过放射性自显影或非同位素来检测d n a 的多态性。其可靠性高，是共显性。 但d n a 用量大，操作繁琐，技术复杂，工作量大，有放射性危害。主要有： ( 1 ) 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a m e n tl e n g t hp o l y m o r p b _ i s m ) ，简称r f l p ， 是出现最早，应用最广泛的d n a 标记技术之一【9 】。r f l p 标记非常稳定，它是一种共显 性标记，在分离群体中可区分纯合体与杂合体，提供标记位点完整的遗传信息。多种农 作物的r f l p 分子遗传图谱已经建成。但其分析所需d n a 量较大，步骤较多，周期长， 制备探针及检测中要用到放射性同位素，尽管可用非放射性同位素标记方法代替，但成 本高、成功率低，且实验检测步骤较多，依然影响其使用、推广。 ( 2 ) 微卫星d n a ( m i n i s a t e l l i t ed n a ) 又称数目可变串联重复序歹i j ( v a r i a b l en u m b e ro f t a n d e mr e p e a t ，v n t r ) 是一种重复d n a 小序列，为1 0 一几百核苷酸，拷贝数1 0 1 0 0 0 0 不等【m 1 1 1 。多态性由于重复单位之间的不平衡交换，从而产生不同等位基因，可通过杂 交检测出。其缺点是多态性分布集中，合成探针困难，应用并不广泛。 1 。2 4 2 基于p c r 技术的分子标记 p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 技术即聚合酶链式反应，是由m u l l i s ( 穆里斯) 于 1 9 5 5 年发明的，m u l l i s 也因此获得1 9 9 3 年的诺贝尔化学奖【1 2 】。p c r 是利用d n a 聚合 酶进行体外扩增d n a 的技术，方法简便、快速。p c r 技术问世不久，便以其简便、快 速和高效等特点迅速成为分子生物学研究的有力工具，尤其是在d n a 标记技术的发展 上更是起到了巨大的作用。现在p c r 仪已经成为每个分子生物学实验室必备的实验设 备。根据使用引物的特点可将基于p c r 技术的分子标记概括为两种类型： ( 1 ) 特异引物p c r 4 一文献综述 特异引物p c r 所扩增的d n a 区段是事先已知的，具有特异性，它依赖于对各个物 种基因组信息的了解。例如s s r ，s c a r ，s t s 。这类标记为共显性，多态性高，分辨 率高，稳定性强，重复性好，速度快，自动化程度高。简单序列重复( s s r ，s i m p l es e q u e n c e r e p e a t ) 又称微卫星d n a ，是一类由1 - 6 个碱基组成的d n a 序列。不同等位基因间的重 复数存在丰富的差异，且重复序列两侧多是相对保守的单拷贝序列，可以通过设计特异 引物，对基因组总d n a 进行p c r 扩增，扩增片段的长度多态性可用作分子标记。微卫 星标记多态性丰富，重复性好，标记多呈共显性，在基因组中分散分布，现已证明微卫 星d n a 存在于绝大多数真核生物基因组中【l3 1 。s s r 的基本重复单位是有几个核苷酸组 成的，重复次数一般为l o 5 0 次。同一类微卫星d n a 可分布在基因组的不同位置上， 由于基本单元重复次数的不同，而形成s s r 座位的多态性，每个s s r 座位两侧一般是 相对保守的单拷贝序列，因此可根据两侧序列设计一对特异引物来扩增s s r 序列。检 测s s r 标记的关键在于设计出一对特异的p c r 引物，为此，必须事先了解s s r 座位两 侧的核苷酸序列，寻找其中的特异保守区。s s r 标记的最大优点是具有大量的等位差异， 多态性十分丰富，但是s s r 标记必须依赖测序设计引物，开发成本高。s c a r ( s e q u e n c e c h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ) 标记，即序列特异性扩增区域，是由r a p d 、a f l p 标记 转化而来的。由于r a p d 的稳定性较差，为了提高r a p d 标记的稳定性，在对基因组 d n a 作r a p d 分析后，将目标r a p d 片段进行克隆测序，根据r a p d 片段两端序列设 计特定引物( 特异性引物包括原来r a p d 分析所用的1 0 b p 和r a p d 标记末端延伸出来 的约1 4 b p 左右的碱基，一般为2 4 个碱基) ，以此引物对基因组d n a 再进行p c r 特异 扩增，这样就可把与原r a p d 片段相对应的单一位点鉴别出来。