（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕凋亡相关基因2的研究.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 家蚕凋亡相关基因2 的研究 摘要a l g 一2 是一种2 2k d 的胞内c a 2 + 结合蛋白，属于p e f 手型蛋白家族并拥有螺 旋一环一螺旋式的c a 2 + 结合结构域。它是由p v i t o 等在1 9 9 6 年通过“d e a t ht r a p ” 分化呈示法所发现的与凋亡相关的蛋白。在鼠组织中，a l g 一2 是一个广泛表达的 蛋白，其表达量最高的器官为胸腺和肝脏。实验表明，在由t c r 、f a s 和糖皮质激 素所诱导的t 细胞凋亡过程中，a l g - 2 起了关键性作用，因为a l g - 2 的损耗可阻碍 该凋亡过程，但当它过表达时则可显著加强这些诱导因素的作用。我们在对家蚕 蛹c d n a 文库测序中，发现一个新的编码家蚕a l g 一2 蛋白基因的c d n a 序列，以此 序列为信息探针检索家蚕e s t 数据库，获得一个凋亡相关基因一2 的c d n a 全序列。 该基因全长为6 9 7 b p ，由5 3 4b p 的开放阅读框序列( o r f ) 、1 1 7 b p 的57 端非翻译 区序列( 5 7 u t r ) 禾1 4 6b p 的37 端非编码区序列( 3 7 u t r ) 组成。由0 r f 编码的1 7 7 个氨基酸序列与其他真核生物间具有较高的同源性。根据该序列，预测其分子量 为2 0 6 1k d ，等电点为4 9 7 。 r t p c r 扩增a l g 2 基因完整的o r f ，并将其克隆到融合表达载体p e t 一2 8 a 术h 应的酶切位点上，成功得到融合蛋白表达质粒p e t 2 8 a b m a l g 。2 。将其转化大 肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，口t g 诱导后裂解菌体进行s d s p a g e 分析，在2 4k d 处有一条 明显的蛋白条带，与预期大小相符。约半数融合蛋白以可溶性的形式存在，超声 波裂解菌体后，采用亲和层析纯化融合蛋白h i s 6 一b m a l g 2 。以该融合蛋白为抗 原免疫两只雄性新西兰兔制备了该重组蛋白的多克隆抗体，e l i s a 检测该抗体血 清的效价可达到1 ：1 2 0 0 0 以上。w e s t e m e n 迹实验呈阳性并发现在b m 5 细胞中也 有特异性条带，进一步证实了多抗的特异性。亚细胞定位结果表明，a l g 一2 在家 蚕细胞b m 5 中分布于细胞质和细胞核。为了研究b m a l g 一2 在家蚕细胞中的功能，我 们合成了d s r n a 并进行i 矾加实验。我们发现，当b m 5 细胞经7 2h 干扰后，其细胞 形态变化并不明显，但通过m t t 法检测后发现，其细胞活性有所降低。而流式 细胞仪检测的结果则说明，干扰后的b m 5 细胞被阻滞于g 1 期。 关键词：家蚕；凋亡相关基因一2 ；原核表达；多克隆抗体；亚细胞定位；r n a 干扰 i i 浙江理工大学硕士学位论文 t h es t u d yo na p o p t o s i s l i n k e dg e n e 一2i nb o m b y x ，咒d ，l a b s t r a c ta l g - 2 ( a p o p t o s i s - l i n k e dp r o t e i n 一2 ) i sa2 2 - k dc a 2 + _ b i n d i n gp r o t e i n b e l o n g i n gt ot h ep e n t a - e f ( p e f ) h a n dp r o t e i nf a m i l yt h a tc o n t a i n st h ec a 2 + - b i n d i n g h e l i x 1 0 0 p h e l i xs t r u c t u r e i tw a sd i s c o v e r e db ya “d e a t h t r a p d i f f e r e n t i a ls c r e e n i n g m e t h o d o l o g yt oi d e n t i f yn e wg e n e sl i n k e d t oa p o p t o s i s a l g - 2i su b i q u i t o u s l y e x p r e s s e di nm o u s et i s s u e s ，w i t hi t sh i 曲e s tl e v e lo fe x p r e s s i o nd e t e c t e di nt h y m u s a n dl i v e r t h ed a t af r o mt - c e l ll i n e si n d i c a t et h a ta