（物理化学专业论文）反胶束中脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯.pdf

摘要 f c 有机合成中的酶催化酯化反应已成为立体选择有机化学的一个成 型的工具，且有一些专著和大量的综述。然而大部分这方面的文献报道 均是基于长链底物的反应，短链酸和醇的酯化反应很少受到人们的注 意。低分子量的酯对很多种水果的气味感觉有关键作用。它们主要是由 短链脂肪酸的衍生物如：乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯或异丁酸酯组成。异 戊酯价值较高，有很大的商业需求，被广泛应用于食品、饮料、化妆品 和制药行业中。天然的气味酯来源于植物，量少价格高，况且气味的质 与量因地域不同而差别很大。大多数此类酯可以由酸与醇在较高的温度 下化学催化反应制得。然而近来消费趋势倾向于天然食品，生物催化要 比化学催化有优势，因为生物催化的产品会带有一种天然的招牌。与以 传统方法制得的类似的酯相比，由象脂肪酶这样的酶催化合成的酯的气 味要好得多。 目前已经有人利用固定化脂肪酶r h i z o m u c o rm e i h e i 。l i p o z y m e i m 2 0 在有机溶剂j 下己烷中催化异丁酸与异戊醇酯合成反应来制备异丁 酸异戊酯，取得了较好的效果。但此种脂肪酶成本太高，不利于应用在 工业生产中。而应用反胶束作为未反应器以脂肪酶催化此反应未见报 道。我们选择了一种价格与之相比低得多、来源广泛的脂肪酶( 其在有 机溶剂中催化此反应的活性远不如r h i z o m u c o rm e i h e i l i p o z y m e i m 一2 0 ) ，采用反胶束为固定化方法，系统研究了两种具有代表性表面活 性剂a o t 和c t a b 与正己烷构成的反胶束体系中，影响反应转化率和 酶活性诸因素：含水量、缓冲溶液p h 值、反应温度、底物酶的比例 等因素的作用规律，优化出两种反胶束体系中制备异丁酸异戊酯的最适 宜反应条件。实验表明，两种反胶束体系均为所选定的脂肪酶( c c l ) 提供了适宜的环境。与有机溶剂中相比，表现出超活力，分别为有机溶 剂中的4 倍和6 倍，其中a o t 体系中脂肪酶c c l 的活性接近文献报道 值，c t a b 反胶束体系中脂肪酶c c l 的活性已超过文献报道值，充分 体现了反胶束体系的微观结构能模拟酶发挥作用的天然生物环境的明 显优势，为反胶束体系中应用脂肪酶催化合成短链脂肪酸酯奠定了工作 基础。 关键词：脂肪酶，表面活性剂，反胶束，超活性，酯化反应 a b s t r a c t l i p a s e c a t a l y z e d e s t e f i f i c a t i o n sr e a c t i o no f o r g a n i cs y n t h e s i s h a s b e c o m eaf a s h i o n e dt o o lo fs t e r e o s p e c i f i co r g a n i cc h e m i s t r y ，w h i c hh a s b e e nr e p o r t e di n m a n yl i t e r a t u r e s h o w e v e r ，m o s t o ft h ew o r ko n l i p a s e c a t a l y z e de s t e r i f i c a t i o n sr e p o r t e di nt h el i t e r a t u r e sh a v eb e e nb a s e d o nr e a c t i o n su s i n gl o n g e r - c h a i nl e n g t hs u b s t r a t e s ，t h ee s t e r i f i c a t i o n so f s h o r t - c h a i nf a t t ya c i d sa n da l c o h o l sh a v er e c e i v e dl i t t l ea t t e n t i o n l o w m o l e c u l a rw e i g h te s t e r sa r er e s p o n s i b l ef o rt h ea r o n l ao fm a n yf r u i t sa n d c o n s t i t u t em a i n l ys h o r t - c h a i nf a t t ya c i dd e r i v a t i v e sl i k ea c e t a t e ，p r o p i o n a t e ， b u t y r a t e a n d i s o b u t y r a t e f o r e x a m p l e ，e t h y l ，b u t y r a t e a n d i s o a m y l i s o b u t y r a t e a r e p r e s e n t e d i nt h ea