（生物化学与分子生物学专业论文）11二氯乙烷微生物降解菌群的生理学和分类学鉴定.pdf

中国科学技术大学学 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究 工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权， 即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和电子版，允许论文被查阅或借阅，可以将学位论文编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：叠垫 砷年r 月f 8 日 巾固科学技术大学硕十研究生毕业论文 摘要 从美国纽约哈得逊河的河底淤泥样品中富集分离得到的微生物菌群，在厌 氧条件下，可将i ，1 二氯乙烷通过还原脱氯的呼吸代谢方式降解生成一氯乙烷。 这个微生物菌群可以利用氢气、甲酸、乙酸、苯甲酸和延胡索酸作为电子供体 进行还原脱氯生长，并能以丙酮酸发酵的呼吸方式生长，但丙酮酸不能用来作 为电子供体进行还原脱氯。通过对其它氯代化合物是否能作为电子受体的实验 中，发现只有l ，1 二氯乙烷能被脱氯。在培养基中加入亚硫酸盐可完全抑制二 氯乙烷的还原脱氯，但硫酸熊、硝酸盐和延胡索酸盐的加入却不影响还原脱氯。 在以氢气作为电子供体进行还原脱氯时，每l 摩尔氯原子的还原相应的细胞干 重增加4 4 0 2 1 2 4 1 克。尽管甲酸作为电子供体时，会有相对长的延滞期。但 是它的脱氯速率与氢气很相似，每l 摩尔氯原子的还原相应的细胞干重增加 4 1 8 1 0 3 8 1 克。乙酸在作为碳源的同时，也可以作为电子供体，不过它的脱 氧速率较慢，每1 摩尔氯原子的移除相应地增加i 1 9 7 0 5 2 克的细胞干重。 同时对富集分离的菌群进行1 6 sr r n a 基因序列分析，在脱氯生长方式下，该微 生物菌群中d e h a l o b a c t e r 细菌占主导地位。 关键词：i ，1 ，二氯乙烷：还原脱氯；卤代呼吸：d e h a l o b a e t e r t 1 6 sr r n a 基因 中国科学技术大学硕十研究生毕业沧文 a b s t r a c t a na n a e r o b i cm i c r o b i a lc o n s o r t i u m r e d u c t i v e l yd e e h l o r i n a t i n g 1 。l - d i c h l o r o e t h a n e ( d c a ) t oc h l o r o e t h a n e ( c a ) w a se n r i c h e df r o mt h es e d i m e n to f h u d s o nr i v e r , n e wy o r k t h ec o n s o r t i u mu s e dh y d r o g e n ，f o r m a t e ，a c e t a t e ，b e n z o a t e a n df u m a r a t ea se l e c t r o nd o n o bf o rr e d u c f i v ed e c h l o r i n a t i o n p y r u v a t ef e r m e n t a t i o n o c c u r r e di nt h ee n r i c h m e n tc u l t u r e ，a l t h o u g ht h i sc o m p o u n dw a sn o tu s e da sa n e l e c t r o nd o n o rf o rd e c h l o r i n a t i o n a m o n go t h e rh a l o g e n a t e dc o m p o u n d st e s t e d ，o n l y d c aw a s r e d n e t i v e l y d e c h l o r i n a t e d s u l f i t ec o u l d c o m p l e t e l y i n h i b i td c a d e c h l o r i n a t i o n ，w h e r e a ss u l f a t e ，n i t r a t eo rf u m a r a t eh a dn oe f f e c t g r o w t hb y r e d u c t i v ed e c h l o r i n a t i o nw i t hh y d r o g e na se l e c t r o nd o n o rw a sr e v e a l e db yac e l l y i e l do f 4 4 0 2 土1 2 4 1go f c e l l s ( d r yw e i g h t ) p e rm o l eo f c h l o r i d er e l e a s e d a l t h o u g h f o r m a t eh a sam u c hl o n g e rl a gp h a s e ，t h ed e c h l o r i n a t i o np a t t e r nw a ss i m i l a rt ot h a to f h 2 t h eg r o w t hy i e l df r o md c a d e c h l o r i n a t i o nw i t hf o r m a t ea se l e c t r o nd o n o rw a s 4 1 8 1 土0 3 8 1go fc e l l s ( d r yw e i g h t ) p e rm o l eo fc h l o r i d er e l e a s e d 。