（生物化学与分子生物学专业论文）migfbp7原核表达载体的构建与表达.pdf

白 获 得 表 达 。 厂 结果: p c r 扩增出7 9 0 b p 的d n a 片断， 构建的重组体经酶切鉴定: m i g f b p - 7 的d n a 与载体的连接方向正确， 使重组体的读码框与预期一 致; 融合表达的蛋白 质产物经s d s - p a g e 检测约3 1 k d o 结论: 成功构建了m i g f b p - 7 的原核表达重组体: p r s e t - m i g f b p - 7 , 并使其在t : 启动子下获得了融合表达。 关键词:小鼠i g f b p - 7 , 、 / t ， 启动子， 构建， 原核表达 /“丫 abs tract background: th e c dna e n c o d i n g c l o n e d i g f b p 7 ( i n s u l in l i k e g r o w th f a c t o r b i n d i n g p r o t e i n 7 ) w a s f i r s tfr o m l e p t o m e n i n g i a l a n d s e n e s c e n t m a m m a ry e p i t h e l i a l c e l l s . t h e d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s h a r e s a 2 5 % i d e n t it y t o i n s u l i n l i k e g r o w th f a c t o r s b i n d i n g p r o t e i n s ( i g f b p ) 1 - 6 s u g g e s t e d t h a t i g f b p 7 c o u l d b e a n o t h e r m e m b e r o f t h e i g f b p s f a m i l y . t h e p re s e n t s t u d ie s h a v e s h o w n t h a t i g f b p 7 d e c r e a s e s e x p re s s i o n i n t h e p r o g re s s i o n fr o m b e n i g n t o m a l i g n a n t . t h o s e d a t a s u g g e s t t h a t i g f b p 7 h a s a s u p p r e s s i v e e ff e c t o n t h e t u m o r d e v e l o p m e n t . o b j e c t i v e : t o c l o n e t h e c d n a s p a n o f m o u s e i n s u l i n l i k e g ro w t h f a c t o r b i n d i n g p r o t e i n 7 ( m i g f b p - 7 ) ; a n d t o e x p re s s t h e f u s i o n p rot e i n o f m - i g f b p 7 i n e c o l i t o ma k e a b a s e f o r o u r n e x t res e a r c h w o r k . me t h o d s : k i l l t h e m o u s e ( b a b l / c ) a n d o b t a i n t h e s p l e e n , t h e t o t a l r n a w a s e x t r a c t e d fr o m i t b y t r i z o l k it . u s i n g t h e t o t a l r n a a s t e m p l e t , f u l l le n g t h c d n a s o f m i g f b p - 7 w e re c l o n e d b y r t - p c r a n d n e s t - p c r m e t h o d s . a ft e r d i g e s t e d b y e c o r i a n d h i n d i i i , t h e c d n a fr a g m e n t s w e r e in s e r t e d i n t o p r o k a ry o t ic f u s i o n e x p re s s i o n v e c t o r p r s e t , t h e n a n e x p r e s s i o n r e c o m b i n a n t p r s e