r o m ao f s t r a w b e r r y a n db a n a n a ， r e s p e c t i v e l y i s o a m y l e s t e r sa r ev a l u a b l ea n d h i g h d e m a n d f l a v o u r c o m p o u n d so fc o m m e r c i a li m p o r t a n c e ，a n da r ew i d e l yu s e di nt h ef o o d ， b e v e r a g e ，c o s m e t i c a n dp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e se t c n a t u r a lf l a v o u r e s t e r se x t r a c t e df r o mp l a n ts o u r c e sa r eo f t e ni ns h o r ts u p p l yo re x p e n s i v e m o r e o v e lf l a v o u rq u a l i t ya n dq u a n t i t yv a r i e sf r o mr e g i o nt or e g i o n ，m o s t o ft h e s ee s t e r sc a na l s ob e p r o d u c e dc h e m i c a l l yb ya c i d c a t a l y z e d c o n d e n s a t i o no fa na l c o h o la n da na c i da te l e v a t e dt e m p e r a t u r e s h o w e v e r ， r e c e n tt r e n d si nc o n s u m e rp r e f e r e n c et o w a r d n a t u r a l p r o d u c t si n d i c a t e t h a t b i o c a t a l y s i sm a yh a v e a n a d v a n t a g e o v e rc h e m i c a l s y n t h e s i s a s p r o d u c t so fb i o c a t a l y s i sm a y h a v ea n a t u r a l l a b e l i tw a sa l s oo b s e r v e d t h a tf a t t ya c i de s t e r s ，s y n t h e s i z e db ye n z y m e ss u c ha sl i p a s e ，o f t e nh a v e b e t t e ro d o u ra n df l a v o u rc h a r a c t e r i s t i c s c o m p a r e d t os i m i l a re s t e r s p r o d u c e d b yc o n v e n t i o n a lm e a n s p r e s e n t l y , i m m o b i l i z e d r h i z o m u c o rm i e h e i l i p o z y m e i m 一2 0h a s b e e nu s e dt o c a t a l y z et h ee s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o nb e t w e e ni s o b u t y r i ca c i d a n di s o a m y la l c o h o lt os y n t h e s i z ei s o a m y li s o b u t y r a t ei nn h e x a n e ，w h i c h h a sb e e np r o v e dt ob ea ne f f e c t i v em e t h o d b u ti ti sn o tf i tf o ri n d u s t r i a l p r o d u c t i o n b e c a u s eo ft h e h i g hp r i c e o ft h e l i p a s e h o w e v e r , t h i s e s t e r i f i c a t i o n c a t a l y z e db yl i p a s e i nr e v e r s e dm i c e l l e sh a sn o tb e e n r e p o r t e d w eu s ea n o t h e re a s i l yo b t a i n e dl i p a s e ( w h i c hh a sm u c h l o w e r a c t i