（生物化学与分子生物学专业论文）壳聚糖纳米载体研究.pdf

中文摘要 利用碱化氯乙酸一异丙醇法制各了羧甲基化壳聚糖，收率8 7 8 ，取代度7 4 6 。利用氯磺酸吡啶法制备硫酸化壳聚糖收率l l o 6 7 ，离子色谱法( i c ) 测定得硫酸根含量3 3 9 5 ，碱性多糖于环氧 乙烷冰浴法制备羟乙基化壳聚糖，收率8 7 ，通过红外光谱法分析确 定了各取代基团的数量和位置。 将羧甲基化壳聚糖、硫酸化壳聚糖、羟乙基化壳聚糖用于制各可 调控释放时间的纳米药物载体，采用反相微乳化法，以胰蛋白酶为模 式药物，按照衍生化壳聚糖比壳聚糖i ：3 的比例混合样品，利用戊 二醛为交联剂，十二烷基璜酸钠为乳化剂，分别制备了羧甲基化壳聚 糖壳聚糖、硫酸化壳聚糖壳聚糖、羟乙基化壳聚糖壳聚糖纳米药物 控释体系，收率分别为7 5 3 3 ，7 9 ，7 9 6 7 ，蛋白装载率为2 9 3 ，2 4 7 ，2 2 2 。通过红外光谱对比检测到羧甲基化壳聚糖为外 包被存在。扫描电镜显示载体大小均一，在i 0 1 0 0 u m 之间，可悬浮在 水溶液中。体外崩解试验表明，样品在溶液中无明显暴释现象，6 小 时内蛋白释放率分别为5 7 1 ，7 1 6 ，7 0 ，载体与酶之间通过共 价键结合紧密，蛋白持续释放时间达2 4 小时。体外崩解试验表明了衍 生化壳聚糖壳聚糖最佳比例为1 ：3 ，最佳交联剂浓度0 4 ，通过调 节衍生化壳聚糖壳聚糖的比例，可有效调节载体崩解时间，达到控释 作用。 通过对载体酶物理和化学性质的研究，发现反相微乳化法固定胰 蛋白酶，稳定性和耐受性都明显增加，固定化酶与底物结合能力无明 显变化， 米氏常数测定酶活性试验得出，羧甲基化壳聚糖壳聚糖载体的 k m = 4 2 0 x 1 0m o l l ，硫酸基化壳聚糖壳聚糖载体的i ( i - 3 8 7 x i 0m o l l 。羟乙基化壳聚糖壳聚糖载体的米氏常数k m = 3 9 2 x 1 0 。m o l l ，相比于原酶的k m = 3 4 0 x l o m o l l ，固定化酶的与 底物结合能力无明显变化 固定化胰蛋白酶热稳定性远高于原酶，8 0 。c 缓冲液中，衍生化壳 聚糖壳聚糖固定化酶在1 0 0 分钟内都具有较强活性。固定化胰蛋白酶 分子财p h 变化的耐受性明显增强，最适p h 为8 o ，在d h - 6 o 一9 o 的范 围内都保持了较高的催化活性，载体固定化酶对变性剂耐受性增强， 经过8 0 乙醇处理l o m i n ，均无明显活性变化。 细胞培养试验未出现明显污染现象，证明制备载体的方法，符合 用于细胞培养的无菌条件，固定化酶可以用于细胞培养中代替胰酶的 作用，作用3 分钟内细胞迅速脱落，与原酶近似，通过细胞计数比较， 加入载体的h e l a 细胞生长正常，细胞状态良好，载体对h e l a 细胞增 殖无任何不良影响。由生长曲线可以看出处理后的细胞继代后生长繁 殖正常，说明固定化酶无明显的细胞毒性。 关键词壳聚糖衍生物纳米载体胰蛋白酶 a b s t r a c t w em a d ec h i t o s a n n a n o s p h e r e s f o r d r u gd e l i v e r y a p p l i c a t i o n s ，u s i n g aw a t e ri no i le m u l s i o nm e t h o d f o l l o w e d b y g l u t a r a l d e h y d ec r o s s l i n k i n go f t h ec h i t o s a na m i n og r o u p s ，u s et r y p s i nf o r t c o n t a i n e dat e r m i n a l a m i n e ，g l u t a r a l d e h y d ea d d i t i o ni n d i s c r i m i n a t e l y b o u n dt h ea c t i v e a g e n t t ot h e p o l y m e ra s i td i db e t w e e nc h i t o s a n c h a i n s ，c o a t e dw i t hc a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ，c a u s i n gd m gi m m o b i l i z a t i o n r a t h e rt h a ne n c a p s u l a t i o n n e wm e t h o d so fc h l o r o a c e t i ca c i d l s o p r o p y l a l c o h o lw a su t i l i s e d f o r p r e p a r a t i o n o fc a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ，r