t - m i g f b p - 7 w i t h t 7 p r o m o t o r w a s c o n s t r u c t e d . t h e n t h e r e c o m b i n a n t s w e re t r a n s f o r m e d i n t o e .c o l i : b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s ( b d p s ) , t h e r e c o m b i n a n t m i g f b p - 7 p r o t e i n w a s e x p r e s s e d w it h i p t g a n d / o r l a c t o s e i n d u c i n g . r e s u l t s : a b o u t 7 9 0 b p d n a fr a g m e n t w a s o b t a i n e d b y p c r , t h r o u g h s e q u e n c i n g， t h e d n a s e q u e n c e o f m i g f b p - 7 a n d t h e re a d i n g fr a m e o f r e c o m b i n a n t w e r e c o n s i s t e n t w it h a n t i c i p a t i o n , s d s - p a g e s h o w e d t h e f u s io n e x p re s s i o n p r o t e i n w i t h t h e m o l e c u l a r m a s s o f 3 1 k d c o n c l u s i o n s : c o n s t r u c t i o n o f a p r o k a ryo t i c e x p re s s i o n r e c o m b i n a n t p r s e t - m i g f b p - 7 w a s s u c c e s s f u l a n d t h e r e c o m b i n a n t p r s e t - m i g f b p - 7 c a n e x p r e s s f u s i o n p r o r e i n o f m i g f b p - 7 . ke y w ords : mo u s e i n s u l i n l i k e p r o m o t o r ; c o n s t r u c t i o n ; p rok a r y o t i c g ro w t h f a c t o r b i n d i n g p r o t e i n 7 ; t 7 e x p r e s s i o n 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 第一部分 目 u台 p r e f a c e 1 9 9 3 年美国学者m u r p h y 从正常的人软脑膜细胞克隆到一段d n a ，并 表达了这种蛋白质， 发现它能够与i g f s 相结合， 进一步研究发现， 它在结 构上与 i g f b p s 有很高程度的同源性，故命名为i g f b p - 7 / i g f b p - r p l e 工 9 9 8 年日 本学者 k a t o m v 从小鼠 ( m o u s e )的 肝脏成功克隆了 i g f b p - 7 ( i g f b p - 7 ) 的全长c d n a ， 共有1 0 9 3 b p ， 编码2 8 1 个氨基酸; 后者为 i g f b p - 7 / i g f b p - r p i 的前体蛋白， 其多肤链的n 端有一个由2 5 个氨基酸残 基的构成的前导肤，切去前导肤生成成熟的m i g f b p - 7 分子，分子量约为 2 7 k d ; m i g f b p - 7 / i g f b p - r p 1 的基因定位于第五号染色体上; n o r t h e r n b l o t 显示i g f b p - 7 m r n a 几乎存在于所有的正常组织中，其中以子宫、卵巢、皋 丸、肾 脏、肺脏和脾脏中的含量最高，而在相应的肿瘤细胞中含量甚微。 人类的i g f b p - 7 的基因定位于4 8 1 2 ，基因序列与小鼠 有7 5 % 的同 源性，编 码的产物含有 2 8 2 个氨基酸，多肤链的 n 端也有一个前导肚序列。 随后 入人 h e l a k a t o m v用表达得到的这种蛋白与绿色荧光素结合，分别把它加 细胞和鼠的s a o s - 2 ( 骨肉 瘤细胞) 培养基中， 发现 工 g f b p 7 定位于 胞浆，分泌至培养基中，于对照组相比，i g f b p 7 明显抑制肿瘤的生长。