（微生物学专业论文）无锡他汀固定化生产和发酵条件优化的研究.pdf

摘要 4 忙。肠f d 筇括s p s t 2 7 1 0 ( 以下均简称为s t 2 7 1 0 ) 可生物转化洛伐他汀为无锡他汀，但 转化过程中有效菌体浓度低，发酵周期长，转化率低，当底物浓度为o 5 m 鲈i l l 、转化1 2 0 h 时，转化率只有4 8 。本研究采用海藻酸钠包埋法和玻璃纤维吸附法固定该菌体细胞，并对 固定化条件及转化条件进行了初步研究。 通过正交实验优化了菌株s t 2 7 1 0 的固定化条件，确定海藻酸钠浓度为2 1 0 0 m l 、c a c l 2 溶液浓度为1 1 0 0 m l 、菌体包埋量为2 5 m l 菌悬液5 0 m l 凝胶。在最优条件下对菌株s t 2 7 1 0 固定化细胞与游离细胞相比，发酵周期由1 2 0 小时缩短为4 8 小时，并且转化率也有所提高。 对固定化菌株s t 2 7 l o 转化洛伐他汀的条件进行了初步研究，确定了转化的最适发酵温度为 2 8 ，最适p h 为7 0 ，2 0 m l 转化培养基2 5 0 m l 的摇瓶装粒量为7 5 n 1 l 凝胶菌体混合液，摇 床转速为1 0 0 “m i n ，并且固定化细胞具有较好的稳定性。 选择玻璃纤维为s t 2 7 l o 的物理吸附载体，并且选择o 5 2 0 m l 培养基为合适的玻璃棉用 量。与游离细胞发酵相比，经吸附法固定后，发酵液中菌体干重由o 0 4 3 9 增加到0 0 8 9 9 。探 索了玻璃纤维吸附法固定化细胞的发酵条件。确定以摇床吸附、最佳摇床转速为1 0 0 r 佃i n 、 增殖时间为4 8 h 。采用该法后，玻璃纤维固定化细胞在底物浓度达到3 m g f i l l 时，转化9 6 小 时后，转化率了达到5 0 以上。并且菌株s t 2 7 l o 吸附法固定化细胞在多批次转化发酵的稳定 性方面表现的非常好。 对发酵条件进行了初步的研究。确定最佳接种量为5 ；添加t w e e n - 8 0 对s t 2 7 1 0 转化洛 伐他汀具有明显的促进作用，最适添加量为6 0 u l ，2 0 m l 培养基，在此条件下洛伐他汀浓度为 2 m g m l 、4 8 h 后的转化率由3 6 5 提高到5 5 以上。考察了分批补料对洛伐他汀转化率的影 响。以0 7 5 m m l 、1 o m g m l 为初始浓度，流加量为o 7 5 m m l 2 4 h 、1 0 m g m u 2 4 h ，至底物 浓度为4 5 5 o m m l 时，转化率可以达到5 0 以上。确定最优发酵培养基( g l ) ：可溶性淀 粉5 0 、h y c a s es f2 、玉米浆3 ，p h7 0 。 关键词：细胞固定化；海藻酸钠；玻璃纤维；发酵条件；洛伐他汀；无锡他汀 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t 4 t 忙。儿f f c 伊括s p s t 2 7 1 0c o u l dt r a n s f 0 姗1 0 v a s t a t i nt ow u x i s t a t i n b u ti nt h ep r o c e s so f m i c r o b i a l 妇n s f o 咖a t i o nt t l e r ea r ep m b l e m st h a tt l l ev i n i l a lc o n c e n t m t i o no fm y c e l i u mi st o ol o w 锄dt 1 1 ep e r i o do ff e m e n t a t i o ni st o o1 0 n g w h e n1 0 v a s t a t i nc o n c e n t r a t i o nw a so 5 m m l ，t h e b i o c o n v e r s i o nr a t ew a s4 8 a f t e r1 2 0 ho f f 宅咖e m a t i o n i i lt h i sp a p e r i m m o b i l i z e dt h em y c e l i 啪o f s 仃a 主ns 他7 1 0 、v i t l ls o d i 啪a l g i i l a t e ，a i l dt h ec o n d i t i o n so fi m m o b i l i z a t i o na n df 爸肿e n t a t i o nw e r e o p t i m i z e d t h ei 衄o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n so f 爿删c d 肠，咿括s p s t 2 7 1 0w e r eo p t i m i z e d 1 1 1 er c s u l t s s h o w e dt h a t 也eb 眦e ri 衄o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：s