（生物化学与分子生物学专业论文）不同类型细胞对羰基应激的响应差异.pdf

中文摘要中又捅要 衰老是遗传因素和环境因素共同作用的结果。根据羰基应激衰老 学说的观点，在氧自由基引起的脂质过氧化和非酶糖基化反应过程 中，会生成具有反应活性的共同中间产物活性羰基类物质，它们 能与生物体内的几乎所有生物大分子发生羰氨交联，这一过程是机 体内衰老损变的核心过程，甚至是机体衰老改变的生化本质。 本学位论文以分别代表两个极端的正常细胞( 即体外生存能力很 弱的红细胞和长期生活在体外的酵母) 为实验模型，探讨它们对羰基 应激的响应差异。 一、血液在储存过程中，血液粘度会随着储存时间的延长逐渐上 升，然而其具体生化机制仍不明了。为了探索这种血液粘度升高的机 制，本文探索了血液储存过程中硫醇、t b a r s 水平、红细胞膜蛋白 羰基化程度以及蛋白质荧光强度的变化。结果显示：伴随着血液粘度 的升高，硫醇水平与蛋白质荧光强度逐渐降低，而t b a r s 水平与膜 蛋白羰基化程度逐渐增加。这些结果表明：活性羰基类物质很容易攻 击蛋白质的氨基和巯基，羰基应激诱导的红细胞膜蛋白羰基化可能是 血液储存过程中粘度上升的重要机制。二、为了探索酵母细胞对羰基 应激的响应，本文用不同浓度的m d a 溶液处理酵母细胞，培养过夜 后用紫外分光光度计在6 0 0n m 处测定培养过夜后酵母的光密度，同 时用p i 荧光染色法( e x 5 3 0 e m 5 9 0 ) 测定经m d a 处理后的酵母细胞 的活力。结果显示：即使在高浓度m d a 的作用下，酵母细胞生长和 活力均未受到显著抑制。这表明：酵母细胞抗羰基应激的能力很强， 但这种抗性的具体机制仍需做进一步的实验探讨。 综上所述，血液中的红细胞在羰基应激条件下会发生系列显著 的生理生化改变；而生长环境相对较恶劣的酵母却对羰基应激不敏 感。 关键词：衰老；羰氨反应；丙二醛；羰基应激；蛋白羰基化；红细 胞；酵母细胞 a b s t r a c t s e n e s c e n c ei sac o l l e c t i v ec o n s e q u e n c eo fb o t hi n h e r i t a n c ea n d e n v i r o n m e n t a c c o r d i n gt o t h e c a r b o n y ls t r e s st h e o 叫o fa g i n g ，t h e r e a c t i v ec a r b o n y ls p e c i e so 玛i n a t e d 矗o ml i p i dp e r o x i d a t i o na n dg l y c a t i o n c a nr e a d i l ya t t a c ka l m o s ta l lb i o m a c r o m o l e c u l e si nv i v o ，a n dt h ec r o s s l i n k o fb i o m a c r o m o l e c u l e si n d u c e db yc a r b o n y ls t r e s si st h ee s s e n t i a lp r o c e s s a n de v e nb i o c h e m i c a lm e c h a n i s mo f a g i n g w i t ht h ea i mt od e t e c tt h ed i v e r s i t yo f r e s p o n s et oc a r b o n y ls t r e s so f d i f r e r e n tc e l l s ，t h i st h e s i se x p l o r e dt h ed i f r e r e n te f 亿c t so fc a r b o n y ls t r e s s o nt h ee r ”h r o c y t ea n ds a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ( y e a s t ) b e c a u s et h e v i a b i l i t yo fe r ”h r o c y t e si nv i t r oi sv e 拶w e a kw h i l et h ey e a s ti sal i v i n g s i n g l e c e l lo 唱a n i s mi nv i t r o f i r s t l y ，t h eb l o o dv i s c o s i t yw i l li n c r e a s ew i t hp r o l o n g e ds t o r a g e t i m e s ，w h i l et h ed e t a i l e db i o c h e m i c a lm e c h a n i s mo fi tr e m a i n so n l yp a n l y u n d e r s t o o d t bs