（生物化学与分子生物学专业论文）人类β蛋白基因5远端mar增强子区的功能研究.pdf

潮 育 医料 大 学 * j 巨 怡 玲祠 叮 创 卜 掌 位 创 仑 j 忆.中 文 幼 要 中 文 摘 要 ( 人 类 卜 珠 蛋 自 基 因 是 真 核 生 物 基 因 组 中 最 具 有 代 表 性 的 基 因 家 族 ， 其表达具有严格的红系组织特异性和发育阶段特异性， 泛深入地研究日 一 珠蛋白基因的表达调控对最终阐明真核基因的表达调控机制以及达到基 因治疗协地中 海贫血的目的具有重要意义。我们发现并报道p 一 珠蛋白基 因5 旁 侧 远端 一 22 82一sl 4bp 位范围内 存在多 个正 、 负 性调 控元 件， 其 中， 一 14 57 一 12 69(l 8 9 b p ) d n a片段在 h e l a细胞中具有增强荧光素酶 (l uc i fe rase ， l uc) 报告基因表达活性。为了 确认该1 8 9 b p d n a片 段的增强子 作 用 并 鉴 定 其 作 用部 位 ， 沐文 设 计 合 成 三 链 形 成 寡 核 普 酸 (trip lex fo ong olig o n u c le ot 记 e ， tfo ) 进行三 链形成实验: 并运用竞争性 凝胶滞留 分析 ( c g r a ) 技术研究 一 1 5 5 9 一8 1 4 bp(7 4 5 b p ) d n a片 段内1 8 9 bp及2 8 0 b p 、 1 7 8 bp d n a片段与h e l a 细胞核抽提物的结合情况。 随后将能够与h ela 细胞核 抽提 物结 合的1 89 bpdna全片 段 和94 bp、 62bpdna片 段 插入 uc报告 基 因载体 闪l z 一 p ro m oter ， 构建三个 l uc 基因重组子。 将这些重组子与含 1 .4 k b 、 745 bp、 2 8 0 b p 和1 78 bpd n a片段的 重组luc基因 通过脂质体转染 技术导入hela细胞， 检测其瞬时表达。 结果显示:1 . 1 8 9bp d n a片 段仁 不能 形 成 三 链。 2 . 在h el 涯 细胞 核 抽提 物中 存 在与18 9 bpdna片 段 特异 性 结 合 的 反 式 作 用 因 子， 其 结 合 部 位主 要 位 于94 bp和6 2 bpdna 片 段中 。 280b p 、 1 78 bp dna片 段与 特定hel a 细 胞核 抽 提物蛋白 质 特异 性结 合。 潮南 医卑 略 大 学* 王 怡玲硕 士 学位论 文 . 中文 按县 3 . 在h e l a 细 胞中1 8 9 b p , 9 4 b p 及6 2 b p d n a片 段均显 著增 强l u c 基因 表 达 ， 而 ，.4 k b , 7 4 5b p , 2 8 0 b p 和 ，7 8 b p d n 、 片 段 显 著 抑 制 基 因 表 、 队 验结 果 提 示 在0 一 珠 蛋白 基 因5 3 d 端 一 1 5 5 9 - - 8 1 4 b p ( 7 4 5 b p ) d n a 片 段中 ， 仅有1 8 9 b p d n a片段显示 增强 子活性，该 活性不受三链形成的 调节。该 1 8 9 b p d n a片段内 核蛋白 因子结合位点主要 位于9 4 b p 及6 2 b p d n a片段 中，这些活性片段与反式作用因子相互作用，可能协同参与调控s - 珠蛋 白 基 因 表 匆 关链词:日 一 珠蛋白基因真核基因表达调控增强子二链形成实验 一 竟 科凝 胶 滞 留 分 析报 告 基 因 分 析 溯 甫 医转 大 学 * 巨 怡 玲月 吐 士 学 位 论 文 . 典 文 摘 要 ab s t r a c t h u m an p 一 g lo b i ng e n ec l u ster i sthe mostty p 1 c a l g e n e 几 m i lyo fa l lthe e u k a ry ot i cg e n e s . i t sstrict e ry th r o id 一and s ta g e . s pec i fi ce xpre s s i on m a k e s th estud yo fp 一 g l o b ing e n e c o mpre h ens i v e l y r a t h eri m p o 比 却 t for e luci d a t l n g th e re gul atio n a l mec h ani sm o f e u k axyot i c gene e x p r e s s i on andperi b n n 1 ng g e n e th e ra p y on p 一 th ai as s e r n ia . p revi ous s t u d i e s p rov 记 edt h a t s eve ral c 动 一 ac ti ng el e m e n tsloca t l n g叩s tr e am tothe 8 14 饰 si teof 夕 fl 斑 水 i n gs e q u e