（生态学专业论文）山东近岸海域水体细菌多样性研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 逵；翅退直基宣壶墨犍别主明的：奎拦豆窒或其它教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：动番白 签字日期：2 0 l o 年多月；日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到：中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：强拖 签字日期：2 0 l o 年多月专日 导师签字：陟 签字日期：伊f 。年霸坫日 山东近岸海域水体细菌多样性研究 摘要 海洋细菌在海洋生态系统中有机物的生成和分解、海洋环境的修复以及有机 营养物质和能量循环的过程中占有重要的地位。本研究分别于2 0 0 6 年8 月( 夏 季) 、2 0 0 7 年4 月( 春季) 、2 0 0 7 年1 0 月( 秋季) 在山东近岸海域采集水体样品。 对胶州湾附近的s d l 站位和烟台近海海域的s d 2 站位水体细菌采用a r d r a 方 法分析细菌群落多样性和季节变化，为海洋微生物资源调查和海洋资源的开发和 利用提供有益数据。 在夏、春、秋三个季节，s d l 站位分别得到4 5 、3 0 和5 1 个不同的酶切图谱， 1 6 sr d n a 文库覆盖率分别为7 7 5 、8 5 o 和7 4 5 ；s d 2 站位分别得至1 j 4 2 、4 7 和 4 1 个不同的酶切图谱，1 6 sr d n a 文库覆盖率分别为7 9 o 、7 6 5 和7 9 5 。两个 站位的文库覆盖率均大于7 0 ，说明所构建的文库可以反映海洋环境中的细菌多 样性。 两个站位样品1 6 8r d n a 序列与数据库中序列比对的结果表明：s d l 站位海 水样品鉴定的细菌主要属于四个门类：变形杆菌门( p r o t e o b a c t c r i a ) 、蓝细菌门 ( c y a n o b a c t e r i a ) 、拟杆菌门( b a c t e r o i d e t e s ) 和浮霉菌门( p l a n e t o m y e e t e s ) 。其 中a p r o t e o b a c t c r i a 为该站位第一优势菌，其次为蓝细菌门( c y a n o b a c t e r i a ) 和拟 杆菌门( b a c t e r o i d e t e s ) 。s d 2 站位海水样品鉴定的细菌主要属于八个门类，包括： 变形杆菌f ( p r o t e o b a e t e r i a ) 、放线菌f ( a c t i n o b a c t e r i a ) 、拟杆菌f ( b a c t e r o i d e t e s ) 、 蓝细菌f - ( c y a n o b a c t e r i a ) 、疣微菌r ( v e r r u c o m i c r o b i a ) 、酸杆菌门( a c i d o b a c t e r i a ) 、 厚壁菌门( f i r m i c u t e s ) 和浮霉菌门( p l a n c t o m y c e t e s ) 。其中t 1 变形杆菌纲 ( a p r o t e o b a c t e r i a ) 为该站位第一优势菌，其次为丫变形杆菌纲和变形杆菌纲。 因此，s d 2 站位细菌多样性高于s d i 站位。 对两个站位三个季节细菌多样性及所占比例进行分析，结果表明：s d l 站位 和s d 2 站位优势菌种的种群组成和种群数量随季节均略有变化。 本研究两个站位中均发现未鉴定的细菌，说明山东近岸海域可能存在很多未 知的海洋新种，有待于进一步探讨研究。 关键词： 山东近岸；水体； 1 6 s r d n a ；细菌多样性 l l d i v e r s i t yo fb a c t e r i a lc o m m u n i t i e si nc o a s t a la r e a so f s h a n d o n gp r o v i n c e a b s t r a c t m a r i n eb a c t e r i ap l a yak e yr o l ei np r o d u c t i o na n dd e g r a d a t i o no fo r g a n i cm a t t e r s , t h eb i o r e m e d i a t i o ni nm a r i n ee n v i r o n m e n t s ，a sw e l la st h ee n e r g yf l o wa n dn u t r i e n t s c y c l i n g t oi n v e s