t u d yt h em e c h a n i s m ，t h ea l t e r a t i o no ft h i o l s ，t b a r s ， c a r b o n y l a t i o na n df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fe r t h r o c y t em e m b r a n ep r o t e i n s w e r ed e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，a c c o m p a n i e db yb l o o d v i s c o s i t yi n c r e a s e ， m em i o l sa n dt h e p r o t e i n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i 够 d e c r e a s e d ；h o w e v e r ，t h e1 e v e lo ft b a r sa n dp r o t e i nc a r b o n y l a t i o n i n c r e a s e d s i n g n i f i c a n t l y t h e s ef i n d i n g si n d i c a t e dt h a tt h er e a c t i v e c a r b o n y ls p e c i e sc a na t t a c kt h ea m i n oa n ds u l 矽d r y lr e s i d u er e a d i l y ，a n d i i i t h e c a r b o n y l s t r e s s m a y b e p l a y a n i m p o r t a n t r o l ei nt h e h e m o r h e o l o g i c a la l t e r a t i o n sd u r i n gb l o o ds t o r a g e s e c o n d l y ，a i m i n gt od e t e c tt h er e s p o n s eo fy e a s tt oc a r b o n y ls t r e s s ， t h ey e a s tw a st r e a t e dw i t hd i v e r s e c o n c e n t r a t i o n so fm d a a r e rt h ey e a s t w a so v e m i g h ti n c u b a t e d ，t h eo p t i c a ld e n s i t ya t6 0 0n mo fw a sm e a s u r e d w i t hu v v i ss p e c t r o p h o t o m e t e r ，a n dt h e v i a b i l i t yw a sa s s a y e dw i t h n u o r e s c e n t s p e c t r o p h o t o m e t e ra t e x 53o e m 59 0a r e rs t a i n e db yp i f l u o r e s c e n td y e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg r o 州ha n dt h ev i a b i l i t yo f t h ey e a s tw e r en o ta f 艳c t e ds i g n i f i c a n t l ye v e na tt h eh i 曲c o n c e n t r a t i o no f m d a t h e s ef i n d i n g si n d i c a t e dt h a tt h ea n t i c a r b o n y ls t r e s sa c t i v i t yo f t h e y e a s tw a sv e 巧s t r o n g ，a n dt h em e c h a n i s mo fi t n e e d e d 如r t h e r i n v e s t 追a t i o n i ns u m m a r y ，t h ec a l b o n y ls t r e s sc o u l dc a u s eas e r i e so fp h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a n g e st ot h ee r t h r o c y t e s ，h o w e v e r ，i t sh a dr a r e l y e f r e c t so nt h ey e a s t k e y 、 ，o r d s ：a g i