a c e t a t ea l s oc a n b eu s e da se l e c t r o nd o n o r ，m t h o u g ht h ed e c h l o f i n a t i o nr a t ew a sm u c hs l o w e r ，a n da g r o w t hy i e l do f1 1 9 7 士0 5 2go fc e l l s ( d r yw e i g h 0w a so b t a i n e dp e re a c hm o l eo f c h l o r i d er e l e a s e d s e q u e n c ea n a l y s i so f1 6 sr r n ag e n ea m p l i f i e df r o m 且h i g h l y e n r i c h e dc u l t u r ew i t hh 2a se l e c t r o nd o n o rs u g g e s t st h a td e h a l o b a c t e rs p e c i e s d o m i n a t e dt h ee n r i c h m e n tc u l t u r eu n d e rd e c h l o r i n a t i o nc o t a d i t i o n s k e yw o r d s ：1 ，i - d i c h l o r o e t h a n e ：r e d u c t i v ed e c h l o r i n a t i o n ：h a l o r e s p i r a t i o n ：d e h a l o b a c t e r ： 1 6 sr r n ag e n e 2 t c a ： d c a ： c a ： p c e ： 1 c e ： c 1 一o h p a ： b e s a ： 巾囡科学技术大学硕十研究生毕业论文 符号说明 三氯乙烷 二氯乙烷 一氯乙烷 四氯乙烯 三氯乙烯 3 一氯一4 一羟基苯乙酸 2 一溴乙烷磺酸钠 3 巾国科学技术大学颂十研究生毕业论文 1 1 脱卤微生物的介绍 第1 章绪论 氯元素的循环是目前已知的主要的生物地理化学循环之一。根据过去几十 年的研究表明，卤代有机化合物通过人为的、生物的和地理化学的原因被大量 的释放到环境中f 2 2 】。目前，人类已经知道大约有3 5 0 0 种有机卤化物，主要包括 氯化和溴化的代谢产物，这些代谢物分别来自于陆地系统和海洋系统。现在大 量的研究证明，虽然许多具有很高活性和毒性的氯代物并不是直接来自于生物 的代谢，但是，它们已经大量的存在于陆地环境中。 自然界的有机卤化物，而不是近年来人工合成的卤化物，早已经歼始促发 微生物体内许多系统成分的进化，使它们具有了脱卤或完全矿化这些卤化物的 能力，阻止了这些卤代化合物在自然乔中的积累，这个可能性近来披生物地理 学的研究进一步加强。研究还显示了，在全球范围内分布着大量的脱卤菌群， 并且它们无论是在污染环境中还是在原始的未污染的环境中都一样会出现。而 且，还原脱卤微生物菌群已经从海洋中的产溴苯盼的海绵动物d p l y s i n a a e r o p h o b a 中分离出来【2 3 】。 然而，从过去的一个世纪以来，大量的卤代化合物被广泛的发现，并且大 量的应用于工业、农业和个人的家庭，例如，杀虫剂、有机溶剂、去油剂、灭 火剂和多聚化合物的生产，导致了这些化合物大量的释放到环境中，由于急性 的和长期的毒性、持久性和生物积累性，这些有机卤化物在环境中的存在已经 引起了广泛的关注，并对人类和环境的健康构成了威胁i “。由于它们的生物化 学性质，特别是多聚卤代有机化合物如多聚联苯( p c b ) 和四氯乙烯( p c e ) ， 在有氧环境中无法脱氯，在无氧的生态系统中如沉积物、港湾的淤泥、土壤和 地下水中可以长期的积累，这些都触发了对能脱卤的、可以便有毒化合物脱去 毒性的微生物菌群的需求。 在过去的四十年，对很多混合的、纯培养的细菌的研究表明，在没有氧分 子存在的环境下，多种脂肪族和芳香族有机卤化物的降解的起始步骤，一是依 赖于还原脱氯过程，二是依赖氧化发酵机制 4 引。由于这些菌群的高度特异的脱 卤的活性和它们特异的呼吸生理性质，研究人员对厌氧菌群的分离和鉴定给予 了极高的关注。这些厌氧菌可以利用脱卤素呼吸进行生长1 2 4 i 4 ”。