t i g a t ed i v e r s i t ya n dc o m p o s i t i o no fb a c t e r i a lc o m m u n i t i e s ，s a m p l i n g w e r ec a r d e do u ti nc o a s t a l8 1 e a - go fs h a n d o n g p r o v i n c ed u r i n ga u g u s t o f 2 0 0 6 ( s u n u n e r ) ，a p r i lo f2 0 0 7 ( s p r i n g ) a n do c t o b e ro f2 0 0 7 ( a u t u m n ) u s i n ga r d r a 16 sr d n af r a g m e n t so fb a c t e r i aw e r ep c r a m p l i f i e da n d16 sr d n ac l o n el i b r a r i e s w e r ec o n s t r u c t e dt oi n v e s t i g a t eb a c t e r i a ld i v e r s i t ya n d c o m m u n i t yc o m p o s i t i o n a ts t a t i o ns d i ，t h en u m b e r so fp o s i t i v e sw h i c hh a v ed i f f e r e n te n z y m ed i g e s t i o n m a p sw e l e4 5 ，3 0 ，a n d5 1r e s p e c t i v e l y t h ec o v e r a g eo ft h et h r e el i b r a r i e sw e r c7 7 5 ， 8 5 0 a n d7 4 5 r e s p e c t i v e l y a tt h e 文a l l l et i m e ，i nt h es t a t i o ns d 2 ，t h en u m b e r so f p o s i t i v e sw h i c hh a v ed i f f e r e n te n z y m ed i g e s t i o nm a p sw g t e4 2 ，4 7a n d4 1r e s p e c t i v e l y t h ec o v e r a g eo ft h et h r e el i b r a r i e sw e r e7 9 o ，7 6 5 a n d7 9 5 r e s p e c t i v e l y t h e c o v e r a g eo ft h et w os t a t i o n s l i b r a r i e sw e r ea l la b o v e7 0 ，s ot h e s el i b r a r i e sc a n r e f l e c tt h eb a c t e r i a ld i v e r s i t yi nt h em a r i n ee n v i r o n m e n t d i v e r s i t yo fb a c t e r i a lc o m m u n i t yw a sh i g h e ra ts t a t i o ns d 2t h a ns d i f o u rm a i n l i n e a g e s ，p r o t e o b a c t e r i a , c y a n o b a c t e r i a , b a c t e r o i d e t e sa n dp l a n c t o m y c e t e s ，w e r e i n v e s t i g a t e da ts d1 ，c o m p a r e dw i t ht h ep u b l i s h e ds e q u e n c e si ng e n b a n kd a t a b a s e a n dg u i d e db yt h ep h y l o g e n e t i ct r e e o t - p r o t e o b a c t e r i ad o m i n a t e dt h ec o m m u n i t ya t s d i ，f o l l o w e db yc y a n o b a c t e r i aa n db a c t e r o i d e t e s e i g h tm a i n l i n e a g e s ， p r o t e o b a c t e r i a , a c t i n o b a c t e r i a , b