l g - 2p r o t e i np l a y sac r i t i c a lr o l e f o rt - c e l lr e c e p t o r - ( t c r - ) ，f a s 一，a n dg l u c o c o r t i c o i d - i n d u c e da p o p t o s i s ，b e c a u s e d e p l e t i o no fa l g 2 i nt h e s ec e l l sb l o c k sa p o p t o s i sw h e r e a si t so v e r e x p r e s s i o n s i g n i f i c a n t l yp r o m o t e sa p o p t o s i s i n d u c e db yt h e s e s i g n a l s a c c o r d i n g t ot h e l a r g e s c a l es e q u e n c i n go f s i l k w o r mp u p a e ，au n i q u eb o m b y x m o r ie s tw a si d e n t i f i e d w h i c he n c o d e st h ea l g 2p r o t e i n w en o m i n a t et h i sn o v e lg e n ea sb m a l g - 2f o r p e f d o m a i n sc o n t a i n i n gp r o t e i n t h ef u l l - l e n g t ho f t h eg e n ei s6 9 7b p i tc o n t a i n sa n o r fo f5 3 4b p ，117b pn u c l e o t i d es e q u e n c ei n5 u t r ( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ) a n d4 6 b p n u c l e o t i d es e q u e n c ei n3 u t r ( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ) i te n c o d e s17 7a m i n oa c i d sa n d s h a r e sh i 曲l yh o m o l o g o u st ot h a to fe u k a r y o t i co r g a n i s mp r e v i o u s l yr e p o r t e d a c c o r d i n gt ot h es e q u e n c i n gd a t a ，t h em o l e c u l a rw e i g h ta n di s o e l e c t r i cp o i n tw e r e e s t i m a t e da s2 0 6 1k da n d4 9 7 r t - p c rt e c h n i q u ew a su s e dt oo b t a i nt h eb m a l g - 2g e n ef r o ms i l k w o r mp u p a e t h eo r fo ft h i sg e n ew a sc l o n e di n t ot h ep e t - 2 8 av e c t o r , a n dc o n s t r u c t e dt h e p r o c a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dp e t - 2 8 a - b m a l g - 2 r e c o m b i n a n tp r o t e i n w a s e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi n e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) i n d u c e db yi p t g t h ea n a l y s i so f s d s p a g es h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nh i s 6 一b m a l g 一2w a se x p r e s s e dh i 曲l yi n e c o l ib l 21 ( d e 3 ) a b o u tah a l fo fa l lr e c o m b i n a n tp r o t e i nw a ss o l u b l e b yh i s 6 a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , p r o t e i nh i