v i t yt h a nr h i z o m u c o rm e i h i el i p o z y m ei m - 2 0l i p a s eh a si nn - h e x a n e ) w i t hm u c hl o w e rp r i c e c o m p a r e dw i t ht h er h i z o m u c o rm i e h e i ，a n db y i n v e s t i g a t i n gs y s t e m a t i c a l l yt h er e g u l a r i t i e so f t h ee f f e c t so fw a t e rc o n t e n t ， p h o f b u f f e r , t e m p e r a t u r ea n dt h er a t i oo fs u b s t r a t e e n z y m eo p t i m i z et h e s u i t a b l ec o n d i t i o nf o rt h ee s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o nb e t w e e ni s o b u t y r i ca c i d a n di s o a m y li s o b u t ) r r a t ei nt w ok i n d so f t y p i c a lr e v e r s e dm i c e l l e so f a o t a n dc t a b e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h et w ok i n d so fr e v e r s e d m i c e l l e sb o t hp r o v i d es u i t a b l ee n v i r o n m e n tf o rt h el i p a s e ( c c l ) ，w h i c h s h o ws u p e r a c t i v i t y f o u ra n ds i xt i m e sa st h a ti nn - h e x a n er e s p e c t i v e l y t h ea c t i v i t yo fl i p a s e ( c c l ) i na o tr e v e r s e dm i c e l l e si sc l o s et ot h a to f r h & o n u c o rm e i h e i l i p o z y m e i m 一2 0i nn - h e x a n e ，w h i l et h e a c t i v i t y i n c t a br e v e r s e dm i c e l l ei s h i g h e rt h a nt h a t o fr h i z o n u e o rm e i h e ii n n - h e x a n er e p o r t e di nl i t e r a t u r e ，w h i c hh a sc e r t i f i e d s u f f i c i e n t l y t h a tt h e m i c r o s t r u c t u r eo fr e v e r s e dm i c e l l eh a so b v i o u s s u p e r i o r i t y w h i c hc a n s i m u l a t et h en a t u r a l b i o l o g i c a l e n v i r o n m e n tf o r l i p a s e t o p e r f o r m i t s f u n c t i o n ，a n dc a nl a yaf o u n d a t i o nf o rt h ef u t u r ew o r ko ne s t e r i f i c a t i o n s y n t h e s i sb e t w e e n s h o r t c h a i nf a t t ya c i d sa n da l c o h o i s k e y w o r d s ：l i p a s e ，s u r f a c t a n t ，r e v e r s e dm i c e l l e ，s u p e r a c t i v i t y , e s t e r i f i c a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：多埔同期之堕：鱼二 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：宅! 二里鱼指导教师签名 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 堑i 丛! ! 鱼玉 通讯地址： 虽逝! 绛冬 辐 遗圭。