a c t e r o i d e t e s ，c y a n o b a c t e r i a , v e r r u c o m i c r o b i a , a c i d o b a c t e r i a , f i r m i c u t e sa n dp l a n c t o m y c e t e s ，w e r ed e t e c t e da ts t a t i o n s d 2 a p r o t e o b a c t e r i ad o m i n a t e dt h ec o m m u n i t ya ts t a t i o n s d 2 ，f o l l o w e db y 丫- p r o t e o b a c t e r i aa n d p r o t e o b a c t e r i a t h ec o m p a r a t i v ea n a l y s i so fb a c t e r i a ld i v e r s i t ya n dt h ep e r c e n t a g eo fb a c t e r i a p o p u l a t i o n si nt h et w os t a t i o nw a sm a d e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t ht h ep o p u l a t i o n c o m p o s i t i o na n dp o p u l a t i o nq u a n t i t yo ft h ed o m i n a t e db a c t e r i u mv a r i e ds l i g h t l yb y s e a s o ni nt l l es t a t i o ns d la n ds t a t i o ns d 2 u n k n o w ns p e c i e sw e r ed e t e c t e da tt w os t a t i o n s ，i n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r es t i l l m a n yi a l l k n o w l li l e ws p e c i e si nt h em a r i n ei ns h a n d o n gc o a s tl i n e k 吖w o r d s ：s h a n d o n g c o a s tl i n e ；s e a w a t e r ；, 1 6 sr d n a ；b a c t e r i a ld i v e r s i t y 山东近岸海域水体细菌多样性研究 目录 第一章前言1 1 1 海洋微生物多样性简述1 1 2 海洋细菌多样性研究简述3 1 2 1 海洋细菌的分布特征3 1 2 2 海洋细菌的多样性研究进展4 1 2 3 我国海域海洋细菌多样性研究现状7 1 2 4 海洋细菌在海洋生态系统中的作用8 1 3 调查海域地理位置及海水概况1 1 1 3 1 山东海域地理位置及海水概况1 1 1 3 2 胶州湾海域地理位置及海水概况1 2 1 3 3 烟台海域地理位置及海水概况1 2 1 4 本论文的课题来源及研究思路、目的和意义13 参考文献15 第二章山东近岸海域水体细菌多样性研究2 2 2 1 材料与方法：2 2 2 1 1 研究海域及样品采集一2 2 2 1 2 大肠杆菌及样品总d n a 的提取及回收2 3 2 1 3 细菌1 6 sr d n a 克隆文库的构建2 8 2 2 结果与分析3 1 2 2 1 水样d n a 提取结果3 1 2 2 21 6 sr d n a 片段的p c r 扩增3 2 2 2 3 样品1 6 sr d n a 基因文库的构建及筛选3 2 2 2 4 阳性克隆子1 6 sr d n a 酶切结果分析3 3 2 2 51 6 sr d n a 克隆文库的分析4 3 2 2 6 细菌1 6 sr d n a 序列分析4 3 2 3 讨论4 6 2 3 1s d i 站位水体细菌群落组成及季节变化特征4 6 2 3 2s d 2 站位水体细菌群落组成及季节变化特征4 8 2 3 3s d l 和s d 2 站位水体细菌群落组成及季节变化比较5 0 2 4 总结5 2 l ! 里塑堂奎兰堡主堂垡笙奎 2 5 展望5 2 参考文献5 4 附录5 9 2 山东近岸海域水体细菌多样性研究 第一章前言 海洋作为最大、最具生产力和多样性的生态系统之一，占据了地球7 0 的表 面积，为各种生物有机体特别是海洋微生物提供了广阔的栖息地。由于海洋复杂 多变的特殊环境及丰富多样的营养和能量循环，导致了海洋微生物丰富的种群多 样性、基因组成多样性和生态功能多样性( 薛超波，2 0 0 4 ) 。