e c l a i mb y8 7 8 ，n e w m e t h o d so fc h l o r o s u l f o n i ca c i d - p y r i d i n ef o rs u l p h a t ec h i t o s a n ，r e c l a i m b v1 1 0 6 7 n e wm e t h o d so fe t h y l e n eo x i d ef o r p r e p a r a t i o n o f h y d r o x y lc h i t o s a n ，r e c l a i mb y8 7 ，f t i rs p e c t r ai n d i c a t et h es u b s t i t u e n t n u m b e r sa n dp o s i t i o n s c o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i st h em o l e c u l a r w e i g h t a n dd i s t r i b u t i o n c h i t o s a nn a n o s p h e r e sm a d eb ym i x e r so fc h i t o s a na n dd e r i v a t i v e o f c h i t o s a na t3 ：1w i t he m u l s i f i c a t i o n p r o c e s sa n d m i c r o s p h e r e se n v e l o p e d w i t h c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n c h i t o s a n c a r b o x y m e t h y l c h i t o s a n n a n o s p h e r e s ，c h i t o s a n s u l p h a t e c h i t o s a nn a n o s p h e r e s ，c h i t o s a n h y d r o x y l c h i t o s a nn a n o s p h e r e s ，r e c l a i mb y7 5 3 3 ，7 9 ，7 9 6 7 ，t r y p s i nl o a d e db y 2 9 3 ，2 4 7 ，2 2 2 ，f t i rc a l ld e t e c tt h ec a r b o x y m e t h y lc b i t o s a nc o v e r ， c h i t o s a nc o r e c o a t e d m i e r o s p h e r e s w e r e m o r p h o l o g i c a l l y c h a r a c t e r i z e df o r s h a p e ，s u r f a c e c h a r a c t e r i s t i c sa n ds i z ed i s t r i b u t i o n ， n a n o s p h e r e sw e r ed e t e r m i n e dw i t hs c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p et h a t u n i f o r m l yd i s t r i b u t i o nf r o m1 0 1 0 0g m t h i sm e t h o d c a r r i e do u ti nm i l d c o n d r i o n sa n dw a sp a r t i c u l a r l yu s e f u lf o r m i s c r o e n c a p s o l u t i o no f t h e r m a l l ys e n s i t i v ep r o t e i n s t h ec o l l a p s e t i m ec o n s t i t u t e db yd i f f e r e n t r a m i f i c a t i o no fc h i t o s a na n dc h i t o s a nr a t i o s ( o p t i m a lb a l u ew a s1 ：3 、a n d g l u t a r a l d e h y d e a td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sc a nm o d u l a t e d r u g r e l e a s e m ( o p t i m a lb a l u ew a s0 4 ) ，t h e r e l e a s eo ft r y p s i ns u s t a i nf o r2 4 h o u r c h i t o s a n c a r b o x y m e t h y l c h i t o s a n n a n o s p h e r e s k m = 4 2 0 x 1 0 。 