脱卤呼吸主 要是通过特异的酶将还原脱卤与能量转换通过电子传递和磷酸化过程相偶联。 4 巾国科学技术大学坝十研究生毕业论文 1 2 厌氧微生物的功能和系统发生的多样性 t 2 。l 在厌氯徽生钕牟的缴卤机孰锈热动力学的可行性 存不同的环境条件卜- 对f 有机卤化物的还原脱岗的不同途径，热动力学 在能量的可行性方面都提供了有力的支持，并且也有助于解释和推测已知的和 未知豹脱卤车凡制。在没有氧分子作为电子受侮的条件下，也可以帮助指导微生 物利用的新途径的研究探索。对大范围的卤代芳香族和脂肪族化合物的g i b b s 自由能和氧化还原潜能的估测，证明了卤代化合物应该是很好的电子受体。在 氢解的还原脱卤条件下。氯原子的移除的产量为一1 3 q 到一t $ 0k j t o o l ，提对应 的氧化还原潜能范围在+ 2 6 0 至j j + 4 8 0 m v 之间，比硫酸盐还原的氧化还原潜能 2 1 7 m v 高很多，和硝酸盐的氧化还原潜能+ 4 3 3 m v 相当。从热力学方面考虑， 人们预测，在有氧条件下。即使很少。也是可以发生还原脱氰的。目前已知的 还原脱氯机制遵循以下几种机制；第一种是氢解机制( 图l a ，b ) ，第二种是在 非芳香族化合物中，经常发生的，即双氧消除( 图l e ) ，两个相邻氯取代基被 同时除去脂肪族c c 键被转化为c - - c 双键。因为双氯消除只需要l 摩尔的氢 气就可以移除2 摩尔的氯离子，圆此双鬣消除比氢解更易避 亍【。从热力学观 点来看，除了还原脱瓤，其它方式的脱氯也是可以进行的。厌氧的微生物菌群 也可以通过有氧的或发酵的途径来降解卤代化合物。但是到目前为止，这方面 的证据还相对较少。 a 0 h 嬲一觑 r 掘2 h 卜 图l ，厌氧细菌中三种不同的脱氯机制。 e 1 1 2 w hh p 2 曩扑 卜棚 。l i l 蝴i ， 只 一 h o xa 2 - c th hh r 鹄婚2 嗡 姗嘛 玳c w 呲 b 峨 链 中国科学技术大学颤十研究生毕业论文 1 2 2 有机卤化物作为碳源和能量的唯一来源 1 、有氧脱氯机制：在t h a u e r a 、p s e u d o m o n a s 和o c h r o b a c t e r i u m 等许多菌属 中有大量的变形杆菌的纯培养分离细菌可以完全的使3 一氯苯甲酸矿化。并且在 反硝化条件下。利用这一广泛分布的卤化芳香族化合物作为碳源和能量的唯一 来源【4 7 1 。然而。在产甲烷的条件下，尽管混合的微生物培养物已经被观察到可 以在这些环境中使卤代化合物完全矿化，在产硫酸盐的条件下，或f e ( i i i ) 一和 m n ( ) 一还原条件下，还没有分离到可以便卤代化合物进行氧化脱卤的纯培养 的微生物菌群。 近年来，兼性的厌氧细菌p s e u d o m o n a ss t u t z e r is t r a i nj j 己经被观察到可以在 无氧、硝化还原的条件下，进行2 一氯乙醇的氧化脱氯的第一株纯种菌【4 s 】，这种 微生物是分离于降解l ，2 二氯乙烷( i ，2 d c a ) 的反硝化富集培养物，然而，这 种细菌并不是l 2 二氯乙烷的脱氯细菌。 2 、发酵脱氯机制；目前得到的两种同型产乙酸、低g c 含量的革兰氏阳性 的纯培养细菌。可以利用卤代有机脂肪族化合物作为它们的碳源和能量的唯一 来源。当细菌d e h a l o b a c t e r i u mf o r m i c o a c e t i c u m 将二氯甲烷发酵后生成乙酸和甲 酸时，细菌彳c e t o b a c t e r i u md e h a l o g e n a n s 已经利用一氯甲烷尘成乙酸作为发酵产 物。在这些菌中，也许相似的途径是活性的。包括类咕啉因子作为起始的甲基 受体的多酶复合体中的甲基转移反应。 另外，包括一氯乙烯和1 ，2 一二氯乙烯的氯乙烯和氯乙烷的发酵脱氯的发生也 有大量的证据说明矧。 3 、在光合细菌中的脱卤机制：在几个光合细菌中，如r h o d o s p i r i l l u m 和 r h o d o p s e u d o m o n a s s p p 。可以在厌氧条件下，利用卤代羧酸或3 一氯苯甲酸，进 行光合自养【3 5 1 。脱卤伴随着还原的途径。然而，在r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s 蕴中，存在一个3 氯苯甲酸辅酶a 的阶段，丽不是自由的有机卤化物。最为显著 的特点是，许多, r h o d o p s e u d o m o n a s p a l u s t r i s e f l ，在实验室培养的尼p a l u s t r i s 细菌， 并不能降解氯苯甲酸，包括足p a t u s t r i ss t r a i nc g a 0 0 9 ，它的基因组被完全测序。 然而这些菌在有机卤化物存在的环境中进一步培养后。可以表现出脱氯活性， 这表明，一些少数有限基因的基因突变是获得脱氯功能所必纛的，并且提供了 研究这种适应性的分子基础p 6 ”j 。 6 巾固科学技术大学顾七研究生毕业论文 1 2 3 还原脱卤 在脂肪族或芳香族的卤代化合物中，存在三种脱卤机制：氧化脱卤、氢解 脱卤和还原脱卤( 圈2 ) 。