（动物学专业论文）16种植物次生代谢物对小菜蛾的毒性筛选研究.pdf

摘要 小菜蛾( p l u t c l l ax y l o s t e l l al ) 是世界上分布最广的一种危害十字 花科蔬菜的重要害虫。本研究针对小菜蛾建立了植物次生代谢物筛选平台， 探索了酢浆草( o x a l i sc o r n i c u i a t al ) ，构树( b r o u s s o n o t i ap a p y r i f c r al ) 、 猪秧秧( o a l i u m a p a r i n e l v a y t e n e r u m ) 、金银花( l o n i c e r aj a p o n i c at h u n b ) 、 日本珊瑚树( v i b u r n u mo d o r a t i s s i m u m v f l f a w a b u k i ) 、野胡萝卜( d a u c u sc a r a t a l ) 、加拿大飞蓬( b r i g e r o nc a n a d e n s i sl ) 、加拿大一枝黄花( 5 0 l i d a g o c a n a d s n s i sl ) 、山胡椒( l i n d e r ag l a u c ab l u m e ) 、合欢( a l b i z i a 矗l i b r i s s i n d u r a z z ) 、野豌豆( v i c i af a b al ) 、银杏( g i n k g ob i l o b al ) 、羊蹄( r u m c xj a p o n i c u s h e u t t ) 、荩草( a r t h r a x o n h i s p i d u s t h u n b ) 、狼毒大裁( e u p h o r b i af i s c h c r i a n a s t e u d ) ，博落回( m a c l e a y ac o r d a t ar b r ，) 等1 6 种植物为材料，涉及1 3 科、 1 6 个属，以小菜蛾拒食、毒杀为指标，筛选结果发现： i 酢浆草( 整株) 、博落回( 叶) 、猪秧秧( 茎叶) 、野豌豆( 整株) 、荩草 ( 整株) 、日本珊瑚树( 叶) 、加拿大飞蓬( 整株) 、加拿大一枝黄花( 茎 叶) 等8 种植物部位的乙醇提取物对小菜蛾幼虫都有一定的杀虫活性。 2 羊蹄( 叶) 、金银花( 茎叶) 及银杏( 外种皮) 3 种植物部位的乙醇提取 物对小菜蛾幼虫作用较强，2 天后幼虫的死亡率均在6 0 以上。其中银 杏外种皮的提取物对小菜蛾幼虫作用最强，2 天后幼虫死亡率达到了9 3 2 。 3 银杏叶、外种皮、银杏叶提取物g b e ( g i n k g ob i l o b ae x t r a c t s ) 残渣中外 种皮的提取物对小菜蛾幼虫的毒杀作用最强，外种皮中的酚酸性物质可 能是银杏抗虫的主要活性成份。 4 通过对银杏外种皮的分离和制备流程的优化，所得到的生物活性物质为 银杏酚酸，经测定该物质显示出较强的拒食作用和毒杀作用。当处理浓 度为6 2 5m g l 时3 龄幼虫的非选择性拒食率在2 4h ，4 8h 后分别达到 7 7 8 、9 4 7 以上，处理时间达到4 8h 时，1 2 龄幼虫的l c s 。为1 。3 1 m g l ，3 龄幼虫的l c ，。为6 0 7m g l 。这为植物次生代谢物的研究和植物 药源的开发利用提供了理论与应用基础。 关键词：小菜蛾毒杀银杏外种皮银杏酚酸拒食 a b s t r a c t d i a m o n d b a c km o t h ( p l u t e l l ax y l o s t e l 妇l ) i sa ni m p o rt a a tv e g e t a b l ep e s t ， w h o s ei n s e c t i c i d er e s is t a n c ea t t f a c t sm u c ha t t e n t i o no fs c i e n t is ts a i m e d a t f i n d i n go u ta n t i f e e d a n t sa n dt o x i ce f f e c t s o fi n s e c tp e s ts ，t h isp a p e r e s t a b l is h e daf i l t e rs y s t e mo fs e c o n d a r yp l a n tm e t a b o l i t e so fn o n h o s tp l a n t s a g a i n s td i a m o n d b a c km o t h w h e nt h ee t h a n o le x t r a c t so f o x a l i sc o r n i c m a t al ， b r o u s s o n e t i ap a p y r i f e r al ，6 a l i o ma p a r l n ol | v a t t e n e r u m ，l o n i c o r aj a p o n i c at h u n b ， y b u f n u m o d o r a t l s s i m u m v a r a w a b u k i d a u e u sc a r a t al b r i g e r o nc a n a d e n s i s l ，s o l i d a g o c a n a d e n s i s l ，l i o d e r a g t a u c ab l u m e ，a l b i z i a 弘l i b r i s s i nd u r a z z ，y i c l a f a b a l ，g i n k g o b i l o b al ，g o m e xj a p o n i c u sh e u t t ，a r t h r a x o nh i s p i d u st h u n b ，e u p h o r b i af i s c h e r i a n a s t e u d m a c l e a y ac o r d a t ar b r w e r ea p p l l e dr e s p e c i i v e l y ，t h ec o n e l u s i o n sa r ca s f 0 1 l o w s ： 1 t h ee t h a n 0 1e x t r a g t so fo x a l i sc o r n l c u l a t al 、腑c l e a y a c o r d a t ar b r 、 6 a l i u ma p a r i n elv a f t n e r u # 、v i c i a 厅妇l 、a r t h r a x o nh i s p i d u st h u n b 、 y i b u r n u mo d 。r ac i s s j 岫v a t a w a b u k i 、e r i g e r o n c a o a d e n s i sl 、s o i i d a g o c a n a d e n s i sl h a dt o x i c i t y t ol a r v a eo f t h ed i a m o n d b a c km o t h 2 t h ee t h a n o le x t r a c t so f u m e xj a p o n i c u si t e u t t 。l o n i c e r aj a p o n i c at h u t l b 、 g i n k g oe x o c a r ph a ds t r o n gt o x i c i t yt o l a r v a eo ft h ed i a m o n d b a c km o t h ， t o x i c i t yo ft h e3 r di n s t a r w asu p w a r d st o6 0 a f t e r2 d c i n k g oe x o c a r p w a ss h o w e dt h eb e s t ，t o x i c i t yo ft h e 3 r di n s t a rw a s9 3 2 a f t e r2 d 3 c o m p a r e dw i t he x t r a c t so fg i n k g ob i l o b al e a v e sa n dg b er e s i d u e ，t h e e x t r a c t so fg i n k g oe x o c a r ph a ds t r o n g e rt o x i c i t yt ol a r v a e o ft h em o t h ， i tw a ss u g g e s t e dt h a tg i n k g o l i ca c i d sh a d b i o a c t i v i t i e st o 1s t 3 r d l a r v a e 4 g i n k 9 0 1 i c a c i d se x t r a c t e d f r o m g i n k g o e x o c a r pb y h a ds t r o “g e a n t i f e e d a n t a n dt o x i c i t y o n ，i x y l o s t e l l a t h e r e s u l t ss h o w e d t h a t 5 g i n k 9 0 1 i ca c i d sh a ds tr o n gt o x i c it yt o1s t3 r dl a r v a eo ft h ed ia m o n d b a c km o t h w h e n6 2 5m g 1o fa c i dw a sa p p l i e d n o n s e i e c t i v ea n t i f e e d a n to ft h e 3 