（生物化学与分子生物学专业论文）孕马血清促性腺激素的分离提纯.pdf

摘要孕马血清促性腺激素( p r e g n a n tm a r es e r u mo o n a d o t r o p i n ，p m s g ) ，也叫马绒毛膜促性腺激素( e q u l c l ec h o r i o n i cg o a a d o t r o p f a ，e c g ) ，是从怀孕早期的母马血清中提取出来的种促性腺激素，由子宫内膜孔洞分泌产生的一种糖蛋白激素。它主要具有类似于促滤泡生成激素( f o l l i c l e s t i m u l a t i n gh o r m o n e ，f s i ) 和黄体生成激素( 1 u t e i n i z i n gh o r m o n e ，l h ) 的双重作用。p m s g 可以促进众多滤泡的生长，并可以促使它1 f j 最终的成熟，它的类似于l h 的活性可以促进发育中的滤泡排卵。一般地，当注入6 0 0 到1 5 0 0 i u 的p m s g ，动物即可进入动情周期，并可生成远多于正常情况下的卵子数目。在包括马在内的许多动物中，p m s g 可以促使卵巢生长并超数排卵。实践证明，同步注射p m s g ，还可以促使大量的饲养动物同步进入发情期。因此，p m s g 可以用于珍稀动物的人工繁殖、家畜的大规模生产以及动物体的研究。但是，混有杂蛋白的1 i 纯p m s o 常常引起动物的严重的健康问题，因此p m s g在畜牧生产上受到了极大的限制，市场上亟需纯的p m s g 。可以预期高纯度p m s g在市场上会有很好的前景。本试验旨在探索国内无人涉及的使用高效液相色谱进行埘p m s g 的分离提纯工作，以得到高效价的较高纯度的p m s g 样品，从而获得更好的经济效益。实验结果如下：1 无论是在柱层析中还是在h p l c 中，目标产物都位于第个蜂中。2 在两种方法中，目标产物都得到了提纯，效价测定时，实验动物并没有不良反应。1。3 在柱层析分离中，所获得的目标分离物效价( 1 1 7 3 i u ) 大于粗品效价( 6 0 i u ) ，并远大于其余产物效价( 6 1 9 i u ) 。4 在h p l c 分离中，耳栎分离物效份( 6 3 8 z u ) 远大于其余产物效价( 2 5 o i u ) 。5 在h p l c 分离中，目标分离物效价( 6 3 8 i u ) 和粗品效价( 6 0 1 u ) 大致持平，经分析，可能是试验条件所限导致部分蛋白质变性，如果采用蔓有利的实验条件，应该可以获得高纯度的目标分离物。6 经计算，分离产物的成本低廉，有良好的市场前景。关键词：p m s gi i p l c 流动相效价a b s t r a c tp r e g n a n tm a r es e r u mg o n a d o t r o p i n ( p m s g o re q u i n ec h o r i o n i cg o n a d o t r e p i n ，e g g ) ，w h i c hism a d ef r o mt h es e r u mo fp r e g n a n tm a r e ，h a st h ef t l n c t i o no fb o t hf o 】ic l e s t i m u l a t i n gh o r m o n e ( f s i t ) a n dl u t e i n i z i n gh o r m o n e ( l h ) 。i ta c c e le r a t e st h eg r o w t ha n d m a t u r a t i o no f t h e f o i l i c l e ，a n do n eo f i t s a c t i v i t i e s ，w h i c h i ss i m i l a rt ot h el u t e in iz i n gh o r m o n e ( l i i ) ，l e a d st ot h eo v u l a t i o no ff o i l i c l e 。g e n e r a l l y ，i fi n j e c t e d6 0 0 1 5 0 0l up m s h ，a n i m a l sw i l lt u r ni n t oe s t r a ma n dp r o d u c ef a rm o r eo v at h a nt h en o r m a lc o n d i t i o nt h e yd o 。