n c eo fp 一 g l obing e n e ， inclu d ing al 8 9 bp d n a 加卿e nt ( 一 1 4 5 7 一1 2 6 9 ) e n h an c ingthelu c i fe n 玲 e g ene e 冲 re s s ion i nh e l a c e l ls . trip le x fo n n l n gas s ay， c o m petiti v e ge1 r e ta “ ja t i on ass a yandtr a n si e n t 坛 知 5 丘 兄 t i on 、 v e r ec ar r i ed o utto a ffirm th e 允 n c t i onof面s 1 8 9 b p d n afr a 脚ent and toi denti勿the s peci fic 云 a gine n tssh o w l n g the e nhancer activ ity. the c g r aw astos tu d y t h e ln t e ra c t io n o f l 8 9 饰， 2 8 0 饰 即d1 7 8 bp d n afr a g m e ni s i n th e re giono f s fl 时 的 n g一 1 5 5 9一8 1 4( 7 4 5 bp) o fp 一 g lobi ngene wi th he l an u c l e ar 9 4 b p ， 62印 d n a n u c l e ar e x 坛acts . t h e1 89bp d n a加g m e ntandits 也 a t s h o w e d b l n d 吨 b ands初thh ela 、 v e r ec l o n e d l n t o the l u c i fer ase 潮育 医冲 冬 大学 * 9 氏 怡 玲4 t 拳 位 论 文 . 典 文 摘 要 r e p o rt e r g e n e v e c t o r - - p g l 2 - p r o m o t e r . t h e s e re c o m b i n a n t l u c g e n e c o n s t r u c t s a l o n g w i t h t h o s e c o n t a i n i n g t h e 1 .4 k b , 7 4 5 b p , 2 8 0 b p a n d 1 7 8 b p d n a fr a g m e n t s w e r e t h e n t r a n s f e c t e d i n t o h e l a c e l l s v i a l i p o s o m e a n d t h e t r a n s i e n t e x p re s s i o n o f l u c g e n e w as d e t e c t e d a ft e r 4 8 h . t h e r e s u l t s s h o w e d : 1 . n o t ri p l e x f o r m e d in t h e 1 8 9 b p d n a fr a g m e n t . 2 . i n h e l a n u c l e a r e x t r a c t s , t h e r e w e re t r a n s - a c t in g p r o t e i n f a c t o r s b i n d in g t o t h e 1 8 9 b p d n a fr a g m e n t , a n d t h e b i n d in g s i t e s m o s t l y l o c a t e d i n 9 4 b p a n d 6 2 b p fr a g m e n t s . s p e c i fi c h e l a n u c l e a r p r o t e i n s b in d i n g t o t h e 2 8 0 b p a n d 1 7 8 b p d n a fr a g m e n t s . 3 . t h e 1 8 9 b p , 9 4 b p , a n d 6 2 b p d n a fr a g m e n t s o f t h e 5 fl a n k i n g s e q u e n c e o f l3 一 g lo b i n g e n e e n h a n c e d t h e l u c g e n e e x p r e s s i o n re m a r k a b ly , w h i l e t h e 1 .4 k b , 7 4 5 b p , 2 8 0 b p a n d 1 7 8 b p d n a fr a g m e n t s in h ib it e d t h e lu c g e n e e x p r e s s io n . t h e r e s u lt s s u g g e s