s 6 - b m a l g - 2w a so b t a i n e d i m m u n i z a t i o no f r a b b i t sw i t hf u s i o np r o t e i ng e n e r a t e d h i g ht i t e r ( 1 ：12 0 0 0 ) p o l y c l o n a la n t i b o d i e s ， m e a s u r i n gb ye l i s a w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ea n t i b o d yc o u l db i n d i i i 浙江理工大学硕士学位论文 t h ee x p r e s s i o nh i s 6 - b m a l g 一2s p e c i f i c a l l y , a n db m a l g 一2i se x p r e s s e di nw h o l eb m 5 c e l le x t r a c t s l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p eo b s e r v a t i o ns h o w e d a l g 一2i sd i s t r i b u t e db o t hi nn u c l e u sa n dc y t o p l a s m w eh a v eb e g u nt oe x p l o r e t h ef u n c t i o no ft h eb m a l g 一2i nb o m b y xm o r ic e l l sb yr n a i a f t e r7 2ho fr n a i ，t h e c e l l sg r o wt h es a m ea sc o n t r o ls a m p l e ，b u tt h em t ta s s a yd a t ai n d i c a t e dt h a tw h e n b m a l g 2w a sk n o c k e dd o w ni nb m 5c e l l s ，t h ec e l lv i a b i l i t yw a si n h a b i t e d b yu s i n g f l o wc y t o m e t r y , w ed i s c o v e r e dt h a tt h eb m a l g - 2d o w n r e g u l a t i o ni nb m 5c e l l s r e s u l t e di nt h ei n d u c t i o no fag 1p h a s ea r r e s t k e yw o r d s ：b o m b y xm o r i ；a p o p t o s i s - l i n k e dg e n e 一2 ：p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ； p o l y c l o n a la n t i b o d y ；s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n i v k a n a p b m a l g 一2 e l i s a e s t i p t g m c s n c b i o r f p c r s d s p l a g e u t r x - g a l 浙江理i 大学硕士学住论文 缩略语 k a n a m y c i n 卡那霉素 a m m o m u m p e r s u l f a t e 过硫酸氨 b o m b y xm 。r ia p o p t o s i s q i 睦e r i e2 家蚕凋亡相关基因- 2 e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附实验 e x p r e s s e ds e q u e n c et a g表达序列标签 i s o p r o p y l t h i o - 1 3 一d g a l a c t o s i d e异丙基硫代一b d 、# 乳糖营 m u l t i p l e - c l o n i n gs i t e多克隆位点 n a t i o n a le e l l t e r f o r b i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t i o n 美国国立生物技术信息中心 o p e nr e a d i n gf r a m e开放阅读框 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 u n t r a n s l a t e dr e g i o n 非翻译区 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - b d g a l a c m s i d e5 - 溴_ 4 氯3 吲哚b d 半乳糖苷 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：繇无力 日期：溯7 年弓月2 z 日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保赠并向国家 有关部f l 域梳构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阉或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学饿论文的仝部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密臼，在 不保密i 学位论文作者签名：撵元为 日期：幻力年3 月? 2e 1 年解密后使用本版权书。 指导教师签名 同期： 浙江理i 大擘硕士学位论文 第一章凋亡相关蛋白一2 ( a l g 一2 ) 研究进展 1 1a l g - 2 概述 1 1 1a l g - 2 的发现 1 9 9 6 年，v i t o 等【3 】通过一种被称为“d e a t h t r a p ”的差异呈示法发现了一 种2 2k d a 的胞内c a 2 + 结合蛋白，由于该蛋白的表达与t 细胞的凋亡过程“4 密切相 关，因而将该蛋白的编码基因命名为凋亡相关基因一2 ( a p o p t o s i s 一1 i n k e d g e n e 一2 ，a l g 一2 ) 【3 4 】。研究表明，当通过反义r n a 技术降低a l g 一2 在t 细胞中的表 达水平时，由f a s 、t 细胞受体和糖皮质激素所诱导的t 细胞凋亡将会被抑制，反 之，若a l g - 2 在t 细胞中过表达时，上述的t 细胞凋亡过程则会被显著加强。 1 1 2a l g - 2 的结构 a l g - 2 蛋白在各个物种中都是高度保守的口一，它在哺乳动物、果蝇、线虫、 植物以及一些低等真核生物( 如变形虫) 中都存在着同源蛋白，特别是人与鼠的 a l g 一2 蛋白，它们的序列几乎完全相同( 见图1 1 ) 。a l g - 2 在各组织中均有表达， 其中以胸腺和肝脏中表达最高【5 】。以人a l g 2 为例，它由1 9 1 个氨基酸残基所组 成，编码该蛋白的a l g - 2 基因定位于第五号染色体的短臂( 5 p t e r 一5 p 1 5 3 ) ，由六 个外显子和五个内含子组成。尽管该基因所编码的蛋白并不大，但其长度却超过 4 2k b p 。造成这一情况的主要原因是第二个内含子的长度竟达3 2k b p 6 1 。如图1 1 所示，竖隔线所标即为内含子插入的位置。 浙江理i 大学硕士学位论文 罐咩罕鬻。产 i l l 、rj d 0s f l n v f 0r vkr6t0 h l j i lk i i t二1 0 jft - wn v = 0rvk f 1f i7 ) 嚣；蓼i 誊壤蹙i 冀鬟 r rrh1 图1 1 不同来源的a l s - 2 蛋白序列比对“1 f i g1 1a l i g n m e n t o f t h e a m i n o a c i ds e q u e a c e s o f a l g - 2 f r o m m o u s ea n d m r i i 从结构上看，a l g 2 由位于c 端的p e f 结构域和位于n 端的疏水结构域( n h b d o m a i n ) 所组成。 1 1 2 1p e f 结构域 首先，位于c 端的p e f 结构域是由五个e f 手型模体或类手型模体所组成。e f 手型模体是二级结构为螺旋一环一螺旋式( h e l i x l o o p h e l i x ) 的c a 2 + 结合模体。 一般说来，e f 手型模体由1 6 个氨基酸残基组成，具体结构如图1 2 所示。 xyz - y x 。z iii ii 口手型模体协1 44 i u y h ：i i o 4 0 1 0 g 1 i - o * * o t p - 1 1 1 1 1 1 ：* 1 1 c a 七i i 珥i n gl o o p 图1 2e f 手型模体示意图 f i g1 2e f - h a n dm o t i fs e q u e n c e e 代表酸性氨基酸残基；n 代表疏水性氨基酸残基；0 代表侧链含氧的氮基酸残基；g 代表甘 氨酸残基；i 代表脂肪族氨基酸残基；星号代表疏水性氨基酸残基。其中x 与一x ，y 与一y ，z 与一z 分别标示出一对与c a 2 + 形成配位键的氨基酸残基。0 1 e f 手型模体的存在使a l g - 2 可以与c a 2 + 发生结合。经研究发现，a l g 一2 存在有 两个高亲和性的c o 2 + 结合位点1 1 4 1 ，m a k i 等6 1 的研究更进一步表明，当这两个位点 与c a 2 + 结合时可促使a l g 一2 暴露其疏水区，从而使a l g 一2 与其结合蛋白发生相互作 用。 