从 而证实它是一种重要的肿瘤抑制剂。 进一步功能学的研究发现，工 g f b p 7能与 工 g f s结合，既参与正常细胞 的生长发育及衰老，又在肿瘤发生发展中起重要作用。它主要是抑制肿瘤 细胞的生长，加速其凋亡。最近的研究表明，i g f b p 7 能以高亲和力与胰岛 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 素受体结合， 从而阻断胰岛素正常的作用， 推测它与i i 型糖尿病和其它代 谢病的发病有关。 正是基于它广泛的生物学作用， 所以i g f b p 7 越来越受关 注，对它的研究也不断深入。 我们采用逆转录p c r 和巢氏p c r 技术成功地克隆了m i g f b p - 7 c d n a , 构建了含t : 启动子的原核重组表达质粒， 并使m i g f b p - 7 在大肠杆菌中获得 了融合表达， 为下一步研究m i g f b p - 7 的生物学活性、 作用机理及临床应用 奠定了基础。 材料与方法 m a t e r i a l s a n d m e t h o d s 1材料 ( m a t e r i a l s ) 1 . 1 动物 ( a n i m a l s ) b a l b / c 小鼠，4 周龄，巧克，购于湖北省实验动物中心。 1 . 2 菌种和质粒 ( b a c t e r i a a n d p l a s m i d s ) 表达质粒p r s e t 、 大肠杆菌d h 5 a 、 b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s ( b d p s )由 华 中科技大学同济医学院医学分子生物学研究室保存并提供。 1 . 3 酶和分子量标准 ( e n z y m e a n d m a r k e r s ) 限制性内 切酶 e c o r i ( 1 6 u / u l ) , h i n d i i i ( 1 4 u / u l ) , t , d n a连接 酶 ( 5 u / u l ) ，t a q d n a聚合酶 ( 5 u / u l ) ，r n a酶，a d n a / h i n d i i i m a r k e r s , 购自 华美公司; 中分子量蛋白质m a r k e r s 购自 上海p r o m e g a 1 . 4 m j i 物 ( p c r p r i m e r s ) 1 . 4 . 1引物i ( p l ) , i g f b p - 7的5 端引物，引入e c o r i 酶切位点: 序列为:5 - t a t a g g g g a a t t c t t c c t c t t c g g a t g c c t g c - 3 1 . 4 . 2引物2 ( p 2 ) , i g f b p - 7的3 端引物， 引入h i n d 工 i i 酶切位点: 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 序列为:5 - g g g t g a c a a g c t t t a g c t a c a g a g g c t c a t g g - 3 1 . 4 . 3引物 3 ( p 3 ) , i g f b p - 7 的5 端引物的上游引物: 序列为:5 - c t c t c c t c t t c c t c c t c t t c - 3 1 . 4 . 4引物 4 ( p 4 ) , i g f b p - 7的3 端引物的下游引物，又为逆转录 引物: 序列为:5 - g a a g t g t g t c a g g c a a g a g c - 3 以上引物均由上海博亚 b i o a s i a )生物技术有限公司合成。 1 . 5 试剂盒和试剂 ( k i t s a n d r e a g e n t s ) 1 . 5 . 1 t r i z o l 试剂盒 ( t r i z o l k i t ) 1 . 5 . 2 r t - p c r 试剂盒 ( r t - p c r k i t ) 1 . 5 . 3 胰蛋白陈 ( t r y p t o n e ) 1 . 5 . 4 酵母提取物 ( y e a s t e x t r a c t ) 1 . 5 . 5 琼脂糖 ( a g r o s e ) e p 0 0 3 1 1 . 5 . 6 丙烯酞胺 ( a c r l a m i d e ) 1 . 5 . 7 n , n 一 亚甲基双丙烯酞胺 ( b i s - a c r l a m i d e ) g i b c o p r o m e g a o x i o d o x i o d e s p a i n f l u k a b i b 1 . 5 . 8 十二烷基硫酸钠 ( s o d i u m d e d e c y l s u l f a t e s d s )b i b 1 . 