n g ；c a r b o n y l 一锄i n or e a c t i o n ； m a l o n d i a l d e h y d e ； c a r b o n y ls t r e s s ；p r o t e i nc a r b o n y l a t i o ne r ”h r o c y t e ； s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e i v 缩略词英文全名 g s h g l u t a t h i o n e 缩略语 中文全名 谷胱甘肽 m d a m a l o n d i a l d e h y d e 丙二醛 瑚、i e 4 - h y d r o x y n o n e n a l 4 - 羟基壬烯醛 t m p a g e s l ，1 ，3 ，3 - t e t r a m e t h o x y p r o p a n el ，1 ，3 ，3 一四甲氧基丙烷 a d v a n c e dg l y c a t i o ne n d p r o d u c t s非酶糖基化终产物 t b a r st h i o b a r b i t u r i ca c i dr e a c t i v es u b s t a n c e s 硫代巴比妥酸反应产物 p i p r o p i d i u mi o d i d e r c sr e a c t i v ec a r b o n y ls p e c i e s b s ab o v i n es e m ma l b u m i n g l n g l u t a m i n e d t n b 5 ，5 一d i t h i o b i s ( 2 - n i t r o b e n z o i ca c i d ) d n p h 2 ，4 一d i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e 5 2 碘化丙啶 活性羰基类物质 牛血清白蛋白 谷氨酰氨 5 ，5 二硫代双( 2 硝基苯甲酸) 2 ，4 二硝基苯肼 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 孝乏吃少即年 l 月乡日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密d 。 ( 请在以上相应方框内打“ ”) 作者签名：寿乏吃日期易叼年 f 月 舌日 别醛名：勃叫 日期：卅年月如 一 i 不同类型的细胞对羰基应激的响应差异 1 1 衰老及其研究概况 第一章综述弟一早三示怂 衰老是自然界任何生物必需面对和经历的一个过程，是一个千古 之谜。从古至今，人类从没有停止过对衰老的研究、对长生不老的追 求。历史上很多帝王、名人都想尽办法追求青春永驻、长生不老，然 而却没有一个人达到了这个目标。衰老是由什么造成的呢? 衰老的机 制是什么呢? 如何控制衰老延缓衰老呢? 这些是现代生命科学和医 学研究的重点，也是延缓衰老的关键。 目前对衰老的一个较能够被普遍接受的定义是：衰老是生物体各 种功能的普遍衰弱，以及抵抗环境伤害和恢复体内平衡能力的降低过 程1 1 。衰老的过程非常复杂，所涉及的因素很多。近代人们从遗传方 面和环境方面对衰老进行了大量的研究，目的在于弄清楚衰老产生的 机制。特别在遗传研究方面，人们取得了很多成果。 遗传学家们经过几十年的辛勤研究，现已发现和验证了十多种与 衰老和长寿有关的基因2 4 】。这些基因功能各异，有的与抗氧化酶类 的表达有关，有的与能量代谢过程有关，有的与抗应激和抗紫外线伤 害有关，还有的与哺乳动物精子的产生有关。此外，通过研究还发现 了大量细胞分裂和衰老相关的细胞周期调控因子，包括c d k l 、p 1 3 k 、 m a p k 、i g f 1 和p 1 6 等等【5 】o 虽然人类对衰老研究的成果很多，但 是这些研究结果令人眼花缭乱，还只是触及了衰老的皮毛而已。 通过这些研究，科学家们也清醒地认识到确实存在与衰老和长寿 硕十学位论文 有关的基因，寿命的长短不是由一个或者几个、一组或者几组基因决 定，而是数以百计的遗传因子共同作用来决定的。 在环境研究方面，对衰老的研究主要是基于一些生物化学实验。 根据生物化学的研究结果，人们尝试着使用各种各样的假说来解释衰 老现象。现在存在的衰老学说有二十多种，它们归纳起来基本分为两 类：遗传衰老学说和环境伤害衰老学说6 1 。而绝大部分的学说认为衰 老主要是和环境因素相关，也就是说衰老是因生命过程中多种多样的 外加损伤造成的后果，是一个被动的损伤积累的过程。 一些著名的学说包括：羰基应激衰老学说、糖基化衰老学说、“弃 置体”衰老学说、进化论衰老学说、自由基衰老学说、神经内分泌衰 老学说、端粒酶衰老学说等。其中羰基应激衰老学说是现在最受关注 的学说之一，也是本研究室主要研究方向之一。本研究室主任印大中 教授基于多年对老年色素类物质逐步形成的生化过程和氧化及羰基 化的研究，于1 9 9 2 年提出了羰基应激衰老学说卯，此学说受到学术 界的广泛关注。