在厌氧条件下，由微生物引起的脱卤有机卤化物的还 原机制，可被划分为两个方面：无生命的或共代谢机制和代谢转化机制。后者 在氯呼吸细菌中被发现，利用特异的、高亲和性的生物催化剂，伴随着还原脱 氯反应来进行微生物的生长。前者主要是通过含金属离子的热稳定性的四卟啉 或酶的催化作用，含氯化合物作为辅因子被混合。 o t y l e n 撒 f i 耔d m c a d r , a 叠t c 一删 l 蚝 q 嘴魏吗娩出幽蛔彘鲥洲 r t 酗碳髓嘲h o f i l i c 幽妇i l l e 瓢妇l i i u 睫f 略 l b 俐鲫印捌妇n 嗍 鳓嘲橡跌晒锄翩： r 捌辩嘲鞠l o f 她靠踊谤l u 魄b 酲坶 ai 蝴y ip o 呻d e r i v e d5 0 r ew a t e r i 肠触翻螂酬概 卜卜攀盯蚴毓睁 图2 ，在自然界存在的三种脱卤机制：氧化脱卤、氢解脱卤秘还原脱卤。 1 3 厌氧还原脱卤 1 , 3 微生物的能量转换 生物体能量代谢的基本生化反应是生物氧化。各种细菌的生物氧化过程、 代谢过程和产生能量的多少有所不同。以有机物为受氢体的称为发酵；以无机 物为受氧体的称为呼吸其中以氧分子为受氢体的是有氧呼吸。以其它无机物 为受氢体的是厌氧呼吸。需氧呼吸在有氧条件下进行，厌氧呼吸和发酵必须在 无氧条件下进行。 在微生物的呼吸过程中，提供能量的电子供体被氧化，i , t a d + 被还原成 n , f i 。通过随后的在无机物的末端电子受体如氧气、硫酸盐或硝酸盐的沉积 7 中国科学技术大学颐十研究生毕业沦文 作用下。n a d h 在电子通道的作用下再次氧化。电子的传递驱动了质子泵在细 胞质膜的两侧产生质子梯度。质子梯度产生的电化学能量使a d p 在a t p 合成 酶的作用下生成a t p 。这个过程称为“氧化磷酸化”或“电子传递磷酸化”。 专性厌氧菌没有需氧电子传递链和完整的三羧酸循环，以无机氧化物作为 受氢体。专性厌氧菌缺乏完善的呼吸酶系统，只能在无氧条件下生存。在有游 离氧存在时，不但不能利用分子氧，且还将受其毒害。甚至死亡。细菌在有氧 环境中进行物质代谢产生超氧阴离子( 0 2 。) 与h z 0 2 ，两者都有强烈的杀菌作 用。厌氧菌因缺乏过氧化氢酶和氧化还原电势高的呼吸酶等三种酶，因此，在 有氧时受到有毒氧基团的作用被过氧化物杀死。 1 3 2 厌氧还原脱卤的模型 厌氧脱卤呼吸是近年来发现的一种新的呼吸方式。到目前为止，脱卤模型 有两个。首先第一个，其模型如图所示( 图3 ) ，还原脱卤酶是厌氧呼吸的重要 组分，它定位在细菌的细胞质膜上，活性位点是面向细胞质的。当有机卤化物 如二氯乙烷( d c a ) 、三氯乙烷( t c a ) 、四氯乙烯( p c e ) 、三氯乙烯( t c e ) 等进入细胞内，在细胞质一侧得到电子被还原。当电子供体如氢气( h 2 ) 、乙酸、 甲酸等通过氢化酶或脱氢酶时，会生成质子和释放电子，电子通过细胞质膜上 的电子传递链组分传递给还原脱氢酶，还原脱氢酶再将电子传递给卤化物，使 其被还原降解。生成的质子可以在细胞质膜的两侧产生电化学梯度，并通过细 胞质膜上的a = 巾酶上的质子泵生成a t p ，供给细菌的生长和代谢。 8 巾囚科学技术大学硕十研究生毕业论文 图3 ，厌氧条件下的还原脱卤模型1 。 第个模型，根据2 0 0 5 年一月份的s c i e n c e 上的一篇文献g p c e 降解 细菌d e h a l o c o c c o i d e se t h e n o g e n e s 的全基因组预4 序娜l ，如图4 所示。它是通 过对d e h a l o c o c c o i d e se t h e n o g e n e ss t r a i n1 9 5 细菌的全基因组测序，而推测出的 一个脱，飘模型。它的主要区别是：还原脱氯酶是定位在细胞质膜上，但活性位 点面向细胞周质，卤化物如四氯乙烯无需进入细胞质内，就可以在细胞周质中 被一步步降解成乙烯。定位在细胞膜上的氢化酶可以将电子供体即氢气氧化成 氢离子( h + ) ，并产生电子。h + 可通过细胞质膜上a t p 酶，并推动a t p 的生成 供给细菌的生长，电子被传递给还原脱氯酶供给卤化物的还原和降解。此外， 四氯乙烯被认为可作为信号分子，被组氨酸激酶的感应器感应后，促进了反应 调控子的转录和表达，进一步诱导还原脱氯酶基因和还原脱氯酶锚定基因的转 录和表达，生成还原脱氯酶蛋白前肽后，经转运出膜后成为成熟的全酶，定位 到细胞质膜上，发挥生物酶活性，进一步降解四氯乙烯。 9 中国科学技术大学硕十研究生毕业沦文 图4 ，厌氧脱卤摸型2 ：根据d e h a l o c o c c o i d e se t h e n o g e n e s 的全基因组测序推测 出的脱氯网络结构 1 3 3 厌氧细菌的系统发生学 系统发生关系用分枝图或树的形式说明。一棵系统发生树是由连结节的分 支组成的图。这些节代表分类单位如种和基因；那些在外的节，位于分支的未 端，代表活的生物。这棵树可以由一个时问尺，或分支的长度可以代表发生在 两个节之间的分子改变的数目。最后，树可以是无报或有根的，一棵无根树只 表示系统发生关系但是不提供进化途径。 