m o l l c h i t o s a n s u l p h a t ec h i t o s a nn a n o s p h e r e sk m = 3 8 7 x 1 0 m o l l ， c h i t o s a n h y d r o x y lc h i t o s a nn a n o s p h e r e s ，k m = 3 9 2 x 1 0 3 m o l l ，c o m p a r e d t o o r i g i nt r y p s i n k m = 3 4 0 x 10 - 3 m o l l t h a ti n d i c a t e dt h e a c t i v e t y o f b i n d i n g t os u b s t r a t en o th a v es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e t r y p s i nc o n t e n t so nc h i t o s a nm i c r o s p h e r e sh a v em o r es t a b i l i z eo n p h6 - 1 0 ，o p t i m a la tp h8 0 ，i m m o b i l i z e dt r y p s i nh a dh i 曲a c t i v i t y a t t e m p e r a t u r e a s8 0 。ca n da f t e r8 0 a l c o h o ld e n a t u r a n t ss t i l lh i g ha c t i v i t y t r y p s i nr e l e a s ep r o f i l e sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d ，u s et r y p s i nm i c r o s p h e r e s t o d i g e s t h e l ac e l l ，a f t e r7 d a yc u l t u r e ，n o n ep o l l u t i o nd e t e c t e d ，t h a t i n d i c a t e dt h em e t h e do fi m m o b i l i z t i o nw a saa s e p t i ct e c h n i q u e c e l lc u r v e a n dm t ti n d i c a t et h a tc h i t o s a nn a n o s p h e r e sh a v en oc e l lt o x i c i t y k e y w o r d ：c h i t o s a n ，d e r i v a t i v e o f c h i t o s a n ，m i c r o s p h e r e s ，t r y p s i n i m m o b i l i z t i o n ，c e l lc u l t u r e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 1 学位论文作者签名：弛日期：墨里幽 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 火学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：i 挝i 指导教师签名 日期：巡白蜘日期 学位论文作者毕业后去向： 工作单位 通讯地址 电话 邮编 1 前言 甲壳素( c m t i n ) 是n 一乙酰基一d 一氨基葡萄糖通过1 3 一( 1 ，4 ) 糖苷键 连接而成的直链多糖。每年生物合成近1 0 亿吨之多，是地球上含量仅 次于纤维素( c e l l u l o s e ) 的天然有机物。 1 1 壳聚糖 壳聚糖( c h i t o s h n ) 是甲壳素脱乙酰化的产物，化学名为b 一( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基一2 一脱氧一d 一葡聚糖，是由葡萄糖结构单元组成的直 链多糖，壳聚糖做为天然的高分子物质，具有良好的生物相容性、降解 性、极低的生物毒性，被大量用于工业、农业、医学、环保、生物工程 等领域。甲壳素经过化学修饰和改性，如烷基化、磺化、硝化、羧甲基 化、酰化等，可获得具有特殊性质和特殊用途的甲壳素系列衍生物，其 应用更加广泛。 在药物制剂方面，壳聚糖的应用倍受各国药学研究人员的关注。 