羰基应激衰老学说指出：羰一氨反应作为两大能源物 质新陈代谢不可避免的生化副反应，能在体内产生广泛而又缓慢的交 联，最终造成体内蛋白、脂质、核酸等生物大分子的不可修复性损伤， 从而造成机体功能的老化8 1 。 总的来说衰老是由遗传因素和环境因素共同作用的结果。衰老过 程是与生理病理相关的，由调控、防御、修复、代谢诸多系统中的多 个基因网络共同协调，抵御种种环境损伤的总结果。 不同类型的细胞对羰基府激的响应筹异 1 2 羰基毒害衰老学说 1 2 1 自由基衰老学说 d e n h a mh a r m a n 博士于1 9 5 6 年提出了自由基哀老学说9 ，10 1 。 他认为衰老是由于以氧自由基为主的种种生化自由基给生物组织带 来的伤害性影响的积累，只要保持体内足量的自由基清除剂就可以有 效的阻止伤害、防止衰老。 自由基是机体正常代谢的中间产物，有一个以上的不配对电子的 高活性分子或原子统称为自由基。自由基是有机物在高温、光照、辐 射、过氧化物存在的条件下通过均裂而产生。图1 1 展示了最主要的 氧自由基的产生过程。 。：。f ：爻赫 2 矿 h p 小 自由基在体内具有很强的反应活性，通过电子传递而与其它分子 发生氧化一还原反应。自由基是自然存在的并是许多生理过程所必需 的，但当其产生过量或出现在不适当的细胞部位将通过过氧化反应 而导致分子的结构及功能的破坏最终造成细胞、组织的病理改变，并 产生连锁反应对蛋白质、核酸、脂肪等造成伤害1 1 】。自由基能直接攻 击细胞膜上的关键性靶分子或多不饱和脂肪酸然后启动脂质过氧化 反应。这种反应像一个放大器，形成更多的基团，使多不饱和脂肪酸 降解成许多种产物。其中的一些醛类活性很高，能够损害膜内外的分 硕十学位论文 子，使细胞膜的完整性受到严重破坏，造成膜通透性增大和离子泄露 以及细胞的结构和功能严重受损，最后导致生物体衰老、死亡。图1 2 列举了可能导致自由基伤害的几种主要的途径1 2 】。 _ j u u o n - 一 一u 月u u e j 1 - 兮l 0 0 h 釜善一 l h 口u f a l 卜 j j 图l 一2 可能导致自由基伤害的几种途径 因为氧自由基伤害几乎与所有应激和疾病过程有着千丝万缕的 关系，所以自由基伤害衰老学说仍是目前最重要的与生化副反应伤害 相关的衰老学说。然而自由基伤害衰老学说却也存在许多牵强之处， 暴露了许多明显的缺陷与不足【1 3 】。大量的实验结果显示，抗氧化剂救 急不救缓，治病不救命，抗氧化研究的统计结果并不支持氧自由基伤 害是生物衰老的根本原因的假设。并且，自由基反应是生命化学的一 个基本组成部分，是诸多生化反应的必然过程，除了氧自由基在免疫 过程中有重要的防御作用，自由基过程是许多氧化酶、脱氢酶进行氧 化还原反应的一个中间环节；作为氧自由基之一的一氧化氮( n 0 ) 是一种神经传导因子，起着重要的生理作用。研究表明：老年动物的 抗氧化体系没有明显损伤变化，老年动物抗氧化酶类和抗氧化组分对 抗氧化紧张的能力并没有实质性的改变和缺陷。 4 不同类璎的细胞对羰基虑激的响应筹异 r 尸、尸、r ， 一) r 八a 甚纩r i ( o 踟岫) r a 八人r ， i 业lr e r 一：h 7 +。八r a m i n e 6 h i触c 唾，蝉 r 、? ，劣r ， k ? 妒一一 矗8h0 l 9 ( | r 。v l r r r 0 + 。秒告。尸q 一 蚤b s h 1 2 2 糖基化衰老学说 环境伤害衰老学说体系中的另一重要衰老学说是糖基化衰老学 说【1 4 】，该学说又称之为美拉德反应衰老学说。糖基化伤害的具体过程 见图1 3 。研究表明，在生理条件下，还原性糖类能与多种氨基酸、 多肽和蛋白质中的氨基发生反应，生成希夫碱，希夫碱则可发生分子 5 硕十：学位论文 内的重排而生成较为稳定的阿马多里( a m a d o r i ) 重排产物。该产物 的进一步降解，如脱氨、水解等则可产生d e o x y o s o n e 等活性羰基类 中间产物。这些中间产物与蛋白质和核酸中的氨基交联共轭，生成发 黄褐变的生物垃圾，称之为晚期糖基化终产物( a g e s ) 。另外，还原 糖( 沃尔夫途径) 、希夫碱( 那米奇途径) 、以及阿马多里中间产物等， 能通过自氧化作用生成活性羰基类中间产物，然后生成a g e s 【挎1 ( 图 1 4 ) 。糖基化美拉德反应衰老学说指出：糖基化造成的蛋白质的交联 损伤是衰老的主要原因，主要发生反应的氨基酸残基有赖氨酸、精氨 酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸以及苏氨酸等。由此造成结构 蛋白的硬化，功能酶的损伤，能量供应的减少，代谢功能的降低，平 衡机能的失调等老化过程。糖基化美拉德反应哀老学说将动物能量 过程中的碳水化合物与衰老过程连接了起来。 p r o t e i n i y s i n e s s c h i 仃 b a s e a m a d or i p r o d u c t 图l - 4 非酶糖基化美拉德反应过程概图 y i s 鼍避哕平甲固 不同类犁的细胞对羰基麻激的响应荐异 然而，糖基化衰老学说也有不少问题和难以解释的现象【1 3 】，如： 实验表明，许多哺乳动物，例如鼠类和人类的血浆葡萄糖含量差别并 不大，但寿命相差几倍甚至几十倍；有些鸟类血糖含量高于人类两倍 以上，却也能活几十年( 猫头鹰和鹦鹉分别能活3 0 年和6 0 年) ，目 前世界寿命最长的一只家养金刚鹦鹉已有1 0 8 岁。