海洋微生物被人们 广泛应用于医学治疗、海洋环境的生物修复，以及生物活性物质的提取、生物材 料的开发利用等各种领域，具有重要的商业、医学和科研价值。加强对微生物多 样性的研究与利用，对提高人类生存环境和生活质量都具有重要意义。 1 1 海洋微生物多样性简述 海洋微生物种类繁多，数量庞大，尽管其个体微小，不易被人发现，但是它 们却无处不在，分布于海洋世界的各个角落。2 0 世纪7 0 年代末，美国伊利诺斯 大学的c r w o c s c 等人对大量微生物的16 s 和18 sr d n a 进行研究，将微生物划 分成与以往各种界级不同的新系统，称为“三域学说”( 图1 - 1 ) ，即：细菌域 ( b a c t e r i a ) 、古生菌域( a r c h a e a ) 和真核生物域( e u k a r y a ) 。 中国海洋大学硕士学位论文 图1 1 “三域学说”系统进化图谱 f i g 1 1p h y l o g e n e t i ct r e eo f t h r e ed o m a i n st h e o r y 从人们对生物界级的分类中可以看出，微生物在所有界级中具有最宽的领 域，而细菌也是其中十分重要的一员。目前发现的海洋微生物大约有1 0 0 万到2 亿种( 李艳华，2 0 0 3 ) ，它们具有不同的形态学、生态学和生理学特征，主要包 括细菌、病毒、单细胞生物和真菌。海洋微生物主要类群及代表菌种见表1 1 ( 薛 超波，2 0 0 4 ) 。 表1 - 1 海洋微生物的主要类群 t a b l e l 1c l a s s i f i c a t i o no f m a r l n em i c r o o r g a n i s i l l s 非细胞类生物：病毒v i r u s e s 古细菌a r c h a e a 化毹自养菌：产甲烷细菌m e t h a n g e n s ；嗜热酸细菌t h e r m o a c i d o p h i l e s a 化能异养菌：嗜盐细菌h a l o p h i l e s 2 山东近岸海域水体细菌多样性研究 细菌b a c t e r i a 光能自养菌 厌氧光合菌：紫色光合细菌和绿色光合细菌( 红菌螺目r h o d o s p i r l l a l e s ) 有氧光合茵：蓝细菌c y a n o b a c t e r i a ( 蓝细菌目c y a n b a c t e r i a l e s ) 原绿植物茵p r o c h l o r o p h y t e s ( 原绿菌目p r o c h l o r a l e s ) 化能自养菌：硝化细菌( 硝化杆菌科n i t r o b a c t e r a c e a e ) ：无色氧化硫细菌； 甲烷氧化菌( 甲烷球菌科m e t h y l o c o c c a c e a e ) 化能异养菌 革兰氏阳性菌：产内孢棒状菌和球状菌：不产孢棒状菌；不产孢球状菌( 微球菌科 m i c r o c o c c e a e ) ) 放线茵( 放线菌i i la c t i n o m y c e t a l e s ) 及其相关菌 革兰氏阴性菌：棒状菌和球状菌，好氧菌( 假单孢菌科p s e u d o m o n a d a c e a e ) ；兼性 菌；弧菌科( v i b r i o n a c e a e ) ：厌氧茵( 还原硫细菌) ；滑动细菌，螺 旋菌 真核生物e u c a r y a 光合自养菌：微藻m i c r o a l g a e 化能自养菌 原生动物f - 鞭毛藻f l a g e l l a t e s ；阿米巴a m o e b a e ；纤毛虫c i l i a t e s 真菌：高等真菌：子囊菌门a s c o m y c o t a ) 担子菌门b a s i d i o m y c o t a 低等真菌：壶菌门c h y t r i d i o m y c o t a ) 接合菌门z y g o m y c o t a 1 2 海洋细菌多样性研究简述 1 2 1 海洋细菌的分布特征 海洋细菌是海洋微生物中重要的一员。海洋细菌分布广、数量大、种类多， 又因其是海洋生物圈中重要的生产者和分解者，具有多样的新陈代谢机理和复杂 中国海洋大学硕士学位论文 菌数量大于远海海域，特别是港口、河口、湾内的细菌数量尤为突出；表层水细 菌数量多于深海区，细菌数量随深度的增加逐渐减少。这些分布规律与海洋细菌 嗜盐性、嗜压性、低营养性、趋化性与附着生长的生理生态特性相辅相成。因此， 研究海洋细菌的生物多样性和分布规律是一项复杂而艰巨的工作。 1 2 2 海洋细菌多样性研究进展 对海洋细菌多样性的研究开始于2 0 世纪4 0 年代，当时的研究主要基于传统 微生物的分离和纯培养，根据其形态学及生理生化特征对细菌进行描述及分类鉴 定。