尤其应用于缓释、控释制剂，已有了相当的研究深度和广度。随着生物 制药技术的迅猛发展，多肽和蛋白质类药物制剂的研究开发，日益得到 广泛的关注，对于壳聚糖如何用于蛋白质类、多肽类药物的制剂化，是 此领域的新兴热点，具有巨大的市场潜力。 岛”嬉。喻。培。 膊如象。乓。如a 。 鏊l ”。5 鏊上 澎。融。喻。婚。 壳聚糖( c h i t o s a n ) 1 2 壳聚糖衍生化产物 1 2 1 硫酸化壳聚糖： 壳聚糖通过氯磺酸一吡啶法可制得硫酸化壳聚糖低分子量 硫酸化壳聚糖为肝素类似物，具有较强抗凝血活性且无任何副作 用，硫酸化壳聚糖还能够抑制肿瘤细胞生长“1 ，具有抑制a i d g 病 毒的作用。 1 2 2 羧甲基化壳聚糖 垌 在碱性条件下，以一氯乙酸为改性剂，可制得n ，0 一羧甲基 壳聚糖，取代物由于具有优良的水溶性、乳化性、成膜性，吸水 性，能够在水溶液中形成凝胶。所以常被作为药物载体的辅剂。 羧甲基壳聚糖对金黄色葡萄球菌等具有极强的抑菌作用。1 。羧甲 基壳聚糖为多糖类物质，还可与某些肿瘤表面的多糖受体结合， 增加该类载体的肿瘤靶向性，羧甲基甲壳素在医药上用作免疫辅 助剂，能有效地诱导细胞毒性巨噬细胞和嗜中性白血球的积聚 【羽 2 3 羟乙基化壳聚糖 甲壳素或壳聚糖在碱性条件下与异丙醇一氯乙醇可进行羟乙 基化反应，可得到酰化度不同的壳聚糖。羟乙基壳聚糖具有良好的 水容性。具有诱导半抗原特异性抗体的免疫活性作用，并可以作为 血液相容性材料应用于医学实践中。能有效地增加巨噬细胞的吞噬 功能和水解酶的活性，通过增强机体非特异性免疫系统的功能而抑 制肿瘤生长激活巨噬细胞使其分泌多种免疫因子调节其他细胞免 疫与体液免疫“1 。 1 3 药物控释技术 药物缓释技术出现于8 0 年代，是通过对药物的可控释放的形式 产生适度的反应，较小的副作用和较长的疗效。近年来在医用高分子 领域内，高分子药物控制释放体系的研究和开发方兴未艾。所谓药 物控制释放体系就是将药理活性分子与天然或合成高分子载体结合 或复合，投施后在不降低原来药效及抑制副作用的情况下，以适当 的浓度和持续时间，导向集聚到患病的器官、细胞部位以充分发挥 原来药物疗效的体系。纳米控释给药系统是运用纳米技术，通过物 理、化学等方法改变制剂结构，使药物在预定时间内，自动按某一 速度恒速释放于靶器官和组织，并在较长时间内维持有效浓度的一 类制剂。纳米控释给药系统能延长药物载体的作用时间，能对肝、 脾以外器官进行靶向输送。 这种给药方式可以调节药物释放速度，减少给药次数，从而增 加了药物治疗的安全性、高效性和可靠性。因此，使一种药物高效的、 可预计的释放，并持续较长时间的疗效在临床上是很有意义的。其基 本方法为药物被缓释材料吸收或交联，通过控制多聚物的性能和降 解时问来调节药物的扩散。目前所应用的药物缓释材料是一些合成 的( 如p e g ，p v a ) 或天然的( 如褐藻酸钠、胶原、糊精等) 生物可降解材 料。壳聚糖壳聚糖衍生物有许多对人体有利的生物活性，如抗肿瘤 作用、免疫佐剂功效和促进组织修复及止血作用等。这些特点使壳 聚糖及其衍生物成为一种理想的药物缓释材料。 1 4 壳聚糖纳米控释系统 壳聚糖药物纳米控释系统是目前应用较多的药物缓释形式。包括 纳米粒子和纳米胶囊。它们是直径在1 0 5 0 0ni t l 之间的固态胶态粒 子，药物分子通过溶解、包裹作用位于粒子内部，或者通过吸附作用 附着于粒子表面。纳米级聚合物粒子作为药物传递和控释的载体。 是一种新的药物控释系统。它的主要特点是超微体积，能够直接作用 于细胞，1 _ ：以增加蛋白质、多肽类的药物稳定性，降低药物在体内 的副作用，延长药物疗效。正是由于纳米控释系统特有的性质，使其 在药物输送方面具有许多优越性。因而作为新的药物载运系统被广 泛应用。 而且近来的研究发现，壳聚糖可以附着到黏膜的表面，并能打开 上皮细胞的紧密联结，因此，从生物制药的角度来看，壳聚糖可以作 为大分子药物的载体促进这类分子通过组织上皮。f a r r a j 等验证了 加入壳聚糖的鼻用胰岛素，在羊体内可使血糖显著下降，血浆胰岛素 水平增加近5 倍“1 。对戈舍瑞林、亮丙瑞林、甲状旁腺素等肽类进 行透粘膜试验，也得到相近的结果，证明壳聚糖能促进多肽类、蛋白 质药物的透粘膜吸收”1 。 壳聚糖纳米控释系统在医药学方面主要应用包括： 1 4 1 1 蛋白类药物载体 由于形成壳聚糖纳米球的条件比较温和，这种药物运载系统适合 于对环境比较敏感的大分子，如牛血清白蛋白、破伤风类毒素、白喉 类毒素和胰岛素等。这类分子可以赢接加载到载体上，而且有高的加 载量，最高可以达到5 0 ，是目前纳米球中加载蛋白最多的一种。蛋白 质和壳聚糖纳米球的相互作用主要是离子相互作用，另外还包括疏 水相互作用、氢键等。体外的药物实验结果显示，释放率受到相关大 分子和壳聚糖相互作用力的影响，控制着药物的释放。y a s u h 等合成 了壳聚糖与yi g s r 的偶联产物( 酪氨酸一异白氨酸i l e 一甘氨酸一 丝氨酸一精氨酸序列的肽分子，类似于层粘连蛋白能够参与到肿瘤 细胞的侵入和转移过程当中，是一种具有高活性的抗肿瘤细胞转移 药物。) 