5 . 9异丙基一 - d - 硫代半乳糖昔 ( 工 p t g ) 过硫酸按( a p ) 澳化乙锭 ( e t h i d i u m b r o m i d e ) p r o m e g a a m r e s c o a m r e s c o 卜日，土 ，.二勺1 1 2 考马斯亮兰 r - 2 5 0 1 3 三轻甲 基氨基甲烷 ( c o o m a s s l e b r i l l i a n t r - 2 5 0 )f l u k a 15.比1.5. 15( t r i s ) f a r c o 1 . 5 . 1 4 2 - 琉基乙醇 ( 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ) 其余试剂为国产分析纯。 g i b c o 1 . 6培养基 ( c u l t u r e m e d i u m ) 1 . 6 . 1 l b 培养基:1 % 胰蛋白 陈，0 . 5 % 酵母提取物，1 % a a c 1 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 1 . 6 . 2 l b 琼脂平板:l b 培养基十1 . 5 % 琼脂 1 . 6 . 3 m 9 z b培养基:0 . 1 % 水解酪蛋白、0 . 6 % n a ; h p o 0 . 3 % k h 2 p o 0 . 5 % n a c 、0 . 0 1 % n h ., c l , 0 . 5 m m m g s o , . 1 . 7 特殊试剂的配制 ( p r e p a r a t i o n o f s p e c i a l r e a g e n t s ) 1 . -7 . 1 t e 1 0 m m o 1 / l t r i s - c l ( p h : 8 . 0 ) l m m o l / l e d t a ( p h : 8 . 0 ) 1 . 7 . 2 s t e 1 0 0 m m o 1 / l n a c l 1 o m m o l / l t r i s - c 1 ( p h : 8 . 0 ) l m m o l / l e d t a ( p h : 8 . 0 ) 1 . 7 . 3 s o l u t i o n i 5 0 m m o 1 / l 葡萄糖 2 5 m m o l / l t r i s - c l ( p h : 8 . 0 ) 1 o m m o l / l e d t a ( p h : 8 . 0 ) 1 . 7 . 4 s o l u t i o n 1 1 0 . 2 m o 1 / l n a 0 h 1 % s d s 1 . 7 . 5 s o l u t i o n i i i 5 m k a c n. 5 %冰醋酸 1 . 8 仪器 ( e q u i p m e n t s ) 1 . 8 . 1 p c r 扩增仪 ( d n a a m p l i f y i n g m a c h i n e ) p t c - 1 0 0 型 美国m j . r e s e a c h 1 . 8 . 2 - 8 6 冰箱 ( - 8 6 0c f r e e z e r ) 3 8 2 e 型 日本s a n y o 1 . 8 . 3电子天平 ( e l e c t r o n i c b a l a n c e ) p b - 2 0 3 e 型 1 . 8 . 4 净化工作台 瑞士 m e t t l e r t o l e d o 公司 ( l a m i n a r f l o w h o o d ) s w - c j - 2 f d 型 苏州苏净集团安泰空气技术有限公司 华中科技大学同济医学院 硕廿学位论文 1 . 8 . 5 数显隔水式恒温培养箱 ( i n c u b a t o r ) 3 0 3 a s - 1 型 上海浦东跃欣科学仪器厂 1 . 8 . 6 冷冻离心机 ( r e f r i g e r a t e d c e n t r i f u g e ) d l - 7 a 型 中科院武汉科学仪器厂 1 . 8 . 7 台式高速离心机 ( m i c r o f u g e ) t g l - 1 6 c 型 上海安亭科学仪器厂 1 . 8 . 8 台式离心机 ( b e n c h c e n t r i f u g e ) l d 5 - 2 a 型 北京医用离心机厂 1 . 8 . 9 恒温摇床 ( r o t a r y s h a k e r ) h q - 4 5 a 型 中科院武汉科学仪器厂 1 . 8 . 1 0电热鼓风干燥箱 ( e l e c t r i c a l l y - h e a t e d d r y i n g o v e n ) c s 1 0 1 - i重庆银河实验仪 器有限公司 1 . 8 . 