r di n s t a r l a r v a ew as7 7 8 a f t e r2 4h a n d9 4 7 a f t e r4 8h a t4 8 h ，t h el c 5 0o f1s ta n d2 n di n s t a rl a r v a ew a s1 3 1 m g 1 ，t h e 3 r di n s t a r 1 a r v a ew as6 0 7m g 1 b as e do nt h ea b o v er e s u l t s i tisc o n c l u d e dt h a t t h eg i n k g oe x o c a r p sc a l lb eu s e dt oe x tr a c tg i n k 9 0 1 i ca c i d st h a tc a n b ep o t e n t i a l l yu s e dt od e v e i o pn e wb i o p e s t i c i d e s ，a n dt h ee x t r a c t i n g m e t h o dc o i l l dm a k er e f e r e n c et ot h e 1 a r g e s c a l eg i n k 9 0 1 i c a c i d s m a n u f a c t u r e k e y w o r d s ：g i n k g oe x o e a r p ；g l n k g o l i c a c i d s ；p l u t e l l ax y l o s t e l l a ； f e e d i n gd e t e r r e n t ；t o x i c i t y 6 一、综述 纵观世界农业发展的整个历程，有关农业害虫防治的工作大致经历了4 个发 展阶段：原始防治阶段、化学防治阶段、综合治理阶段、持续控制阶段( 尤民生 等，19 9 9 ；2 0 0 1 ) 。随着人们环境保护意识的增强，对害虫治理基础理论及应用 技术研究的不断深入和实践经验的不断积累，同时考虑到人类自身生存以及自然 资源的有限性，确定了持续发展是唯一的发展模式。 化学农药的使用曾为农业的发展起了重要的作用，但其潜在的危害性也在长 期使用中暴露出来，因此在日益强调环境保护、提倡有害生物综合治理( i p m ) 、 发展可持续农业的今天，害虫防治工作者愈来愈重视植物次生代谢物质在控制害 虫中的作用，重视植物与昆虫的相互关系，积极探索有机杀虫剂以外的害虫控制 措施，以适应环境保护中害虫治理可持续发展的要求。 1 小菜蛾研究现状 小菜蛾( p l u t e l l ax y l o s t e l l al ) 属鳞翅目菜蛾科，俗称吊丝虫、小青虫， 是世界上分布最广的一种危害十字花科蔬菜的重要害虫。该虫年发生代数多，繁 殖速度快，世代重叠现象严重。长期以来，人们主要靠使用各种化学杀虫剂来达 到控制小菜蛾危害的目的。随着杀虫剂的大量使用，小菜蛾对各种有机合成杀虫 剂如抑太保、定虫隆都产生了不同程度的抗药性( 赵善欢，19 9 5 ) ，对生物农药 b t 的抗性也很高( r a j us v s ，1 9 9 5 ) ，而且具有抗性发展速度快、抗性倍数 高的特点( 唐振华，1 9 9 3 ) ，为此小菜蛾猖獗为害，严重影响了农业生产，小菜 蛾的生物防治和抗性治理成为世界各国重点研究的对象之一( 赵怀玲等，2 0 0 1 ) 。 1 1 小菜蛾抗药性的发展 自h n k e r s m i tw o l ft 等于1 953 年首次报导了小菜蛾在印尼爪哇对d d t 产 生了约7 倍的抗性以来，随后在菲律宾、日本、马来西亚、泰国，新加坡、印度、 印度尼西亚、中美洲、美国夏威夷和澳大利亚等国家和地区先后也报道了小菜蛾 抗药性问题( 赵怀玲，2 0 0 1 ) 。到2 0 世纪8 0 年代末，t a b a s h n i c k ( 19 9 0 ) 统计， 小菜蛾大约已对5 0 余种杀虫剂具有抗性，其中包括有机磷、有机氯、氨基甲酸 酯、拟除虫菊酯、苯酰基硫脲类昆虫生长调节剂类似物和苏云菌杆菌( b t ) 等。如 在印度小菜蛾对有机磷的抗性迭6 2 8 倍多( r a j us y s ，1 9 9 5 ) ，在中国对溴氢 菊酯的抗性超过了1 0 ，4 1 4 倍( 赵怀玲等，2 0 0 1 ) 。 小菜蛾抗药性发展与药荆选择压力有关。由于用药历史和用药水平的差异， 不同地理区域的小菜蛾对杀虫剂的抗性发展程度不同。在小菜蛾常发或多发地 区，连续多次高剂量使用1 种或同类型杀虫剂很容易产生抗性。如m o r is h i t a ( 19 9 8 ) 报道，小菜蛾对b t 毒素、定虫隆、丙硫磷等等抗性随应用频率而变化， 频繁使用使小菜蛾产生高水平的抗性。一般来说，小菜蛾对目前使用的六大类杀 虫剂抗性的大小表现为：拟除虫菊脂 氨基甲酸脂类 酰基脲类 有机磷类 b t 杀 蚕毒素类( 程东美等，1 9 9 9 ) 。由于化学药剂的不合理使用，小菜蛾的抗性发展 越来越快，二三年内就可对1 种药剂产生抗性。抗性谱越来越广，新药荆的合成 速度远远跟不上其抗性发展的速度。 