药理实验结果表明，偶联物在抗肿瘤细胞的转移和侵入方面 都比单纯的肽分子活性提高m 。 p i t h a y a n u k u 等报道了阿糖胞苷( c y 2 t a r a b i n e ) 与壳聚糖通过己 二酸偶联形成前药，药理实验结果表明，载体在生理条件下表现出 良好的药物释放特性，抗肿瘤活性较阿糖胞苷增强，药物的毒副作 用显著减小”1 。 1 4 1 2d n a 载体 在基因转移领域已出现了基于壳聚糖的纳米球系统。同其他阳 离子多聚物一样，壳聚糖通过静电作用与d n a 的结合，这种相互作用 很强，使得壳聚糖与d n a 的复合物以结合的状态进入细胞内而且许多 证据表明，阳离子多聚物包埋的d n a 在细胞黏附和避免酶降解方面起 重要作用。m a o 通过在高速搅拌的条件下往壳聚糖溶液加入d n a 溶液 的方法，制备壳聚糖d n a 纳米球，并首次证明了壳聚糖d n a 的转染作 用”1 。r o y 研究表明，壳聚糖d n a 纳米球能够作用于h e x 2 9 3 、1 1 3 3 和t h e 细胞系，但转染效率低于脂质体，通过在纳米球中增加氯或在 球表面偶联铁传递蛋白、6 磷酸甘露糖不能提高转染效率，说明壳聚 糖纳米球是通过内吞作用进入细胞“。有关壳聚糖d n a 纳米复合物 动物学实验结果显示：通过鼻腔、口腔和气管途径给药壳聚糖d n a 纳 米球颗粒的转染率远高于裸露d n a 。“ 1 4 2 壳聚糖药物纳米控释系统根据制备组成成分的不同可分为： a 壳聚糖通过交联技术制各壳聚糖微球。 b 多糖与有机大分子辅剂混合成分构成壳聚糖微球( 如酸钠壳 聚糖纳米微球，明胶一壳聚糖共混球) 。 c 多糖或脂质覆盖的壳聚糖交联微球。 多糖覆盖的交联壳聚糖微球可通过离子化反应在微球上覆盖一 层离子多糖( 如羧甲基几丁质等) 的方法来制备。而脂质覆盖的 交联壳聚糖微球的制备则用溶剂蒸发法获得。其中离子多糖 和脂质多层覆盖的微球不但直径分散度较窄，而且可以提高其 稳定性，极大的提高其水溶性“3 1 。 1 5 壳聚糖纳米载体交联技术 1 5 1 现在已经报道制备壳聚糖纳米球方法主要包括 i 5 1 1 共价交联法 o h y a f 等于1 9 8 9 年首次报道了5 一氟尿嘧啶与壳聚糖衍生物“。采 用戊二醛为交联剂在水溶液对壳聚糖的游离氨基与药物进行交联， 制各壳聚糖纳米粒，作者研究了前体药物在3 7 下体外不同溶液介 质中释放5 一氟尿嘧啶的行为，证明载体对肿瘤细胞的亲和性明显提 高，。但是，戊二醛的细胞毒性以及对大分子药物的灭活作用使人们 致力于采用更温和的方法来制备纳米粒。 1 5 i 2 离子交联法 1 9 8 9 年，k o ，j a 等“”首次报道了离子交联法用于制备壳聚糖纳 米粒的实验研究。在壳聚糖溶液中，加入三聚磷酸盐( t p p ) 阴离子，利 用壳聚糖的游离氨基与t p p 阴离子发生分子间或分子内交联反应，从 而制备壳聚糖珠球状凝胶。由于该实验反应条件温和，不使用有机溶 剂，易于得到均一、可调整粒径范围的纳米粒( 1 2 0 i 0 0 0nm ) ，因此 在壳聚糖纳米粒的制备中得到广泛应用“”“。 6 1 。5 1 3 反相微乳法 反相微乳法( w 0 微乳法) 是由水、油和表面活性剂组成的热 力学稳定体系，其中水相被表面活性剂单层包裹形成微水滴分散于 油相中，通过控制微水滴的尺寸来控制超微颗粒的大小，因为在微水 滴生成的纳米颗粒的粒径可被微水滴的大小有效地限制。微乳技术 的关键是设计合适的体系制备微观尺寸均匀、可控、稳定的微乳液。 1 9 9 4 年，o h y a 等“”首次以反相微乳法进行了载药壳聚糖纳米粒的研 究。采用水油( w 0 ) 型乳化剂进行乳化，以戊二醛为交联剂对壳聚 糖的游离氨基进行交联，制备了5 氟尿嘧啶( 5 一f u ) 壳聚糖纳米粒。 由于共价交联法采取高浓度醛类以及其他交连剂络合的壳聚糖 复合物具有较强的细胞毒性，而离子交联法使用t p p 离子共沉淀的微 球稳定性差对p h 敏感，在高p h 缺乏稳定性，所以w 0 反相微乳法 制备纳米微粒是近年来较流行的方法之一。 本方法具有以下优点： 1 ) 壳聚糖纳米球的合成条件温和： 2 ) 球非常均一并可以调整大小( 1 0 2 0 0 nm ) 具有可以方便调 整的阳性表面： 3 ) 有很强的结合多肽、蛋白、疫苗寡核苷酸和质粒的能力： 4 ) 可以通过调整其组成来改变药物的释放率： 5 ) 冻干后复原可以保持球的完整性和药物成分的活力。“。“ 1 6 壳聚糖复合载体的成分组成和研究概况 壳聚糖载体固定化蛋白一般采取复合载体的形式。通过调节壳 聚糖与共混物的混合比例，共混物的种类改变载体的物理和化学性 质。调节药物释放时间和溶解性质从而建立可调控的药物控释体 系。 在国外m i c h a e lf r o i x 等研究了藻酸钠壳聚糖微球的的固定 条件和方法“，m a l m s t e n ，m a r t i n ：l a r s s o n ，a n d e r s 研究了缩水 甘油甲基丙稀酸盐的固定”。