p a r t i c u l a r l y ，i tc a nm a k em a n ya n i m a lst u r ui n t oo e s t r u ms y n c h r o n o u s l y ，w h i c hisv e r ya t t r a c t i v ei ns t o c k h r e e d i n g a sar e s u l t ，p m s gc a nb eu s e di nt h em a n yf i e l d s ，s u c ha st h ep r o p a g a t i o no fr a r ea n i m a la n ds t u d yo fa n i m a lb o d y 。，h o w e v e r ，i m p u r ep m s gc a nl e a dt os e r i o u sh e a l t h ym a t t e r s ，s oi th a sar e s t r i c t i v ea p p l i c a t i o ni np r a c t i c e 。t h i n k i n go ft h eb r o a da p p l i c a t i o na n dt h ee n o r m o u sr e m a n d s ，j tc a nh ee x p e c t e dt h a tt h eh i g h l yp u r l f i e d 融骼gp r o d u c tw i l lh a v eav e r yg o o db u s i h e s sp r o s p e c t m ye x p e r i m e n ti st oe x p l o r et h ef e n s i b i l i t yo f p u r i f y i n gt h ep m s ( ；w i t hh p l c 。l h er e s u l t sa r ea sr e ll o w s ：1i nb o t ho ft h et w op u t i f i c a t i o nm e t h o d s ，t h ep r o d u c t sw ew a n t e da r ei nt h ef i r tp e a k 2 t h ep r o d u c t sw ew a n t e da r ep u r i f i e di nb o t hm e t h o d s ，a n dt h ee x p e r i m e n t a la n i m a l sh a v en oa n ys i c kr e a c t jv n v 3 i nt h ec o n c l u s i o no fc h r o m a t o g r a m ，t h ep r o d u c tw ew a n t e dh a sam o r ee x c e l l e n ta c t i v i t y ( 11 7 3 i u ) t h a np b l s gs a m p l e ( 6 0 l o ) d o e s，4 i nt h ec o n c l u s i o no fc h r o m a t o g r a p h ，t h ep r o d u c tw ew a n t e dh a sam u c hb e t t e ra c t i v i t y ( 6 3 8 i u ) t h a no t h e rp r o d u c t s ( 2 5 o i u ) d o e s ，a l t h o u g hit sa c t i v t t yisa l m o s te q u a lt ot h ec r u d es a m p l e s ( 6 0 1 u ) 5 h a v i n gad e t a i l e da n a l y s i s ，w ef i n di fw ei m p r o v et h em a c h i n e sa n de x p e r i m e n t a lc o n d it i o n s w