总体说来，凡是与a l g 一2 一样具有五个e f 手型模体的蛋白质，同归类于p e f 箭：黧 州州一学葚鬻； 镬i g o释黧篡如珊 渐江理i 大擘硕士学住论文 手性蛋白亚族【8 1 ，其成员包括s o r c i n 、p e f l i n 、g r a n c a l c i n 9 l 平4 c a l p a i n 1 0 , l l i 等。 这类蛋白具有一些共同的特征，如在一级结构上具有相当的保守性( 其同源性一 般都在4 0 以上) ，而在二级结构上则以a 螺旋为主等等。p e f 结构域的存在不仅 使得a l g - 2 具有结合c a 2 + 的能力，同时也是它形成二聚体的分子基础。a l g 一2 蛋白 从n 端到c 端的前四个e f 手型模体是成对出现的，如e f _ 1 ，e 卜2 成对，e f 一3 ，e f 一4 成对，而第五个e f 手型模体却无法成对。这是因为e f - 5 的一级结构中插入了两个 氨基酸残基( 如图1 3 中箭头所指) ，从而使e f - 5 失去了结合c a 2 + 的能力【8 】o e f 一1 e 口& z 2 & z z 2 糊 c a l ps - u b 一一e e v r q f i r l f a a l a c r d d 一嘧v 8 a 1 2 螂f b n k 审v t r e p d d f d g p g t9 6 - 1 4 i 一c a l po a u b一一8 i d e 日? k a 工釉。l a g e 尊一珥z s v 司 l r 2 $ l n r i i s k m k d l r t k g f s l5 4 2 5 8 7 b o r c i n 一- q t q d p l y g y f a a v a g q d 一0 0 j d a d e l q r c i t q s g i a g 一一g y k p f 肌3 0 7 2 g r a x l c a l c i n 一一s a g d s v y t y f s a v a g e e 卜g e v d a e e l q r c l t q s g x n g - t - y s p f s l4 9 - 9 1 l g 一2 一- p d q s y l w i g t q r v d k d p s c ：s d t # 0 0 a l s n g t p 一f n p 2 3 - 6 2 p e t l l n - 辨d p e y s 啪o s 妨s b i t s g y i s m 啦r 0 、憎c 研i 8 8 一f s d1 1 d 一1 5 j e f - 2 z e & z z z & a z 2 砑 c a l p8 - s u b 辨e r s 螂a v m d s 0 t 删x l r 嚣e e f k y 球檬砒豫w q a 一z y 聊 i 一c a l pl - s u b z 芭8 c r s h 研i ：州d r 0 k g l v 唧i l w n r i r ) 碍l s 一i ? r f s o r c l i ib c r ： 押s h l d r a 船g n 帖蹦b f 雎l 张，埘g w r 口一h # 1 s q r a n c a l c i n e t c b t m z a m l d r 口q t g 褂5 g e w f k e i 埘a 眦n w k e 一一档h t a l g 一2v t v r s ：! s h f o r e n x a 舯f s 础t g v w f y l t 硎口坤- v g r t p e f l l n蹦u 幽喇娜掌g r 卿y ( 事s a 功慨f 霉锚撙k 琦卅疆 e f 一3e f 一4 z z 2 口& & z 翻口z z z 2 & a z 口 f d t d r s g t i c s s e t p g x f e a 船自强n 拦h l y 她班# 曝￥8 一一d e s s n m d f d s 1 9 1 - 2 2 8 p d 二盘x s g g m s a y e h r m a t e s a g ? k l n k k l y e l r i t r y s 一g d ：a v d f e n6 2 7 6 7 4 翱”0 r 3 g r v d p o e l q k 札删g 砖l o p 掣嗍s i k r ! s - 一t h g k i t j d d 1 1 2 - 1 5 b v 呦0 s g r v e h h 豇r 触r g l m g r r l 8 p 口r 工、r k r y s - k - n g r f y d d 1 3 1 1 7 7 y d r o n 8 讲| 芏d k 髓l k 口l s g f g y f l s i f i a d i l i r 矧扫一r 口c r o q r p o 口1 0 2 1 5 0 蜘) r 口r s 稻，8 y t l m 口锄渊瑚岱p 0 计缸d v s 鱼耽p r 8 p 脚垃l 掰t 1 9 3 2 4 2 c a l ps - s u b乎l s c 熔一书黼鸭8 皤k d g 嘲南v k