区j 电话：盟翌丝z 邮编：上! 哗 东北师范大学硕士学位论文 第一章引言 低分子量的酯对很多种水果的气味感觉有关键作用。它们主要是 由短链脂肪酸的衍生物如：乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯或异丁酸酯组成。 比如，丁酸乙酯与异丁酸异戊酯分别存在于草莓和香蕉的气味中。异 戊酯价值较高，有很大的商业需求，被广泛应用于食品、饮料、化妆 品和制药行业中【1 1 。天然的气味酯来源于植物，量少价格高，况且气味 的质与量因地域不同而差别很大。大多数此类酯可以由酸与醇在较高 的温度下的催化反应制得。然而近来倾向于天然食品的消费趋势表明， 生物催化要比化学催化有优势，因为生物催化的产品会带有一种天然 的招牌【2 】。人们也注意到，由象脂肪酶这样的酶催化合成的酯的气味， 与以传统方法制得的类似的酯相比要好得多口“j 。 有机合成中的酶催化方法始于1 9 世纪末，并已开发出很多有用的 反应，酶催化现已成为立体选择有机化学的一个成型的工具，且有一 些专著和大量的综述。近些年该领域已经有公开发表的实例。脂肪酶 ( 三酰基甘油水解酶) ，由于具有区域选择、立体选择、底物特征性、 温和的反应条件和相对较低的能量要求而被广泛应用于各种合成反应 中。脂肪酶催化的酯化反应已经用于在合适的溶剂或无溶剂状态下甘 油5 1 、脂肪醇【6 - 8 】、羟基脂肪酸9 和萜烯醇 1 0 】的酯的合成上。然而大部 分这方面的文献报道均是基于长链底物的反应，短链酸和醇的酯化反 应很少受到人们的注意。短链( c s ) 底物水溶性更好，因此与非水系 统中长链底物的反应有所不同。 生物转化属于化学和生物学的交叉领域，生物催化剂和反应介质是 生物转化的两大要素。一方面，生物催化剂工程( b i o c a t a l y t i c e n g i n e e r i n g ) 运用发酵技术获得大量催化剂，利用生物学、化学或物理学方法对现有 生物催化剂进行改造。另一方面，介质工程( m e d i u m e n g i n e e r i n g ) 贝, 0 为生 物催化过程提供理想的溶剂体系。生物催化剂工程和介质工程研究的 根本目的是保持或提高生物催化剂的活性和稳定性。介质工程的研究 经历了从水一有机溶剂一反胶束( r e v e r s e m i c e l l e s ) 的过程。在水有机溶 第一章引言 剂两相体系和微水有机溶剂单相体系中，仅有少数酶能够保持催化活 性。由于反胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境，因而在反胶束体系 中，大多数酶能够保持催化活性和稳定性，甚至表现出“超活性” ( s u p e r a c t i v i t y ) 。自1 9 7 4 年w e l l s 发现磷酸酯酶a 2 在卵磷脂乙醚水反 胶束体系中具有卵磷脂水解活性以来，国外有二十多个实验室对5 0 多 种酶在反胶束中的酶学性质进行了广泛而深入的研究，由此促进了一个 新的研究领域一胶束酶学( m i c e l l a r e n z y m o l o g y ) 的兴起。分散在有机相 中的含酶水滴作为微型反应器( m i c r o r e a c t o r ) 的概念已普遍为人们所接 受。胶束酶学研究的权威m a r t i n e k 预言：反胶束体系有可能成为生物转 化的通用介质1 1 1 。 1 、有机溶剂中的酶催化反应 1 1 有机溶剂中的酶催化反应特点 酶能在有机介质中表现出活性，这并不奇怪。因为在生物体中， 酶是在一种特殊的微环境中起作用，这种微环境并非是简单的水溶液 介质。生物体中许多酶就是在天然的疏水环境中发挥作用的。但是酶 能在非生物体系的有机溶剂中表现出活性这一事实无疑是对有机溶剂 使酶变性、失活这一观念的挑战。早在本世纪初b o u r q u e l o t e 等人就 做了将乙醇丙酮类的有机溶剂加入到酶的水溶液中，进行非水酶催化 尝试。在这种情况下需要保持很高的含水量，酶才具有一定的催化活 性，但是比水溶液中的酶活力低得多。在有机溶剂是酶的变性剂、失 活剂这一传统观念的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究十分缓 慢。直到本世纪八十年代初，才取得了突破性进展。酶催化介质由水 与有机溶剂( 乙醇、丙酮、甘油、二氧六环等) 的互溶体系不仅过度 到水与有机溶剂( 如三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚丙醇等烷基卤化物， 酯、醚和除乙醇以外的醇类) 组成的双液相体系、反相胶团，而且还 发展到仅含少量水或几乎不含水的有机溶剂( 如正己烷、苯、环己烷 等脂肪族和芳香族的烃类) 。在这种含微量水的有机介质中，美国 k l i b a n o v 1 0 教授利用脂肪酶酶粉和固定化酶催化合成酯肽手性的醇、 羧酸、羧酸酯和胺，日本稻田佑二用聚乙二醇修饰脂肪酶，使酶能溶 于苯并能催化酯合成反应。也有人用猪胰脂肪酶粉和其固定化酶催化 2 东北师范大学硕i 学位论义 酯合成和酯交换反应“】。