t t h a t t h e 1 8 9 b p d n a fr a g m e n t i s t h e o n l y fr a g m e n t n o w e l u c i d a t e d i n t h e 7 4 5 b p d n a fr a g m e n t t h a t e n h a n c e d l u c g e n e e x p re s s i o n . i t c o n t a in s h e l a n u c l e a r p ro t e i n f a c t o r - b in d i n g s i t e s , m o s t l y i n th e 9 4 b p a n d 6 2 b p fr a g m e n t s . t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n e n h a n c e r s a n d t r a n s - a c t i n g f a c t o r s f a c i l i t a t e s t h e g e n e e x p r e s s i o n . k e y w o r d s : 0 - g l o b i n g e n e e u k a ry o t i c g e n e e x p re s s i o n a n d re g u l a t i o n e n h a n c e r t r ip l e x f o r m i n g as s a y c o m p e t i t i v e g e l r e t a r d a t i o n as s a y re p o r t e r g e n e ass a y 翔 甫 眨 刀 斗 大 攀 * 反 怡 玲月 吐 士 学 亡 比 论 文 . 前 宫 前言 人类 珠蛋白 基因 包括。 一 珠蛋白 基因 簇 ( 。 gl obing e n o d us te r) 和p 一 珠 蛋白 基因 簇( p 一 gl obinge necl us te r ) ，q 一 珠蛋白 基因 簇位于16号染色体短 臂上，长约 3 0 k b ，按 5-心 2 一 中心 1 书q z 一 中q ; 一 叭一 3 ，顺序排列;p 一 珠蛋白 基因 簇位于fl号染色体短臂上， 长约60kb，由五个功能基因和一 个假基 因 组成， 并按 夕 - g 丫 a 丫 一 中p 一 6 一 p 一 3 t方向 排列， 其主要功能 基因的核 普酸序列已完全阐明。 珠蛋白基因是真核生物基因组中最具有代表性的基 因 家 族， 其 表达具有 严格的 红系组 织特异 性和发育 阶段 特异 性1 一 ，同 时 需 要 精 确 调 控以 维 持。 一 和卜 珠 蛋白 基 因 表 达 平 衡 11 ， 。 。 一 地 中 海 贫 血 娜 一 地贫 ) 是一种由 于p 一 珠蛋白 基因水平的突变导致p 一 珠蛋白 肤链合成完全 缺如 或不足而引 起的 一种遗传性小细胞低色素溶血性贫血151 。 由 于珠蛋白 基因 表达 具有上 述 特点， 并 且有关其表 达调 控的 顺式 作 用元件。 括 . a c t 访 9 e l e m e n ts ) 和反式 作用因 子伪 哪唱 t in gfact o rs ) 包括d n a 一 蛋白 质、蛋白 质 蛋白 质和d n a d n a调控中的研究尚不尽全面、 深入，目 前对p 一 地贫实 施基因治疗仍然十分复杂而困难。因此，很有必要对p 一 珠蛋白基因表达 的调控机制进行广泛深入的研究， 以达到基因治疗p 一 地中海贫血的目的。 人类6 一 与p 珠蛋白 基因间序列全长达 5 .4 kb， 约为p 一 珠蛋白基因 编码 序 列 (l .6 k b ) 长度的3 .4倍。 研究6 、 和p 一 珠蛋白 基因 间 序列 对p 一 珠 蛋白 基因的表达调控作用，对于阐明珠蛋白 基因及其它真核基因特别是 溯 南 胜 刀 略 大 月 卜 冲 巨恰 洲 卜 月 叹 士 学 位 论 文 . 分 宫 高等生物的基因表达调控具有十分重要的意义。 在6 。 和0 一 珠蛋白 荃因间 的含转录调控元件的研究中，国内外对p 一 珠蛋白 基因的 研究报道多限于 5 端- 6 1 0 位以 内 【6 9 1 。 研究 发 现。 . 珠 蛋白 基 因 启 动 子区 包 含 三 个 保守 盒 的 基 序 (10 1 ， 包 括 位于 帽 位上 游 约一 3 0 b p 处 的t a t a盒 ( h o g n e s s - g o ld b e r g 序列 ) 、 位于 . 7 0 b p 处的c c a a t 盒 和 一 9 5 一1 2 0 b p 处的c a c c c 盒， 是r n a 聚合酶结合以 进行精确有效地转录所必需的d n a序列。 c a c c c盒在调 控 卜 珠蛋白 基因发 育阶段特异性表达中发挥作用， 红系特异核蛋白 因子 e k l f ( e r y th r o id k r u p p e l - l i k e f a c t o r ) 特异地结合至c a c c c盒序列并 激 活r 一 珠 蛋 白 基 因 i ii 。 