1 1 电热恒温水浴箱 ( w a t e r b a t h ) h h . w 2 1 . 4 2 0 型 武汉精华科教仪器公司 1 . 8 . 1 2紫外分析仪 ( u l t r a v i o l e t t r a n s m i s s i o n a n d r e f l e c t i o n d e t e c t o r ) z f - 1 型上海嘉鹏科技有限公司 1 . 8 . 1 3 手提式紫外检测灯 h a n d - h e l d u l t r a v i o l e t ) z f - 7 型 上海顾村电光仪器厂 1 . 8 . 1 4超声波细胞粉碎机 ( u l t r a s o n i c c e l l d i s i n t e g r a t o r ) k s - 1 5 0 型浙江宁波科生仪器厂 1 . 8 . 1 5恒压恒流电泳仪 e l e c t r o p h o r e s i s p o w e r s u p p l y w i t h c o n s t a n t c u r r e n t a n d v o l t a g e ) d f - d i i i 型 北京东方特力科贸中心 1 . 8 . 1 6 电泳槽 ( e l e c t r o p h o r e s i s t a n k ) 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 d y y - i 工 工 3 1 a 型北京六一仪器厂 d y y - 1 1 1 3 1 b 型北京六一仪器厂 d y y - 1 1 1 2 3 a 型北京六一仪器厂 1 . 8 . 1 7 微量移液器 ( p i p e t t e ) 2 u 1 , 2 0 u 1 , 1 0 0 u 1 , 2 0 0 u 1 法国g i l s o n l o u t上海芬兰 1 0 0 0 u 1北京金花 2 .实验方法 ( e x p e r i m e n t a l m e t h o d s ) 2 . 1抽提总 r n a的准备( 无 r n a s e 处理) 1 )塑料制品 ( e p 管、 t i p 头)均用一次性新品，用d d h zo 煮两 遍，使用前高压灭菌。 2 )玻璃器皿常规洗净后，用 0 . 1 % 二乙基焦碳酸盐 ( d e p c ) 浸 泡处理 ( 3 7 c , 2 小时) ， 再用灭菌d d h r 0 冲洗几次， 高压消 毒去除d e p c ，然后 1 8 0 干烤 1 0 小时. 3 )电泳槽处理:用去污剂洗净，用蒸馏水冲，再用乙醇干燥， 然后灌满 3 % h .-,o : 的溶液，室温放置 1 0分钟，再用灭菌的蒸 馏水冲干净。 4 )试剂的处理: 所用试剂为新包装， 用干烤过的药勺称取试剂， 用高压灭菌水配制溶液，将溶液装于无r n a s e 的玻璃器皿， 再用0 . 1 % d e p c 于3 7 处理过夜， 然后高压处理( 1 . 0 3 4 * 1 0 5 , 2 0 分钟) 。 5 )整个操作过程，操作者戴口罩与帽子:在操净工作台进行。 2 . 2从小鼠 脾脏中抽提总r n a i )取组织:消毒，解剖小鼠，取新鲜脾脏。 2 )匀浆:5 0 m g 组织加 l m l 的t r i z o l 匀浆。 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 3 )分离水相:匀浆后样品转e p 管置室温5 分钟，加0 . 2 m l 的 氯仿， 手剧烈震荡1 5 秒， 置室温3 分钟， 离心1 4 0 0 0 r p m * 1 5 分钟，水相转至新e p 管。 4 )沉淀 r n a :加 0 . 5 m l的异丙醇，置室温 1 0分钟，离心 1 4 0 0 0 r p m * 1 0 分钟。 5 )洗涤 r n a : 弃上清， 向沉淀中加 l m l 7 5 9 6 的乙醇( - 2 0 预冷) ， 漩涡震荡，离心1 4 0 0 0 r p m * 5 分钟。 6 )溶解 r n a :弃上清， 沉淀中加2 0 0 u l d e p c 处理的水溶解 r n a 备用。 2 . 3聚合酶链反应 ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n , kr ) 2 . 3 . 1 逆转录 p c r ( r t - p c r ) : 根据试剂盒要求建立以下反应体系和反应过程: a )反应体系5 0 u l 终浓度 p c r 专用水 ( n u c l e a s e - f r e e w a t e r ) 2 5 u l 缓冲液 ( a m v / t f l 5 x r e a c t i o n b u f f e r ) l o u l 1 * 原料 ( d n t p m i x , l o m m o f e a c h d n t p ) l u l 0 . 