糖基化反应本身的 速度相当慢，事实上，糖基化的许多实验是在有氧条件下完成的，与 氧自由基相关的氧化过程加速和促进了糖基化反应的作用。 氧化和糖基化衰老学说既相对独立，又互相联系、互相补充，于 是k r i s t a l 和y u 在1 9 9 2 年提出了自由基氧化糖基化衰老学说【1 6 】。这 样使得两种衰老学说在理论上相互补充，从而能够解释许多目前还不 能解决的衰老机理方面的问题。 1 2 3 羰基应激衰老学说 自由基氧化和非酶糖基化衰老学说在环境伤害方面的研究表明： 自由基氧化和非酶糖基化是能导致生物老化的蛋白质翻译后 ( p o s t t r a n s l a t i o n a l ) 生化副反应的两个最主要的原因【1 7 18 1 。大量的研 究数据显示：生物衰老的重要过程与羰基应激交联相关的多种生 物成分的变化，是自由基反应与美拉德反应共同的最终归宿，因此， b r u n k 教授与印大中教授通过对老年色素的深入研究并根据老年色素 形成的生化过程，提出了羰基应激衰老学说【7 ，8 1 。1 9 9 2 年y i n 在 m e c h a n i s m so f a g e i n ga n dd e v e l o p m e n t 杂志的一篇文章中首次阐 明羰氨反应是氧化与糖基化两大生化副反应的共同点与兼有点。此 学说指出，衰老是生物体内不饱和醛酮毒害造成的累积性的、不可逆 硕卜学位论文 的、生理性的变化。 越来越多的研究结果表明，由脂质过氧化作用所产生的内源性 醛，能参与细胞和组织的氧化应激的病理生理学作用过程。与那些具 有极强反应活性的氧自由基不同的是，这些醛类物质能存活更长的时 间，因此可以从原来的位置( 例如细胞膜) 扩散、抵达、甚至攻击那 些存在于细胞内或细胞外的远离自由基的目标。脂质的自身过氧化是 产生自由基的一个放大器，这些生成的活性醛类可作为复合物链式反 应的第二毒素信使。当膜上脂双层中的多不饱和脂肪酸被修饰成脂质 过氧化物的时候，链式反应就会发生。 作为两大能源物质的糖类与脂类在氧化过程中都会造成对生物 本身的伤害，糖类本身的存在便可对生物造成损伤，而糖基化作用则 是糖与蛋白通过复杂生化过程最终也造成分子交联等伤害；而自由基 通过脂类过氧化物而进一步造成生物大分子交联等各类伤害。葡萄糖 作为一种多羟基的醛酮，它与蛋白或氨基酸发生反应时的第一步反应 即是羰氨反应，而阿马多里重排产物与核酸、蛋白的进一步交联反 应也属于羰氨反应类型。自由基氧化生成的不饱和醛酮与其他生物 分子反应造成生物损伤的过程是羰氨反应的过程，也正是生物老化、 交联、分子变性过程最核心的内容。所以自由基损伤、糖基化损伤及 其它氧化伤害的本质都是羰基应激作用。许多与衰老相关的退行性疾 病的部分病因是数种生化反应所产生的毒性羰基因子引起的，这类疾 病包括：神经变异性疾病，如帕金森病( p a r k j n s o n s ) 【1 5 】、阿尔兹海默 病( a l z h e i m e r s ) ；慢性炎症，如关节炎和糖尿病；局部缺血再灌注 不同类型的细胞对羰基应激的响应差异 症，如中风、心肌梗塞；以及其它与羰基紧张相关的病变，如白内障 和脂褐素的形成等。 醛和酮是两类含羰基的有机生物分子，它们在饮食中广泛存在， 在氧化应激情况下，各类醛也可以由脂质过氧化物断裂形成，并且非 酶的糖基化终末产物也是一系列毒性羰基类物质。 导致醛类生成的主要步骤可以被称为脂质过氧化物的p 一断裂，或 者更精确地说，可以称做脂质烷氧基的p 一断裂。例如，1 5 过氧化花 生四烯酸或1 3 一过氧化亚麻油脂的p 一断裂反应产生了己醛。羟基烯醛 的形成机制理所当然更复杂，且在实验方面未得到解决。从羟基或氢 过氧化烯醛的构造模型来看，我们可以推论出( a ) 面6 一p u 认s ，例 如l8 ：2 和2 0 ：4 能产生4 羟基十一碳烯醛，4 过氧化羟醛和4 ，5 二羟 基十一碳烯醛。( b ) 西3 p u f a s ( 2 2 ：6 ) 能生成4 羟基己烯醛，4 一氢 过氧化己烯醛和4 ，5 二羟基己烯醛。( c ) 面9 p u f a s ( 2 0 ：3 ，在组织 中含量极低) 能产生4 羟基十一碳烯醛，4 过氧化羟基十一碳己烯醛 和4 ，5 一二羟基十二烯。 羰基极易与初级氨反应，形成希夫碱，羰基能与蛋白质、脂类、 核酸及亚细胞成分交联，改变生物大分子的形状和正常生理功能。研 究资料表明：醛、酮是变异性神经病的病因，氧化应激、脂质过氧化 在帕金森病的衍变过程中起很大的推进作用。该类病人的血样中脂质 过氧化物升高，产生氧自由基的多形核白细胞升高，m d a 累积”】。 该类病人死后的大脑样品中，4 羟基2 壬烯醛的蛋白加合物大量累 积。源于糖的羰基因子在糖尿病病理上起重要作用。糖尿病人的h 2 0 2 硕十学位论文 和m d a 含量会增高，血和尿中的t b a r s 均有提高。 