ew 】j1g e tam o r ee x c e l 】a n te o n c u s i o nt o o ，6 h a y i n gad e i a i l e da n a l y s i s t h i sm e l h o dw i l lh a v eav e r yg o o db u s i n e s sk e y w o r d s ：p m s gh p i cm o b i l ep h a s ea c t i v i t y南开人学硕士学位沦文日u舌一总论孕马血清促性腺激素( p r e g n a n tm a r es e r u mg o n a d o t r o p i n ，p m s g ) ，也叫马绒毛膜促性腺激素( e q u i n ec h o r i o n i eg o n a d o t r o p i n ，e c g ) ，是从怀孕早期的母马血清中提取出来的种促性腺激素，由母马胎盘合体滋养层细胞合成和分泌，具有黄体生成素( t u t e i n i z i n gh o r m o n e ，l h ) 和促滤泡生成素( f o l c l e s t i m u l a t i n gh o r m o n e ，f s l l ) 的功能。p m s g 在未成熟雌性鼠体内的生物活性类似于l h 和f s h 的混合体，促进滤泡和子宫的生长与成熟，促进间质组织成熟，引起明显的黄体化，它的类似于l i 的活性可以促进发育中的滤泡排卯。一般地，当注入6 0 0 到1 5 0 0 i u 的p m s g ，动物即可进入动情周期，并可生成远多于订三常情况下的卵子数目。在雄性鼠体内的活性也与l i 和f s h 的混合体类似，使睾丸重量增加，精囊和前列腺增大。在某些动物交配期间注射p m s g ，可以改善胎盘的形成和生长以及产仔率。 12 矗4 5 7 9 jp m s g 是一种糖蛋白激素，含糖量很高，占分子总重的4 5 左右。已报道的p m s g 分子量范围不一致，范围在4 9 0 0 0 - - - 6 8 5 0 0 之间。p m s g 是种酸性蛋白质，等电点p h i 8 2 4 。p m s 6 含有两个亚基，这两个弧基彼此不同，以非共价键结合，分别称作n 皿基和b 一亚基。它们均含有糖侧链，通过n - 糖苷键依附在氨基酸残基的氨基上。p m s g ，表一p m s g一p m s g 和b p m s g 的糖含量如下p m s g 和d p m s g 的糖含量糖p m s g一p m s gbp m s g岩藻糖0 2o 1痕量忖露糖2l3 42 3半乳糖1 4 13 91 47葡葡糖胺1 3 67 81 4 3半乳糖胺411 74 6唾液酸1 1 o631 2 9总和4 5 i2 324 88最中数据为g l o o gp m s g 分子中有二硫键，半胱氨酸能引起p m s g 完全失活，说明二硫键对分子的活性很重要。p m s g 分子中的唾液酸含量较高，因此它的等电点很低。p m s g 与l h 和f s h 不同，l 和f s h 的糖侧链部分对激素在靶组织位置上表现活性并不重要，但对减缓激素分子在体内被蛋白水解酶裂解，可能起着重要作用，而p m s g糖侧链中的唾液酸对活性的表现则必不可少( 用神经氨酸苷酶处理p m s g ，电使南开大学硕h 学位论文前言其活性丧失) 。有不同方法纯化得到的p m s g 纯品中的唾液酸含量是有微小差别的，从而导致它们的l h fs h 活性不同，唾液酸含量高的p m s g 分子的体内生物活性高。另外，高温、极度的酸和碱的条件都能引起活性迅速丧失。1 5 , ”二p m s g 的分离提纯的研究进展1 国外的研究进展自从发现了p m s g 以后，已有许多学者投入到孕马血清促性腺激素纯化技术的研究中，并提出了相应的方法。它们的目的在于得到p m s g 的绝对纯品，用以研究p m s g 的分子结构和l h f s h 双重效价特征。因此他们的纯化产物的活性往往超过一万，但是纯品的产率是极低的，一般在2 0 以下，孕马血清的损耗量极大，单位重量的p m s g 纯品的造价是相当高的。在五十年代至六十年代初，r a a e k eb o u r i l i o n 和g o t 以及l e g a u l td e m a r e等人已获得了活性达到1 5 0 0 0 1 u m g 的高纯度p m s g ，但是他们所采用的分离方法繁琐费时。