1 2 小菜蛾抗药性研究 室内害虫抗药性选育是研究害虫抗性的重要手段，是进行抗性机理、交互抗 性、抗性遗传等研究的基础。有关杀虫剂对小菜蛾的室内抗性选育研究国内外已 有较多的报道。陈之浩等( 1 9 9 3 ) 用杀虫双和杀螟丹对小菜蛾经过3 5 代选育，小 菜蛾对杀虫双和杀螟丹的抗性分别增长了5 1 5 3 倍和2 5 8 8 倍，而且对沙蚕毒素 类杀虫剂之间有较高的交互抗性，对菊酯类的溴氰菊酯、氯氰菊酯和氨基甲酸酯 类的灭多威、久效威呈负交互抗性。t a b a s h n i k ( 1 9 9 1 ) 利用田问小菜蛾抗性品系 在实验室内进行筛选，连续选择9 代后，对b t 产生高达8 2 0 倍的抗性，表明小 菜蛾能对b t 产生高水平的抗- 】生。 小菜蛾在药荆选择压力下产生的抗性有些是稳定的，有些是不稳定的。朱树 勋等( 1 9 9 9 ) 将具较高抗药性的小菜蛾田间种群经室内无药剂压力条件下连续饲 养，其抗性逐渐下降，2 0 代后丧失对氰戊菊酯和亚胺硫磷的抗性，但对灭多威 的抗性衰退相对较为缓陵。m a r u y a m a 等( 1 9 9 9 ) 研究发现，在b t 的选择压力下， 随着选择压力的增加，小菜蛾对b t 制剂产生较高的抗性，当抗b t 小菜蛾品系在 无b t 选择压力情况下，其抗性水平可维持2 0 代，2 0 代后抗性水平逐渐下降。 2 。国内外次盖；代谢物的研究进展 针对化学农药的种种弊病，生物农药的开发逐渐受到重视。生物农药又称生 物源农药( 张兴2 0 0 2 ) ，一般是指直接利用自然界有益的生物或从某些生物中获 得具有杀虫、防毒等作用的生物活性物质。生物农药可分为两大类，一类是生物 体农药，另一类是生物化学农药。 2 1 生物体农药 生物体农药包括动物体农药、植物体农药及微生物体农药。 动物体农药主要指天敌，捕食螨及采用物理或生物技术改造的昆虫等。如 g r e a t h e a d 于1 9 8 6 年报道，世界有9 0 个国家应用3 9 3 种寄生蜂防治农林业中的 2 7 4 种害虫，有8 6 0 例成功的生物防治例子( 张兴等，2 0 0 2 ) 。 植物体农药指具有防治生物功能的活体植物。这方面的研究始于孟山都公司 的转基因作物( 抗虫棉、玉米、大豆抗草甘膦玉米) 1 9 8 6 年获e p a 批准进入 环境释放试验。目前约有9 0 种转基因植物产品已被批准商业化生产，其中大部 分与病虫害防治有关，如抗虫玉米、抗虫棉花、抗病毒的西葫芦和番木瓜、抗除 草剂的大豆等等。 微生物体农药中最常用的真菌杀虫蒉1 j 为白僵菌和绿僵菌，能防治2 0 0 种左右 害虫，在细菌类农药中，使用最广泛的为苏云金杆菌，用于防治1 5 0 多种鳞翅 目有害昆虫及其它害虫，1 9 9 7 年仅b t 制剂一项，销售额逸9 8 4 亿美元。 2 2 生物化学农药 生物化学农药包括动物源生物化学农药、微生物源生物化学农药及植物源生 物化学农药。 动物源生物化学农药是指昆虫产生的激素、毒素、信息素、几丁质或产生的 毒素、几丁质经提取或仿生合成的农药。最常见的是昆虫信息素类，如棉铃虫性 诱剂、甘蔗条螟性诱剂等，其它如阿根廷蚁产生的防卫毒素、大胡蜂产生的曼德 拉毒素、海生环节动物异足索蚕产生的沙蚕毒素等。 微生物生物化学农药是指由微生物产生的抗生素类、毒素类等，主要用于杀 虫的( 如a v e r m e c t i n ) 、防病( 如井冈霉素) 、除草( 如双丙氨磷) 及调节植物生 长发育( 如赤霉素) 等。我国研究开发农用抗生素处于世界先进水平，到目前为 止已注册并生产的农用抗生素品种达1 6 个，生产厂家13 0 多家，年产量达到7 万多吨制剂，年应用面积达到3 亿多亩次( 张兴等，2 0 0 2 ) 。 植物源生物化学农药也即通常所说的植物源农药，主要包括植物毒素，即植 物体产生的对有害生物有毒杀及特异作用( 如使昆虫拒食、忌避、驱避、抑制昆 虫生长发育等) 的物质；植物内源激素，如细胞分裂素、脱落酸、赤霉素等；植 物源昆虫激素，如早熟素等；异株克生物质，即由植物产生并释放到环境中能影 响附近同种或异种植物生长的物质；防卫素，如豌豆素等。 目前开发植物源农药主要是利用植物体内的次生代谢物质。1 9 世纪，k i r b y 、 s p a n c e 和f a b r e 开始注意到植食性昆虫仅或多或少取食某些植物，1 8 9 1 年， k o ss e l 提出植物中的化学物质从功能上可分为初级代谢物和次级代谢物。1 8 9 0 年，比利时植物学家a b b o t t 和g r r e r a 都认为植物中的化学成份可以作为植物防 御动物包括昆虫的一种措施，但在当时植物次生物质可能的生态角色仍未引起关 注，1 9 1 0 年，在阿姆斯特丹大学，v e r s c h a f f e l t 在向荷兰皇家科学院( r o y a l n e t h e r l a n d sa c a d e m y ) 所作的报告中指出一些植物次生物质可以诱导昆虫取食， 并认为芥子油苷( g l u c o s i n o l a t e s ) 分布是导致菜粉蝶寄主范围大小的主要原因 ( c h a p m a n ，2 0 0 0 ) 。