，g e n t a 研究了壳聚糖脂体微球的性质 ”“。d u n c a n r u t h 报道了壳聚糖、淀粉共混载体的研究“。 m u z z a r e l l i ，c ：c o s a n i ：t e r b o j e v i c h ，m 报道了环糊精、壳聚糖纳 米载体的研究= 2 。m i ，f w u l o n g 研究了p l g a 与壳聚糖混合微球的 性质( c h i l i n p l g ab l e n dm i c r o s p h e r e s ) 。b e n d i k i e n e 。“研究了 用壳聚糖的磁性衍生物为载体制备固定化胰蛋白酶，与非磁性载体 相比，发现磁性载体有较低的膨胀能力，良好的吸附能力，简化了分 离过程，固定化酶可以再生。 在国内肖厚荣”报道了以脱乙酰壳聚糖为载体，明胶包埋，戊 二醛为交联剂，对胰蛋白酶的固定化条件和固定化胰蛋白酶的性质 进行研究。刘利萍报道了。8 1 壳聚糖丝素复合磁微球的制备及体 外性质研究n o u a i m i ，m e r y e m 。”研究了在壳聚糖微球表面增加羧 甲基壳聚糖包被对于提高微粒溶解性，对提高药物活力具有明显的 作用。 g e n t ai d a ，p e r u g i n i 。“1 研究表面不同分子量壳聚糖混合能够有效 提高载体活性，小分予水溶性壳聚糖的加入，能够显著提高微球溶 解性，生物相容性。释药性质相对较快，且遵循准一级动力方程。 综上壳聚糖纳米粒作为一种新型的药物载体，具有无毒、良好 的生物相容性和生物可降解性，可提高药物的稳定性，改变给药途 径，增加药物的吸收，提高药物的生物利用度，降低药物的毒副作用 等特点：也可以缓释、控释、靶向释放药物，应用于药物的器官靶向、 提高d n a 转染效率、多肽蛋白类药物的非注射途径给药以及注射给 药的长效制剂研究等，因此具有非常广阔的应用前景。但壳聚糖仅 仅溶解于稀酸溶液，这在一定程度上限制了壳聚糖的应用范围，因 此需要对它进行结构修饰，扩大其应用范围。壳聚糖药物纳米控释 系统是可有效控制药物传递和控释的载体。而且壳聚糖、壳聚糖衍 生物本身具多种生物学活性，作为药物辅料和药物结合在一起将具 有双重的治疗效果。 1 7 研究意义 根据不同多肽类药物的结构特点，当多肽分子大于3n m 时需采用 具穿透增强能力的聚合物作为载体，而肽类在肠道内易被降解也需选 用有保护作用及粘附性质的聚合物。壳聚糖类聚合物具有内皮细胞穿 透性、溶涨保护作用及良好的生物粘附性。这些重要的性质决定了壳 聚糖载体可以用于药物载体的制备，具有良好的应用前景。 肿瘤细胞具有比正常细胞表面更多的负电荷，因此壳聚糖所带的 正电倚对肿瘤细胞表面具有选择性吸附和电中和作用。此外，壳聚糖还 具有直接抑制肿瘤细胞的作用，并通过活化免疫系统促进人体抗肿瘤 作用，从而与抗肿瘤药发挥协同作用。抗肿瘤药物同时对机体细胞也有 明显的毒性，因此需要增加药物靶向性和降低药物的副作用，所以壳 聚糖纳米药物控释载体对抗癌药物的研发有重要的意义。 目前国内外，尚未有关于壳聚糖纳米粒载体蛋白作用于细胞培养 的替代物的研究报道，建立一种可用于细胞培养技术的纳米控释载体， 研究无菌交联方法，以模式药物为样品，探讨交联技术对蛋白活性的 影响，以及对细胞生长状态的影响，是对进一步探讨载体技术对生物 机体影响的有益探索。 建立不同比例的壳聚糖与低聚易溶性材料混合微球体系，可调控 药物释放时间，提高药物的稳定性，改变给药途径，增加药物的吸收， 提高药物的生物利用度，降低药物的毒副作用。 本文利用改进的制备方法制备了壳聚糖衍生物，并有效的提高了 样品的收率和取代度，系统的研究了三种衍生物作为混合载体辅料的 理化性质。利用不同比例的样品和交联剂改进了载体的崩解性及物理 性质。 讨论了无菌条件下用于细胞培养的载体制备以及交联剂对细胞耐 受性的研究。利用模式蛋白讨论了改进的乳化交联法对酶活性的影 响，并检测了本方法固定化酶物理和化学性质。 2 试验材料 所用材料来源于青岛海洋大学制备，脱乙酰壳聚糖成品 1 分子量测定粘度法测量分子量1 5 0 ，0 0 0 2 脱乙酰度测定酸碱滴定法测定脱乙酰9 5 4 睨乙徽= 面篓舞葛 3 产品纯度测定灰度含量 0 5 1 0 3 结果分析与讨论 3 1 壳聚糖的化学修饰 3 1 1 羧甲基化壳聚糖的制各 n ，0 一羧甲基壳聚糖( n ，0 一c m c ) ： 取5 0 0 m g 壳聚糖通过碱化氯乙酸一异丙醇法制各羧甲基壳聚糖。 ( 1 ) 所得样品4 3 9 m g 收率8 7 8 ( 2 ) 分子量s e p h a d e xg 1 0 0 柱层析，分子量3 0 ，0 0 0 5 0 ，0 0 0 ( f i 9 1 ) ( 3 ) 羧甲基壳聚糖取代度 d e lt a2 3 2 0 2 s 型p h 计，采用电位滴定法进行测定，取代度 7 4 6 ( 4 )红外光谱( i r ) 测定结果，对比原壳聚糖色谱图f i g l 。 1 7 4 4 c m - 1 处为羧基上的羰基振动峰( n ，o - 羧甲基壳聚糖) ，由于基 团问相互作用的变化( 新出现羧基，羟基减少) ，特别是氢键的变化， 原壳聚糖的1 6 5 5c m 。