大量研究结果表明，酶在有机介质中的催化 反应有以下优点：( 1 ) 提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物 连续生物转化；( 2 ) 使许多热力学平衡从加水分解反应转变为其逆反 应，如酯合成和肽合成；( 3 ) 可以抑制由水引起的副反应；( 4 ) 酶可 以用双亲性大分子( 表面活性剂) 修饰，使酶在有机溶剂中可溶；( 5 7 提高酶的热稳定性；( 6 ) 扩大反应p h 值的适应性；( 7 ) 酶可用简单吸 附法固定，并改变其性质：( 8 ) 降低依赖于水的副反应；( 9 ) 防止微 生物污染：( 1 0 ) 低沸点溶剂中有利于产物的分离；( 1 1 ) 使酶可以直 接应用于化学反应进程；( 1 2 ) 测定某些在水介质中不能测定的常数。 因此近几年酶在有机介质中催化反应的研究十分活跃，目益增多的研 究报道和综合评述，展示了有机溶剂中的酶优于水相中的酶的巨大应 用潜力。而酶在有机介质中催化活性的充分发挥和催化选择性的调节 和控制是有机溶剂中酶催化反应研究的重要基础与核心。 1 2 有机溶剂中的酶催化反应的影响因素 1 2 1 系统含水量 大量的实验文献报道表明，在有机溶剂中，酶的催化活性与系统 的含水量密切相关。系统含水量包括酶粉水合的结合水，溶于有机溶 剂中的自由水以及固定化载体和其它杂质的结合水。1 9 8 4 年，z a k s 和 k l i b a n o v 7 7 】 艮道了脂肪酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的 催化活性，发现对酶分子活性构象起维持作用的只是酶分子表面的一 层单分子水层( 也叫必需水) ，只要该必需水层不被破坏，其它水分子 被有机溶剂代替并不影响酶的活性。1 9 8 6 年，m a r t i n e kk 等人【8 训提出， 由于该单分子水层水量微乎其微，故可以近似看作酶处在几乎无水的 有机介质中。即酶在几乎无水的溶剂中仍然可以发生作用，而且热稳 定性大大提高。有机溶剂中酶活性与酶含水量呈一近钟型曲线。当含 水量低于最适水量时，酶构象过于刚性，而失去催化活性；当含水量 高于最适水量时，酶结构的柔性过大，酶的构象将向疏水环境下热力 学的稳定状态变化，引起酶结构的改变和失活。只有在最适水量时蛋 白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之问达到最佳平衡点，酶表现 出最大活力。因此，最适水量是保证酶的极性部位水合，表现活力所 笙二皇! ! 童 必需的，即。必需水”。它类似于润滑剂和增塑剂，用于维持酶活性所 需构象的柔性1 3 ，14 1 。各种酶因其结构不同，维持其具有活性构象的必 需水的量也不同。在实验中发现，系统的含水量与溶剂的亲疏水性密 切相关。反应系统中含水量除影响酶活性外，还影响酶的选择性。人 们在实验中发现对映体的选择性对水含量的依赖关系。北口博司和 s t o c k e s 【1 5 报道了含水量对酶选择性的影响。他们认为，水在一定范围 内增加，能加强酶的柔性，因而提高了酶的活性和选择性；但是，水 量过大时，会引起酶的构象过于柔软和伸展，导致酶活力和选择性下 降。 1 2 2 溶剂 j2 8 8 年r 蚤舾醴幻g 酗观察到躏在存辊溶剂申驹辏诣话性与有机 溶剂的亲米性量逆相关青啼御摊赜群氍野菊妊陆溶剂中砌，超j 邑与 ，硼刮竹婶影衍帮我酶分子前必须水前能为辛昏荚。1 9 8 8 年，z a k sa 等人f 卅 观察到酶在有机溶剂中的催化活性与有机溶剂的亲水性呈逆相关，最 高活性通常在疏水性溶剂中出现，这是与疏水性溶剂夺取酶分子的必 须水的能力相关。有机溶剂对酶活性的影响方式之一。是溶剂夺取酶 的维持活性构象的必需水，导致酶失活。l e a n e 等人用溶剂的极性参数 1 9 p ( p 为某溶剂在正辛醇和水双相体系中的分配系数) 描述了溶剂的 极性和酶活性的关系，并通过实验得出规律：酶在l g p 2 的极性溶剂 中活性较低；在2 l g p 4 的非极性 溶剂中具有较高活性。许多实验结果都符合该规律。 溶剂对活性影响的另一种方式，是溶剂通过对底物或产物的扩散的 影响控制酶活性，例如在实验中，脂肪酶在十二烷( 1 9 p = 6 6 ) 中活力 只达到苯( 1 妒- - 2 ) 中酶活力的5 5 7 ，酶在2 o 1 驴 7 0 时p h 值的增大对酶活力的影响较大，酶 活力随p h 值的增大降低较快。 缓冲溶液的d h 值 对转化率的影响 图3 4 反成条件：反应物浓度，o 0 6 t o o l l ( 异丁酸) ；加酶量：5 4 r a g ：】e 己烷溶液：1 0 r a l ；禽 水量w 0 = 6 ：反应温度：4 0 c ；反应时间：2 4 h ，其它条件同3 2 3 。 3 3 4 底物浓度酶的比例对酶活力的影响 底物浓度酶的比例为1 6 m m o l l - 1 m g 。时酶活力最高，为 1 9 m m o l g h ，已经接近于文献值2 2m m o l g - i h 。底物浓度较低时， 与酶接触机会较少，同时对酶的稳定化作用也较弱致使酶活力不高： 随着底物浓度的加大活力增加。过高的底物浓度对产物从油水界面 分离并扩散到有机相中产生抑制作用，并且高浓度的底物也使部分 酶失活从而使酶活力下降。