在0 - 珠 蛋白 基 因 旁 侧 一 6 1 0 b p 范 围 内 已 鉴 定 出 了8 个 顺 式 正 调 控 和 负 调 控 元 件 (6 -9 1 。 在。 珠 蛋白 基因5 旁 侧 一 3 3 8 - - 2 3 3 b p , - 6 1 0 - 4 9 0 b p d n a 序 列 中 各 存在 一 个 沉 默 子 16 1 , t - 1 6 0 b p 处 存 在一 个 二甲 亚 w d m s o ) 诱导 性增强子， 在0 一 珠蛋白 基因3 端第二个外显子中e c o r i 位点 附 近及 其p o l y a 位点 下 游5 5 0 b p 一 8 0 0 b p 的d n a区 域中 各 存 在一 个 增 强 子 9 ,12 1 . 成 人 型卜 珠 蛋白 基 因 启 动 子 上 游 序 列 经 蛋白 因 子 介 导 抑 制p 珠蛋白 基因表达， 并 可以 在较晚的 阶段调节该基因表达 1 3 1 。我室杨友云 等 14 1 采 用 缺失 分析 发 现0 珠 蛋白 基因5 远 端 - 8 1 4 - - 2 2 8 2 b p 位范围内 存 在多个正、负性调控元件，是这一领域的突破性进展。其中，- 1 5 5 9一 - 2 2 8 2 b p ( 7 2 3 b p ) d n a片段中 存在 有 沉默子， 而 一 8 1 4 - - 1 5 5 9 b p ( 7 4 5 b p ) d n a片段中至少存在一个增强子。 0 - 珠蛋白 基因5 远端 1 4 5 7 - - 1 2 6 9 b p ( 1 8 9 b p ) d n a片 段在h e l a 细胞 中 能 够 增 强lu c 报 告 基 因 的 表 因14 1 。 这 个区 域内 存 在 一 个 可 能 形 成 三 链的 潮 甫 胜 料 a 学 * j 巨 怡 翻 卜 祠 目 t 学 位 论 文 . 月 亩 金 同 聚嚓岭一 同聚啥咤 ( h o m o p u r in e - h o m o p y r i m i d i n e , h r - h 妈序列， 可作为 三链 形成 寡聚 核昔 酸 ( t r i p l e x f o r m in g o l i g o n u c l e o t i d e s , t f o s ) 调 控基因 表 达的 靶 序列。 本课 题首先 试从 这个 角 度 研究 三 链形 成与 该 1 8 9 b p 增强 子 功能 的 相互关 系。 其次， 为了 进一 步 鉴定1 8 9 b p d n a片 段的 增强 子活 性 并定位功能区， 本实 验拟用p c r 技术将该1 8 9 b p 片 段分为三个小片段， 以1 8 9 b p 和这三个小片段以 及一 8 1 4 - - 1 5 5 9 b p ( 7 4 5 b p ) d n a片段的近3 端 2 8 0 b p 和1 7 8 b p d n a 片 段 作 为 探 针， 进 行 竞 争 性 凝 胶 滞留 分 析 ( c o m p e t iv e g e l re t a r d a t i o n a s s a y , c g r a ) ， 鉴 定 这些片 段与 真核 细胞核 抽 提物 蛋白 质结 合的 特性。 将 1 8 9 b p d n a片段中带有核蛋白 结合位点的片段克隆入 p g l 2 - p ro m o t e r 载体构建 重 组l u c 报告 基因， 与 含 有1 .4 k b , 7 4 5 b p , 2 8 0 b p 和1 7 8 b p d n a片段的重组质粒一 起， 通过阳离子脂质体基因 转移技术导 入h e l a 细胞中， 检测l u e 基因瞬时表达。 由 此分析各个片段的功能活性， 并确定具有增强活性的具体部位。从而，为进一步阐明人类0 一 珠蛋白基 因的表达调控机制及p 一 地中海贫血的基因治疗的研究奠立一定的基础。 溯 甫 医料 大 学 * 贬怡 玲 祠 吐 .士学 位 论 文 . 材 利. 每 方 法 材 料 与 方 法 一 材料 质粒: p g lz一 prom o terd n a : 荧光 素嗽l uc ) 报告 基因 载 体， 含s v 40增强 子， 无真核启动子， 用于克隆和阳性对照; ps v 一 日 一 g al 州os i d a sec o n tr o l v ec t 叫卜g):日 一 半乳糖普酶报告基因载体， 用于校正导入效率。以 上质 粒均为promega公司产品。 重组l uc报告基因质 粒pgl14 ， pgl 7 4 5， pgl 2 80 和闪l 1 78为我室杨友云老师构建。 