1 3 血液存储中的流变学变化 1 3 1 血液流变学介绍 流变学是力学的一个分支，由于物体的流动与变形是不可分割 的，即变形是流动的基础，流动是变形在时间上的连续，故称为流变 学。血液流变学是生物流变学的重要分支，是研究有关血液的变形性 与流变学的科学。血液流变学包括两大部分内容：宏观血液流变和微 观血液流变学。前者包括血液粘度、血浆粘度、血沉、血液及管壁应 力分布；后者包括红细胞聚集性、红细胞变形性、血小板聚集性、血 小板粘附性等，故又称为细胞流变学。 1 3 2 红细胞的形态结构 红细胞来源于造血干细胞，是血细胞的一种。红细胞较其它血细 胞结构简单，没有核和细胞器，表面有一层细胞膜，厚度约7 0 1 0 0 岬，胞浆主要成分为血红蛋白。红细胞膜是由磷脂双层和膜骨架构 成的，两者共同决定了膜的力学性质。细胞膜和细胞内液的组成和结 构特点为红细胞在流变场容易变形提供了物质条件。由于红细胞的结 构比较简单，且取材方便，分离和纯化膜的程序比较简单，所以被广 泛采用作为膜生物学研究的材料。 正常状态下红细胞为双凹圆盘形，体积约9 0 岬3 ，与半径为2 8 p m 的圆球体积相当( 表面积约l o o 岬2 ) ，而红细胞的直径约7 8 岬， 表面积约1 4 0 岬2 ，为同体积圆球表面积的1 4 倍，因此红细胞在低 渗环境中会吸水，体积可增大到原来的1 5 1 8 倍，这种几何特征使 1 n 不同类型的细胞对羰基廊激的响应差异 红细胞在外力作用下易变形和折叠。 1 3 3 红细胞的流变特征 红细胞容易受力变形，并在流场中随流线取向。红细胞在血液中 的有效体积浓度降低，则液体的流动内摩擦力降低。用流变镜可直接 观察红细胞在流场中被拉伸成椭圆形，并且其长轴随流线取向。变形 的大小和定向的程度随切变率( 或切应力) 而增加。红细胞的这一流 变特点与血液粘度随切变率升高而降低有密切关系。若红细胞变形性 降低，其适应流场的能力即会下降，故对流动的阻力也会增大。在微 循环中可见红细胞通过毛细血管时变成液滴状、拖鞋状、弹头状及降 落伞状等各种形状，其形状和变形性的大小取决于当地流场分布和流 体切应力的大小。如把切应力去除，红细胞又立即恢复到双凹圆盘型。 1 3 4 红细胞膜的组成和结构 完整的红细胞膜是由磷脂双层及其内表面的细胞骨架构成的。通 过膜蛋白带2 1 ( c a n k y r i n ，又称锚蛋白) 将血影蛋白( s p e c t r i n 又称 为膜收缩蛋白) 与膜内在蛋白带3 相连，将磷脂双层与细胞骨架( 又 称膜骨架) 联系在一起。 红细胞磷脂双层的组成随动物种属而变。人红细胞膜磷脂的组成 与其饮食习惯有关，现已证明血脂成分与饮食有很大关系。红细胞膜 磷脂成分与血脂成分可进行交换，保持着动态平衡。而膜脂的组成对 膜的流动性有较大影响，从而影响红细胞的生理功能。 红细胞膜脂质含量较其它细胞高，其磷脂约占6 0 ，包括磷脂酰 胆碱( p c ) ，磷脂酰乙醇胺( p e ) ，神经鞘磷脂( s p h ) ，磷脂酰丝氨 硕十学何论文 酸( p s ) 。红细胞膜脂质双分子层的外层以磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂 为主，内层以磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺为主。膜上分布有糖脂化 合物，主要是神经糖脂，它由神经酰胺和半乳糖，葡萄糖组成。这些 糖脂很活跃，多集中于膜的外表面，具有多种功能。 膜脂的组成及膜脂的动态特性对维持膜结合蛋白的构象和活性 起着重要作用。反之这些膜蛋白又可影响膜脂的结构，使脂双层中脂 质分子发生重排。因此膜脂与膜蛋白的相互作用对维持膜作为极性化 合物通透屏障的结构完整性方面起着重要作用。 红细胞膜膜脂中的不饱和脂肪酸链和蛋白质分子中的巯基对活 性氧的氧化十分敏感。在氧自由基的攻击下脂肪酸的双键发生氧化作 用生成脂质过氧化物，脂质的自身过氧化是产生自由基的一个放大 器，这些生成的活性醛类可作为复合物链式反应的第二毒素信使，使 更多脂质发生过氧化，形成一个自动催化的链式反应。脂质过氧化作 用对细胞膜的损伤在于其氧化产物是毒性羰基类物质( 主要是丙二 醛) 。羰基能与氨基发生反应，引起蛋白质及脂质的羰氨交联，使细 胞膜变硬，易破溶。近来，蛋白质羰基化常作为蛋白质被氧化修饰的 一个比较敏感的指标。羰基可特异地与2 ，4 二硝基苯肼( 肼岬h ) 反应， 生成2 ，4 二硝基苯腙类化合物，通过检测其产物在3 7 0n m 处的吸收 值即可以测得羰基蛋白的含量。， 超氧阴离子( 0 2 。) 除了能使膜脂质过氧化外，还可使血红蛋白 变性，在红细胞内产生h e i n z 小体，引起溶血。红细胞长期处于高氧 环境中，血红蛋白在代谢过程中，约有5 0 的氧合血红蛋白被氧化成 不同类型的细胞对羰基应激的响麻麓异 高铁血红蛋白，同时产生大量的0 2 。，可引起细胞膜损伤。但是正常 红细胞内有一系列抗氧化酶，可保护细胞膜免遭损伤，这些酶包括超 氧化歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶等。 此外谷胱甘肽、维生素e 和维生素c 都有抗氧自由基保护细胞膜的 作用。