1 和1 5 9 6 c m1 谱带合并到1 6 1 0c m - 1 。原壳聚糖 酰胺谱带1 3 1 7c m - 1 也发生了位移。，而1 6 1 0c m - 1 和1 4 2 0 c m l 谱带 明显增强，说明壳聚糖在n 位和( 或) 0 位不同程度引入了羧甲基。 ( f i 9 5 ) 3 1 2 磺化壳聚糖的制备 ( 1 ) 磺化试剂的制备以甲酰胺为反应介质，氯磺酸吡啶法制 备硫酸化壳聚糖，称取彻底干燥的壳聚糖样品3 0 0 m g 供磺化。得 硫酸化壳聚糖3 3 2 m g ，收率1 1 0 6 7 。 ( 2 ) 硫酸根含量测定离子色谱法( i c ) 离子色谱法( 1 c ) 测定得硫酸根含量3 3 9 5 ( 3 ) 分子量检测 s e p h a d e xg 1 0 0 柱层析分子量3 0 ，0 0 0 - - 8 0 ，0 0 0 。( f i 9 2 ) ( 4 ) 红外光谱分析 样品在3 4 1 9 c m l2 9 2 4 c m “1 6 3 5 c m “1 0 9 2 c m “6 1 1 c m l 处有壳聚 糖糖的特征吸收峰，原壳聚糖( 0 一h ) 谱带减弱，而”( c h ) 和 口( c 一0 ) 谱带均增强。同时还观察到到时1 3 0 5a m l 处出现了 硫酸根特征谱带。( f i 9 6 ) 3 1 3 羟乙基化壳聚糖的合成 碱性多糖于环氧乙烷冰浴法制各 ( 1 ) 羟乙基试剂的制备碱化一异丙醇一氯乙醇法，称取彻底干 燥的壳聚糖样品2 0 0 m g 供羟乙基化使用。得羟乙基壳聚糖1 7 4 m g ， 收率8 7 。样品为纯白色粉末状，比较均一。 ( 2 ) 分子量检测 s e p h a d e xg 1 0 0 柱层析分子量8 0 ，0 0 0 1 0 ，0 0 0 。( f i 9 3 ) ( 3 ) 红外光谱分析 样品在3 4 1 9 c m l2 9 2 4 c m l1 6 3 5 c m _ 11 0 9 2 c m l6 1 l c m - 1 处有壳聚 糖的特征吸收峰，可以得至o c h 2 的伸缩振动2 9 2 4a m l 和变形振动 1 4 5 3 c m 一1 ，1 4 1 0c m “非常突出。而口( c 一0 ) 谱带出现在1 1 1 2a m 1 和1 0 6 6c m 。这是由于羟乙基化壳聚糖的c 一0 键都是一c h 2 0 ，与原壳聚糖无异。3 4 0 5 c m 一1 有很强的吸收说明羟乙基化壳 聚糖保留了原壳聚糖同样数目的羟基。( f i 9 7 ) 1 2 3 2 纳米壳聚糖微球制备方法的比较和讨论 3 2 1 反相微乳法制各壳聚糖壳聚糖衍生物载体： 3 2 1 _ l 制备方法 3 0 m g 壳聚糖分别与l o m g 衍生化壳聚糖混合溶于l m l2 乙酸 溶液，以压力喷射至1 1 0 0 m l 液体石蜡反应介质中，超声波振荡， 使液滴充分分散。) j l l 入2 m l 戊二醛，l m l 十二烷基璜酸钠作为乳 化剂，制成网状微空壳聚糖载体，将微球分散于无水乙醇中备 用。冰浴4 | 。c 条件下加入抽滤灭菌的2 胰蛋白酶溶液2 m l ，冰浴 搅拌2 0 分钟后，) j n a 无菌l m l 4 戊二醛，l m l 4 乙醇胺交联剂 反应3 0 分钟，再加入5 羧甲基壳聚糖5 m l ，反应3 0 分钟。低温 高速离心，低温充n 2 干燥，得到胰蛋白酶壳聚糖载体微球。 3 2 1 2 样品物理性质： 样品羧甲基化壳聚糖壳聚糖载体为淡黄色粉末状，比较均一， 有少量大颗粒凝结。有极强的吸水性。 硫酸化壳聚糖壳聚糖载体色泽深，有少量黑褐色杂质 羟乙基化壳聚糖壳聚糖载体淡黄色，均一。 3 2 1 3 扫描电镜分析： 扫描电镜下对三种样品进行观察，样品分散系数好，样品 大小集中在1 0 - l o o u m 之间。 3 2 1 4 所得载体收率 表l 壳聚糖衍生物的收率 第一次第二次第三次平均收率 羧甲基化壳聚糖壳聚糖载体2 9 4 m g3 1 l m g2 9 9 m g 7 5 3 3 硫酸化壳聚糖壳聚糖载体 3 2 7 m g3 0 4 m g3 1 7 m g 7 9 羟乙基化壳聚糖壳聚糖载体2 9 7 m g3 3 4 m g3 2 5 m g 7 9 6 7 3 2 1 5 蛋白收率： 低温0 i m o l l 乙酸处理2 4 小时使载体完全溶解，6 8 0 n m 测定 溶液光吸收值，确定蛋白含量。 羧甲基化壳聚糖壳聚糖载体蛋白收率溶液a 原酶a ：2 9 3 硫酸化壳聚糖壳聚糖载体蛋白收率溶液a 原酶a = 2 4 7 羟乙基化壳聚糖壳聚糖载体蛋白收率溶液a 原酶a = 2 2 2 3 2 l 6 羧甲基外包被的检测 取包被羧甲基壳聚糖的硫酸化壳聚糖载体样品进行红外光 谱分析，对比硫酸化壳聚糖图谱，明显出现羧基的特征峰值，证明 在微球表面结合了一定量的羧甲基壳聚糖。证明本包被方法成功的 引入羧甲基化集团。根据l i t a 的关于两步法不同分子量壳聚糖混 合物制备载体方法报道，利用加入低分子量羧甲基壳聚糖能有效提 高载体水亲和力。 