寡 核 昔酸 ( 0 1 妙n u c l eo “ d es ， o n t， t f o): ( ) n t l ( 1 3 6 1 一 1 3 3 9 ) : 5 ，一 g a g c t g a a a g g a a g a a g 护l a g g a g 一 3 ， o n t z ( 一 1 3 3 9 一 1 3 6 1 ) : 5 ，t c c i a c t y c t t c c i ， y t c a g c i 一 3 ， t f o:夕 一 g ag gaag a agaa ggaaagag gag 一 3 ontl和o n 口变性后退火为23饰 双链d n a o 引物: p l ( 一 1 4 5 7 一1 4 3 8 ) : 5 ，一 g g c c o g t a c c g g a t c c a g t i丫 1 ，c l l l l g g i 丁 一 3 ， p z ( 1 3 8 2 一1 3 6 3 ) : 5 ，一 c g c c g g t a c c a a t c g i a gf i t c a g a g t g t i ，一 3 ， p 3 ( 一 1 3 2 4 一 1 3 0 5 ) : 5 ，. g c c c g g i a c c a a g 毛 幻人 a c a c t厂 1 ，c c 们rac 一 3 ， p 4 ( 一 1 3 64一1 3 8 3 ) : 5 、 g g c c c t c g a g a a c a c t c t g a a a c 飞 a c g a t t 一 3 ， p s ( 一 1 3 2 1 一 1 3 4 0): 夕 毛g c c c i g a g c 一1 一 f l 一 i a c ，门 丁 g c a y g t 】 ， r c t 3 p 6 (- 1 2 6 9 一1 2 8 8 ) : 5 一 g g c c c t c g a g g a a i ，c c t g c c c c t a c c t g g a 一 3 ， p 7 1 2 7 4 一1 2 5 5 ) : 5 ，一 g g c c g c t a c c g g 川叮c a g g a t g a c t g a c a g 一 3 ， p 。 ( 一 9 8 9 一l 0()7 ) : 5 ，( 旧c c g g t a c c t g a 户 j c a a g g a a a t c a- 门 ，竹一 3 ， p g ( 一 9 94一 9 7 5 ) : 5 ，一 6 g c c c t c g a g c a t y c a a g 仃c c 下 戊 n 门 ，c t c 一 3 p ， 0 ( 一 8 1 1 一 8 3 0): 5 ， g g c c c t c g a g g t t a a c t g g g g a c a t c t a a c 一 3 ， 溯 甫 吐料 大 学 * a 反 怡 玲祠 砚 创 七 学 位 论 文 . 材 转 匀 方 法 其中引 物p i , p 2 , p 3 , p 7 , p : 的5 端加挂k p n i 位点，引 物p 4 , p 5 , p 6 , p 9 , p i 。 的5 ，端加挂x h o i 位点。 全部引物由 上海生工生物工程技术服务公司合 成。 各引 物位置 见f i g . i 0 卜 一 即 比i s g e n e 5 rp 4rp 5rp 6rp 8 pi p 2 p 3 p 7 p 9 峥一3 月卜-侧卜-峭卜 .月 一勺 一 7 4 5 b p ( - 1 5 5 ， 一 8 1 4 ) 1 8 9 b p ( - 1 4 5 7 - - - 1 2 6 9 ) 9 4 b p ( - 1 4 5 7 - - - 1 3 6 4 ) 6 2 b p ( - 1 3 8 2 - 1 3 2 1 ) 5 6 b p ( - 1 3 2 4 一 1 2 6 9 ) 2 8 0 b p ( - 1 2 7 4 一 9 8 9 ) 1 7 8 b p ( - 1 0 0 7 一 8 1 1 ) 2 3 b p ( - 1 3 6 1 - 1 3 3 9 ) f i g . 1 h - g l o b i n g e n e 5 fl a n k i n g - 1 5 5 9 、- 8 1 4 ( 7 4 5 b p ) d n a f r a g m e n t a n d p r i me r s f o r p c r 溯 甫 眨 料 大 学 * 9 反 怡 玲布 侧 七 攀 位 论 文 . 材 转 每 方 法 工具酶: 限制性内 切酶: h i n d i i i , b a m h i 、 e c o r i 、 h i n f i , x h o i 、 p s t i 、 k p n i ; 修饰酶: t a q d n a聚 合酶、 几d n a连接酶、 几多 聚核昔酸激酶 ( t 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e ) 。以 上各酶分别购自 工程技术服务公司。 公司和上海生工生物 试剂盒:质粒d n a纯化试剂盒、l u c 报告基因检测试剂盒、0 . 半乳 糖 普 酶 检 测 试 剂 盒、 转 染 试 剂t fx 4 - 2 0 等 均 为p r o m e g a 公 司 产品 。 细胞株、菌种及培养基: h e l a 细胞为本室保存: r p mi 1 6 4 0 培养基、 小牛血清购自美国g i b c o 公司;胰蛋白 酶购自 华美生物工程公司。