2 m m 下游引物 ( d o w n s t r e a m p r i m e r , p 4 ) 5 0 p m o l 1 1i m 上游引物 ( u p s t r e a m p r i m e r , p 3 ) 5 0 p m o l 1 11 m 硫酸镁 ( m g s o , , 2 5 m m ) 2 u l 1 m m 逆转录酶 ( a m v r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , 5 u / u l ) l u l l u / u l 聚合酶 ( t f l d n a p o l y m e r a s e , 5 u / u l ) l u l 0 . l u / u l 模板: 上述提取的总r n a 2 u l b )反应过程: 4 8 c , 4 5 分钟- 一一 逆转录 华中 科技大学同济医学院硕士学位论文 9 4 0c , 2 分钟- - 一一灭活逆转录酶 9 4 6 8 c , 、3 0 秒，6 0 0c, 6 0 秒，6 8 c , 1 2 0 秒，4 0 个循环 7 分钟。 2 . 3 . 2 第二次 p c r 扩增 ( n e s t - p c r ) 以第一次p c r 扩增的产物作为模板， 以p l , p 2 作为引物， 特 异地扩增出 i g f b p - 7 的 c d n a : a ) 反应体系5 0 u l x 4 只终浓度 p c r 专用水 ( n u c l e a s e - f r e e w a t e r ) 2 5 u 1 缓冲液 ( 1 0 x p c r r e a c t i o n b u f f e r ) 5 u 1 1 x 下游引物 ( d o w n s t r e a m p r i m e r , p 2 ) 5 0 p m o 1 1 11 m 上游引物 ( u p s t r e a m p r i m e r , p 1 ) 5 0 p m o 1 1 11 m 原料 ( d n t p , 2 . 5 m m o f e a c h d n t p ) 4 u 1 0 . 2 m m e a c h 抓化镁 ( m g c l 2 , 2 5 m m ) 4 u 1 2 m m d n a 聚合酶 ( t a q d n a p o l y m e r a s e , 5 u / u l )l u l 0 . 1 u / u l 模板:逆转录p c r 产物2 u 1 b ) 反应过程: 9 4 0c , 5 分钟 9 4 c, 4 0 秒，5 8 0c , 4 0 秒，7 2 c , 5 5 秒。3 0 个循环 7 2 c, 7 分钟 p c r 产物经 1 % 琼脂糖凝胶电泳与a d n a / h i n d i i i m a r k e r s 比 较鉴定，紫外灯下拍照 ( 珠江d f 相机，标准镜头 +3 个近摄 镜头 十红色滤色镜，光圈5 . 6 ，速度4 5 秒) 。 2 . 3 . 3 p c r 产物的 纯化: p c r 产物经酚冻法回收纯化: 1 ) 取 1 . 5 m 1 e p 管称重，去皮; 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 2 )用手提紫外灯确定目 的条带的位置 ( 注意不要离的太近) ; 3 )用手术刀切下含 p c r产物即目的基因条带，置已 称重的 e p 管中，称胶块的重量; 4 )用刀片切碎凝胶，注意越碎越好; 5 )按 1 0 0 m g胶加 1 0 0 u l 酚的量加入饱和酚，漩涡剧烈振荡 1 0 分钟，置- 2 0 过夜; 6 )次日取出，3 7 水浴融化，漩涡振荡 1 0 分钟; 7 )离心，1 4 0 0 0 r p m * 5 分钟; 8 ) 将上层水相小心转入另一 印管， 用酚: 氛仿: 异戊醇和氛仿: 异戊醇各抽提一次; 9 ) 再将上层水相转入另一 e p管，加入 1 / 1 0 体积 3 m的n a a c ( p h : 5 . 2 )及 2倍体积一 2 0 c预冷的无水乙醇，混匀， 于 - 2 0 过夜: 1 0 ) 次日 取出 后离心，1 4 0 0 0 r p m * 1 0 分钟， 弃上清， 用7 0 9 6 乙醇 洗涤沉淀两次: 1 1 ) 将 d n a沉淀溶于一定体积的 t e缓冲液中， 使核酸终浓度 l u g / u l e 2 . 4 原核表达载体p r s e t - m i g f b p - 7 的构建 2 . 4 . 1目的基因片断的制备: a .回收纯化的p c r 产物用e c o r工 和h i n d工 1 1 双酶切: a )建立 1 0 0 u l e c o r i 酶切反应体系: d d d h 2 0 8 0 u l 1 0 xb u f f e r h l o u t e c o r i( 1 6 u / u l )3 u l 回收纯化的p c r 产物l o u l 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 振荡混匀，离心数秒，3 7 水浴酶切2 . 