3 2 1 7 壳聚糖壳聚糖衍生物微球蛋白释放 水浴搅拌条件下，利用测定溶液中6 8 0 h m 紫外吸收值，测定 壳聚糖壳聚糖衍生物微球蛋白释放衄线，证明3 种样品的药物释 放比较均一，没有明显的暴释现象。 表2 壳聚糖壳聚糖衍生物微球蛋白释放 3 06 09 01 2 01 8 02 4 03 0 03 6 04 2 0 总 壳( a ) o 1 4o 2 7o 3 3 0 4 8 0 5 8o 7 40 8 4o 9 21 0 42 3 8 羧( a ) o 3 3o 4 50 5 0o 5 60 8 3 o 9 41 1 61 2 41 3 92 1 7 硫( a ) 0 3 4 o 4 8 0 5 8o 6 91 0 21 2 l1 3 21 3 91 4 81 9 4 羟( a )0 3 8 o 4 7 0 5 60 6 8 0 9 51 1 91 2 2i 3 41 4 52 0 6 壳为壳聚糖载体羧为壳聚糖羧甲基壳聚糖混台载体 硫为硫酸化壳聚糖壳聚糖载体羟为羟乙基壳聚糖壳聚糖载体。 3 2 1 8 壳聚糖壳聚糖衍生物微球主体崩解性的检测 以阿司匹林( 乙酰水杨酸) 为指示剂，与壳聚糖，壳聚糖衍生物混 合制各载体，检测微球崩解性，分别取5 m g 阿斯匹林，3 0 m g 壳聚糖分 别与l o m g 衍生化壳聚糖利用反相乳化法，制成壳聚糖载( 本体) 。分别 取上述包药微球2 0 m g 分散于2 0m lp h - 7 1 4 的磷酸盐缓冲溶液中， 恒温3 7 ，连续搅拌2 4h ，每隔一小时时间取出少量：悬浮液，离心分 离，用紫外分光光度计在2 8 0t i m 处测定溶液中阿斯匹林的浓度，用测 得的a 2 4 d 、时的a ，用所得的比值列表比较微球释药性能， 表3 载体崩解释放时间表 1 小时2 小时3 小时4 小时5 小时 6 小时 壳聚糖羧甲基l ：2 2 43 3 8 2 4 7 5 5 8 1 7 3 3 8 9 7 壳聚糖羧甲基l ：11 9 8 2 3 4 3 8 9 4 7 5 6 1 5 6 7 4 壳聚糖羧甲基2 ：11 1 4 1 6 5 2 2 8 3 1 9 4 2 7 5 1 o 壳聚糖羧甲基3 ：1 8 9 1 4 1 1 7 2 2 8 7 3 3 4 4 1 5 壳聚糖羧甲基4 ：14 1 8 8 4 1 4 8 2 2 7 2 9 7 3 3 4 结果可以看出随着壳聚糖含量比例的提高，微球的崩解的速度 变慢，二者基本成线性关系。这是由于壳聚糖分子量较大，不溶于水， 只是表面溶涨，所以阻碍了微球的释放，而羧甲基壳聚糖含量高时， 崩解速度明显加快，但是收率偏低。 表4 壳聚糖羧甲基比例与样品收率 1 ：2 l ：1 1 ：2l ：3l ：4 壳聚糖羧甲基收率5 5 2 6 3 4 6 7 4 7 3 4 8 2 1 壳聚糖羟乙基收率3 8 7 4 8 7 5 9 5 6 3 8 8 0 7 壳聚糖硫酸化收率3 3 2 4 2 3 5 4 9 6 9 2 8 1 4 由表4 可以看出随着壳聚糖羧甲基壳聚糖比值增大，载体的收率 有明显的提高，这是因为，硫酸化与羟乙基壳聚糖分子量小，极易溶 于水，在反复洗涤，溶解搅拌过程中，有较大的损失。羧甲基壳聚糖 具有极好的溶涨性和成膜性，在水中表面形成凝胶，所以损失较小。 但是总体的趋势是收率与壳聚糖的含量成正比。 壳聚糖壳聚糖衍生物的比例过高则颗粒变大，溶解性差，而且 释放周期长，崩解需要较长时间。比例过低则收率低，损失大。但是 溶解性有提高。所以通过调节壳聚糖壳聚糖衍生物的比例可以控制载 体崩解周期，提高药物利用率。 崩解时间也与戊二醛反应浓度，以及时间有关，本文采取了 e m i r b a k i 的方法，减少了与戊二醛作用时间，使样品能较快崩解，并 减少了样品中戊二醛的含量。从而有利于生物活性的检测。 3 2 1 9 壳聚糖壳聚糖衍生物交联性的检测 s d s p a g e 电泳 检测了胰酶与壳聚糖的交联度，证明了载体中无游离酶，载体酶 电泳无明显谱带，且显色区域发散，对比原酶有明显滞后，证明了所 有的载体蛋白都与壳聚糖，壳聚糖衍生物产生共价结合，载体通过缓释 作用，逐步释放酶分子。【1 2 1 部分酶结合小分子载体，在图谱上出现了 滞后于原酶的前锋带 3 2 1 1 0 壳聚糖壳聚糖衍生物与酶之间的相互作用 壳聚糖分子与酶分子之间通过在壳聚糖氨基和蛋白羧基之间的 共价键结合。而且分子之间存在多种相互作用，模式图如下： 0 h o hx h c 轼臼h f i g2 壳聚糖自身交跃模式 f i g3 壳聚糖与蛋白之间的作用 1 6 掣一 r，_，【 旷 ， 旷 备薯笋移 博一 舟 。甲o。-铲铲j多 型- 一o o d ， 唪 3 2 2 壳聚糖壳聚糖衍生物固定化酶的性质 3 2 2 1 米氏常数的测定 计算得出原酶的i c m = 3 4 0 x 1 0 一m o l l ， 羧甲基化壳聚糖壳聚糖载体的i g - n = 4 2 0 x 1 0 3 m o l l ， 硫酸基化壳聚糖壳聚糖载体的k m = 3