到六十年代末，d e n n i sg o s p o d a r o w i c z 和h a r o l dp a p k o f f 提出一种较为简便的方法：先用偏磷酸去掉血清中的杂蛋白，然后用乙醇分段沉淀，再经s e p h a d e xg 1 0 0 和s e - - s e p h a d e xc 一5 0 色谱柱分离，可得到效价为1 5 8 0 0 1 u m g的纯品。但是利用他们的方法得到高效价纯品时，在后期提纯过程中，必须再引入柑血清，即将商品p m s g ( 2 0 0 0 i u m g ) 溶解于马血清( 2 5 0c f 【g p m s g 5 0 0 m l 血清)中，然后采用上述方法依次进行分离，方可得到高效价的纯品。由于粗血清的再引入使该方法在生产：【艺上不能行之有效。进入八十年代后，w 订1j a mt m o o r e ，j r a n dd a r e 1n w a r d 经过大量的实验推出两种纯化p m s g 的方法。一种是利用羟基磷灰石从部分纯化的商品p m s g中提纯得到具有高效价的p m s g 。经过仔细选择羟基磷灰石上获得的组分，一次色谱分离即可得到完全纯化的产品( 1 3 0 0 0 i u m g ) 。另一种是将四氨乙基( q a e )s e p h a d e xa 一5 0 和s e p h a d e xo - 2 0 0 并用，但得到的最好的组分仍含有微量杂质( 1 1 7 0 0 i u m g ) 。2 国内的研究进展由于国内在生物学领域的研究才刚刚起步，p m s g 的纯化方法仍停留在较为初级的水平，只能生产效价较低的商用p m s g 粗品( 粗品效价为3 0 0 l u m g 精品效价为1 0 0 0 i u m g ) 所采用的方法即用偏磷酸去掉血清中的杂蛋白，然后用乙醇分段沉淀。国内的一些研究人员也曾试图利用s e p h a d e xg 一2 0 0 色谱柱获得效离开大学艇f j 学位论文前言价高的p 娜g 制品，但组分分离效果差，耗时长，价格昂贵，影响其规模提纯。目前国内的p m s g 作为生殖激素已用于猪、牛、羊、兔等牲畜，效果较好，没有明显的副反应。但是国内的p m s g 商品要想打入嗣际市场，实力远不够- 效价低是主要症结。三蛋白质的分离纯化概述蛋白质的分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一，和其它生物产品的生产过程一样，蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。一k 、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。目前，生产蛋白质的上、中游技术如基因突变、基闳重组与表达、基因工程菌的大规模培养等技术发展很快，而下游蛋白质分离纯化技术却没有得到相应发展。很多蛋白质在实验室规模已生产成功，但却无法走句工业化生产而取得经济效益和社会效益。因此，急需发展蛋白质分离纯化技术。蛋白质的分离纯化是一项细致的，i 作，有时制备一个纯度较高的蛋白质要付出艰巨丽长期的努力。制备工艺涉及物理学、化学和生物学等较为广泛的知识。在这个繁杂的过程中需要许多复杂的技术操作，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能够把任何一种蛋白质从复杂的蛋自质混合物中提取出来，但是对于任何种蛋白质都有可能选择一套适当的分离程序以获得高纯度的制品。所以提纯某种蛋白质时，各种方法都要尝试。试验前要进行充分调查研究，对自己欲分离提纯的蛋白质有一定的了解，同时要建立相应的分析鉴定方法，以指导分离纯化工作的顺利进行。( 一) 蛋白质分离纯化的特点i 大多数蛋白质产品是生物活性物质，在分离纯化过程中，大部分有机溶莉、溶液ph 值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。2 蛋白质产品在物料中含量很低，且物料组成非常复杂。例如，利用基因工程菌发酵生产蛋白质，物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等，目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1 。