系统发生的或系统的分类系统，这些系统建t 在进化灭系上而不是普遍相 似性。由于缺少好的化石记录，对证明原核生物和其它微生物是困难的，而氲 接比较遗传物质和基凼产物如r n a 和蛋白质则克服了这些m 题。现任人们更多 的父注5 s 和1 6 sr r n a 基因序列，它们分别是从原收7 t - 物核搪体5 0 s 和3 0 s 亚 0 巾国科学技术大学颁十研究生毕业论文 基中分离f f j 来的。这些r r n a 是研究微生物进化和相互关系的难得理想的材料， 因为发现它们对所有微牛物的一个主要细胞器足必要的，它们的功能在所有核 糖体中是样的。因此。它们的结构随时间改变非常慢，可能由于它们是恒定 和必要的功能。因为r r n a 包含有可变和稳定的序列，许多主要系统发生类群 的1 6 sr r n a 有一个或多个被称为寡核苷酸杯签的特征核营酸序列。寡核营酸 标签序列是特殊的寡孩苷酸序列，一个特定系统发生类群的大多数或全部成员 都有这个序列。所以亲缘荚系近藕非常远的微生物都能比较。因此，在还原脱 氯的细菌的分类学锰定巴，常采用1 6 sr r n a 序列作为比较的依据，建立系统 发生树【i s l 。 核糖体r n a 是与核糖体蛋白结合的r n a 分子，在蛋白质的翻译中起重要作 用。原核生物( 细菌和古生菌) 含有2 3 s 、1 6 s 和5 s 等3 种r r n a 。其大小分别约 为3 0 0 0 、1 5 0 0 和1 2 0 个碱基。真核生物与之对应的为2 8 s 、1 8 s 和5 8 sr r n a 。其 中作为小亚单位核糖体r n a 的1 6 sr k n a ( 或1 8 sr r n a ) 的大小最适合于进化分 析，通过比较各类生物1 6 sr r n a 的基因序列，从序列差异计算它们之间的进 化距离，可以绘制出生物进化树。因此1 6 sr r n a 序列分析技术的基本原理就是 从微生物样本中钓取1 6 sr r n a 的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交， 获得1 6 sr r n a 序列信息再与1 6 sr r n a 数据库中的序列数据或其它数据进行比 较，确定其进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。在蛋白 质的合成过程中，1 6 sr r n a 的3 端与位于m r n a 上的转录起始信号结合成复合 体，以确定m r n a 在核糖体上的位置。同时也与起始因子3 ( i f 3 ) 和氨酰t r n a 的3 端c c a 结合。 1 6 sr d n a 是编码原核生物核糖体小亚基r r n a ( 1 6 s r r n a ) 的基因，长度 约为1 5 0 0 b p ，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，其序列包含 1 0 个可变区( v a r i a b i er e g i o n ) 和与之相阃的1 1 个恒定区( c o n s t a n t r e g i o n ) ， 可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，t r a u b 等通过对 2 7 株原核生物1 6 sr d n a 的比对发现其中至少存在9 个高度保守的寡聚体 ( o l i g o m e r s ) ：较之2 3 sr d n a 等看家基因，它具有分子大小适中，突变率小等 优点，素有“细菌化石”之称。w o e s e 与o l s e n 基于对1 6 sr d n a 的分析构建了 现已被公认的全生命系统进化树。越来越多的细菌依据1 6 sr d n a 被j 下确分类 或重新分类，尤其是许多环境中的细菌。 叶1 国科学技术大学坝十研究生毕业论文 1 3 4 厌氧还原脱卤微生物 在过去二十年的研究中，第一个能够通过能量转换而使3 氯苯甲酸还原脱 氯成苯甲酸的6 一变形杆菌d e s u l f o m o n i l e 应咖f 的分离和生理鉴定p j ，为揭示厌 氧微生物的新形式的能量代谢奠定了基础。从此以后，不仅在脱卤呼吸细菌的 多种系统发生学和代谢多样性方面，也在这些细菌的脱卤呼吸网络的结构、功 能和调控方面，做了很多的研究。大量的单体和多聚氯化有机物已经可以被脱 卤呼吸微生物进行脱氯，包括氯乙烯和氯乙烷、卤代苯和苯酚、多氯联苯和二 氧芑等。目前已获得的纯培养已经被划分为几个不同的门1 5 0 l ( 图5 ) 。根据分离 细菌不同的电子供体和受体的范围和代谢多样性，它们被分别划为几个菌属， 其中，几株d e h a l o c o c c o i d e s 和d e h a l o b a c t e r 菌属的分离细菌表现为高度特异性 的细菌f 1 7 ，”l ，它们严格依赖脱卤呼吸进行生长，且大部分条件下，以氢气作为 唯一的电子供体。在大范围的原始的或污染的自然的或工业的生态系统中，脱 卤呼吸微生物被广泛的发现和应用。 t m 0 , 1 c 钿蹦b 蹦嘲 一i 岫h 矗呐 图5 ，卤呼吸细菌的系统发生树。