如图5 所示，与在有机溶剂中相比，反 胶束体系提高了底物酶的适宜比例，节省了酶的用量，酶活力提高 近4 倍，表现出超活性。 第三章a o t 正己烷反胶柬中脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯 底物浓度酶的比例( m m 0 1 l - 1 m g 1 、 图3 5 a o t 反胶束体系反应条件：加酶量：5 4 m g ：正己烷溶液：l o m l ；含水量w o = 6 ；缓冲 溶液的p h = 7 1 5 ；反应温度：4 0 ( 2 ；反应时问：2 4 h ，其它条件同3 2 3 。 有机相反应条件：加酶量，3 0 r a g ；反应时间：6 h ；反应温度：4 0 。c ；正己烷：1 0 m l 其 它条件周2 21 。 3 3 5 反应的动力学特性 1 1矿 1 根据速率方程：石1 = 古+ 争一1 ，利用双道书法做出了 y p m a xm a xc 5 l i n e w e a v e r - b u r k 曲线，当底物浓度酶的比例小于1 6 m m 0 1 l m 9 1 时此反应遵循m i c h a e l i s - m e n t e n 动力学。由图6 计算出在有机溶剂中 和反胶束体系中的米氏常数k 。和最大初速度v 。a x 分别为 0 0 5 1 m o l l 、o 5 5 6 m m o l g - 1 h 。和o 1 0 8 m o l l 、4 o m m 0 1 g - j h ，反 胶束中v m “值远大于有机溶剂中的v 。值，此反应在反胶束体系中 更具有优越性，而二者的k 。相差不大。 东北师范大学硕 ：学位论文 3 3 6 反应进程曲线 1 c e 自 图3 6 反应的l i n e w e a v er b ur k 曲线 反应时间( h ) 反应进程曲线 图37 a o t 反胶束体系反应条件：反应物浓度，0 0 6 m o l l ( t 酸) ；加酶量：5 4 m g ： 正己 烷溶液：i o m l ：龠水量w o = 6 ；缓冲溶液的p h = 71 5 ：反应温度：4 0 。c ：就它条件同3 2 3 。 反成条件：反应物浓度，o 0 6 m o l 几( 异丁酸) ：加酶量，6 m g ；反应温度：4 0 ( 2 ；溶剂， 1 0 m l 其它条件同2 2 1 ， 在不同的反应时间测得反应的转化率，得到如下图所示的反应进 3 i 扯拍拍扯加似他仆 第三章a o t ! 丁e 己烷反脞柬中脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯 程曲线，从曲线可以看出反应在2 4 小时以内转化率呈线性变化，4 8 小时以后反应转化率变化不大，此时的转化率为7 8 。反应转化率最 高可达9 9 。随着反应的进行，反应转化率提高变得缓慢。一方面 由于随着反应时间的加长，酶活性呈下降的趋势；另一方面由于反应 生成水的量逐渐增多而使反应平衡向不利于生成酯的方向移动。从进 程曲线不难看出，反应时间较短时反胶束体系的转化率明显高于有机 相中的转化率，体现出明显的优越性。 3 4 本章小结 本章考察了a o t 正己烷反胶束体系中一些因素对脂肪酶催化合 成异丁酸异戊酯反应转化率和酶活性的影响，确定了较为适宜的反应 条件为：反应温度：4 5 ：酸醇物质的量比为1 ：2 ：缓冲溶液的p h 为7 7 2 ；含水量w 。= 6 ：底物浓度酶较佳比值为1 6 m m o l l m 9 1 ，酶 活力最高值为1 9 m m o l g - 1 h ，已经接近于文献值2 2m m o l g - 1 h 。反 应的最大初速度和米氏常数分别为：4 0 m m o l g - 1 h 、0 1 0 8 m o l l ： 反应活化能为2 3 3 k j m o l ；与有机相中反应相比，反胶束体系不仅提 高了所选定的脂肪酶的适宜反应温度范围，而且节省了酶用量。当反 应物浓度为0 0 6 m o l l ( 异丁酸) 时，反应转化率在2 4 小时以内呈线性 上升，4 8 小时以后反应转化率变化不大，此时的转化率约为7 8 。 实验表明，与有机相中相比，反胶束体系中酶活性最多可提高到近4 倍，表现出超活性。 查整鲎薹盔鲎堡主兰笙建塞 一一一一 第四章c t a b j e 己烷 反胶束中脂肪酶催化会成异丁酸异戊蘸 反胶康体系是一种薪型的酶反应介质。该体系中酶和其它亲水性 物质能够通过螫合作用进入“水池”，水池内水和细腿内水的性质类仪t 水池尺寸豹大小可通过水含量的调节使之与蛋白质分子的大小楣近。 反胶束体系中表面活性剂的分子膜类似于生物细胞膜类脂分子的定向 摊剜，可敬控制底杨或产物分子的有向进出，从雨为酶倦化反应提供 了一个独特的微环境。表蘑活性剡分子膜的存在，可避免酶与周围的 有机溶剂接触，保护酶的活性部位不因与有机溶剂接触而失活。由于 反胶柬体系较传统的油水相酶促反应体系有许多优点，近年来关于酶 在反胶乘体系中催化活性的研究网趋活跃，近年来非水介威中酶催化 技术取得了很大进展。 反胶柬的构建与表面活性翔的种类和结构性质密切褶关。