但是，绝大多数的海洋微生物是不可培养的，通过传统方法分离鉴定的海洋 微生物大约仅占估计种的1 - 5 ( a m a n ne ta i ，1 9 9 5 ) ，而且海洋水体细菌可培 养率仅为0 0 1 - 0 1 ，因此造成海洋微生物资源的严重丢失。另外，实验室培 养基条件与实际环境不相符，从而导致过高估计细菌种群的结构与数量( c u l l e ne t a 1 ，19 9 7 ) ，难以保证其准确性与科学性。 2 0 世纪7 0 年代后，生物标记物的方法在细菌多样性研究领域逐渐兴起。该 方法是以标记物的特定结构来标记特定类群的细菌，从而达到细菌分类鉴定的目 的。此技术的应用使细菌鉴定结果更加准确、可靠，但是只能将细菌粗略分为几 大类群，不能具体到属或种，限制了细菌分类的进一步研究。 2 0 世纪8 0 年代以来，随着分子生物学和基因组提取技术的不断发展，细菌 多样性的研究逐渐进入了分子生物学阶段。核酸序列的保守性与可变性( 雷正瑜， 2 0 0 6 ) ，确保了种属鉴定的准确性与可行性。目前，1 6 sr d n a 是细菌鉴定中最常 用的核酸序列，1 6 sr d n a 序列存在于所有细菌中，长度适中，包含交替分布的 保守序列和可变序列( 图1 2 ) ( 贾俊涛，2 0 0 3 ；) ，并且其序列变化特征与进化距 离一致( 陈文新，1 9 9 8 ；雷正瑜，2 0 0 6 ) 。加之国际基因数据库( g e n b a n k 、e m b l 、 d d b j 、r d p i i 等) 的日趋丰富与完善，结合p c r 技术和测序技术，构建1 6 sr d n a 文库即可确定细菌的分类水平，准确反应细菌种群之间的进化与亲缘关系。 4 山东近岸海域水体细菌多样性研究 5 v lv 2v 3v 4v 5 v 6v 7v 8v 9v i o3 s 4 0 b p9 7 0 b p 1 5 4 0 h p v 图l - 21 6 sr d n a 基因 f i g 1 - 21 6 sr d n ag e n e 近年来，在细菌多样性研究中较为成熟且应用广泛的分子生态学方法有：1 6 s r d n a 文库构建、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r c s i s ，d g g e ；t c 釉p e r ：撒玳g r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) ( m u y z e r e ta ，1 9 9 3 ) 、限制酶切片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m s ，r f l p ) ( b u r k e le ta 1 ，2 0 0 2 ) 、末端限制性内切酶酶切片段长度 多态性分析( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，t - r f l p ) ( l i u e ta 1 ，1 9 9 7 ) 、单链构象多态性分析( s i n g l es t r a i nc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ， s s c p ) ( l e ee ta 1 ，1 9 9 6 ) 、随机扩增多态d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a ，r a p d ) ( h a d r y s e ta 1 ，1 9 9 2 ) 、扩增片段长度多态性技术( a m p l i f i e df r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) ( v o se ta 1 ，1 9 9 5 ) 、扩增核糖体d n a 限制性分析 ( a m p l i f i e dr i b o s o m a ld n a r e s t r i c t i o na n a l y s i s ，a r d r a ) ( f r i e se ta 1 ，19 9 7 ) 和分子杂交分析技术等。这些方法各有优点和不足，因此也往往采用多种技术结 、 合使用的方法，确保细菌分类的科学性和有效性。 目前，基于1 6 sr d n a 测序技术对海洋细菌的研究表明，全世界超过7 5 的 海洋细菌属于以下九大种群：r o s e o b a c t e r ( a p r o t e o b a c t e r i a ) 、s a r ll 5 里塑鲎奎兰堡主堂篁堡奎 一 ( 洳b a c t i e t i a ) 、s a r ll6 ( n p r o t e o b a c t e r i a ) 、s a r 8 6 ( t - p r o t e o b a c t e r i a ) 、 a c t i n o b a 阳i a 、p i c o p h y t o p l a k t o n 、s a r 2 0 2 ( g r e e nn o n s u l f u r b a c t e r i a ) 、s a r 3 2 4 ( 6 - p r o t e o b a c t 硎a ) 和s a r 4 0 6 ( m u n n ，2 0 0 4 ；g i o v a n n o n i ，2 0 0 5 ) 。