d h 5 a 菌株系本室保存;胰蛋白 陈和酵母浸出粉为英国d x o t d公司生产; 制备感受态所用氛化钙系f i s h e r 公司生产。 常规试剂: 苯酚、 氯仿、丙 三醉、乙 醇、 盐酸、 冰醋酸、氯化钾、 氯化镁、 抓化 钠、 醋酸钠、 碳酸 氢钠、 磷酸氢二钠、 磷酸二 氢钠、 葡萄糖、 t r i s , e d t a 等均为国产分析试剂; s d s ( 重结晶 ) 为浙江黄岩产品: 琼脂糖购自 上海生 工生 物工 程技术 服务 公司: 丙 烯酞 胺 及甲 叉 双丙 烯酞 胺为s i g m a公司 产 品 ; d n t p s 为p r o m e g a 公 司 产 品 。 y p ) a t p 购自 北 京 亚 辉 公 司 。 溯 甫 医刀 咚 大 拳 * 困 氏 怡 玲祠 吸 d l- 学 位 伦 文 . 材 铆 咯 an 方 法 主要仪器: p c r 扩增仪:珠海黑马公司生产 7 5 2 紫外/ 可见分光光度计:中国上海分析仪器厂制造 液闪仪:美国b e c k m a n 公司生产 酶标仪:b i o - t e k i n s t r u m e n t s 公司产品 二. 方法 ( 一 ) 三链结合实 验 混 合i p m o l o n t ， 与i p m o l o n t 2 ， 于9 5 变 性， 缓 慢降 温 退 火 成 双 链， 按p r o m e g a 公 司 产品 说明 1 15 1 ， 用t 4 多 聚 核 普 酸 激 酶 及 y 3 2 p a t p 标 记。 按p e r k i n s b d t1 6 1 的 方 法， 1 .5 n m o t/ l 1 2 p - 2 3 b p d n a片 段 分 别 与1 2 .5 n m o l/ l , 1 2 5 n m o l/ l , 1 .2 5 ti m o l / l , 1 2 .5 u m o l / l和2 5 a m o l/ l的t f o混合溶于三 链结合缓冲液( 1 0 m m o l / l t ri s - h c i , p h 7 .6 , l 0 m m o l/ l m g c 12 , 1 0 % s u c r o s e ) , 于3 7 v w育2 4 h 。 上样于1 0 % 聚丙 烯酸胺凝胶 ( 丙烯酞胺( a c r ) : n ,n - 亚甲 基 双 丙 烯 酞 胺 ( b i s ) = 1 9 : 1 ， 含8 9 m m o l/ l t ri s , 8 9 m m o l/ l b o r a t e , p h 8 .0 , a n d i o m m o l/ l m 9 c 1 2 ，无 e d t a ) ,然后进行聚丙烯酞胺凝胶 电泳 ( p o l y a c ry l a m i d e g e l e le c t ro p h o r e s i s p a g e ) 。电 泳条 件为: 在电 泳缓 冲 液 ( 8 9 m m o l/ l t r i s - b o r a t e , p h 8 .0 , a n d 1 0 n u n o l / l m g c 1 2 ) 中2 5 c ，以i o v / c m 的电 压电 泳2 小时.干胶后，于一 7 0 放射自 显影1 - 2 天。 该 实 验在 不同 的p h 值( 6 .8 , 7 .2 , 7 .6 , 8 .0 ) , 盐 离子( 5 m m o l/ l , 1 o m m o l / l , 1 5 m m o l/ l m 广 )浓度 、精胺 ( o m m o l/ l , 0 .4 m m o l/ l s p e r m in e 溯 育 眨转 大 攀 * 巨 怕 玲 t e t r a h y d r o c h l o ri d e ) 、和 亚精 胺 硕 创 七 学 位 论 文 . 衬 林 与 幼 犷 诀 合 ( o m m o l / l , 2 . 5 m m o l 几 s p e r m i d i n e t r ih y d r o c h lo ri d e ) 、 反 应温 度( 4 c , 2 0 0c , 2 2 0c , 3 7 c ) 和反 应时间( 3 0 m i n 执2 4 h . 7 2 h ) 的 条 件 下 重 复 17 ,18 1 ( 二) 探针制备及标记 1 . p c r扩 增9 4 b p , 6 2 6 p , 5 5 b p , 1 8 9 b p , 2 8 0 如及1 7 8 b p d n a片 段 分别用引 物 p i + p 6 , p ， 十 氏、p 2 + p s , p 3 + p 6 , p 7 + p 9 及 p 8 + p lo 从质粒 p g p r p h中 扩 增出1 8 9 b p ( - 1 4 5 7 - - 1 2 6 9 ) , 9 4 b p ( - 1 4 5 7 - - 1 3 6 4 ) , 6 2 6 p ( - 1 3 8 2 - - 1 3 2 1 ) , 5 6 b p ( - 1 3 2 4 一1 2 6 9 ) , 2 8 0 b p ( - 1 2 7 4 - - 9 8 9 ) 和1 7 8 b p ( - 1 0 0 7 - - 8 1 1 ) 等6 个含0 一 珠蛋白基因5 远端不同长度的d n a片段。 