十六烷 基三甲基溴化铵( 篱称c a t b ) 是一秘常用的期离予型表藤活性剡，翦一 章我们讨论了典型阴离子型表面活性剂a o t 构成的反胶束体系中酶 催化反应情况，本章研究采绡由阳离子表面活性齐g 十六烷基三甲 基溪化铵( 篱称c a t b ) 与正毫烷 每成的反胶束体系，考察7 不月水含 量、p h 值、温度、底物酶的比例对酶活力的影响，得到酶活力相对 较高的反胶柬体系组成及较适条件，同时对反应的一些动力学特征进 行了研究。结果表羁，在c a t b 正穗烷构成的反胶束中，脂肪酶( c c l ) 表现出很蔼的涟力，优于有机楣和a o t 正己烷所构成的反胶康。 4 1 仪器与试剂 4 。l 。l 主要试瓤 柱状假丝酵母目旨肪酶f l u k a 公司出晶 ( c c l ，l i p a s ef r o m c a n d i d a c y l i n d r a c e a ) c a t l 3 分析纯北京化工厂 ( 十六靛基三甲基澳化铵) 3 3 第四章c t a b 正己烷反胶束中脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯 异丁酸 异戊醇 分析纯 分析纯 上海化学试剂一厂 上海化学试剂一厂 其它试剂均为国产分析纯试剂。 4 1 2 主要仪器 超级恒温水浴c s 5 0 1重庆试验设备厂； 8 0 0 型离心机上海手术器械十厂； v a r i a n 3 4 0 0 气相色谱仪( 附f i d ) 美国 c a f t a n 公司； 磁力搅拌器上海南汇电讯器材厂； p h s 2 c 型精密酸度计 上海雷磁仪器厂； 薄膜旋转蒸发仪上海医疗器械厂； 4 2 实验方法 4 2 1 含水量的测定 含水量的测定方法同3 2 2 。 4 2 2 反胶束酶催化体系的制各 向置于恒温套内的平底烧瓶中按照一定比例加入 5 0 m m o l l 。c t a b 的正己烷溶液，置于磁力搅拌器上加入一定量溶有脂 肪酶的缓冲溶液，搅拌以制成反胶束，再加入物质的量比为l ：2 的异 丁酸和异戊醇，继续搅拌开始反应，经过一定时间取样进行定量分析。 4 2 3 产物的分析和酶活力的计算 产物的分析和酶活力的计算方法同3 2 4 。 4 3 结果与讨论 4 3 1 反胶束体系中水含量( w o ) 对反应转化率的影响 如图4 1 所示，水含量对转化率的影响呈近似钟形规律，出现一 个最佳点。当w o = 5 时酶的催化活力最高。当w o 较小时反应体系中含 水量低，水几乎与表面活性剂结合形成反胶束，不能满足酶保持活性 构象所需的必需水，此时的酶过于刚性，而使酶的活力不高；随着w 。 的增大，酶的活性增大；w o 过大时，水池的尺寸也增大，油水界面减 小，相当一部分酶处于水池内部难与底物接触，影响酶活力的发挥； 另外水量过大使该酯化反应平衡向不利于生成酯的方向移动，两种因 素协同作用使酶活力降低。 变! ! 塑苎盔兰堡兰些丝兰 术 v * 篁 磐 。! 反应条件：反应物浓度，o 0 6 m 。l ( 异丁酸) ；力酶量：54 m g ；反应温度：4 0 c ；缓冲 溶液的p h 2 7 1 5 ；反应时间：2 4 h ，其它条件同4 2 2 。) 4 3 2 反应温度对转化率的影响 誉斛蓑 兰婴要! 坠! ! 蛋莹堡星堕壅史! ! 堕堕堡些垒盛塞i 堕墨些塑 一 1 厂r * 1 0 。 图4 ，3 c t a b 反艘柬反鹿条件：反瘦物浓度，0 , 0 6 t o o l l ( 羿丁酸) 加酶量：5 4 m g ；正已垸浴液： 1 0 m l ；古永蠡w n = 5 ；缓冲溶液的p h = 7 1 5r 反应时间；2 4 h ，其它条件l 司4 2 2 毒帆棚反成条件：反艟物浓度，0 0 6 r a o v l ( 异丁陂) 拥酶餐，2 0 r a g ；反鹿时阚：6 h ：正己 烷：1 0 m l 其它条件硒2 2 1 。 湿度对所选定酶对该反应转化率的影响呈如图所示的曲线变化， 由此可见，3 5 - - - 4 5 的温度范围杰有利于该酶保持活性构象，催化活 力变化不大；4 0 时转化率最嵩，瀑度过离使活性构象难以保持，并且 反胶柬的稳定性也随湿度的丹赢恧下降，从恧使酶活力降低。从图中 我们也可以看出，与有机溶剂相比，酶活力随温度变化情况楣类似， 二者其有相同的最佳反应温度，这一点与a o t 反胶束体系有所不同。 酶活力随温度变化关系也符合a r r h e n i u s 方程：l g a = * e a 2 。3 0 3 r t + c ，以 l g a 对1 t 乍圈。由胬我们计算击该反应在有机溶剂中与反胶束中的活 化能分别为1 6 1 0 k j t o o l 4 和2 6 9 8 k j - t o o l 一，结果寝明，在反胶束中反 应钓活化能离于在有机溶剂中的活化能，这与p r a z e r e s 的研究结果相 似。反胶束体系中活化能值高说明在反胶束体系中形成的酶底物复合 物的热焓离于在有枫溶剂体系中所形成的酶一底物复合物的热焓，可以 认为在反胶束体系中形成的酶。底物复合物比在有辊溶剂体系中有更 多的化学键发生畸变，甚至发生断裂。这可熊是发生水合作用的表西 东北师范大学硕l j 学位论文 活性剂层阻碍了酶与底物发生缔合作用，而在有机溶剂体系中不存在 这种阻碍。因此，酶活力的提高不能以活化能值进行解释，可能是由 于反胶束体系中胶束间的高频碰撞及为酶与底物提供了较大接触界 面，使传质速率加快，从而使酶活性大大提高。 