红细胞在老化过程中，这些酶的活力逐渐降低。 红细胞膜蛋白主要包括血影蛋白( s p e c t r i n ) ，锚蛋白( a n k y r i n ) 带3 蛋白、带4 1 蛋白和肌动蛋白( a c t i n ) ，此外还有一些血型糖蛋 白。除了带3 蛋白以外，上述膜蛋白均是构成红细胞膜骨架的主要成 分1 9 1 。膜骨架对维持红细胞形状、膜的稳定性和细胞的变形性起着决 定性作用。膜蛋白带1 2 是s p e c t r i n 的两个亚单位( 0 【链和p 链) ，分 子量分别为2 4 0 和2 2 0k d ，它们常以二聚体或四聚体形式存在。 s p e c t r i n 通过a n l ( y r i n 与带3 蛋白结合。带5 ( a c t i n ) 是单体，在有 a t p 存在的条件下，带1 2 蛋白在蛋白激酶及m 9 2 + 的催化作用下发生 磷酸化，与a c t i n 形成a c t i n s p e c t r i n 复合体，构成二维网状结构。带 4 1 蛋白与血型蛋白相连，此外带4 1 可增强a c t i n 与s p e c t r i n 间的相 互作用。故通过a n k y r i n 和带4 1 蛋白将膜骨架和脂双层紧密地联系 在一起构成完整的细胞膜。 1 4 血液粘度的变化与衰老的相关性 粘度是一个流变学概念，它代表流体的流动特性。如果相邻的两 层液体之间存在相对运动，则它们之间会产生接触面的切向力，这时 运动快的液体层会对运动慢的液体层施加拉力，而运动慢的液体层则 会对运动快的液体层施加阻力。这两个切向力相互作用就形成了液体 1 1 硕十学位论文 内的摩擦力，也就是所谓的粘性力。液体的粘性则指的是液体具有粘 性力的特性。粘度则是为了描述液体粘性而引入的一个物理量。粘度 是指当流体层接触处的速度梯度为1 个单位时，其接触面上所受的摩 擦力大小，它衡量流体粘性大小。 血液是非牛顿流体的一种，其粘度随着血液中速度梯度的( 剪切 率) 增大而降低。因此，通常说的血液粘度就是血液在不同剪切率下 的表观粘度。在许多疾病研究中发现，在出现临床症状之前会有血液 流变学的异常。例如：吸烟、情绪紧张、脂质代谢紊乱等多种因素会 导致冠心病，同时这些因素也引起了血液流变性异常，这常常发生在 出现冠心病临床症状之前，这表明血液流变性的异常可能是这些疾病 的始动因素或者是中间环节。伴随着年龄的增长，血液的粘度逐渐增 大。血液流变性的异常特别是血液粘度的增高很可能与心脑血管疾病 尤其是中风等密切相关。血液粘度的增高己经被看成是肺心病、肺动 脉高压的主要形成因素之一。 1 5 巯基化合物的抗氧化作用 随着社会的进步，人们的注意力逐渐转向保健和延年益寿等方面 上，研制和生产保健食品将是重大课题和机遇。为开发出新的抗衰老 策略，许多研究室对抗氧化剂对衰老各方面的影响展开了广泛的研 究。在不同的实验生物系统中，用巯基化合物( 如巯基乙醇、n a c 或 g s h ) 处理可延长寿限或改善衰老相关进程。 谷胱甘肽( y l 谷氨酰l 半胱氨酸甘氨酸，g l u t a t h i o n e ，g s h ) ， 广泛存在于哺乳动物体内，是细胞内最主要的巯基和含量最丰富的小 1 4 不同类酗的细胞对羰基应激的响应差异 分子三肽化合物，在人体和动物红细胞、肝脏和眼睛晶状体中含量 均较高【2 0 】。g s h 分子中含有一个特异的y 肽键，由谷氨酸的y 羧基 与半胱氨酸的仅氨基缩合而成，且半胱氨酸侧链基团上连有一个活泼 巯基，是其许多重要生物学功能的结构基础。 谷胱甘肽是细胞内最重要的巯基抗氧化物，也是胞内巯基二硫 键氧还状态( 1 迮d s t ) 的决定性因素。在正常环境下谷胱甘肽以其硫醇 还原型( g s h ) 存在，是细胞内主要的非蛋白质巯基化合物。氧化应激 或亲电化合物攻击可使细胞内g s h 含量下降，或使其转变为双硫氧化 型( g s s g ) ，后者又可通过以n a d p h 为辅酶的谷胱甘肽还原酶转变为 g s h 。g s h 与g s s g 之间的相互转化，从而对蛋白和糖类起保护作用。 g s h 可以作为谷胱甘肽过氧化物酶的底物，进而抑制脂质过氧化。同 时g s h 也能减少自由基对d n a 的攻击从而减少d n a 损伤和突变。 g s h 是细胞自由基防御系统中的一个重要物质，它能有效清除生 物氧化产生的自由基，使暴露于氧化环境的细胞膜免受自由基损害， 以维持细胞内环境的稳定2 1 1 。 氧自由基可引发细胞膜上多不饱和脂肪酸( p 切认) 产生脂质过氧 化反应，对蛋白质及多糖高分子物质等产生氧化、交联和变性，对细 胞膜结构产生严重损害，影响细胞膜的功能甚至导致细胞死亡。 g s h p x 特异性地催化g s h 对h 2 0 2 的还原反应，从而起到保护细胞结 构和功能完整的作用【2 2 】。 红细胞在代谢过程中经常产生少量的h 2 0 2 。h 2 0 2 可使细胞膜的巯 基失活，还能使细胞膜上的磷脂分子中不饱和脂肪酸发生氧化反应， 硕十学位论文 产生脂质过氧化物，而脂质过氧化物进一步和膜蛋白产生交联，会使 红细胞膜遭受损伤而发生溶血。