i 蛳q 篮穗y s 2 2 9 - 2 5 8 m - c a l pl s u b f v c c l h t l $ t h r i p g 扎d t d 二d 9 埘矬) l f p m 口0 = h f 6 7 5 7 1 4 s o r c i n摹4 a c 啡聊酣d s 张聃蛐a 0 凹，协脚2 d d ? i 舛嘲s y 1 5 9 1 9 8 g r a n c a l c l n 神a c c q k l r t d f 豫k r o h 二q a 0 0 出i q y d 卯b o g 弼 苴1 7 8 - 2 1 7 a h g - 2 张口g c j v 厶一一一弧f d i j m r y 口t d o d 0 w 矗耶髓0 y l s m v s i v 1 5 1 一l 1 p e f l l n释q v c t o l - - - 豁驴e 踟晰a v 郴率唧t 嘏 s r m l 2 4 3 - 2 8 t 。 干_ 。 图1 3 不同蛋白p e f 结构域的比对 f i g1 3s e q e n a l i g n m e n t o f t h e p e f d o m a i n s 晶体分析的结果表明，上述这个不能与c a 2 + 结合的e f 一5 模体就是a l g - 2 发生同 二聚化或与p e f 亚族蛋白的其他成员形成异二聚化的关键区域。大量研究表 明，二聚化现象普遍存在于p e f 亚族蛋白的行为中”】，如l o 等 1 4 1 通过研究a l g - 2 的突变体蛋白证实了当c a ”浓度较低时，两个a l g 一2 蛋白是通过其e f 一5 手型模体的 相互结合来形成同二聚体的。另外，k i t a u r a 等【15 】也发现a l g 一2 可以与同族蛋白 p e f l i n 形成异二聚体，且该异二聚体会随着c a ”浓度升高时而逐渐发生解离。总 体上说，二聚体的形成能使p e f 亚族蛋白发生构象上的改变，从而为其提供了与 其他蛋白发生结合的位点，并进而诱发各种生物学效应。 9 戮狲戳躲东盟 b b s n 蛐“ “ 昏坤h醯：u礓：吾c；n 蛆卜驴扎昨 1 1 2 2n h b 结构域 浙江理i 大学硕士学位论文 位于a l g - 2n 端的疏水结构域富含疏水性氨基酸p r o g l y ，该段序列的存在 赋予了a l g 一2 与众多的结合蛋白相结合的能力m 】。n 端疏水结构域的差异是区别 各种p e f 亚族成员的重要依掘【l6 1 ，妻i p e f l i n 和a l g 一2 的n h b 序列长度虽然相差很多 ( 前者达1 1 5 个氨基酸残基，而后者却只有2 3 个) ，但是它们在一级结构上所相 差的只是序列为a p p g g p y g g p 的九个重复片段【7 】。因此，进一步研究p e f 蛋白在n h b 结构域上的异同，不仅有助于理解各种p e f 亚_ 族蛋白功能上的区别，也为找到这 些蛋白在进化上的关系提供了很好的切入点。 i 2a l g - 2 研究进展 1 2 1a l g - 2 与细胞凋亡 a l g 一2 得名于它在t 细胞凋亡中的作用，但它调节细胞凋亡的具体机制到现 在还不很清楚。1 9 9 9 年，j u n g 】等利用荧光共聚焦显微镜观察j u r k a t 细胞，他们 发现，当f a s 未被激活时，a l g - 2 基本上都富集于细胞膜附近，但是细胞经f a s l 处理之后，a l g 2 便立即迁移至胞质，并且a l g 2 蛋白在迁移的时候蛋白大小由 2 2k d a 转变为1 9k d a 。另外，l a c a n a e 等【1 8 1 的研究说明，a l g 一2 表达水平的下降 并不影响f a s t c r 糖皮质激素所引发的c a s p a s e 酶活上调。所以，a l g 一2 在信号通 路上的位置要么处于c a s p a s e 的下游，要么它根本与c a s p a s e 的活化无关。2 0 0 2 年， h w a n g 等 1 9 1 发现在b o s c 2 3 细胞中，a l g - 2 的过表达可以诱导a s k i 从胞质迁移 到细胞核，而c h e n 等【2 0 】发现r a f - 1 虽可使a l g 一2 磷酸化，但a s k l 还可使a l g 2 被 强烈磷酸化，且前者可以阻碍后者的发生。c h e n 等认为这是r a t - 1 通过a l g 2 来 发挥其抗凋亡功能的机制，同时，该研究也说明磷酸化修饰是调节a l g 2 活性的 一种重要方式。 不过，通过对小鼠a l g 2 基因的敲除实验，j a n g 等【2 1 墉到了一些令人困惑的 实验结果。他们发现，a l g 一2 敲除后的小鼠不仅可育且繁殖力很强，并没有发生任 何发育异常或免疫功能紊乱的迹象。此外，他们还发现敲除后小鼠的t 细胞不再 对t 细胞受体、f a s 和地塞米松的刺激表现出任何的抗性。对于这个出人意料的结 l o 浙江理i 天学硕士学位论文 果，j a n g 等的解释是，在生理条件下，a l g 一2 并不是上述凋亡过程所必需的，而 在哺乳动物细胞中可能还有某些功能上类似的蛋白，当a l g 一2 无法表达的时候， 它们便会逐渐替代a l g 2 在生长发育以及免疫系统中的作用。 