o d i u ma l g i n a t e2 1 0 0 m l ， c a i c i 岫c h j o r i d el 1 0 0 m l ，s u s p e n d e dm i c r o b i a lc e l l s2 5 m l 5 0m lg e l c o m p a r e dw i t hf k ec e i l s ， t 1 1 ef e r i i l e m a t i o np e r i o do fi m m o b i l i z e dc e l l sw a ss h o r t e dg r e a t l y ，w 1 1 i c hw a s 丘o m1 2 0h o u r st o4 8 h o u r s a n d 血er a t i oo ft m s f b n n a t i o nw a si m 口r o v e d t h ef e m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z e d s t r a i l ls t 2 7 1 0w a ss t i l d i e dp r i m a r i ly t h eb e n c rt r a n s f b m a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf 0 1 1 0 w s ： t e m p e r 曲u r e2 8 ，p h7 0 ，c e uc o n c e 曲i o n7 5 m ls o d i u ma l g i r l a t e ，2 0 m lr n e d i 哪，r o t a t es p e e d 1 0 0 l 恤i n t h ee 丘& to fs u b s 仃a t ec o n c e n t r a t i o na n db i o 仃a n s f b n n a t i o nt i m ew e r ea i s os t u d i e d t h e s t o r es t a b i l i t ya n dr e p e a t e df 响e m a t i o nw e r ea l s op r e s e n t e d g l a s s 、 ，o o lw a ss e l e c t e da st h ea d s o r p t i v ec a r r i e ra i l dm eb e s td o s a g ew a so 5 2 0 m lm e d i u m c 叩缸e dw i m 雠ec d l s ，t h ed r yw e i g h to fc e l l sw a si n c r e a s e de o mo 0 4 3 9t oo 0 8 9 9 t h e f 锄e m a t i o n so fa d s o r d t i o nc e l l sw e r ea l s os t u d i e d t h er e s l l l t sw e r ea s f o l l o w s ： s w 幻g - b e d - a d s o r p t i o n ，l o o r i n i n ，p m l i f b r a t e st i m e4 8 h b yg l a s s 、v o o l sa d s o r p t i o n ，w h e nt 1 1 e l o w i s t a t i nc o n c e n 廿眦i o n 、哪u pt o3m g m l ，t 1 1 eb i o 嘶s f o m l a t i o ny i e l dw a sm o r em a n5 0 a n e r 9 6 ho f f e n n e n t a t i o n t h e 乜a i l s f o n n a t i o nn l t eu n d e rd i f f 宅r e n ti n o c u l u m sw a sd i s c u s s e d 姐d5 ，aw a st h eb e s t t h e o 埘面z a t i o no ff 咖e n 诅t i o nc o n d i t i o n sw a sp r e s e n t e d t h ea d d m o no ft 、v e e n - 8 0 、v o u l da c c e l e r a t e t l l eb i o c o n v e r s i o nr a t eo b v i o u s l y a tt h eb e s ta d d i t i o np o i n t ，t h et r a n s f o n n a t i o nm t ew a si n c r e a s e d f b m3 6 5 t o5 5 w h e nm e1 0 v a s t a t i nc o n c e n t r a t i o nw a