在这九大种 群中，绝大多数为不可培养细菌，只有少数几个种群包含可培养细菌，如 i b s e o b a c t e r 、p i c o p h 如p l a l n 和s a r i 1 ( m u m ，2 0 0 4 ：g i o v a n n o n i ，2 0 0 5 ) 海洋细菌多样性的研究已经从传统的描述性阶段发展到现在的分子生物学 阶段，因此，对于细菌多样性的研究和认识也随之进一步深入。在过去的几十年 中，多样性研究的发展与进步是有目共睹的，从基本的形态学、生理学特征描述 到基因水平的群落结构与功能研究( 图1 - 3 ) ( 李秋芬，2 0 0 7 ) ，细菌多样性研究 经历了质的飞跃。在研究细菌种群组成的同时，结合其生物地球化学功能、稳定 性和弹性之间的关系，以及各细菌种群在海洋环境中的应急机制等进行深入探讨 ( 李秋芬，2 0 0 7 ) ，为人类全面认识和保护海洋生态系统提供了重要的科学依据。 传统分类学和鼻 藩特征研究方法 t n d i t i o n a l t z z o n o m y 瑚 c o m m u n i t y e l m l m i z s f i o a 曩代和将来的分 类和器落犄征研 究方法 l d o l k r nu d f u t u m m p p r o m c l m s t o t a x o n o m ya n d a 衄u n i t y t h c “譬如土i a 曩 天然t 生钧爵体 n a t u r a la s s v m b l a l 睁 o f m i a d 雠g - n i 删 懒i s o l a t i o 舳n a n d 骗c u l t a r c o fi n d i v i d u a lt a z al ，1 1刁 形态特征 l 9 7 ) 。目前，已知的细菌种类 占估计种的比例仅为5 ( 杨永华，2 0 0 0 ) ，并且研究表明在自然环境中，大约 有9 9 的环境细菌在实验室条件下是不可培养的( t o r s v i ke ta 1 ，1 9 9 0 ； d y k h u i z e n ，1 9 9 8 ) 。这些非培养细菌通常集结在一起，形成一群，与现在已经 获得培养和鉴定的细菌自然分开，由于某些原因尚未获得纯培养( 戴欣，2 0 0 1 ) 。 本研究发现s d l 站位中绝大多数细菌为非培养细菌，与赫崇波( 2 0 0 8 ) 等对大 连湾和辽东湾海水细菌多样性的研究结果一致。这一结果表明，该站位海水样品 中可能存在较多特有的微生物种群，有待于进一步研究。 6 变形菌是该站位的特有菌群。该细菌属于有机化能营养菌，多数为硫酸盐 还原细菌( s p a ) ，能够参与硫代谢反应，厌氧降解很多海洋环境中的有机污染物， 对海洋环境的监测和修复具有重要意义。 4 7 中国海洋大学硕士学位论文 c 1 w 图2 1 3s d l 站位海水样品细菌多样性的季节变化 f i g2 - 1 3s e a s o n a lv a r i a t i o no f b a c t e r i ad i v e r s i t yi n t h ew a d 睨 o f s t a t i o ns d i 2 3 2s d 2 站位水体细菌群落组成及季节变化特征 s d 2 站位各季节及总体的细菌菌落组成和多样性季节变化如图2 1 4 所示。结 果表明g t 变形菌纲为该站位的优势种群，其次分别为t 变形菌纲和变形菌纲， 与白洁等( 2 0 0 9 ) 对黄海北部海域水体细菌多样性的研究结果相符，并且再一次 证实了众多国内外研究结论：变形菌门细菌特别是其中的a 变形菌纲、丫变形菌 纲细菌在海洋种群结构中占有优势地位( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 7 ；t o e se ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 从各季节细菌群落比例上看，本站位夏季优势菌种依次为小变形菌纲、放线 茵( a c t m o b a c t e r i a ) 和p 变形菌纲细菌；春季为小变形菌纲、7 变形茵纲和 变形菌纲细菌；秋季为r - 变形菌纲、变形菌纲和a 一变形菌纲细菌。由此可见， 该站位优势菌种的种群组成和种群数量随季节均略有变化。 小变形菌可以进行光合作用，并能参与c l 化合物的代谢，有些种类的还可以 与植物或者动物共生，在海洋生态系统的c 、n 循环中发挥重要作用。