而以谷胱甘肽为底物的g s h p x 催化 h 2 0 2 生成h 2 0 ，催化脂质过氧化物生成相应的醇，从而避免了对红细 胞的损伤【2 3 】。正常人血红蛋白分子含二价铁( f e 2 + ) ，可与氧结合成为 氧合血红蛋白。如果血红蛋白中的二价铁被氧化成f e 3 + ，即成为高铁 血红蛋白( m h b ) ，则丧失运氧功能。但在正常情况下，红细胞内的谷 胱甘肽与其它还原性物质( 如抗坏血酸、维生素b 1 、n a d p h ) 共同组成 m h b 的还原系统，能有效地防止二价铁的氧化。 在多种细胞和组织中都观察到了细胞衰老相关的g s h 浓度和谷 胱甘肽i 强d s t 的改变。在人类全血( 主要是红细胞) ，外周血单核细胞 ( 主要是淋巴细胞) ，人类和大鼠骨骼肌组织，以及大鼠和小鼠肝、肾 和脑中都观察到了衰老相关的r e d s t 氧化水平的提高。在大鼠和小鼠 脑组织，以及猪视网膜神经胶质细胞，小鼠脾细胞，大鼠肝、肾细胞 中也观察到了衰老相关的g s h 浓度降低。一个基于老龄群体的研究显 示，在全血( 本质为红细胞) 中高g s h 含量与疾病减少、胆固醇降低和 血压降低显著相关。 1 6 本文实验设计思路 需氧参与的自由基氧化和不需氧参与的非酶糖基化是体内在生 理和病理状态下不可避免的生化副反应。另一方面，作为自由基氧化 和非酶糖基化的重要活性中间产物活性羰基类物质( r e a c t i v e c 舶o n y ls p e c i e s ，r c s ) 具有很强的生物反应活性，它能攻击包括蛋白 质、核酸和脂类在内的几乎所有生物大分子，一旦它们的浓度超过一 1 6 不同类型的细胞对羰基应激的响应筹异 定的范围，将导致机体出现多种病理生理改变，即所谓的羰基应激。 基于此研究背景，本论文以分别代表两个极端的正常细胞( 即体 外生存能力很弱的红细胞和长期生活在体外的酵母) 为研究对象，探 讨它们对羰基应激的响应及差异。 在探讨红细胞对羰基应激的响应试验中，主要从血液中红细胞膜 蛋白的一系列生化指标入手，检测红细胞膜蛋白的巯基含量变化、色 氨酸残基损伤程度以及蛋白羰基化程度的变化，从而确定羰基应激是 引起血液粘度上升的机制之一。在研究酵母细胞对m d a 诱导的羰基 应激的响应情况中，主要是检测经m d a 处理后，酵母的生长与繁殖 是否受到影响，这为酵母对羰基应激的抗性研究奠定了基础。 硕十学位论文 第二章羰基应激：血液储存过程中血液粘度上升的机制之一 2 1 引言 在人体生命活动中，血液参与了运输养料与废物、体液调节的联 系媒介、保持内环境稳定、防御及调节体温等诸多功能，同时它也是 人体健康与否的重要指标。血液流变学性质，作为血液的重要功能指 标，不仅与多种疾病的病理生理机制密切相关，而且也与输血安全性 联系紧密。现有研究表明，血液的储存时间较长将导致血液的多种流 变学性质改变，而改变往往是导致术后患者多器官功能衰竭的一个危 险因素2 4 ，2 5 1 。然而，血液储存过程中血液流变学性质变化的机制仍然 具有一定争议。 考虑到红细胞不仅是血细胞的最主要组成成分和血液功能的重 要执行者，而且在血液储存的过程中，红细胞无论是形态还是变形性 等性质都会随储存时间的延长而发生改变。同时有研究表明：血液流 变学指标的改变，不仅与异形红细胞的数量成正比，而且与红细胞的 流变学指标的改变密切相关2 6 1 。因此，我们以红细胞为研究对象探索 红细胞流变学性质改变的生化机制。 自由基氧化和非酶糖基化是体内在生理和病理状态下不可避免 的生化副反应，同时也是引起血瘀症和血液粘度等流变学指标改变的 一个重要原斟2 7 1 。现有研究表明：羰基应激不仅与各种衰老相关的疾 病的病理过程密切相关，而且可能是加速机体衰老的重要原因2 8 2 9 】。 生物体由大量的蛋白质组成，蛋白质在机体内很容易发生氧化而 不同类型的细胞对羰基戍激的响戍差异 造成损伤。当受到自由基等的攻击时会在其氨基酸链上形成羰基，导 致羰基化而产生交联损伤。针对羰基应激诱导的红细胞膜蛋白羰基化 可能蕴含了红细胞流变学性质改变的生化机制这一推论，本文将首先 检测血液储存过程中一些生理生化指标的变化，进而检测该过程中硫 醇水平、t b a r s 水平、红细胞膜蛋白羰基化程度以及蛋白质荧光强 度的变化，从而确立羰基应激在血液粘度等流变学性质改变中的重要 作用。 2 2 材料和方法 2 2 1 材料与试剂 新鲜全血长沙市血液中心 2 ，4 二硝基苯肼( d n p h )s i g m a 公司 硫代巴比妥酸( t b a )s i g m a 公司 二硫代双硝基苯甲酸( d n 旧) s i g m a 公司 g s h s i g m a 公司 分子量标准蛋白s i g m a 公司 盐酸胍长沙天恒公司 考马斯亮蓝染料长沙天恒公司 乙酸乙酯长沙天恒公司 磷酸二氢钾，磷酸氢二钠湖南师范大学试剂厂 氯化钠湖南师范大学试剂厂 盐酸( 3 7 )湖南师范大学试剂厂 硕十学位论文 无水乙醇( 9 9 5 )湖南师范大学试剂厂 2 2 2 主要仪器 l s 5 0 b 荧光分光光度计( 美国p e 公司) ；l a n b d ab i 0 4 5 紫外分 光光度仪( 美国p e 公司) ；高速冷冻离