氯呼吸分离菌( 黑体) 的系统发生树是基于 细菌的核糖体小亚基的r r n a 序列构建的。在原核生物中，指的是1 6 sr r n a 。 2 巾固科学技术大学硕十研究生毕业沦文 1 4 还原脱卤酶 1 4 1 还原脱卤酶的生化和分子特征 还原脱卤酶是脱卤呼吸微生物呼吸链上的关键性的催化荆。在过去的五六 年的时b j 中，尽管来自不同层次的好氧菌的脱卤酶如卤代烷烃、卤代酸、4 氯 苯甲酰辅酶的脱卤酶，已经在分子水平上广泛的研究，包括几个晶体结构的解 析。细节性的对厌氧微生物的脱卤酶生物化学与分子生物学的研究知识已经开 始积累1 3 2 1 ，来源于大量的脱卤呼吸微生物中的底物特异性的还原脱卤酶，已经 被大量的纯化和鉴定。迄今为止，发现所有酶的特点都是或多或少的与细胞质 膜紧密联系，强化了它们在与细胞质膜相关的电子传递偶联磷酸化的作用。 还原脱卤酶催化作用的辅因子：生物化学水平上的分析表明了，除了一个 酶以外，其他的还原脱卤酶都是单体和类咕啉依赖性酶。b 1 2 依赖性的还原脱卤 酶是目前发现的三类b 1 2 依赖性酶中的一类1 2 4 1 。在大多数情况下，钴胺素( i ) 的催化活性已经被烷基一碘化物的酶活性的光可逆失活反应初步证明。在大量 的例子中，酶中钴含量的分析、用浓缩方法和电磁顺磁共振光谱对类咕啉辅因 子的分析都给予了后期的证明。 但是在细菌df 招讲e f 中的3 氯苯甲酸还原脱氯酶中就不含有类咕啉因子。 它的酶是异源二聚体，每个小亚基都可能含有一个亚铁血红索因子，亚铁血红 素与类咕啉很类似这个酶是一个含有过渡态金属离子的四吡咯f 3 ”。 近年来，在sm u l t i v o r a n s 细菌中，降解p c e 的还原脱氯酶的类咕啉因子已 经被纯化出来，它的晶体结构已被解析。它不同于其它已知的b 1 2 辅因子的地 方，是因为它的钴胺酰胺半族中缺少一个甲基组分。相比之下，从d e h a l o b a c t e r r e s l r i c t u s 细菌中分离的降解p c e 的还原脱氯酶中得到的类咕啉因子，与其他的 通用的钴胺素有着共同的特点。有趣的是，没有脱卤能力的一株sm u l t i v o r a n s 细菌被证明是失活的，是因为它不能产生特有的降解p c e 的还原脱卤酶的类咕 啉因子。现在，对于许多脱卤呼吸分离菌的生长必须添加氰钴维生素或维生素 b 1 2 的建议。更加证明了还原脱卤酶的活性发挥是依赖类咕啉辅因子的。 除了d t i e d j e i 细菌的还原脱卤酶之外，直到目前，从厌氧微生物中分离纯 化的所有的还原脱卤酶都是含有两个铁硫( f e s ) 簇来作为类咕啉的辅因子。 通过对这些辅因子的e p r 谱的分析，使人们更加了解了还原脱卤酶的反应机制。 然而，最近从c l o s t r i d i u mb i f e r m e n l a n sd p h 1 和d e s u l f i t o b a c t e r i u mh a f n i e n s e p c p 1 细菌中分别分离纯化得到降解p c e 和2 ，4 ，6 三氯苯酚的还原脱卤酶，经过 1 3 中国科学技术大学烦十研究生毕业沦文 鉴定后，它们都缺少铁硫簇1 3 3 l ，这说明还原脱卤酶家族已经进化演变得至少四 个不同的类型。这个事实也证明了，后两种还原脱卤酶并不和其他的还原脱卤 酶表现出同样重要的序列相似性。1 9 , h a f n i e n s ep c p - l 细菌中的与结合在细胞质 膜上的2 ，4 ，6 三氯苯酚的还原脱卤酶是由e r d a 基因编码的，它比其他的还原脱卤 酶的分子量小( 3 3 k d a 比4 7 6 5 k d a d 、) ，它在微生物体内催化f 位的脱卤活性。 从cb i f e r m e n t a n sd p h 1 细菌中分离的降解p c e 的还原脱卤酶是作为同源二聚 体发挥活性，它也是结合在细胞质膜上的。 近年来从几种新型的脱卤呼吸分离菌的天然提取物中分离出来的几种还原 脱卤酶的活性有所不同。从d e s u l f i t o b a c t e r i u md e c h l o r o e l i m i n a n s 细菌中得到的酶 具有依赖类咕啉因子的l ，2 二氯乙烷的双氯消除活性，这种酶是具有立体选择性 的。从d e h a l o c o c c o i d e ss p s t r a i n c b d b l 的天然提取物中得到的氯苯脱卤酶的活 性说明了这种酶对i ，2 ，3 ，4 四氯苯和五氯苯具有极高的活性，大约比其它已知的 还原脱卤酶的活性离十倍。迄今为止，我们还不清楚在微生物的体内到底是一 种还是多种酶在发挥活性作用。然而，在不同同源物上的前期生长过程中，都 表明了不同的还原脱卤酶的活性可以受不同的电子受体诱掣2 8 】。在含有类咕啉 和f e s 簇的还原脱卤酶家族中，最近又增添了一个从高度富集的 d e h a l o c o c c o i d e $ s p s t r a i nv s 的培养物中分离得到的一个具有分解代谢氯乙烷 的还原脱卤酶。它的生化和分子水平的特征都显示了极高的相似性和高度的特 异性和对于氯乙烯的底物特异性，但是它与细菌d e h a l o c o c c o i d e se t h e n o g e n e s 的 降解t c e 的还原脱卤酶也有一些不同【4 ij 。 