2 . d n a片段的分离、回收与纯化 1 6 % 聚丙 烯酞胺凝胶( a e r : b i s = 1 9 : 1 ) 电 泳分离， 回收、 纯化这些片段， 用 【 y 3 2 p a t p 进 行 末 端 标记 。 ( 马竞争性凝胶滞留 分析 1 . h e l a 细胞核蛋白 抽提物制备 h e l a 细 胞 核 蛋白 抽 提 物 制 备 按d i g n a m j d 等 的 方 法 ( 17 1 ， 在4 进 行 操作。蛋白 质用考马斯亮兰 染料结合法进行定量1 叹 湖 甫 医 早 牛大 学 * a 氏 怡 玲祠 叹 t 学 位 论 文 . 材 林 匀 方 法 2 . d n a 一 蛋白 质结合反应 按a u s u b e l f m的方法进行 1 9 。 即在0 .5 m 1 离心管中分别加 入1 0 , 0 0 0 c p m d n a 探针 ( 约2 .5 n g ) , 3 0 0 u g /m l b s a ， 竟争 性片 段及3 ” g h e l a 细胞核蛋白 抽提物。 轻轻混匀后， 于室温放置2 0 m i n ， 即 进行p a g e . 聚丙 烯酞 胺凝 胶浓 度为6 % ( a c r :b i s =7 9 : 1 ) ，内 含2 . 5 % 甘油， 4 5 m m t r i s , 4 5 m m b o r a t e , p h 8 .0 , a n d 1 m m e d t a 。电 泳条件为1 2 .5 v / c m ， 于4 电 泳 2 小时。干胶后，于一 7 0 放射自 显影 1 - 2 天。 3 .滞留 区 带滞留 教m t a r d a t i o n r a t e , r r ) 的 计算 滞留 率( r r ) = 1一 滞留区带迁移距离 / 游离探针迁移距离 ( 四)重组载体构建及鉴定 1 . 构建重组子 p c r 扩增1 8 9 b p ( - 1 4 5 7 - - 1 2 6 9 ) , 9 4 b p ( - 1 4 5 7 - - 1 3 6 4 ) , 6 2 b p ( - 1 3 8 2 - 一 1 3 2 1 ) d n a片 段， p c r 产 物 经g l a s s - m a x m a t r i x 系缄p ro m e g a ) 回 收。 构建 流程图 见f i g . 1 0 。 首先用k p n i 和x h o i 消 化以 上各p c r 产物， 回收 纯化 后， 分别与 经勒” i /x h o i 线性化的p g l 2 - p ro m o t e r 进 行定向 连 接， 连接 反应于 4 过夜进行，插入片段与载体的摩尔比为 3 : 1 。由此得到重组子 p g l 1 8 9 , p g l 9 4 和p g l 6 2 . 溯 甫 医 料 大 学 * 反 怡 玲硕 d l- 掌 位 论 文 . 刁 弓转 每 ir -a 2 . 重组子的筛选和鉴定 将转 化后经含氨节青霉素 ( 1 0 0 1, 创 m l ) 培养基 培养过夜的 菌液， 用碱裂 解 法 小 量 制 备 质 粒d n a 2 2 1 。 各p g l 重 组 子 以b g l i 酶 切 消 化 鉴 定 后， 送 上海博亚生物技术有限公司测序鉴定。用于细胞转染的质粒均用d n a纯 化试剂盒提取纯化。 ( 五 ) 细胞培养和基因导 入 h e l a 细胞用含 1 0 % 小牛血清的r p m i 1 6 4 0 培养基于3 7 0c , 5 % c o 2 的 培养箱中 培养。 接种于2 4 孔板， 培养1 天 至6 0 - 8 0 % 融合， 将0 .5 11 g 各p g l 重 组 质粒 及阳 性 对照 质 粒p g l 2 - p ro m o t e r 分 别与0 .5 u g 0 一 半 乳糖 昔 酶内 对照质粒 在阳 离子 脂 质体r f x m - 2 0 介导 下 共转 染h e l a 细胞。 每 个 样 本 均 重 复4 次 。 具 体 操 作 按p ro m e g a t f ct m - 2 0 转 染 说明 书 1 15 】进 行。 细 胞 于3 7 -c , 5 % c o 2 的培养箱中继续培养4 8 h 后， 检测荧光素酶及0 。 半乳糖 昔酶活性。 ( 六” u c 报告基因的 表达检测 按p ro m e g a 公司l u c 报告基因 检测试剂 盒和0 - 半乳糖普酶检测试剂盒 n 5 l裂解以 上细胞。 裂解液分为 两份，一 份用于0 . 半乳糖普酶分析， 测 定反应物4 2 0 n m波长下的光密度;另一份进行l u c 分析，取2 0 u 1 裂解液 与1 0 0 1 l u c 检测试剂混合，立即计时， 在b e c k m a n 液体闪 烁仪上按单光 洲 甫 医万 略 大 学 * 阅 丘 怡 玲硬 .士 学 位 论 文 .冲 才 料 有 方 法 子检测程序操作， 测定 样品混合后2 0 - 4 。 