1 9 5 9 年，美国u n i v e r s i t yo f i i i i n o is 的g s f r a e n k e l ( 1 9 5 9 ) 在s c i e n c e 上发表“t h er a is o nd e t r eo fs e c o n d a r yp l a n ts u b s t a n c e s ”， 强调绿色植物所含的营养成份与人体相近，植食性昆虫的食性决定于对植物次生 物质的适应性。这种理论受到研究蚜虫食性的k e n n e d y ( 1 9 6 5 ) 的修正，他认为除 了植物次生物质外，营养成份同样也是决定昆虫食i 生的一种因素。e h r li c h 和 r a v e n ( 19 6 4 ) 在“b u t t e r f l i e sa n dp i a n t s ：as t u d y i nc o e v 0 1 u t i o n ”一文中 首先使用了“协同进化”( c o e v l u t i o n ) 一词，认为在昆虫选择食物时，植物所 含的次生物质起着关键性作用。这种情况不仅对蝴蝶，可能对其它动物也是同样 的。 “次生性代谢产物或次生物质”是由k o ss e l 和c z a p e k 提出的( 钦俊德， 1 9 9 5 ) 。植物次生物质在来源和性质上与基础代谢物质如核酸、蛋白质等有所不 同，是复杂的分支代谢途径的最后产物，不直接参与维持产生者的生长发育和生 殖有关的原始生化活动( 尹淑艳等，2 0 0 0 ) ，主要类别有含氮化合物、萜类、酚 类、聚已炔类等。已知的植物次生物质约1 0 万种( 钦俊德，1 9 8 7 ) ，它们的多样 性和在生药学及工业上的应用早已为人民所熟知，但次生物质在植物与昆虫相互 关系中的作用则仅在最近三四十年才被人间所熟知和重视。 8 0 年代开始，以对印楝素的系统研究为起点，在全世界范围内掀起了研究 植物杀虫剂的热潮。到目前为止，人们已发现了一系列对昆虫有生理活性的植物 次生物质，包括糖苷类、醌酚类、生物碱类、肉桂类、香豆素类、木聚糖类、甾 类、萜类和炔类等对昆虫有忌避、拒食和引诱作用的物质；保幼激素、蜕皮激素 等对昆虫生长、发育、变态等方面有影响的神经内分泌类似物；喜树碱、三尖杉 酯碱等对昆虫生殖系统有毒杀作用的物质；丹宁、木质素、酚树脂、抗蛋白酶等 防碍昆虫消化食物的物质( s c h m u t t e r e r ，1 9 9 0 ) 。如b i n d e ( 1 9 95 ) 等研究了金合 欢烯、橙花叔醇和金合欢醇等倍半萜类化合物在欧洲玉米螟( o s t r i n i a n u b i l a l i s ) 成虫期的第1 个6 天对其产卵的影响，结果表明，金合欢烯促使此 虫产卵，金合欢醇却抑制其产卵。m u s e t t i ( 19 9 7 ) 等研究表明，番茄( l y c o p e r s f c o n m r s u t u m ) 叶片提取物中的挥发物能够干扰定居在叶片上的马铃薯长管蚜 ( m a c r o s i p h u me u p h o r b i a e ) ，2 4 h 后致死率达到1 0 0 。经硅胶气谱柱分析，2 十三烷酮是有效组分，将毛状体渗出物和2 一十三烷酮喷于人造膜上可抑制该 虫取食，2 4 h 后导致死亡。 目前国内外研究较多的植物有印楝，番荔枝、巴婆、万寿菊等，其中最成功 的为印楝，从中分离出的印楝素及其他四环三萜类化合物对小菜蛾具有较好的生 物活性。已商品化的印楝产品有m a r g o s a n - o ( 美国) 、n e e m m a r k ( 印度) 、o 3 印楝素乳油( 中国) 。我国是研究和应用杀虫剂植物最早的国家，从3 0 年代以来 对杀虫植物进行过比较广泛的研究，8 0 年代后，我国对杀虫植物的研究进入一 个新的发展阶段，在某些方面已达到国际先进水平。目前，我国在植物活性成份 的筛选、生物测定及毒理学等理论研究领域取得显著的成果，研究内容涉及到楝 科，卫矛科、柏科，豆科、菊科等科的多种植物，而且已成功地开发了许多植物 农药，烟碱、苦参碱、楝素、茴槁素和茶皂素等1 6 种植物农药已登记注册。华 南农业大学在这方面的研究比较深入，对楝科植物，特别用川楝、苦楝等对数十 种昆虫进行了系统的活性试验，对其化学成分、作用机理及至工业化生产都进行 了研究，并从实际出发，对菜青虫、柑桔全爪螨、稻瘿蚊、褐飞虱、小菜蛾等进 行了田间试验示范，取得了较好的效果( 王云峰等，2 0 0 1 ) ：对苦皮藤也进行了多 学科研究，从中鉴定出3 类活性物质，苦皮藤素i ( 拒食) 、苦皮藤素j i 、1 i i ( 毒 杀) 和苦皮藤素i v ( 麻醉) ；从黄杜鹃提取物中鉴定出对昆虫有拒食、毒杀作用 的闹羊花毒素( 赵善欢等，19 83 ，1 9 8 6 ，1 9 9 1 ；张兴等，1 9 8 3 ，1 9 9 2 ，1 9 9 9 ；徐 汉虹等，1 9 93 ，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ；罗万春等，1 9 9 7 ) 。 