1 2 2a l g 一2 的不同亚型 t a r a b y k i n a 等t 2 2 】在分析鼠肝c d n a 时，发现了两种不同的a l g 2 克隆：其一是 p t o 等在9 6 年发布的a 1 分2 序列，而另一种a l g 一2 克隆则缺失了编码g l y 川并t l p h e m 的序列。t a r a b y k i n a 等将这两种a l g - 2 蛋白分别命名为a l g 一2 ，5 和a l g 2 ，1 。研究 表明，这两种蛋白在鼠组织中都存在，其分子比为2 ：1 ，但这两种蛋白对c a 2 + 的亲和性差别较大，其 c a 2 + 】o5 分别为1 2m m 和3 1m m 。酵母双杂交显示，这两 种蛋白均有形成同、异二聚体的趋势。但与a l g 2 ，5 不同的是，a l g 2 ，l 不能与 a l i x 发生结合。另外，a u b r y 等 2 3 】在变形虫( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 中也 发现了两种a l g 一2 的同源蛋白：d d a l g 一2 a 和d d a l g 2 b 。通过研究，a u b r y 发 现，与ca _ h 的结合均可造成这两种蛋白疏水区的暴露。d d a l g - 2 a 同二聚体的形 成与c a 2 + 的浓度紧密相关，当d d a l g 2 a 的n 末端或e f ，5 模体被去除后则可阻止 其同二聚化。但d d a l g 一2 b 自身根本无法形成同二聚体，而只用当它被固定时才 能与d d - a l g - 2 a 形成异二聚体。在这两种蛋白中，只有d b a l g - 2 a 可与鼠源的a l i x 发生结合。 1 2 3a l g - 2 的亚细胞定位 早早在2 0 0 0 年时，k r e b s 和k l e m e n z 2 4 】就用荧光共聚焦显微镜观察了不同来源 的乳腺癌细胞系，他们发现了在细胞分化之前，细胞核内有高浓度的a l g 0 2 蛋白 的聚集。这之后，k r e b s 等【2 7 】又进一步地比较了癌细胞和正常细胞中a l g 2 的表 达，他们发现在癌细胞中a l g 一2 的表达水平发生了显著的上升，而且在许多癌细 胞的核内均出现了a l g 一2 的大量富集。因此，k r e b s 等推测a l g 一2 可能在大量增 殖的组织里起到了调节转录的作用，这一现象同时也说明了a l g 一2 有可能成为具 有临床意义的肿瘤诊断标志物。k i t a u r a 等 2 5 1 发现在j u r k a t 细胞中，分布于细胞核 与细胞质中的a l g 2 的量几乎一样。但在研究眼色素层黑素瘤的过程中，l a l i t a s u b r a m a n i a n 等1 2 8 1 却发现，无论是在正常黑素细胞，还是在黑素肿瘤细胞，a l g 一2 浙江理工大学硕士学住论文 和a l i x 都主要定位于细胞质，且当胞i 为c a 2 + 浓度发生改变的时候，其定位也不发 生改变。只有在细胞分裂中期核膜消失时，a l g 一2 和a l i x 才在除染色体外的全细 胞区域中出现。 2 0 0 6 年，m o n t a v i l l e 等2 9 1 利用不同颜色的荧光蛋白分别融合了a l g 2 与r n a 结合蛋i ! t r b m 2 2 ，然后将它们转染到n m3 t 3 细胞中。当进行单转染时，a l g 一2 融合蛋白大多集中于细胞质，而r b m 2 2 的融合蛋白则主要集中于细胞核。但当 进行共转染实验时，两者均有超过9 5 的蛋白共定位于细胞核，这说明r b m 2 2 可能与a l g 一2 在核内发生了某种功能性的结合。之后，y a m a s a k i 等 3 0 】又发现 a l g 2 可与c o p i i 复合物的组分s e c 3 1 a 的脯氨酸富集区发生结合。因为失去 c a 2 + 结合能力的a l g 2 突变体无法与s e c 3 1 a 发生结合，所以a l g 一2 与s e e 3 1 a 的结 合是c a 2 + 依赖性的。同时，a l g 2 的耗损还会造成内质网膜上s e c 3 1 a 蛋白水平的 下降。随后l ac o u r j m 等3 1 1 进一步利用某些能使胞内c a 2 + 浓度升高的刺激物处理 h e l a 细胞，他们发现原来弥散于h e l a 细胞胞质中的a l g 2 会与s e c 3 1 a 发生共定 位，并在胞质中呈点状聚集。而h i d e k is h i b a t a 等i “】在h e l a 细胞中的研究进一步 说明t c a 2 + 在a l g - 2 与s e c 3 1 a 的结合中所起到的作用。他们发现，当利用离子载 体a 2 3 1 8 7 处理h e l a 细胞后，升高的胞内c a 2 + 浓度可加强a l g - 2 在s e c 3 1 a 的共定 位，反之，当用螯合剂b a p t a a m 处理h e l a 细胞后，胞内的a l g 2 则更趋向于 弥散状态。