在本站位 鉴定的阳性克隆子中，c 2 w - 1 0 0 克隆子与分离自地中海西北部表层海水的细菌 山东近岸海域水体细菌多样性研究 t h a l a s s o b a c u l u ms a l e x i g e 瑚s p n o v 具有较高的同源性( u r i o se ta 1 ，2 0 1 0 ) ，该 种为刚发现的海洋细菌新种，在本站位的发现说明该种在我国山东近海海域也有 广泛分布。克隆子d 2 w - 18 0 与北冰洋深海中的q 变形菌亲缘关系较近( g a l a n de t a 1 ，2 0 0 9 ) ，表明该菌种可以同时适应近岸海域与深海水体环境。另外，p r a b a g a r a n ( 2 0 0 7 ) 等人对乌斯怀亚，阿根廷和亚南极洲采集的海水中细菌进行研究，本站 位中c 2 w - 3 、c 2 w - 1 3 和c 2 w - 9 3 克隆子均与其研究的细菌具有较高同源性。 y 变形菌纲的细菌可以在不同类型、不同浓度的碳源下迅速繁殖，因此常成 为富营养培养条件下的优势菌( e i l e r s ，2 0 0 0 a ) 。克隆子c 2 w - 1 8 8 与e i l e r s ( 2 0 0 0 b ) 分离自德国北海的丫变形菌纲的s a r 8 6 种群具有较高同源性。p a i s s 6s 等人( 2 0 0 8 ) 对法国b e r r e 湖的细菌进行研究，该湖水长期有石油污染现象，本站位中c 2 w 二1 2 3 克隆子与此湖中的细菌有亲缘关系，推测s d 2 站位可能存在石油或者其他烃类化 合物污染现象。f r e i t a g ( 2 0 0 3 ) 等在研究海洋沉积物氨代谢情况时发珊变形菌 能够参与厌氧氨氧化过程。本研究在水体环境中也发现了大量的丫一变形菌，表明 该种群可能与水体环境中的物质代谢和能量流动密切相关。 变形菌纲种属分类较少，主要是与动物共生的一些类群( 李友训，2 0 0 8 ) 。 c 2 w - 1 3 5 和c 2 w 0 1 5 1 克隆子均与发现于德国北海的弯曲杆菌科 ( c a m p y l o b a c t e r a e e a e ) 弓形杆菌属( a r c o b a c t e r ) 细菌具有亲缘关系( e i l e r se ta 1 ， 2 0 0 0 b ) 。弓形杆菌常在动物和动物食品中检出，在世界范围内各种类型的水体环 境中均有分布，如海水、地表水、淡水等( d i e r g a a r d t ，2 0 0 4 ；l e h n e r ，2 0 0 5 , 许 小红，2 0 0 9 ) 。也有研究表明弓形杆菌属细菌是城市污水中的优势菌种( 吴春笃， 2 0 0 8 ；许小红，2 0 0 9 ) ，说明该菌属适应性和分布性较强，且具有较高的耐污力。 放线菌门、疣微菌门、酸杆菌门和厚壁菌门是s d 2 站位的特有菌群。放线 菌在海洋水环境和沉积物中均有报道( i n a g a k ie ta 1 ，2 0 0 6 ；c h i k e r ee ta 1 ，2 0 0 9 ) ， 其个体微小，常生存于极限环境中( u r s e le ta 1 ，2 0 1 0 ) ，能参与有机质的分解 和矿化作用。为保证特殊环境下的生存能力，放线菌已发展出很多特殊的代谢模 式，如：某些种属放线菌可以高效去除无机氰化物，有的还可从某些菌种中分离 抗生素等生物活性物质。因此，放线菌具有重要的海洋污染环境的修复作用和微 生物资源的开发价值。该种群多见于高温地热区域( n o r r i se ta 1 ，2 0 0 2 ；l o p e ze t a 1 ，2 0 0 3 ) ，但是在次北极地区的白令海沉积物与本研究s d 2 站位夏季样品中 4 9 中国海洋大学硕士学位论文 均发现该种群的存在，说明在放线菌中同时存在存在嗜( 适) 冷性与嗜( 适) 热 性细菌( 邹扬，2 0 0 9 ) 。 a2w(2w 图2 1 4s d 2 站位海水样品细菌多样性的季节变化 f i g2 14s e a s o n a lv a r i a t i o no fb a c t e r i ad i v e r s i t yi nt h ew a t e ro fs t a t i o ns d 2 p r o t e o b a c t e d a o y - p r o t e o b a c t e d a e - p r o t e o b a c t e d a 口c y a n o b a c t e r l a i i v e r r u c o m l c r o b l a 争p r o t e o b a c t e r i a 叠f l a v o b a c t e r l a 口f i r r n l c u t e s b a c t e r o i d e t e s b a c j d o b a c t e r l a p l a n c t o m y c e 协9 b a c t i n o b a c t e d a 口u n i d e n t i f i e db a d 酸杆菌和疣微茵绝大多数为非培养细菌，只有通过分子生物学方法才能鉴定 出来。