s c a r 在基因定位和遗 传作图中的应用比r a p d 和其它利用随机引物的方法更好，因为它使用的引物长，具 有更高的可重复性。s c a r 标记按简单的孟德尔方式遗传，在不同个体之间可能表现为 存在或缺失，为显性标记：也可能表现为扩增片段长度的差异为共显性标记。 ( 2 ) 随机引物p c r 随机引物p c r 所扩增的d n a 区段是事先未知的，具有随机性和任意性，应用这种 标记技术可以在基因组中寻找未知的多态性座位作为新的d n a 标记。随机引物p c r 扩 增的d n a 区段产生多态性的分子基础是模板d n a 扩增区段上引物结合的碱基序列发 生了突变，因此不同来源的基因组在该区段( 座位) 上将表现为扩增产物有无的差异或扩 增片段大小的差异。其中第一种情况较为常见，因此随机引物p c r 标记通常是显性的， 但有时也会表现为共显性，即扩增片段长度的差异。与r f l p 相比，操作简便，自动化 5 湖北大学硕士学位论文 程度高，但稳定性稍差。目前，常用的随机引物p c r 标记主要有r a p d ，d a f ，s p a r 等，其中r a p d 标记使用较多。r a p d 标记所用的引物长度通常为9 1 0 个碱基，大约 只有常规p c r 引物长度的一半，使用短的p c r 引物是为了提高揭示d n a 多态性的能 力【1 4 。15 1 。由于引物较短，所以在p c r 中必须使用较低的退火温度，以保证引物能与模 板d n a 结合。在r a p d 分析中，通常每次p c r 反应只使用一种引物，在这种情况下 只有两端同时具有某种p c r 引物结合位点的d n a 区段才能被扩增出来；如果将两种引 物组合使用，则还可扩增两端分别具有其中一种引物的结合位点的d n a 区段，产生新 的带型，找到更多的d n a 分子标记，在实验材料多态性程度较低时，可考虑用这种方 法。r a p d 引物己经商品化，可以直接购买，商品化的r a p d 引物基本能覆盖整个基因 组，检测的多态性远远高于r f l p 。 1 2 4 3 基于p c r 与限制性酶切技术相结合的d n a 标记 这类d n a 标记可分为两种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显 示限制性片段长度的多态性，如a f l p ；另一类是通过对p c r 扩增片段的限制性酶切来 揭示被扩增区段的多态性，如c a p s 标记。a f l p 技术是1 9 9 2 年由荷兰科学家v o s 等 发明的一种检测d n a 多态性的方法，被认为是迄今为止最有效的分子标记【16 1 。a f l p 的原理是基于对基因组d n a 双酶切经p c r 扩增后的限制性片段进行凝胶分析。具体的 说就是基因组d n a 经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段， 酶切后的d n a 片段被连上人工接头形成带接头的特异片段，作为p c r 扩增的模板，根 据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，通过接头序列和p c r 引物的识别，只有那 些与引物的选择性碱基严格配对的d n a 片段才能被扩出来，扩增产物通过变性聚丙烯 酞胺凝胶电泳将限制性扩增片段分离。它既有r f l p 的可靠性，又有r a p d 的简便性。 1 2 4 4 基于单核苷酸多态性的d n a 标记 如s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ) 是新近发展起来的一种基因组分子标记，可 以检测出基因组中因一个碱基的不同而产生的d n a 多态性。s n p 主要是指由基因组核 苷酸水平上的变异引起的d n a 序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插 入、缺失等。