以上的这些报道说明，当胞内c a 2 + 浓度升高时，a l g 2 很可能通过与 s e c 3 1 a 的短暂结合而参与到内质网和高尔基体之间物质转运过程的调控中。 1 2 4a l g - 2 a l i x 复合物的研究进展 1 9 9 9 年，v i t o 等旧与m i s s o t t e n 等各自利用酵母双杂交技术发现了第一 个a l g 2 的结合蛋白，后来的研究证明，这两个研究组所发现的实际上是同一 种蛋白，当时这一a l g 2 结合蛋白被分别命名为a i p 1 和a l i x 3 3 1 ( 下文均采用 a l i x ) 。那时两个研究组均发现a l i x 是以c 末端与a l g - 2 相结合的，m m i s s o t t e n 等【3 3 】还进一步证明，与a l g 2 的自二聚化不同，a l g - 2 与a l i x 的结合却是c a 2 + 依赖性的。事实上，c a 2 + 的存在往往是a l g 2 与其他蛋白发生结合的前提条件， 如s a t o h 等1 2 6 1 用酵母双杂交技术发现a l g - 2 的核内结合蛋白a n n e x i nx 1 只有当 a l g 2 因结合c e + 而暴露的其疏水面时才能通过其n 末端( a n x n ) 与a l g 一2 发生 浙江理工大学硕士学位论文 结合，这一结合方式可说与a l i x 用c 末端与a l g 一2 的结合方式如出一辙。另外， v i t o 等”1 还发现在成纤维细胞中，a l g 2 与a l i x 共定位于细胞质。同年，c h e 等1 3 4 1 在鉴定参与爪蟾卵母细胞成熟过程的调控基因时，又意外地发现了a l i x 的 同源蛋白x p 9 5 。c h e 等发现在爪蟾卵母细胞发生减数分裂期间，内源性x p 9 5 的保守区k d n d f i y 中的酪氨酸残基会被一种s r e 激酶所磷酸化，这提示a l i x 可能参与了细胞增殖的调控。这一观点随即得到了后来研究的支持：当a l i x 在 h e l a 细胞中发生过表达时，h e l a 细胞会发生g 1 期阻滞；当a l i x 在n i h 3 t 3 细 胞中发生过表达时，n i t 3 t 3 细胞的增殖则会被明显抑制，但是当a l i x 的表达水 平下降时，n i t 3 t 3 细胞的增殖却显著加强了。【4 2 】 a l i x 是一种在胞质中广泛表达的蛋白，它的c 末端具有大量的脯氨酸富集 区，这一区域就是与a l g 一2 发生结合的关键位点【3 5 l 。a l i x 的c 末端序列( a l i x c t ) 的过表达可抑制若干种刺激物介导的细胞死亡：如a l i x c t 的过表达可以部分保 护h e l a 与c o s 细胞免受因为营养因子的短缺而造成的细胞死亡【3 2 】，因此a l i x 可能具有调节凋亡过程的能力。a l i x 除可与a l g 2 发生结合以外，它可同许多 其他的结合蛋白结合。如在酿酒酵母中，m i x 的同源蛋白r i i i l 2 0 p 可与转录 因子r i m l 0 1 p 发生结合，而r i m 2 0 p 还可通过s n f 7 p 来活化半胱氨酸蛋白酶 r i m l 3 p ，从而达到切除r i m l 0 1 p 的c 末端区域并活化r i m l 0 1 p 的目的扭6 1 。s c o t t 等 3 7 1 通过酵母双杂交证明了s e t a ( 癌化星细胞内的含s h 3 结构域的蛋白) 具 有与g r b 2 ，c b l 和s b l 等信号转导相关蛋白结合的能力。同年，c h e r t 等p 8 】详细 报道了s e t a 与a l g 一2 a l i x 复合物之间的相互作用。他们发现s e t a 基因可编 码多个n 端含有s h 3 结构域的接头蛋白，而s e t a 蛋白的s h 3 - n 结构域可与 a l i x 的c 末端序列相结合，迸一步进行的免疫共沉淀说明，s e t a 与a l i x 结合 后还可同a l g 2 形成复合体。这一相互作用对星细胞凋亡极为关键。实验表明， s e t a 蛋白s h 3 一n 结构域的过表达可抑制由紫外线照射所诱导的星细胞凋亡，而 s e t a 蛋白其他区域的过表达则不会对上述凋亡产生抑制。k a t o h 等( 3 9 】发现 c h m p 4 a 和c h m p 4 b 可与a l i x 发生结合，且在h e l a 细胞中，c h m p 4 b 与a l i x 共定位于细胞质。而进一步的研究证明，c h m p 4 b 与a l i x 的结合比c h m p 4 a 更 强【删，而c h m p 4 b 已被证明与多泡囊体的分选有关，这提示了a l i x 可能与胞内 的物质转运有关。2 0 0 6 年，t s u d a 等 4 h 发现p o s h 蛋白可以与a l g 2 、a l i x 形 成复合物，而a l i x 则起到一个