4 3 3 缓冲溶液p h 值对转化率的影响 缓冲溶液d h 值 图4 4 反应条 件：反应物浓度，0 0 6 m o l l ( 异丁酸) ；加酶量：5 4 m g ；j 下己烷溶液：1 0 m l ；含水量w o = 5 ； 反应温度：4 0 ( 3 ：反应时间：2 4 h ，其它条件同4 2 2 。 缓冲溶液的p h 值对反应转化率的影响呈如图所示的变化曲线，当 p h = 7 1 5 时酶活力最高，在7 0 7 2 范围内变化不大，可以作为反应的 适合p h 值范围。我们还可以看出，在选定的p h 值范围内，反应转化 率受缓冲溶液的p h 值的影响实际上并不大。最佳p h 值与a o t 反胶 束中的情况相似。 4 3 4 底物浓度酶的比例对酶活力的影响 第1 = ! 【】章c t a b 正己烷反胶束中脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯 底物浓度l 酶m m o ll - ii t i g 图45 c t a b 反胶束反应条件：加酶鱼：54 m g ：正己烷溶液：1 0 m l i 宙水量w o = 5 ；缓冲 溶液的p h = 71 5 ；反应温度：4 0 反应时间：2 4 h ，其它条件同4 2 2 。 有机相反应条件：加酶量，3 0 m g ；反应时间：6 h ： 反应温度：4 0 。c ；正己烷：l o m l ) 它条件问2 2 i 。 如图4 5 所示，底物浓度酶的比例为1 6 r e t o o l l - i m g 。时酶活力最 高。底物浓度较低时，与酶接触机会较少，同时对酶的稳定化作用也 较弱致使酶活力不高：随着底物浓度的加大活力增加。过高的底物浓 度对产物从油水界面分离并扩散到有机相中产生抑制作用，并且高浓 度的底物也使部分酶失活从而使酶活力下降。与在有机溶剂中相比， 反胶束体系提高了底物酶的适宜比例，节省了酶的用量，使酶活力提 高了近6 倍，表现出超活力，并且高于a o t 反胶束体系。 4 3 5 反应的动力学特性 东北师范大学硕。j 学位论文 根据速率方程：寺= + 土，利用双倒数法做出了 m a xm “c 5 l i n e w e a v e r - b u r k 曲线，当底物浓度酶的比例小于1 6 m m o l l 一m g 。1 时 此反应遵循m i c h a e l i s m e n t e n 动力学。由图4 6 计算出在有机溶剂中和 反胶束体系中的米氏常数k 。和最大初速度v 。a x 分别为o 0 5 1 m o l l 、 o 5 6 m m o l g - 1 h 。1 和o 0 7 m o l l 一、5 0 m m o l g - 1 h 1 ，反胶束中v 。值远大 于有机溶剂中的v 。值，此反应在反胶束体系中更具有优越性，而二者 的k 。相差不大。 4 3 6 反应进程曲线 在不同的反应时间测得反应的转化率，得到如下图所示的反应进 程曲线，从曲线可以看出反应在1 8 小时以内转化率呈线性变化，3 6 小时以后转化率变化不大，此时的转化率为8 5 。随着反应的进行， 反应转化率提高变得缓慢。但最高可达9 9 以上。一方面由于随着反 应时间的加长，酶活性呈下降的趋势；另一方面由于反应生成水的量 逐渐增多而使反应平衡向不利于生成酯的方向移动。从进程曲线不难 看出，反应时间较短时反胶束体系的转化率明显高于有机相中的转化 率，体现出明显的优越性。 3 9 ：如柚拍“舱柚仙他他佃 第删章c t a b t t 己烷反胶柬中脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯 反应时间( h ) 反应进程曲线 图4 7 c t a b 反胶束反应条件：加酶量：54 r a g ；正己烷溶液：1 0 m l ；含水量w o = 5 ：缓冲溶 液的口h - 71 5 ；反应温度：4 0 ，反应物浓度，o0 6 m o | l ( 异丁艘) 其它条件同4 2 2 。 有机相反应条件：加酶量，3 0 m g ；反应温度：4 0 c ；反应物浓度，o0 6 m o l l ( 异丁酸) 正己 烷：1 0 m l 其它条件同2 2 1 。 4 4 本章小结 本章考察了c t a b 正己烷反胶束体系中一些因素对脂肪酶催化合 成异丁酸异戊酯的反应转化率和酶活性的影响，确定了较为适宜的反 应条件为：反应温度为4 0 ；酸醇物质的量比为l ：2 ；缓冲溶液的 p h 值为7 7 2 ；含水量w 。：5 ；底物浓度酶较佳比值为1 6 m m o l l - i m g ； 酶活力最高值为2 8 m m o l g - 1 h ，高于文献值2 2m m o l g - 1 h 1 ，相比之 下节省了酶用量。反应的最大初速度和米氏常数分别为： 5 0 m m o l g h 、o 0 7 m o l l ；反应活化能为2 6 9 8 k j m o l ；当反应物浓 度为o 0 6 m o l l ( 异丁酸) 、酶用量为5 4 m g 时，反应转化率在1 8 小时以 内转化率呈线性变化，3 6 小时以后反应转化率变化不大，此时的转化 率约为8 5 。实验表明，与有机相中相比，c