s2 m m ia f t e r4 8 ho ff e r n l e n t a t i o n w h e n 也es u b s t r a t ew a s5 m m lt l l e 廿a n s f o m l a t i o nr a t ec o u l dr e a c h 廿l ep e a l ( o fm o r et 1 1 a i l5 0 l r o u 曲 b a t c hf e e d w h i c hs h o w e dt l i a tm e 印p m a c ho f b a t c hf e e d i n gi sa v a i l a b l e t h ef e 咖e n t a t i o nm e d i u r l l w 越o p t i m i z e d t h eb e s tf b 咖e n t a t i o nm e d i u r nw a sa sf o l l o w s ：s 0 1 u b l es t a r c h5 0 、h y c a s es f2 、c o m s t e 印j i q u o r3 1 “yw o r 旧s ： i r m o b i l i z e dc e l l s ； s o d i u r n a i g i n a t e ；g l a s sw o o l ； f e m e n t a t i o nc o n d i t i o n s l o v a s t a t m ：w u x i s t a t i n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：关昨日期： 拍年亨月f d 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日期：以年矿月日 1 1 胆固醇的作用 第一章绪论 胆固醇是人体不可缺少的重要成分，它不但是血液中脂类物质之一，也是构成细胞生物 膜的基本成分，是维护生命、繁衍种族所不可缺少的重要物质。 一百多年以前，德国病理学家v i r c h o w 发现患有与动脉有关的一些疾病如动脉硬化的病 人的动脉通常是较厚的不规则的并含有黄色的脂类物质，后定义为胆固醇。1 9 1 3 年舸t s c h k o w 和c h a l a t o w 发现用高胆固醇的饲料喂养兔子也会出现与人相似的病症。由于冠心病( c o m m r y h e a nd i s e a s e ，c h d ) 人血浆的胆固醇含量要比正常人高，这样，找出胆固醇与冠心病之间 的关系也就成为研究的热点。于是，在二十世纪五十年代，开始一项名为f r a m n g h j m 的 计划，主要目的是研究血浆中胆固醇与冠心病之间的关系，最后发现血浆中胆固醇的升高与 冠心病的死亡率有正相关【i j 。 人体内的胆固醇小部分来自食物，大部分由体内自行合成。正常情况下体内合成量可自： 动调节，且保持一定的水平，过多或过少都不利于健康。对代谢旺盛的青少年和经常参加体 力活动或坚持锻炼的青壮年来说，有害胆固醇不易积累，所以没有必要过分限制胆固醇的摄 入量。但对中老年人，由于内分泌水平的改变( 因精神过度紧张，体力活动减少，或患高血压、 肥胖等病) ，脂质代谢失调，使血清胆固醇增多。摄入过多的饱和脂肪和胆固醇不仅可引起这 种紊乱，导致血脂升高甚至发展为动脉粥样硬化。 1 2 胆固醇的生物合成过程 胆固醇合成过程比较复杂，整个过程可分为三个阶段【lj 。 第一阶段：3 羟基3 甲基戊二酸甲酰c o a ( h m g 。c o a ) 的生成 在胞液中，3 分子乙酰c o a 经硫解酶和h m g c o a 合成酶催化生成 n v i g c o a ，此过程 与酮体的生成机制相同。 第二阶段：甲羟戊酸( m e v a l o n i ca c i d ，m v a ) 的生成 h m g c o a 在h m g c o a 还原酶催化下，消耗两分子n a d p h 和h + 生成甲羟戊酸( m v a ) ： h m g c o a 还原酶 h m g c o a + 2 n a d p h + h + m j 硝+ 2 n a d p 十+ s h c o a - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + 此过程是不可逆的，h m g - c o a 还原酶是胆固醇合成的限速酶。 第三阶段：胆固醇的生成 m v a 先经磷酸化、脱羧、脱羟基、再缩合生成含3 0 碳的鲨烯，经内质网环化酶和加氧 酶催化生成羊毛脂固醇，后者再经氧化还原等多步反应最后失去了3 个碳，合成2 7 碳的胆固 醇。 、 当体内总胆固醇过高，超过合成生物膜、胆汁酸及类固醇激素等的需要时，胆固醇及其 l 江南大学硕士学位论文 酯则沉积在动脉内皮下的巨噬细胞中( 这些细胞是由迁移到动脉内皮下的血单核细胞分化而 成的) ，引起内皮下变形，进而导致血小板在动脉内壁集聚。若同时伴有动脉壁损伤或胆固醇 转运障碍，则易在动脉内膜形成脂斑，继续发展可使动脉管腔变狭窄。