1 4 2 还原脱卤酶的分子生物学 细菌d e s u l f i t o b a c t e r i u md e h a l o g e n a n s 的降解o 氯苯的还原脱卤酶是由 e p r b a 基因编码的细菌sm u l t i v o r a n s 中的降解p c e 的还原脱卤酶是由p c e a b 基因编码的，除了以前对这些酶的生化分析以外，现在通过分子水平的分析， 表明了这些编码的酶形成了含有类咕啉因子的还原脱卤酶的新的一类。从脱卤 呼吸细菌中分离得到的大量的降解卤代脂肪族和卤代芳香族的还原脱卤酶的编 码序列更加证明了以上的观点。从纯化的多肽中获得的n 一术端氨基酸序列可 以用反译基因组的方法去克隆和鉴定编码的基因。在所有的情况下，还原脱卤 酶的催化亚基的编码序列都是与一个编码疏水膜蛋白的小的开放阅读框紧密相 连。对于d d e h a l o g e n a n s 的c p r b a 基因簇和sm u l t i v o r a n s 的p e e a b 基因簇， 1 4 巾国科学技术大学硕七研究生毕业论文 通过n o r t h e r n 杂交和r t - - p c r 分析表明了这些基因是共转录的，也说明了这 些基因产物是功能性相联系的。值得注意的是，卤代芳香烃的还原脱卤酶的r d h b 基因是在r d h a 编码基因的上游，而卤代烷烃还原脱卤酶的r d h b 是在r d h a 编码 基因的下游，基因r d h b 的产物的作用是帮助酶的催化亚基锚定到细胞质膜上的 【2 9 3 1 。 从系统发生学的角度，不同的细菌的不同的还原脱卤酶的催化亚基的序列 相比较，显示了大量的高度保守的序列和部分未知的序列花样，在生化水平上 显示了功能和机械的相似性。所有属于c p r a p c e a 家族的催化性的还原脱卤酶 亚基，都是由一个含有两个精氨酸( r r ) 信号序列的前肽产生。这个r r 序列 是细胞质外蛋白复合物的共有特征，在转运加工过程中被切断。成熟的转位的 全酶含有复杂的氧化还原辅因子，其中最具代表性的就是可以进行细菌的呼吸 作用和光合成代谢。这两个精氨酸转位机制通过折叠的或完全包装的状态将这 些复合物转运通过细胞质膜。有趣的是在cb i f e r m e n t a n s 和nh a f n i e n s es t r a i n p c p - l 的两个不相关的还原脱卤酶中都有一个信号序列。尽管这个信号序列并 不是r r 结构，而且c p r a p e e a 家族的还原脱卤酶的多肽都共有两个保守的f e s 簇结合花样，第一个是铁氧还型蛋白，第二个，除了d e h a l o c o c c o i d e se t h e n o g e n e s 的降解t c e 的还原脱卤酶之外，都是通过l o 1 2 个氨基酸残基把前两个半胱 氨酸( c y s ) 残基分离开，给了两个残基一个合适的空自j 构象。这部解释了为什 么d _ d e h a l o g e n a n s 的降解d 氯苯的还原脱卤酶含有一个 4 f e - 4 s 和一个 3 f e 4 s 】 簇。相比之下。d e h a l o b a c t e r r e s t r i c t u $ 的降解p c e 的还原脱卤酶和nh a f n i e n s e s t f a i nt c e 1 、p c e s 和y 5 1 的降解p c e 的还原脱卤酶是同一类都拥有两个 4 f e - 4 s 簇。序列分析更加证明了，f e s 簇的结构和特性的不同，是由于原先 序列划分直接反映的。结构隔开的甘氨酸( g l y ) 和脯氨酸( p r o ) 残基在d d e h a l o g e n a n s 的c p r a 结构中是缺失的，与nr e s t r i c t u s 的p c e a 的两个分离的 c y s 相连，是形成坏的主要原因。因此证明了在第二个 4 f e - 4 s 簇形成时，是允 许c y s 残基参与的【2 ”。最后，几个高度保守的残基被鉴别，包括色氨酸和组氨 酸，在结合类咕咻因子和稳定卤代化合物的方面起了重要的作用。 i 4 3 还原脱卤酶的多样性 还原脱氯细菌的显著的系统生态多样性给对有特殊呼吸卤代有机化合物的 能力的进化起源带来了问题。这个过程的关键酶的分子特征表明了大部分的还 1 5 巾国辩学技术大学颤十研究生毕业论文 原脱卤酶中有一个高保留的功能相关的序列花样。厌氧还原脱卤过程极可能是 一个来自古代的进化过程，包括自然的氯化物的降解。而不是由于环境中人工 合成的卤代化合物的释放而新发展的。这个观点也被许多其他的脱卤细菌在地 球范围内的广泛分布所证明。 另外，热力学方面也显示了进行卤代呼吸的微生物的生长产量的转换比预 计的值低，这也说明了，近年来人们向环境中投放的卤代有机化合物确实对微 生物脱卤能力的进化方面起了重要的作用，但是代谢脱卤的有效性还没有发展 到最佳的阶段。另一个可能的解释，脱卤呼吸缺陷的突变体，表明了转录的调 控子和环境的感官因子在脱卤呼吸活性的调控方面都有极为重要的作用。