我国近岸海域对这两种菌的研究报道较少，基本都发现在黄渤海海域沉积 物中( 肖慧，2 0 0 9 ；白洁，2 0 0 9 ) ，酸杆菌具有较高的遗传和代谢多样性。厚壁 菌门常见于近海和浅海沉积物中，在天津近海、宁波北仑港、黄海北部等近海水 体以及高盐水体中均有发现( 陈义光，2 0 0 7 ；白洁，2 0 0 9 ；郭非，2 0 0 9 ：刘兵， 2 0 0 9 ) 。肖慧等( 2 0 0 9 ) 在对本站位沉积物多样性的研究中均发现酸杆菌、疣微 菌和厚壁菌的存在，说明水体环境与沉积物细菌种群之间可能存在一定的相互联 系和影响，还有待于进一步研究探讨。 2 3 3s d i 和s d 2 站位水体细菌群落组成及季节变化比较 s d i 和s d 2 站位细菌多样性在群落组成和数量上都具有一定的差别，且两 山东近岸海域水体细菌多样性研究 个站位的季节变化也各有特点。s d l 站位共发现8 个细菌种群，其优势菌为洳 变形菌纲细菌，其次分别为蓝细菌门和拟杆菌门细菌，6 变形菌纲为该站位特有 种群。s d 2 站位共发现1 1 个细菌种群，其优势菌为a 变形菌纲细菌，其次分别 为y 变形菌纲、变形菌纲和放线菌门，放线菌门、疣微菌门、酸杆菌门和厚壁 菌门为该站位特有种群。因此，从细菌种群组成上看，s d 2 站位的细菌多样性高 于s d i 站位。另外，s d i 站位的非培养细菌和未鉴定细菌的数量远大于s d 2 站 位，说明s d l 站位中可能蕴藏着更多的未知的海洋新种，有待于我们进一步鉴 定。此外，在两个站位中仍然存在很多共有的种群：p 变形菌纲、变形菌纲、 拟杆菌门、蓝细菌门和浮霉菌门。 r e nj 等( 2 0 0 6 ) 对胶州湾细菌多样性的研究发现，胶州湾普遍存在蓝细菌， 本研究在s d l 和s d 2 站位均发现了蓝细菌，与该结论相符。a 2 w - 1 7 7 克隆子与 分离自印度洋红海的聚球蓝细菌属( s y n e c h o c o c c u s ) 亲缘关系相近( f u l l e re ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。蓝细菌通过同化c 0 2 生成0 2 ，在好氧条件下固氮，而在黑暗中通过厌 氧呼吸还原硫，因此在海洋生态系统的碳、氮、硫循环中发挥重要作用，是海洋 初级生产力的重要组成之一( 白洁，2 0 0 9 ) 。 浮霉菌一般在淡水中大量存在( 孙鑫鑫，2 0 0 9 ；吴兰，2 0 0 9 ) ，但是在高盐 水体、海洋和深海环境中也均有发现( f u e r s t ，1 9 9 5 ；林曦，2 0 0 7 ；王鹏，2 0 0 8 ) 。 克隆子a 2 w - 1 6 1 与w a l s h 等人( 2 0 0 9 ) 研究促成海洋死亡区的微生物时发现的 细菌有亲缘关系，有研究表明该种群与深海有机质的矿化有关( s c r e n s c n ，2 0 0 5 ) 。 拟杆菌门在两个站位克隆文库中均有分布，其中s d i 和s d 2 站位中各有一 个克隆子属于黄杆菌纲。黄杆菌是淡水和海水环境中的常见菌群，对碳源的利用 能力较强，能有效分解d n a 、几丁质等生物大分子，并能参与多环芳烃的生物 降解( 雷萍，2 0 0 4 ) ，是海洋碳循环中的重要功能菌群。a 2 w - 1 8 9 克隆子与德 国北海海域的f l a v o b a c t e r i u ms p 具有较高同源性( a l o n s oe ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 v i e i m 等( 2 0 0 8 ) 对不同富营养化程度的入海口水体的细菌分析表明，拟杆 菌门和厚壁菌门细菌数量会随水体营养浓度的升高而增加。b 变形菌在富营养化 水体中具有污染物降解能力。在s d 2 站位中，厚壁菌门细菌是该站位特有细菌， 拟杆菌门和p 变形菌纲夏、春季的细菌数量均高于s d i 站位，初步推断s d 2 站位 富营养化程度高于s d l 站位。可能因为s d i 站位位于胶州湾内，远离陆地，仅受 中国海洋大学硕士学位论文 船只进出扰动水体的影响，人为影响较小，而s d 2 站位靠近陆地，且为人工养殖 区，水体易受到污染( 肖慧，2 0 0 9 ) ，因此推断s d l 站位水质优于s d 2 站位。 海洋复杂多变的特殊环境，孕育了数量巨大，种类繁多的海洋细菌。目前， 我们对于海洋细菌的种群信息还知之甚少。本研究在s d i 和s d 2 站位均发现有未 鉴定的细菌存在，说明海洋中还蕴藏着很多我们未知的新种。加强海洋微生物多 样性的探讨研究，加快海洋微生物研究进展，对于海洋生物资源和生态环境的合 理保护与