可见动脉粥样硬化与 血中高水平的胆固醇有关脚。 1 j 降血鹰药的种类 随着人们生活水平的提高，饮食结构的调整，现在高血脂和冠心病的病人数量不断提高， 特别是发达国家，以美国为例，每年大约有1 3 0 0 1 4 0 0 万成年人面临此病口j 。因此心血管疾病 是一类严重危害人类健康的疾病，在世界范围内其发病率和死亡率始终居高不下，接近世界 人口总死亡的1 4 ，成为人类健康的头号大敌，世界卫生组织( w h 0 ) 总干事中岛宏博士说： ”在今天的世界上，心血管疾病比其他任何疾病杀死更多的人，并使千百万人致残。尽管近3 0 年来心血管病死亡率除东欧各国外的大多数国家都有不同程度的下降，但其仍是多数国家4 5 岁以上男性第一位的死亡原因，在女性则是仅次于肿瘤的第二位死因，严重影响着人类的期 望寿命和生存质量。而高血脂是冠心病的主要危险因素，因此人们把血腊调节药物的开发作 为治疗心血管疾病的重点。 自2 0 世纪8 0 年代末起，降血脂的药物大量推出，因种类较多，分类也较困难。就其主 要降血脂功能可分为降总胆固醇、主要降总胆固醇兼降甘油三酯、降甘油三酯、主要降甘油 三酯兼降总胆固醇四大类。就其化学结构特点与主要降血脂功能相结合来分类，可将常用的 种类及制剂分为胆酸整合剂、m v i g c o a 还原酶抑制剂、烟酸、阿西莫司、烟酸肌醇酯、贝 特类、普罗布考、泛硫乙胺、弹性酶、o m e g a - o 脂肪酸口】。 1 4 1 作用机理 他汀类物质的降低血浆中胆固醇作用不仅仅是抑制胆固醇的生物合成，在二十世纪七十 年代，b r o w n 和g 0 1 d s t e i n 【4 】因发现肝脏中的l d l 受体在测定血浆中胆固醇的功能及作用而获 得1 9 8 5 年的诺贝尔奖。 h m g c o a 还原酶抑制剂的作用是减少甲羟戊酸的合成，这会减少体内胆固醇的积累垆j 。 内源性胆固醇水平的降低促进了与内质网膜结合的s r e b p 水解，使后者转变成有活性的带有 螺旋环形螺旋亮氨酸的拉链蛋白质，后者脱离内质网并移入细胞核，与低密度脂蛋白受体 ( l d l r ) 基因的启动予结合，激活低密度脂蛋白受体基因的转录，使细胞低密度脂蛋白受体 水平升高，加强了低密度脂蛋白受体与血浆中的低密度脂蛋白的结合，从而降低血浆低密度 脂蛋白的水平”】。尽管l d l 受体蛋白不是h m g c o a 还原酶抑制剂( c o m p a c t i n ，l o v a s t a t i n ) 的 作用目标，但b m w n 和g o l d s t e i n 的研究结果表明，低密度脂蛋白受体蛋白的表达与他汀类物 质的药效有直接关系。细胞表面特异性低密度脂蛋白受体，是清除低密度脂蛋白的主要途径， 其合成速率与细胞内胆固醇含量呈负相关性【i j ，因而刺激细胞表面低密度脂蛋白受体合成和 数量增加。低密度脂蛋白通过与肝内特异低密度脂蛋白受体和其它组织中低密度脂蛋白受体 ( 低密度脂蛋白降解部位) 的结合而从循环中清除，在溶酶体中低密度脂蛋白降解释出胆固醇 并被摄入内质网状组织中。除此之外，他汀类物质也可促进低密度脂蛋白受体的合成，提高 循环中高密度脂蛋白。 纳摩尔级的他汀类物质能明显抑制从h m g c o a 合成羟甲基戊二酸，而对羟甲基戊二酸 合成胆固醇无影响，这就说明他汀类物质对h m g c o a 的还原酶有抑制作用。他汀类物质是 h m g c o a 的还原酶的竞争性抑制剂【7 】，他汀类物质对还原酶的亲合能力比h m g c o a 的亲 合能力高10 4 倍，表明他汀类物质具有强的特异性【2 】。通过实验证明：h m g - c o a 首先与酶结 合，之后与n a d p h 结合，发生还原反应：依次释放n a d p 、c o a 和羟甲基戊酸。这表明他 汀类物质分子中的内酯环既是其活性中心也是还原酶的结合位点【”。 他汀类物质本身以非活性内酯形式存在，在体内被酶水解后才成为有活性的羟酸形式【5 j 。 它们带有疏水基团，后者可能结合在h m g c o a 还原酶活性区中的h m g 结合区。他汀类物 质中类似于h m g 的基团与h m g c o a 还原酶c i s 环中残基( s e r 6 8 4 ，a s p 6 9 0 ，l y s 6 9 1 ，l y s 6 9 2 ) 之间形成大量的极性作用，这些众多的氢键和离子对导致他汀类物质中类似于h m g 的基团 与h m g c o a 还原酶之间电荷与结构的互补，使他汀类物质特异、紧密地结合 玎g c o a 还 原酶，从而在空间上阻碍该酶的底物与之结合。因此，他汀类物质通过与h m g c o a 还原酶 竞争性结合，抑制后者的活性。但这一过程并不影响h m g c o a 还原酶与n a d p h 的结合。 现已确定h m g c o a 还原酶的羧基端与他汀类物质结合，同时又对 玎g c o a 还原酶抑制剂 的空间结构和作用机理有了更深入的研究口j ，从而在调节血浆胆固醇水平中起重要功能。 h m g c o a 还原酶抑制剂在降低低密度脂蛋白、t g 的同时，能够升高高密度脂蛋白水平。 