5 小时。 b ) 酶切反应完成后，反应体系用酚: 氯仿: 异戊醇抽提 2 次， 氯仿: 异戊醇抽提1 次; 加入1 / 1 0 体积3 m的n a a c ( p h : 5 . 2 ) 及 2 倍体积一 2 0 预冷的无水乙醇， 混匀， - 2 0 过夜， 次日 取出，1 5 0 0 o r p m离心 1 5分钟，弃上清，7 0 % 乙醇洗沉淀 1 次，灭菌d d d h , o 9 0 u 1 溶解沉淀。 c ) 建立1 0 0 u 1 h i n d i i i 酶切反应体系: 上述酶切纯化的产物9 0 u 1 1 0 x b u f f e r e l o u l h i n d i i i ( 1 4 u / u l )3 u 1 振荡混匀，离心数秒，3 7 水浴酶切2 . 5 小时 b .双酶切产物经 1 % 琼脂糖凝胶电泳分离，酚冻法回收纯化 ( 方 法见2 . 3 . 3 ) ，即得到目的基因片断。 2 . 4 . 2 载体片断的制备: a .碱裂解法大量制备含表达载体p r s e t 的质粒: 1 )于2 5 0 m 1 l b 培养基中 ( a m p 终浓度 l 0 o u g 加1 )接种含表达 载体p r s e t 的大肠杆菌， 置空气摇床振摇，3 7 1c , 1 6 0 r p m , 培养过夜; 2 )次日离心收集细菌，平均转入四个5 0 m 1 离心管中; 3 ) 室温， 离心3 0 0 o r p m * 1 0 。 分钟; 4 )弃去上清，向每管中加s t e 5 m 1 ，用吸管吹打悬浮细菌后转 入一个 5 0 m 1 离心管; 5 ) 室温， 离心3 0 o o r p m * 1 0 分钟; 6 )弃上清，吸管壁水珠，每管加4 m l s o l u t i o n工 ，吹打悬菌; 7 )每管加 8 m l s o l u t i o n 1 1 ，轻轻颠倒几次混匀，立即置冰 华中科技大学同济医学院 硕士学位论 文 上 5 分钟; 8 )每管再加6 m l s o l u t i o n i i i( 冰预冷) ， 轻轻混匀，置冰上 1 5 分钟; 9 ) 室温， 离心3 0 0 0 r p m * 1 0 分钟， 转移上清至另一 5 0 m 1 离心管: 1 0 )向离心管中加 1 0 m l 异丙醇，混匀，置室温 1 0 分钟; 1 1 )离心3 0 0 0 r p m * 1 0 分钟，沉淀核酸; 1 2 )弃上清，吸尽管壁水珠，加入3 m l t e 溶解沉淀; 1 3 ) 加3 m l的5 m o l / l l i c l( 冰预冷) ，混匀， 置冰上 1 0 分钟: 1 4 )室温，离心 3 0 0 0 r p m * 1 0 分钟，沉淀 ( 去除大分子 r n a ) : 1 5 ) 上清转入另一管， 加入 6 m l 的异丙醇，混匀， 置室温 1 0 分 钟:离心3 0 0 0 r p m * 1 0 分钟; 1 6 )弃上清，吸尽管壁水珠，加入 0 . 5 m l t e溶解沉淀，转至 1 . 5 m 1 e p 管: 1 7 )加入 0 . 5 m l的5 m o 1 / l l i c l( 冰预冷) ，混匀，置冰上 1 0 分钟， 离心1 4 0 0 0 r p m * 5 分钟; 1 8 ) 上清转入另一管， 加入 l m l 的异丙醇， 混匀， 置室温 1 0 分 钟;离心1 4 0 0 0 r p m * 5 分钟; 1 9 )弃上清，吸尽管壁水珠，2 0 0 u l t e 溶解核酸; 2 0 )加入5 u l r n a 酶于 3 7 c 消化3 0 分钟: 2 1 )再加入等体积 ( 2 1 0 u 1 )的1 . 6 m o l / l n a c 1 , 1 3 % p e g 混匀， 置冰上 6 0 分钟; 2 2 )室温，离心 1 4 0 0 0 r p m * 1 0 分钟; 2 3 )弃上清，吸尽管壁水珠，用3 0 0 u l t e 溶解核酸; 2 4 ) 用酚: 氯仿: 异戊醇抽提2 次，氯仿: 异戊醇抽提 1 次; 2 5 ) 水相转入另一管，加入 1 / 1 0 体积 3 4 1 n a a c ( p h : 5 . 2 )和 2 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 倍体积 - 2 0 预冷) 无水乙醇，混匀， - 2 0 0c 沉淀 2 小时: 2 6 )低温，离心1 5 0 0 0 r p m * 1 0 分钟; 2 7 ) 弃上清， 吸尽管壁水珠， 用t e 溶解核酸， 使终浓度为l u g / u l . b .将制备的质粒用e c o r i 和h i n d工 i i 双酶切 ( 方法见2 . 4 . 1 . a ) . c . 