3 银杏次生代谢物的研究现状 3 1 银杏次生代谢物的开发与利用 银杏( g i n k g ob i l o b al ) 又名白果、公孙树、鸭脚、佛指甲、灵眼等，为 最古老的中生代孑遗植物之一，故有裸子植物“活化石”、“植物界大熊猫”之称。 银杏为落叶乔木，直立挺拔，树姿优美。叶扇形顶端常二裂，叶脉分叉状。枝有 长枝、短枝之分，叶在长枝互生，在短枝上簇生，花白色，单性、雌雄异株。种 实核果状，外种皮为肉质，成熟时橙黄色；内种皮为膜质，外包骨质种核壳。5 月开花，1 0 月成熟。 我国银杏的分布北起辽宁省的东南部，南到广东、广西部分山丘，东至台湾 省的南端，西至西藏的昌都地区。银杏是一种集食用、药用、绿化观赏于一体多 功能的经济树种。目前国内外银杏资源的开发主要以银杏白果和银杏叶为主，并 已成功地从白果及叶中提取出多种有效成份，用于药品、食品、饮品、化妆品等 各种产品的开发和生产。 银杏果实( 白果) 早就为古人作为药用，本草纲目记载白果具有“生食 引疳解酒，熟食益人。生食降痰，消毒杀虫”之功效。明代李时珍曾曰：“入肺 经、益脾气、定喘咳、缩小便。”清代张璐璐的本经逢源中载白果有降痰、 清毒、杀虫之功能，可治疗“疮疥疽瘤、乳痈溃烂、牙齿虫龋、小儿腹泻、赤白 带下、慢性淋浊、遗精遗尿等症”。然而，长期以来银杏的其它价值尚未揭示出 来，直至6 0 年代末，对银杏的综合开发利用才逐渐受到国内外的重视。在本世 纪6 0 年代中期，德国科学家发现银杏叶中含有能有效促进全身毛细血管血液循 环，并清除体内自由基，抑制脂质过氧化的银杏黄酮、银杏内酯等多种有效成份， 因此国内外研究者对银杏资源利用的开发研究也愈加深入( 梁立兴，19 9 8 ) 。8 0 年代进入开发热，开发的范围已从种仁扩展到外种皮、叶及木材，应用的领域也 从医药扩大到食品，保健品、化妆品、工艺品。植物保护等方面。 银杏叶片产量高、易加工，且成份复杂，因而一直是银杏开发的热点。银杏 叶含有银杏内酯 ，b 、c 、m 、j 和白果内酯、黄酮甙、芸香素、槲皮素、醇类 氨基酸、维生素、叶绿素及矿物质元素等成份，其中主要的活性物质是银杏黄酮 类和银杏内酯( 黄天芳，1 9 9 7 ) 。业已证实，银杏黄酮类具有扩张冠状血管、改 善血管末梢和脑血管循环、降低胆固醇、解除平滑肌痉挛、松弛支气管等作用( 吴 元立，1 9 9 8 ) ；银杏内酯是血小板活化因子一p a f 的强拮抗剂，对心肌缺血、脑 缺血缺氧起保护作用( 曾华武等，1 9 9 7 ) ，此外还有改善皮肤血管末捎循环和促 进毛发生长的作用，并能清除体内自由基，抑制脂质过氧化。 虽然我国银杏资源的开发利用已经取得很大的成果，但都是以银杏白果和银 杏叶为主要研发对象，对于银杏外种皮的有效成分用于杀虫的系统研究报道较 少。银杏外种皮俗称白果衣胞见( 图1 ) ，是银杏种子硬壳外面的部分，外种皮 部分占整个种子鲜重的7 0 。据统计，我国每年约有3 0 ，0 0 0 吨左右的银杏外种 皮作为废料弃去，未被利用，既浪费大量资源又造成环境污染。据测定，银杏外 种皮所合化学成份与叶相近，但银杏黄素、白果酚酸性成份较高。外种皮的主要 成份有羟基类和酚酸类、双黄酮类、银杏内酯类、甾醇和甾酮类、白果醇、棕榈 酮、儿荼酚氨基酸、鞣质乖糖类等成份。烷基酚及烷基酚酸属于长链苯酚类化合 物，目前所说的银杏酚酸主要指这类化合物，主要有白果酸( g i n k g o li ca c i d ) ， 氢化白果酸( h d r o g i n k g o l i ca c i d ) ，氢化白果亚酸( h y d r o g i n k g o l i n i ca c i d ) ， 银杏酚( b i l o b a l ) 与白果酚( g i n k g a l ) ( 赵成林，1 9 9 7 ) 。 图1 银杏白果 3 2 银杏外种皮中瓴杏茧n 茛的苟理掌研究 随着对银杏酚酸研究的深入，银杏酚酸在化妆品、生物农药和医药方面得到 了很好的应用。银杏酚酸的用途主要如下： 1 ) 可作为日化用品添加剂：c 。和c 1 5 ：2 酚酸能高效地抑制酶活和清除自由基， 具有保护皮肤弹性和增白的效果( is a o ，1 9 8 6 ) 。 2 ) 防治病虫害：这些酸性成份可替代农药防治蚜虫、红蜘蛛及其它具咀嚼 口器的昆虫。 3 ) 抗肿瘤：酚酸类成份对小鼠内瘤s i l o 表现出显著的抗肿瘤活性。 4 ) 抗炎：酚酸类成份对炎症早期的毛细管渗透性增高、炎性渗出和水肿有 很好的抑制作用，对慢性炎症和免疫性炎症同样有效( 许丽丽，1 9 9 2 ) 。 5 ) 抗过敏：银杏酚酸具有与地塞米松药物相类似的抗过敏作用，与现有的 抗过敏药物皮质激素、色甘酸钠相比较，具有毒性较小的优点( 金巧秀 等，i9 9 5o 6 ) 对免疫功能的影响：银杏酚酸对细胞免疫和体液免疫功能有抑制作用， 作用性质与环磷酰胺和地塞米松相似。 7 ) 对心血管的作用：银杏外种皮水提物对大鼠离体心脏灌流实验表明，主 动脉输出量逐渐减少，冠动脉流量则渐增，总的心输出量减少。 8 ) 抑菌：白果酸具有较强抑茵或杀菌作用，对枯草菌、大肠杆菌、酵母菌、 金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌等均有抑制作用，对2 0 多种真菌 也有抑制作用。 