该标记的特点是：( 1 ) 高密度、数量多，在人类基因组中大约平均每1 0 0 0 b p 就会出现一个s n p ，这样s n p 在人类基因组的分布达3 百万个【1 7 】，平均遗传距离为 2 - 3 c m ，比微卫星密度高；( 2 ) 代表性，即某些位于基因表达序列内的s n p 有可能直接影 响蛋白质结构或表达水平；( 3 ) 遗传稳定性比微卫星高；( 4 ) s n p 的获得与基因组序列密 6 一文献综述 切相关，大量s n p 的获得在己知基因组序列的模式生物中容易，但在基因组序列未知 的物种中难于实现。因此，s n p 主要应用于人及模式生物的研究。 1 3 分子标记线粒体d n a 以及在蜘蛛目蜘蛛中的应用 1 3 1 动物线粒体简介 线粒体，作为高等动物唯一的核外遗传物质，目前己被广泛应用于动物起源进化、 亲缘关系、遗传变异、系统发育等方面的研究。线粒体在每个细胞中含有1 0 0 0 1 0 0 0 0 个拷贝，数目因细胞种类不同，如肝细胞内有1 0 0 0 1 6 0 0 个线粒体。尽管线粒体仅占整 个真核生物总量的1 以下，但在物种不同层次的遗传分化研究方面具有独到优势，也 研究的最为深入广泛，尤其是随着限制性内切酶、序列分析，聚合酶链式反应等分子生 物技术的建立与发展，研究线粒体己经成为动物保护遗传学、分子系统学和地理系统学 研究的重要技术途径。 1 3 1 1 动物线粒体基因组的基本结构 线粒体基因组是一种共价密闭环状双链，在动物界中其结构大致相同。根据碱性 氛化密度梯度离心结果，其双链密度不同，可分为重链( h 链) 和轻链( l 链) 。大多数动 物的线粒体由3 7 个基因和一段长度可变的非编码序列组成，包括2 个r r n a 基因 ( 1 6 s r r n a 和1 2 s r r n a ) ，2 2 个t r n a 基因、1 3 个m r n a ( 蛋白质) 基因( 分别为细胞色素 c 氧化酶亚基i 、i i 、i i i ( 即c o i 、c o i l 和c o i i i ) ，细胞色素b ( c y t b ) ，a t p 合成酶亚 基6 和8 ( a t p a s e 6 和a t p a s e 8 ) ，n a d h 脱氢酶亚基。蛋白质基因n d 6 和其中的8 个t r n a 基因由l 链编码，其余的基因均由h 链编码。除编码区外，动物还有两段长度可变的 非编码区，一段是m t d n a 复制及转录的起点，即l 链复制起始区；另一段是控制区 ( c o n t r o lr e g i o n ) ，又称为d 环区( d i s p l a c e m e n t l o o pr e g i o n ，简称为d l o o p ) ，在无脊椎 动物中，因该区域的a 、t 含量高，又被称为a + t 丰富区( a + t - r i c hr e g i o n ) 或非编码区 ( n o c o d i n gr e g i o n ) ，是整个线粒体基因组序列和长度变异最大的区域，包括转录的终 止相关序y u ( t a s ) 和m t d n a 复制起始有关的序列( c s b ) 。 i 3 1 2 动物线粒体基因组的特点 0 ) m t d n a 的基因结构特点 m t d n a 基因的排列紧凑，结构稳定、分子量小，除与复制和转录有关的一小段区域 7 湖北大学硕士学位论文 外，其他序列无内含子和转座子，也没有基因间隔序列。2 + r r n a 基因紧紧相邻，2 2 个 t r n a 基因位于r r n a 和1 3 个蛋白质基因之间。上述结构与核基因组对比，认为是高度经 济有效的。m t d n a 基因分子量小，分子大小为1 5 2 0 k b ，绝大多数动物介于1 6 1 8 k b 之间， 节肢动物m t d n a 的全长序列为1 4 3 9 8 1 9 5 1 7 k b ，因为节肢动物线粒体基因组大小的变化 受a + t 丰富区长度变化的影响十分显著。a + t 丰富区的长度最短为2 6 3b p ，最长达 4 6 0 1 b p ，两者相差4 3 3 8 b p 。前者见于血红扇头蜱，后者见于黑腹果蝇。a + t 一丰富区的 这种长度变化主要与重复单元( r e p e a tu n i t ) 的长度和拷贝数的变化有关【1 8 】。哺乳动物的线 粒体长度只有1 6 k b 左右，广泛存在于动物各组织中，拷贝数高，易于分离和纯化【1 9 珈j ， 重复性好【2 。 ( 参m t d n a 的母系遗传 动物线粒体的遗传传递属于一种无性传递方式一母系遗传( m a t e n a li h e r i t a n c e ) ，即 仅通过卵子细胞质传给下一代，使得子代的m t d n a 与雌性亲体一致，所以又称为核外 遗传。m t