有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体，为获取蛋白质，还需进行细胞破碎，结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。置含蛋白质产品的物料不稳定，蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。4 很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用，因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的，产品无菌、无致热源等。0 0 南开大学硕k 学曲论文前言( 二_ ) 蛋白质分离纯化的基本过程各种蛋白质的分离纯化都有一个基本相似的过程。1 ，选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的材料，进行预处理。例如去除动物组织的结缔组织、脂肪组织，植物种子的去壳除脂，分离微生物的菌侨和发酵液，破碎细胞、分离细胞器等。2 把蛋白质从原来的组织和细胞中以溶解的状态提取出来并保持原有的天然状态，不失去生物活性。常用的溶剂是稀赫溶液和缓冲液，某些与脂类结合牢固、或分子中非极性侧链较多的蛋白质可以用有机溶剂提取。3 用适当的方法将蛋白质从抽提液中分离出来，并将所需蛋白与其他杂蛋白分开。山于原料中蛋白成分复杂，因此提纯一种蛋白质往往需要经过许多步骤才能完成，可以根据情况选择不同的方法完成。4 纯度鉴定。较好的方法是层析法和电泳法，检验有生物活性的蛋白质则以测定活性最为可靠。一般以两种以上的方法相互验证，才能肯定一种蛋白质的纯度。( 三) 实现蛋白质产品的分离纯化应解决的问题i 设计蛋向质产品分离纯化的最佳工艺，用最少的步骤获得最大的产率、最高的纯度，同时做好各种措施确保蛋白质的活性。2 发展蛋白质纯度的快速分析检测技术。在下游的各道工序，准确、快速地对蛋白质产品进行纯度分析和活性检测，以保证产品的质量。3 搞好上、中、下游技术的配合，便于蛋白质产品的分离纯化。大多数蛋白质产品的分离纯化，需消耗大量的人力、物力，因此应尽可能改进上、中游技术，减少下游过程负荷。例如，利用金黄色葡萄球菌，发酵生产a 蛋白。通常，a 蛋白结合于菌体胞壁上，需要进行细胞破碎，然后将a 蛋白从胞壁上剪切下来，过程繁琐，难度大。若运用生物技术培养出a 蛋白分泌型菌来生产，a 蛋白的分离纯化就容易得多。 1 0 l( 四) 分离纯化蛋自质的传统方法分离纯化蛋白质的方法很多，对于不同的目标产物，分离纯化方法不同。选择合适的工艺路线，取决于目标产物的理化、生物特性。例如，。目标产物和杂质的密度不样，可采用离心技术加以分离；目标产物和杂质在一定的溶液环境中溶解度不同，可采用沉淀技术加以分离；目标产物和杂质在亲水性高分子两相溶液中分配不同，可采用双水相萃取技术加以分离；若目标产物和杂质等电点不同，口j - 采用离子交换层析和电泳技术分离。通常，为获得高纯度目标产物，往往需要剐舌综合利用目标产物的理化特性，采用多种分离技术绢合，但分离步骤多，分离时m 长，则影响目标产物的得率和回收。传统的方法主要有以下几利1 ：1 1 1 2 ，”1 4 1 5 1 6 ”18 。1 9 】1 区带离心法区带离心法是分离蛋白质的一种有效而且常用的方法。该法的第一步是在离心管中形成个密度梯度( 常用蔗糖梯度) ，然后将待分离的蛋白质混合液放在密度梯度顶端。超速离心时，各蛋舟质通过密度梯度移动，依据沉降系数的不同被分 r ，最后在离心管中被形成各自不同的区带。如果在底部刺一小孔逐滴放出，分部收集，很容易将沉降系数不同的蛋白质分开。2 层析法在众多的蛋白质分离纯化技术中，层析是一+ 门关键的技术，它通常在分离工序的后部，决定着产品的纯度和收率。和其它分离技术相比，层析技术具有以下特点：( 1 ) 分离效率高。离心、沉淀、双水相萃取技术往往只能获取耦产品而运用层析技术，可得到纯度较高的生物产品。例如，在中空纤维膜反应器内培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，单克隆抗体存在于杂交瘤细胞培养液中，采用沉淀分离技术只能获得粗产品，为提高单克隆抗体纯度。还必须结合离子交换层析、分子筛层析等。若运用亲和层析技术，以a 蛋白为配基，从杂交瘤细胞培养上清液中，经一步纯化，得到的单克隆抗体纯度可达到电泳纯；( 2 ) 和电泳分离相比，层析过程易于放大，易于自动化。