1 4 从上所述可见，以前一直被视为加工废弃物的外种皮及所含的酚酸类物质将 会成为银杏类产品开发的新对象，甚至会由此带来银杏开发的第二次热潮。 4 本实验的研究目的 在应用植物杀虫剂控制害虫的研究蓬勃发展同时，人们日益感到植物资源的 有限性，可开发利用作为毒杀害虫的植物种类相对较少，因此人们一直寻求植物 筛选的新目标和途径，以获得更多有利害虫持续控制的天然活性物质。 本论文利用资源丰富的异源植物，包括田间杂草的植物次生物质，通过室内 试验，从酢浆草、构树、猪秧秧、金银花、野豌豆、珊瑚、小蓬草、博落回、山 胡椒、合欢、野胡萝r 、狼毒大戟、银杏、羊蹄、加拿大一枝黄花、荩草等植物 中筛选出杀虫效果较好的几种植物进行比较试验，确定最有效的植物次生代谢 物，优化分离制备流程，获取植物中对害虫具有拒食和毒杀作用的有效成份，为 植物次生物质的开发利用、菜田害虫持续控制和废弃物的综合利用提供理论与应 用依据。 二、植物次生代谢物的筛选 1 材料与方法 1 1 植物材料的采秦 植物材料的来源详见表1 。 襄1 植物材料的来滠 科植物名称 采集部位采集地 酢浆草科酢浆草o x a l i sc o r n i c u l at al 整株上海市区 桑科构树b f o u s s o n e t i ap a p y r i f e r nl 计 上海市区 茜草科 猪秧秧g a l i u ma p a r i n el v a t t e 月e r u m茎叶上海市区 忍冬科金银花l o n i o e r aj a p o n i c at h u n b 茎叶上海崇明岛 忍冬科e l 本珊瑚树v i b u r n u mo d o r a t i s s i m u mv a t a w a b o k i 叶上海市区 伞形科 野胡萝pd a u e u sc 8 f a t al 整株杭州天目山 菊科 加拿大飞蓬e r i g e r o nc a n a d e n s i sl 整株上海市区 菊科加拿大一枝黄花s o l i d a g oc a n a d e n s i sl 茎叶上海崇明岛 樟科 三胡椒l i n d e r ag l a u c ab l u m e 茎叶杭州天目山 豆科合欢a l o i z i a 如l i b r l s s i nd u r a z z 茎叶杭州天目山 豆科 野豌豆v i c i a 向加l整株 上海崇明岛 银杏科 银杏g i n k g ob i l o b al 叶、外种皮 江苏东山 蓼科革蹄r o m e xj a p o n i c u sh e u tt 叶 上海崇明岛 禾本科荩草a r t h r a x o nh i s p i d u st h u n b 茎叶 上海崇明岛 大戟科狼毒大戟e u p h o r b i af i s c h e r i a n as t e u d 根云南香格里拉 婴粟科博落回m a c l c a y ac o r d at a r b r 茎花，叶 杭州天日山 1 2 植物次生代谢物样品的提取 仪器：10 1 a 一3 恒温烘箱：上海市实验仪器总厂 r 5 0 2 旋转蒸发器、恒温水浴锅：上海申生科技有限公司 试剂：乙醇、丙酮等均为分析纯 1 6 将采集的植物材料分别用报纸包好放入恒温烘箱内，6 0 c 下烘6 8 小时， 用粉碎机粉碎过4 0 目筛。6 - j 5 , j # , s zl o g 干粉，用滤纸包装后装入索氏抽提器， 加入无水乙醇1 5 0 m l 后回流提取6 h ，水浴温度9 0 c 。将各提取液在旋转蒸发器 内浓缩至稠膏状，称重各抽提物。 1 3 小菜蛾的饲养 1 3 1 油菜的种植：整个过程在饲养室内，室温25 2 7 下进行，每天光 照1 2 h 。首先取适量新油菜菜籽，水浸1 2 1 4 2 1 ，将泥土平铺在搪瓷托盘中放入 烘箱，1 5 0o c 消毒冷却后洒水浸润至表面略有积水。然后将浸泡好的菜籽撒在泥 土表面，轻轻抚平土壤表面，使菜籽均匀分布。4 8 h 后大部分菜籽有胚根伸出， 6 0 h 后几乎全部有芽长出，长势较好。每隔6 7 h 喷水一次。 1 3 2 小菜蛾的饲养：小菜蛾是完全变态的昆虫，其一生经历卵、幼虫、蛹、 蛾4 个发育阶段，见图2 。 田2 小菜域四个冀育阶段 从上海市崇明前哨农场采集小菜蛾幼虫及蛹，带回饲养室内饲养。室内相对 湿度控制在7 0 8 5 ，温度控制在2 6 1 ，光照为l d l 2 ：1 2 。幼虫移置盆栽油菜 叶上，以油菜叶饲养；蜗放在培养皿中，移入养虫笼内，待蛹羽化后在笼内放入 合i 0 蜂蜜水的棉花团，同时在箱内放置一盆油菜，供雌雄小菜蛾交尾后产卵 用，每天更换盆栽油菜。卵孵化后移入搪瓷托盘栽种的油菜叶上饲养，直至其化 蛹为止。采集小菜蛾蛹，放入1 0 冰箱内保存，待幼虫大部分化蛹后从冰箱中 将蛹移至养虫笼内，使小菜蛾开始一个新的世代。持续饲养并取其1 3 龄幼虫 供实验用。 1 4 毒力测定 采用叶碟法进行非选择性测定各种植物部位的乙醇提取物对小菜蛾幼虫的 毒性( 徐汉虹等，2 0 0 0 ) 。