酶切产物经 1 % 琼脂糖凝胶电泳分离，然后用酚冻法回收较长的 d n a片断 方法见 2 . 3 . 3 ) ，经酚氯仿异戊醇抽提纯化后得到表 达载体片断。 回收纯化的目的基因片断和表达载体片断经1 % 琼脂糖凝胶电泳 与a d n a / h i n d i i i m a r k e r s 比 较鉴定，以 确定其含量和大小， 紫外灯下拍照 ( 方法见2 . 3 . 2 ) . 2 . 4 . 3目 的基因片断与表达载体片断的 连接: 建立以下连接反应体系，将酶切并回收纯化的目的 基因片断和表达载体片断进行连接: 灭菌 d d d h z 0 1 6 u l 1 0 x d n a l i g a s e b u f f e r 2 u l 回收纯化的表达载体l u l 回收纯化的目的基因l u l 毛 d n a l i g a s e l u l 将反应体系混匀，置4 冰箱过夜。 2 . 4 . 4 重组体转化大肠杆菌d h 5 a : a . 感受态的制备: 将大肠杆菌d h 5 a 按 1 : 1 0 0比例种入含1 0 0 u g / m l氨节青霉 素的l b 培养基中， 3 7 培养过夜; 次日， 取菌液0 . 5 m l 加入2 4 . 5 m l 含氨节青霉素的 l b 培养基中， 3 7 继续培养2 . 5 小时; 使o d = o . 2 0 进行以下操作，注意在操净台上，冰上操作: 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 1 )离心管从摇床中取出，立即置冰上 1 0 分钟。 2 ) 低温 ( - 4 0c ) , 3 0 0 0 r p m ， 离心 1 0 分钟， 弃上清， 离心管 倒置 1 分钟。 3 ) 加入8 m l 冰浴冷的0 . l m o l / l的c a c l , 轻轻悬菌， 不要反复 吹打或剧烈震荡，置冰浴2 0 分钟。 4 )低温 卜4 c) , 3 0 0 0 r p m ，离心 1 0分钟，弃上清，离心管 倒置 1 分钟。 5 )加入 l m l冰浴冷的0 . l m o l / l 的c a c l : 轻悬菌，置冰浴 3 0 分钟。 b . 转化: 1 ) 取已灭菌的1 . 5 m l e p 管三只 1 , 2 , 3 ) 。 分别加入t e 1 0 0 u l， 1 号管 ( 阴性对照管)加灭菌双蒸水 l u l , 2 号管 阳性对 照管)加 ,1 x 1 质粒 l u l , 3 号管加连接反应混合物 7 u l ,混 匀，置冰上预冷1 0 分钟; 2 ) 加入d h 5 。 感受态细胞 1 0 0 u l， 轻混匀， 置冰上3 0 分钟; 3 ) 4 2 c，热休克9 0 秒，转置室温，各管再加入l b 培养基 8 0 0 u l ; 4 )置3 7 水浴 1 小时; 5 ) 取出e p 管 1 2 0 d o r p m 离心1 5 秒，上清弃去9 0 0 u 1 , 剩余 1 0 0 u l 悬菌，3 管各取1 0 0 u l 铺入l b 琼脂平板 ( 含氮节青 霉素1 0 0 u g / m l ) ，置3 7 恒温箱培养过夜。 2 . 4 . 5 阳性克隆的筛选及鉴定: 被转化成功的d h 5 a 能在含氨竿青霉素( 1 0 0 u g / m l ) 的l b 琼 脂平板正常生长，而未被转化的d h 5 a 则不能生长。故在培养平 板生长出来的菌落即为要筛选的转化子。 为确定这些转化子是否 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 含有构建的重组体，还需进一步进行下列鉴定。 a . 初步筛选即质粒的小量快速提取: 用接种环从培养皿上挑取单菌落种入2 m 1 l b 培养基中，加 入氨节青霉素至终浓度为 1 0 0 u g / m l , 3 7 培养过夜;次日，对 培养的菌液小量快速提取质粒: 1 ) 从试管各取1 . 5 m 1 菌液， 置于1 . 5 m 1 e p 管中，1 5 0 0 0 r p m , 离心 巧秒; 2 )弃上清，每管加入l m l s t e ，在漩涡振荡器上振荡悬菌; 3 )室温，1 5 0 0 0 r p m ，离心5 分钟，弃上清; 4 )每管加1 0 0 u 1 s o l u t i o n i ,漩涡振荡器上振荡悬菌，室 温放置 5 分钟; 5 ) 每管加2 0 0 u 1 s o l u t i o n i i ， 轻翻转5 次， 置冰上5 分钟: 6 ) 加冰预冷的1 5 0 u 1 s o l u t i o n i i i , 混匀， 置冰上 1 0 分钟; 7 ) 室温， 1 5 0 0 0 r p m ， 离心1 0 分钟; 上清4 0 0 u 1 转一 e p 管; 8 )每管加2 4 0 u 1 异丙醇，混匀，室温或冰上放置1 0 分钟: 9 )室温，1 5 0 0 0 r p m ，离心1 0 分钟，弃上清; 1 0 ) 5 0 u l t e 溶解沉淀， 加5 0 u 1 冰预冷的5 m的l i c