此点不同于其它的降血脂药物，高密度脂蛋白通过提供载脂蛋白c 和胆固醇酯，帮助将肝外 组织胆固醇转运到肝脏，并激活脂蛋白脂酶，高密度脂蛋白可对抗高胆固醇血症和高低密度 脂蛋白，血症的致动脉粥样硬化作用。实验观察到当高密度脂蛋白升高0 0 2 6 咖o l l i 时，通 心病死亡率下降5 5 。 1 4 2 发现过程 h m g c o a 还原酶是胆固醇生物合成途径中的限速酶之一，与胆固醇合成途径中其它物 质相比，羟甲基戊二酰辅酶a 是水溶性很好的物质。当h m g c o a 还原酶受到抑制时，羟甲 基戊二酰辅酶a 不会在体内进行积累，而走向其它的途径，因而不会产生有毒物质的前体物。 因此，寻求和开发h m g c o a 还原酶的抑制剂是药物研究者的工作重点l l j 。 最早进行微生物法生产h m g c o a 还原酶抑制剂研究的学者是e n d o l 2 j ，他在1 9 7 1 年寻 找通过微生物生产治疗胆固醇的药物时，历时两年多从6 0 0 0 多株中筛选出一株尸e ，l 把讲f “m c f f r f n 姗i ，其发酵液对h m g c o a 还原酶具有抑制作用，他们将这种活性物质称为m l 2 3 6 b ( c o m 口a c t i n 、m e v a s 诅t i n ) ；后将这种活性物质进行分离和提纯，在医学上称之为美伐他汀， 又名美瓦停。其他一些研究者证实它在哺乳动物与高胆固醇血症患者中都有明显的降低血清 中总胆固醇水平的作用，但由于其它的原因，最终没有在临床上应用。 在1 9 7 6 年，e n d o 研究小组将美伐他汀样品和一些相关数据无偿提供给m e r c k 公司，通 过动物试验得出相同的结论。1 9 7 8 年，该公司的研究者a l b e r t sc h e n 等从土壤中分离到一株 菌4 印p ，g “，淞据r 陀淞，它能产生美伐他汀的类似物一洛伐他汀( 1 0 v 嬲t a t i n ，乐瓦停，美降之) ， 发现它的抑制效果优于美伐他汀【8 】，并能明显降低血清中总胆固醇的含量和原发性高胆固醇 江南大学硕士学位论文 血症病人的l d l 胆固醇，因其安全性好，在1 9 8 7 年获得f d a 批准用于临床【2 】o 由于这两种 物质的特殊的疗效，使研究者开发与它们结构相似的化合物，第二个进入市场的是辛伐他汀， 它与洛伐他汀不同之处是在侧链多一个甲基。之后不断有他汀类物质推出，1 9 8 9 年日本三共 公司推出普伐他汀( p r a v a s t a t i n ) ，同年在日本上市，1 9 9 4 年在中国上市。1 9 9 4 年瑞士诺华公司 首次人工合成他汀类物质氟伐他汀( n u v a s t a t i n ) ，继这之后，美国的辉瑞公司1 9 9 7 年首次在英 国上市了目前分子量最大的人工合成的含氟的他汀类物质阿托伐他汀( a t o r v 船t a t i n ) i1 9 9 7 年德 国拜耳公司上市的西立伐他汀( c e r i v a s t a t i n ) ，是合成他汀类物质中分子量最小的药物【9 】，但因 与吉非贝齐联用导致罕见的肌无力不良反应，最后从全球市场中撤出【l “。而现处于研究阶段 的m l g c o a 还原酶抑制剂主要有：日本n i s s a n 和k o w a 公司的伊伐他汀( i t a v a s t a t i n ， p i t a v a s t a t i n ) ，日本盐野公司的罗伐他汀( r o s u v a s t a t i n ，f d aa u g u s t1 2 ，2 0 0 3 ) ，以及 由日本h i s 鲫i t s u 公司和m e r c k 公司控股的日本万有公司共同开发的h b s 一1 0 7 。在这些他汀 类物质中，洛伐他汀是发酵产品；普伐他汀是美伐他汀的羟基化产物：辛伐他汀是以洛伐他 汀为底物，通过化学方法合成的；而其余的他汀类物质是化学方法合成的。有学者还对 m “g - c o a 还原酶抑制剂的抑制效果进行了比较，发现阿托伐他汀抑制效果最好，i c 5 0 ( 他汀 类物质抑制m l g c o a 还原酶活力5 0 时，所用他汀类物质的量) 为8nm o l 几，美伐他汀为最次， 2 3n m o l l ；西立伐他汀、辛伐他汀和氟伐他汀的i c 5 0 依次为1 0 、1 1 和2 8 n m o l l ；而h m g c o a 与卸g c o a 还原酶结合的米氏常数为4um o l ，l 【3 l 。他汀类物质的结构示意图见图1 2 。 从图1 2 可以看出，所有他汀类物质有一个共同的结构即活性中心，b 羟基6 内酯环( 开 环或闭环) ，其中美伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀和辛伐他汀有四部分组成：p 羟基6 内酯环： 连接内酯环和亲水基团的桥：萘环；侧链酯。如果羟基被甲酯所代替，则无活性，证明活性 中心是p 羟基6 内骼环，如果羧基被碳酰氨所代替，则活性就消失，进一步证明p 羟基6 内 酯环是活性中心。另外，连接桥的长度对酶的活性也有影响，原因可能是它们维持一定的空 间结构l “o “。