另外， 几个基因编码的分子蛋白复合体形成的催化亚基，例如伴侣蛋白( c p r d ，c p r e ) 和触发因子( c p r t ) 都是在脱卤呼吸的条件下特异性表达的，显示了它们在还 原脱卤酶复合物的成熟方面起了重要的作用。 还原脱卤酶基因表达的调节机制已经在dd e h a l o g e n a n s 中进行了较为详细 的研究i m 。在加入氯苯类底物后，脱卤酶编码基因c p r b a 的转录活性在3 0 分钟 内提高了1 5 倍。c 卜o h p a 的还原脱卤酶的调控机制如图6 所示。质膜上的组氨 酸激酶能感受外界环境中的有机氯化物，并激活转录调控子c p r k 。c p r k 的基 因产物是c r p f n r 转录调控子超家族的成员之一，它们作用在脱卤呼吸的特异 的基因表达。在脱卤呼吸细菌诱导的转录亚基的上游，象f n r 盒的结合花样成 为卤盒( h a l o b o x ) ，是被活化的c p r k 蛋白识别和结合的，从而启动了还原脱卤 酶基因c p r b a 的转录和表达。表达产物在分子伴侣蛋白c p r d 、c p r e 和触发因 子c p r t 的帮助下进行折叠，并经过一系列转录后加工成前体蛋白c p r a - - r r ， 其n 端的双精氨酸( r r ) 信号序列能够被细胞膜上n 玎转运子识别并引导前 体蛋白通过细胞膜，转运到膜外。随后信号肽r r 被切除，c p r a 成为成熟的还 原脱卤酶蛋白被锚定到细胞质膜上的c p r b 蛋白上，组装成成熟的全酶，发挥 还原脱卤能力将c 卜o h p a 降解成h - o h p a 。这个研究也说明了只有在氯代底物即 c i o h p a 存在的条件下，基因的异源过表达和纯化的c p r k 才能特异性的结合到 c p r 启动子区域。 1 6 巾国科学技术大学硕十研究生毕业论文 图6 ，nd e h a o g e n a n s 的脱卤酶复合体的调控和功能组合模型。m e ，金属离子， 可能参与基因的表达和参与形成成熟的酶的复合物：h k ，组氨酸激酶：r e r e ， 反应调控子；r r ，两个精氨酸信号序列；t a t ，两个精氨酸特异的转位子。虚线 表示推测的信号转导。 1 5 脂肪族卤代化合物的特性 1 5 1 卤代脂肪族化合物 卤化的c i 和c 2 溶剂在2 0 世纪7 0 年代就得到了广泛的关注。这一类化合物主 要包括氯甲烷、氯仿、p c e 和t c e 。这些卤代化合物被广泛的应用于干燥清洁剂、 去脂剂、除草剂和杀虫剂。水的氯化杀菌也会产生一些这样的化合物，并且脂 肪族溶剂都具有一定的水溶解性。因此，脂肪族化合物成为土壤和地下水的主 要污染物。在2 0 世纪8 0 年代，人们开始研究这些溶剂的降解，并发现了其复杂 的降解途径，包括可能性的生物的或非生物的( 化学的) 步骤和一些脱卤机制。 其中，还原脱卤是几个脱卤机制之一，它主要发生在厌氧环境中。脂肪族的化 合物的还原脱卤常发生在大范围的不确定的微生物菌群、纯培养的细菌和无细 胞系统中。在极大程度上，还原脱卤降解脂肪族溶剂依赖于这些化合物本身、 物理化学环境和附近存在的微生物。在甲烷类和乙烯类的微生物脱卤的研究中， 只有很少的还原脱卤可以发生。在同样的环境条件下，会产生大量的低氯产物。 1 7 巾四科学技术大学坝十研究生毕业论文 这是因为，在污染的厌氧的自然环境中。会经常发现卤代脂肪族化合物的低氯 产物。例如，在厌氧的蓄水层罩，当有p c e 或t c e 污染时，c i s 一二氯乙烯( c i s - - d c e ) 也是这个环境中最常见的和重要的污染物【3 9 2 5 _ 2 们。但是，p c e 和t c e 的完全脱氯也是有可能性的，而且现在已经被研究的很深入，无毒的乙烯会最 终成为p c e 和t c e 降解产物【6 t7 ，8 9 o 1 ”。 但是到目前为止，关于氯代烷类的脱氯研究却相对较少i 他l ，仅有少数的氯 代烷类能够被厌氧的细菌降解【4 t 棚。关于氯乙烷的还原脱氯的纯培养细菌仅有 d e h m o b a c t e r s p e c i e s s t r a i nt c a l i i i ，它可以将t c a 还原降解成c a ： d e h a l o c o c c o i d e se t h e n o g e n e ss t r a i n1 9 5 t 4 1 、d e h a l o c o c c o i d e ss p s t r a i nb a v l 【1 5 1 、 d e s u l f i t o b a c t e r i u md i c h l o r o e l i m i n a n ss t r a i nd c a i 1 6 1 和d e h a l o b a c t e rs p s t r a i n w l l l 7 j 可以还原降解1 2 d c a 。 1 5 2 二氯乙烷的理化特性 l ，l - 二氯乙烷( d c a ) 是无色，略带有甜味的油状液体。它的分子量是9 8 9 6 ， 熔点是一9 7 ，沸点是5 7 ，所以在室温下极容易挥发和燃烧。它的水溶性是 5 4 0 0 m g l ，证明它具有定的溶解于水的能