秒共2 0 秒钟内的单光子强度( 以 c p m值计数) 。 l u c 活性的校正值按以下公式计算 s c p m一 b c p m 校正值= s a .c 一 b u . c 式中s 代表各重 组子 样本， b代表阴 性对照( 空白h e l a 细胞) ， c p m 代表l u c 活性值，a - g代表r - 半乳糖昔酶活性值。 j l j l j i q 矗：种大掌宰j t 怡泠习i 士学位论文结囊 结果 一、三链形成寡核苷酸( t r i p l e xf o r m i n go l i g o n u c l e o t i d e ，t f o ) 的设计 至今所报道的在所有在活细胞内有效作用的t f o s 都是g 或 g t - t f o s ，其中，反向结合的g a t f o s 形成的三链稳定性高于g t t f o s 者，而特异性则较低- 2 6 ，可用作三链形成的初筛方法。故本文运用三链 形成的标准规则，设计了可能与靶序列的富嘌呤链反向结合的g a t f o ( t f o ) f 2 3 , 2 7 , 2 8 1 ，进行三链结合实验。 o n d 5 - g a g g a a g a a g a a g g a a a g a g g a g 3 2 3 b pd u p l e x 5 - g a g c t g a a a g g a a g a a g t a g g a g 3 。 3 - c t c g a c t t t c c t t c t t c a t c c t c 5 二、争珠蛋白基因s + 旁侧远端t s 9 b p ( - 1 4 s 7 - 1 2 6 9 ) d n a 片段与三链形成 b 一珠蛋白基因5 旁侧1 8 9 b pd n a 片段内2 3 b r 1 3 6 1 - 1 3 3 9 ) 靶d n a 片段( 1 5 t o o l l ) 与1 2 5 n m o l l 、1 2 5 n m o l l 、1 2 5l lm o l l 、1 2 5pm o l l 和 2 5um o l l 的o n d ( 分别为2 3 b p 靶片段的8 3 、8 3 、8 3 0 、8 ，3 0 0 及1 6 ，6 0 0 倍) 反应，都只见一条双链探针区带，未见滞后的三链区带( f i g 2 ) 。该 实验在不同的p h 值( 6 8 、7 2 、7 6 、8 0 ) 、盐离子( 5 m m o l l ，1 0 m r n o l l ， 15 m m o l lm 9 2 + ) 浓度、反应温度( 4 、2 0 c 、2 2 c 、3 7 c ) 、反应时间 ( 3 0 r a i n ，2 h , 2 4 h , 7 2 h ) 及有无精胺( s p e r m i n e ) 、亚精胺( s p e r m i d i n e ) 的 条件下重复，结果均未出现滞后的三链区带，提示该区域无三链形成。 1 6 湖龠囊：科大掌掌j t 恰玲鼍l 士掌位论文爿r 果 f i g 2b a n d s h i f ta s s a yo f t f ob i n d i n gt os y n t h e t i c2 3 b pd u p l e x t a r g e ts e q u e n c ew i t ht h ec o r r e s p o n d i n gt f oi ss h o w na b o v et h e a u t o r a d i o g r a p h t a r g e ts e q u e n c e i s c o n s t a n t l y 1 5 n m o l l m o l a r c o n c e n t r a t i o n so f t f oi nt h ei n c u b a f i o n sa r e0 ，1 2 5 m n o f l ，1 2 5 n m o i l 1 2 5 l am o l l 1 2 5um o l la n d2 5um o l lf o rl a n el 6 r e s p e c t i v e l y d ：d u p l e x 湖龠医科大掌木j t 恰玲司e 士掌位沦文t l a - j 1 1 三、b 一珠蛋白基因5 旁侧远端- 1 5 5 9 - 8 1 4 b p ( 7 4 5 b p ) 区域内各片段与 h e l a 细胞核抽提蛋白结合的特性 分别用引物p l + p 6 、p l + p 4 、p 2 + p 5 、p 3 + p 6 、p 7 + p 9 p s + p l o ( f i g 3 ) 从 质粒p g0 8 p h 中扩增出1 8 9 b p ( 一1 4 5 7 一1 2 6 9 ) 、9 4 b p ( 一1 4 5 7 1 3 6 4 ) 、 6 2 b p ( 一1 3 8 2 一1 3 2 1 ) 、5 6 b p ( ，1 3 2 4 1 2 6 9 ) 、2 8 0 b p ( 一1 2 7 4 一9 8 9 ) 和 17 8 b p ( 1 0 0 7 _ 8 1 1 ) 等6 个含8 珠蛋白基因5