而萘环也起一定的作用，因为没有它，活性减弱1 0 6 之多。另一方面，c 3 位的 h 被c h 3 取代( 洛伐他汀) ，则活性有所增加，另外，侧链甲基丁酯若缺失，活性将降低1 1 0 或更少1 1 3 1 4 1 。 s c o a 图1 1 几种他汀类物质的结构示 ( a ：美伐他汀，b ：洛伐他汀，c ：普伐他汀，d ：辛伐他汀，e ：西立伐他汀 f ：氟伐他汀，g ：阿托伐他汀h ：罗伐他汀，而最后为删g c o a ) 普伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀都是美伐他汀的衍生物，对照它们的化学结构和分子量 极其相近，具有非常相似的药物动力学性质，特别是洛伐他汀和辛伐他汀相互仅在辅基的支 链上相差一个甲基，且都以无活性的内酯形式存在，只有进入人体内水解成6 一羟酸才能产生 降血脂作用。普伐他汀与洛伐他汀的辅基相比仅在萘环上有差别，前者是羟基后者是甲基， 但普伐他汀的活性基团是以具有活性的开放酸盐结构存在，水溶性特征明显，在肝脏和小肠 中含量高于其他组织，抑制肝脏胆固醇的合成能力比周围组织高4 0 0 1 2 0 0 倍【”】。 1 4 3 他汀类物质的降脂作用 血脂异常属于一种代谢紊乱，合理的膳食和运动等非药物措施在其治疗中起着最基本的 作用，但往往未受到患者及医师的足够重视。由于h m g c o a 还原酶抑制剂能有效抑制胆固 醇的合成，因而对血脂的主要成分有明确作用，并有良好的危险效益比而应用日趋广泛h 矾。 刚k洲l 肛扎 h 。警 江南大学硕士学位论文 h m g c o a 还原酶抑制剂的化学结构与h m g c o a 还原酶有类似之处而竞争性抑制 后者所催化的生化反应，一方面使胆固醇生成减少，另一方面因肝细胞内胆固醇浓度降 低，肝细胞膜上作为循环中清除低密度脂蛋白主要途径( 约占6 0 8 0 ) 的低密度脂蛋 白受体( a p ob e ) 转录性上调，数量及活性增加，最终使血胆固醇下降。 1 5 微生物转化 微生物转化( m i c r o b i a lt r a n s f o m a t i o n 或m i c r o b i a lb i o c o n v e r s i o n ) ，即利用微生物生 长代谢过程中产生的某个酶或一组酶对底物进行催化反应的过程，简单地说，即指利用 微生物来进行某种化学反应。 1 5 1 微生物转化的一般过程 微生物转化是利用微生物产生的酶对底物的某一部位进行特定的化学反应来获得 目标产物的过程。在这一过程中，微生物的生长和底物的转化可以完全分开。一般先进 行菌体的培养，然后加入底物，用微生物菌体产生的酶来转化底物分子。 微生物转化通常分为两个阶段【1 7 】： 第一阶段为菌体培养。为了获得较多的微生物菌体或酶，需供给菌体丰富的营养， 在最适的温度、p h 和通气条件下，使其充分繁殖，保证菌体良好生长。培养时间的长 短随菌种而异，一般细菌需要1 2 2 4 h ，霉菌2 4 4 8 h 。但微生物菌体生长与酶的产生条件 不完全一致，还需研究发酵产酶的条件，尽可能地诱导产生所需要的酶，抑制不需要的 酶。 第二阶段是加入底物进行转化。转化反应前将底物进行适当处理，配制成溶液，再 与微生物发酵液或菌体悬浮液混合，按适宜的转化条件进行反应。 1 5 2 特点 微生物转化，可以在发酵过程进行到一定时间后添加底物，又称为添加前体发酵法； 也可以用滤出的、洗涤过的菌体细胞或固定化细胞作为生物催化剂，与有机化学合成和 酶法合成类似的方式进行转化，也可称为生物催化( b i o c a t a l y s i s ) m 。 微生物转化，与有机化学合成和酶法合成相比较，有下列特点： ( 1 ) 在立体结构合成上具有高度的专一性：微生物转化是一种酶的催化反应，类似 于无机或有机化学的化学反应，所不同的是微生物转化具有高度的专一性。微生物或酶 作用于底物时，具有高度的立体结构选择性，它不仅有化学选择性( c h e m o s e l e c t i v i t y ) 和 非对映异构体选择性( d i a s t e r e o t o p es e l e c t i v i t y ) ，并且有严格的区域选择性 西o s e l e c t i v i t y ) 、面选择性( f a c es e l e c t i v i t y ) 和对映异构体选择性( e n a l l t i o p es e l e c t i v i t y ) 。 严格的立体结构选择性，对药物合成来说是非常重要的。特别像生理活性很高的激素、 抗生素以及心血管系统和神经系统药物等的药效对立体结构的要求很高，往往具有严格 对映体立体构型要求，此为有机化学合成方法难以达到的【i ”。并且，微生物或酶有时能 6 在有机分子的非活性中心发生反应，这对一般化学方法来说是很难实现的【l 引。 ( 2 ) 微生物转化所需反应条件适中、设备简单、反应速率快：高效催化是微生物转 化的另一特征。在最适条件下，酶能在l s 内使1 0 2 1 0 6 个底物分子转变成产物，并在常 温、常压和p h 近中性等条件进行催化反应，这往往是普通化学催化剂所不能进行的。 