以丙酮为溶剂，将各抽提物按浸膏重量配成1 0 0 m g m l “ 的浓度，以丙酮作为空白对照。青菜用打孔器( d = 1 9o m ) 制备成圆片，将其 浸入不同植物的处理液中，3g 后取出，待溶剂挥发后放入垫有滤纸( 加几滴水 保湿) 的培养皿( d = 9c m ) 中，每个培养皿中放入2 片处理叶碟，接入1 0 头已 饥饿4h 的小菜蛾3 龄幼虫，每一浓度重复1 0 次。2 4h 后更换对应的处理叶片， 4 8h 后观察小菜蛾幼虫的死亡情况。根据2d 后试虫的死亡情况计算校正死亡 率若对照组死亡率大于2 0 ，试验重做；若对照死亡率小于2 0 ，用a b b o t t 公式校正处理组死亡率( 唐振华，1 9 9 3 ) ，即 处理组死亡率一对照组死亡率 校正死亡率=1 0 0 1 0 0 一对照组死亡率 从上述实验中筛选出有一定杀虫活性的植物源提取物进一步测定。同样采用 叶碟法，各提取物设8 0 、6 0 、4 0m g m l 13 种浓度，重复上述步骤，每一浓度重 复1 0 次，2 天后观察小菜蛾幼虫的死亡情况。 实验中活性较强的部分植物提取物加长观察时间，在2 d ，4 d 、6 d 后观察幼虫 死亡情况。同时进一步测定其生物活性，每种植物源提取物按浸膏重量配成6 0 、 4 0 、2 0 r a g ，m l 。3 种浓度，分另4 在1 d 、2 d 、4 d 、6 d 后观察幼虫死亡情况。 2 实验结- m 1 ) 不同植物的乙醇提取物对小菜蛾的毒力测定结果见图3 。1 6 种植物材料 用乙醇进行次生代谢物的提取及其活性筛选，结果表明合欢、构树、博落回( 茎 花) 、山胡椒、狼毒大戟、野胡萝卜等6 种植物部位的乙醇提取物对小菜蛾幼虫 基本无毒杀活性，而酢浆草、博落回( 叶) 、猪秧秧、野豌豆、荩草、日本珊瑚 树、加拿大飞蓬、加拿大一枝黄花、羊蹄等9 种植物源杀虫剂对小菜蛾幼虫都有 一定的杀虫活性，其活性大小依次为酢浆草 博落回( 叶) 猪秧秧 野豌豆 荩 草 日本珊瑚树 加拿大飞蓬 加拿大一枝黄花 羊蹄，金银花及银杏外种皮2 种植物的乙醇提取物对小菜蛾幼虫作用较强，2 天后幼虫的校正死亡率分别达到 7 6 8 、9 3 2 。 琶 丹 u 献 旧 搿 g 蕞 。 田3 不同植物的乙_ 基提取物对小秉蛾的番秉作用 1 ：合欢：2 ：构树；3 ：博落回( 茎花) ； 4 ：山胡椒； 5 ：狼毒大戟；6 ：野胡萝i - ；7 ：酢浆草； 8 ：博落回( 叶) ； 9 ：猪秧秧；1 0 ：野豌豆；1 1 ：荩草； 1 2 ：日本珊瑚树； 13 ：加拿大飞蓬；1 4 ：加拿大一枝黄花； 1 5 ：羊蹄；1 6 ：金银花； 1 7 ：银杏外种皮 2 ) 酢浆草、博落回( 叶) 、猪秧秧、野豌豆、荩草、日本珊瑚树6 种不同植 1 9 帅 帅 仰 蚰 加 如 0 物部位的提取物随浓度不同的幼虫死亡情况见图4 。在低浓度下，幼虫死亡率较 低，随着浓度的增大，幼虫死亡率增大。其中，在4 0 m g m 1 1 浓度下酢浆草、日 本珊瑚树的乙醇提取物对幼虫的毒性低，基本无生物活性。6 种植物中野豌豆的 乙醇提取物对小菜蛾幼虫的作用较强，在6 0m g m 1 1 浓度下幼虫的校正死亡率达 到4 8 1 。但这6 种植物的提取物对幼虫的生物活性郝不是很高，3 种浓度下其 幼虫死亡率均未超过5 0 。 圈4 不周浓度下6 种植物的乙醇提取物对小菜域幼虫的毒杀作用 3 ) 加拿大飞蓬、加拿大一枝黄花、羊蹄、金银花、银杏5 种植物部位的乙 醇提取物随时间变化其幼虫死亡情况见图5 。实验表明随着实验时间的增加，幼 虫的死亡率增高。其中羊蹄、金银花、银杏外种皮3 种提取物对小菜蛾幼虫的毒 杀作用明显，4 天后幼虫的死亡率均在7 0 以上。 田5 五种植物的乙醇提取物对小菜蛾幼虫的毒杀作用 4 ) 加拿大飞蓬的乙醇提取物对幼虫的毒杀作用相对较弱，幼虫的死亡率 均未超过5 0 。加拿大一枝黄花、羊蹄叶、金银花茎叶、银杏外种皮4 种提 取物按照6 0 、4 0 、2 0 m g m l 。三种浓度梯度在1 d 、2 d 、4 d 、6 d 后观察幼虫死 亡的结果分别见图6 、图7 、图8 、图9 。 在4 0 m g m l 。浓度下，加拿大一枝黄花的乙醇提取物4 天后达到53 2 ，6 天后达到5 7 6 。在6 0 m g m 1 1 浓度下，羊蹄的乙醇提取物2 天 后达到4 9 。6 ，4 天后为5 2 8 。 金银花茎叶与银杏外种皮的乙醇提取物杀虫效果较好，具有很好的开 发前景。两者相比之下，银杏外种皮的提取物杀虫效果优于金银花提 取物，详见表2 。 裹2 蕾蠢花，氟軎外种皮的提取物对小菜l 的杀作用比较 般( m g m 1 弋肌 1 d2 d 4 d 6 d 6 0 3 8 1 士7 8 27 3 8 5 0 38 1 2 士4 5 28 4 5 2 3 2 金银花 4 02 4 5 5 1 l 4 6 6 4 3 3 5 3 4 0 95 3 4 0 9 2 02 5 3 土4 0 24 5 1 土2 4 45 0 2 3 5 65 3 6 士4 1 6 银杏 6 05 1 3 4 9 49 3 2