微生物转化无需高压、强热等苛刻的条件，设备简单，反应条件温和，生产安全，原料 除底物和普通培养基外没有其他化学品，避免或减少使用强酸、强碱和一些有毒原料， 改善操作条件，环境友好。 ( 3 ) 微生物转化收率高、成本低：微生物转化是在全细胞内进行，保持原有整体酶 系统比较符合生物催化所需的环境与条件【2 0 】。在氧化还原等催化反应时不需添加辅酶， 对于酶法合成来说这是很难满足的。微生物转化反应可以持续进行，反应量大，收率高， 可以大规模工业生产。加上设备和原料简单易得等优点，生产成本一般低于化学合成， 也往往低于分离纯化酶的酶法合成。 1 5 3 几种i 扣m q c o a 还原酶抑制剂的生物转化 1 5 3 1 微生物对美伐他汀的转化 最早发现微生物对他汀类物质的转化作用的是日本的研究学者，他从给药( 美伐他 汀) 后的哺乳动物的代谢产物中分离得到一种物质，这种物质的活性比美伐他汀要高【2 l l ， 并且疗效也比美伐他汀高，后经鉴定为普伐他汀，后来他们从大约l 0 0 0 株细菌和真菌 中进行筛选，结果发现在1 3 个属2 6 个种的真菌中有5 3 株菌具有此转化作用；而细菌 中具有此转化作用的菌株很少，多数为放线菌，主要为 r 0 阳，硪口s p 和勋印幻帕旧即 r d s c r o m d 2 p ”“s 【2 1 2 3 1 。在真菌中最好的一株为胁l ， 把m 口凰s a n k 3 6 3 6 7 2 ，转化率 大约为4 3 7 【2 4 j 。后来他们又发现含有p 4 5 0 单氧化酶的唧胁，c c n r 6 印 f ，淞也是具 有此转化作用，并且有研究者对此酶进行了分子学方面的研究【2 2 2 5 之6 】。在此研究基础 上，a m o l dld e m a i n 【2 7 棚l 研究小组检测其中有转化作用的5 9 株放线菌，发现有一株 爿c f f ”d 聊日砌r 日s d 2 9 6 6 ( a t c c5 5 6 7 8 ) 具有较高的转化率( 6 5 7 8 ) 。此研究小组从菌 龄、培养基、底物添加方式等方面进行了系统的研究。韩国研究人员发现另一株 龇p f o m y c p ss p y - 1 1 0 也可以将美伐他汀转化成普伐他汀，并对转化酶进行了研究1 3 呻”。 从以上这些研究成果可以看出，美伐他汀到普伐他汀的微生物转化是最为成功的。 1 5 3 2 微生物对辛伐他汀的转化 最早研究辛伐他汀微生物转化的是m e r c k 公司的研究人员i j 。”j ，发现o c 甜咖 口“f d f 唧 f c 日s p d 肌e 砌胆f f n 和爿c f f n d 肌y c e 把m a 6 4 7 4( a t c c 5 3 8 2 8 ) 对辛伐他汀有明显 的转化作用，转化产物见图1 2 ，其中b 物质有a 、8 两种形式。对 胁翮口口f d 脚矗耙口 s p 口m e 腑”，加日来说，高浓度的辛伐他汀对转化有抑制作用，而低浓度、分批补料有利 于转化产品的生成，作者还讨论了在小试和中试中溶解氧、种子培养基、分批补料 等对转化率的影响；而爿c f f n d 埘y c e 把m a 6 4 7 4 是从土壤中分离得到的，主要对辛伐他汀 钠盐有转化作用，文章中讨论了转化培养基的种类、p h 、无机盐等对转化率的影响，还 江南大学硕士学位论文 对转化产物中的q8 二者比例的产量进行了讨论。 a 图1 2s i m a s t a t i n 两种衍生物的结构示意图 b 1 5 3 3 微生物对洛伐他汀的转化 微生物对洛伐他汀( 图1 1 a ) 的转化是在1 9 8 3 年由日本学者忙i i 首次提出，他们在进 行美伐他汀转化成普伐他汀时，偶然发现胁f c o r 把m 口凰s 心3 6 3 6 7 2 对洛伐他汀也具 有转化作用，产物分别是6 羟基洛伐他汀和3 a 羟基异洛伐他汀( 产率分别为1 7 3 和1 6 3 ) ，它们的结构式见图1 1 b 和图1 1 c ，但二者对h m g c o a 还原酶的抑制效果 低于洛伐他汀。1 9 9 0 年，m e r c k 公司发现爿c 砌d m y c p 把m a6 4 7 4( a t c c 5 3 8 2 8 ) 在适 合的条件下，对洛伐他汀的钠盐具有转化作用，可生成6 羟甲基一洛伐他汀和8 酰基洛 伐他汀类似物( 辛伐他汀的转化物) ，后者对h m g c o a 还原酶的抑制效果好于洛伐他汀 川。1 9 9 7 年，a m t o n j aj e l ( 1 ( e 1 发现彳6 s 油口c d p ，“z p “i d r 7 0 5 ( i d r ：i n s t i t i l t ef o rd n l g r 船e a r c hl t d ，b u d a p e s t ，h u n g a r y ) 对洛伐他汀有转化作用，产物有两种：一种是c 2 位的 c h 3 被c h 2 0 h 所取代，此物质为新化合物( 图1 1 d ) ；另一种物质以前为化学合成( 图 1 1 e ) 。二者对m d g 。c o a 还原酶的抑制效果同洛伐他汀相似。 还有一种是将洛伐他汀转化为砸o da c i d ( 图1 1 f ) 。由于它保留了h m g c o a 还原 酶抑制剂的主要结构，因而它对h m g c o a 还原酶也具有抑制作用，同时砸o da c i d 还 具有以下两点优越性：1 ) 砸o da c i d 可作为中间体合成新的他汀类物质；2 ) 由于洛伐他 汀和辛伐他汀结构极其相似，在辛伐他汀合成之后很难将未反应的洛伐他汀除掉，若将 洛伐他汀转化成t r i o da c i d ，再通过结晶法就可将t r i o da c i d 和辛伐他汀分开。菌株 c f d ，舢，口c ”c d m 阳c “淞c “肠对洛伐他汀的钠盐或铵盐就有此种转化作用，产率可达6 0 以上，而对辛伐他汀没有作用，同时s c h i m m m e l 等人还对转化酶的性质进行了研究p ”。 在1 9 9 7 年y a n g 等人就用m o da c i d 通过c 白h 旃幽r 唧脚的固定化酯酶在有机相溶剂中 合成了洛伐他汀，并对反应条件进行了研究 【”j 。 本实验室于海博士从本中心保藏( 从自然界中筛选) 的放线菌中筛选到对洛伐他汀 有转化作用的菌株一所脚肠f d 筇括s p s t 2 7 1 0 。彳c d 肠，哪捃s p s 配7 1 0 菌株对洛伐他汀 的转化作用是国内外首次报道。通过爿脚) 御，口，唧扫s p s t 2 7 1 0 转化洛伐他汀，将转化产 物进行提取、分离和纯化，并进行结构鉴定；结果发现转化产物i 和i i 为同分异构体， 比洛伐他汀的分子量多1 6 ，说明菌株s t 2 7 1 0 对洛伐他汀有羟基化作用。其中的一种转 v 争豁v 争寥 化产物( 转化产物i i ) ，经教育部科技查新站( l 0 8 ) 检索后确定为新化合物。同时，通过体 外检测洛伐他汀及其转化产物对h m g c o a 还原酶活性的抑制作用，发现洛伐他汀对酶 的i c 5 0 ( 他汀类物质抑制h m g - c o a 还原酶活力5 0 时所用他汀类物质的量) 为 8 0 5 7 肛咖l ，转化产物i 和i i 的分别为3 7 7 6 肛咖l 和3 0 5 7 l p g ，m l ，比洛伐他汀的i c 5 0 分别低2 1 倍和2 6 倍。再将二者混合后测定的i c 5 0 为2 0 2 1 咖l ，明显低于单一样品和 洛伐他汀，这种他汀物质的协同效应增强效应国内未见报道。因此将新的化合物( 转化 产物i i ) 暂命名为无锡他汀p 。 1 6 细胞固定化技术 细胞固定化技术p9 j 是将微生物细胞固定化保持在生存的状态下，它照常维持该菌体 的生物化学功能。固定化活的微生物发酵技术与传统游离细胞发酵相比，由于它大大增 加了细胞的浓度，因此加快了发酵速度，缩短了发酵周期，提高了产成品率。同时，由 于发酵作用的菌体细胞被固定，因而细胞可长时间的反复使用，这为发酵的连续化、管 道化提供了方便。 根据大多数研究者的意见，大体可将细胞固定化方法分成载体结合法、包埋法、交 联法、多孔物质包络法、超过滤法等几大类。其中以包埋法使用最为普遍。 1 6 1 载体结合法 1 6 1 1 表面吸附法 很多类型的微生物细胞，有吸附在固体物质表面的天然倾向。供吸附细胞用的载体 多是多孔性物质，包括高岭土、硅藻土、多孔硅、聚氯乙烯碎片、活性炭、木屑、离子 交换树脂、多孔玻璃等。有时，微生物本身并不具有吸附能力。但是，通过改变细胞或 固体载体表面的理化性质，可以使微生物细胞以离子引力或借助化学键吸附于载体。 1 6 1 2 共价结合法 此法是利用细胞表面的反应基因，如氨基、胺基、羟基、巯基、咪唑基等，与己活 化的无机载体或有机载体相反应，形成共价键，而成为固定化细胞。利用此法制备的固 定化细胞，细胞大多已经死亡。 1 6 2 包埋法 将细胞直接包埋于多聚体载体中的包埋法是固定化细胞技术中使用最为普遍、最为 有效的一种方法。目前工业上以凝胶包埋法固定细胞应用最为广泛。已被广泛使用的载 体有：海藻酸钙凝胶、k 角叉胶、琼脂糖胶、卡拉胶等等。近来还采用各种天然的凝胶 物质，如琼脂、壳聚糖、明胶、胶原、蛋清、槐豆胶、混合胶，人工合成的聚合物以及 利用辐射作用能聚合的物质。近几年又发展出了几种载体联用的方法。 凝胶包埋法主要有以下几个特点： ( 1 ) 方法简便，将细胞与单体或聚合物一起聚凝，细胞被包埋在形成的聚合物之 江南大学硕士学位论文 中。 ( 2 ) 条件温和，可选用不同的聚合物载体，不同的包埋系统和条件，以保持细胞 的酶催化活性。 ( 3 ) 细胞不易渗漏，稳定性好。 ( 4 ) 有较高的细胞容量，聚合体中的细胞含量可达5 0 7 0 。 1 6 3 交联法 此法利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团( 例如氨基、酚基、巯 基咪唑基等) 发生反应，使细胞彼此交联，形成网状结构，即成固定化细胞。 1 6 4 多孔物质包络法 此法利用一些能够使细胞穿运入空隙、并在其中形成很大细胞群体的多孔物质来制 备。很明显，多孔物质内的孔隙必须足够大，以便使微生物细胞容易穿透进去；但是， 空隙又不能很大，通常为