若采用电泳技术分离蛋白质，虽然产品纯度非常高，但其过程却产生大量的热，不但有损于蛋白质的生物活性，而且过程难于放大。层析过程并不产生明显的热量，放大可采用加大柱径和高度的方法。运用计算机进行控制，还可实现操作过程的自动化；( 3 ) 层析技术适用性广。差不多每一种蛋白质纯化过程都包括层析技术，或者是离子交换层析，或者是分子筛层析，或者是几种层析技术的组合。针对蛋白质不同的生物特性，采用不同的层析技术，可获得纯度很高的蛋白质产品。在蛋白质分离纯化方法中，层析技术占有重要地位。当然层析技术的成功应用电需要和其它的分离技术相配合。特别是前面的离心、沉淀等过程对层析效果的好坏也有很大的影响。最常用的传统方法是凝胶过滤法和离子交换层析法。( 1 ) 凝胶过滤法( 分子筛层祈、分子排阻层析)凝胶过滤是一种快速而简便的分离分析技术，可用于蛋白质的脱盐、分离、提纯、分析。柱中的填充料是水合程度高而不溶的碳水高聚物，最常用的是葡聚南开大学硕j 一学位论文前言糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。葡聚糖凝胶是具有不同交联度的刚状聚合物，不同型号的葡聚糖凝胶其“网眼”大小不同，可以用来分离纯化不同分子大小的物质。当蛋白质混合物通过层析柱时，比“网眼”大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着颗粒间隙流动，流程短，速度快，最先流出层丰j i 柱；比“网眼”小的分予则进入凝胶颗粒内部，沿着孔道移动，从一个颗粒流 j 又进入另一个颗粒，导致移动速度慢，随后被洗脱下来。这样不同大小的蛋白质分子由于流经距离不同而得到分离。( 2 ) 离子交换柱层析离子变换层析是早期蛋白质层析方法之一，目前仍被普遍使用a 离子交换层析是指液相中的离子与固相( 交换剂) 上活性基团离子的可逆交换反应，利用此反应将要分离的混合物先在一定p h 值的溶液中全部解离，然后流过固相使之与同相l 的离子进行交换，吸附于固相上。再根据混合物中各组分解离度的差别，用不同川的溶液分别洗脱下来。分离蛋白质常用的交换剂是纤维素离子交换剂，在纤维素上引入不同的活性基团( 酸性或者碱性) ，就成为了不同类型的离子交换剂。其中，酸性基团可以解离出 与溶液中的阳离子进行交换，日q 做船离子交换剂；碱性基团可以解离出0 卜r 与溶液中的阴离子进行交换，叫做阴离子交换剂。常用的阳离子交换剂是弱酸性的羧甲基纤维素( c m 一纤维素) ，阴离子交换剂是弱碱性的二乙氨基乙基纤维素( d e a e 纤维素) 。纤维素离子交换刹对蛋自质的交换容量大，分辨率高能获得较好的分离效果以及较高的回收率。此外，在与溶液中的离子交换后，对离子的吸附力较弱，在比较温和的条件f 即可被洗脱下来，不影响蛋白质的活性。蛋白质混合物的分离可通过改变溶液中盐离子强度和d h 来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质最先被洗脱f 来。当前离子交换层析的一个最重要的改进是：把离子交换和分子排阻两种效应结合起来，用于这种层析的材料有d e a e 一葡聚糖等。( 3 ) 其它的层析方法羟基磷灰石层析基于羟基磷灰石对一些蛋白质的吸附作用进行分离。虽然羟基磷狄石层析应用有限，但其分离成本低，在对某些蛋白质如血浆铜蓝蛋白的分离方面有独到之处。疏水作用层析、反相作用层析利用组分问疏水性的差异分离各组分。用于疏水作用层析、反相作用层析的固定相表面都带有疏水作用基团。不同的是，疏水作用层析固定相表面的疏水基团疏水性弱，一定盐浓度的蛋白溶液流过固定相南开火学硕士学位论文时，蛋白质被吸附，然后以低盐水溶液作为洗脱剂进彳予洗脱。而反相作用层析固定相表面的基团疏水性强，蛋白质水溶液流过固定相时，蛋白质被吸附，然后用有机溶剂洗脱。疏水作用层析多用于大分子蛋白质的分离纯化。反相作用层柝分离蛋白质时，蛋白质容易变性失活，一般用于小分子蛋白质、多肽和氨基酸的分析、分离。亲和层析是6 0 年代发展起来的一种高效、快速蛋白质分离纯化技术。通常的层析方法都是利用蛋白质理化性质的差异来进行分离的，这种差异往往并不是很大，所以，分离精度不高。亲和层析则利用蛋白质分子与某_ 分子专一可逆结合的生物特性，来选择分离目标蛋白质。亲和层析容量大，分离效率高，且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用。随着染料配基、人工定向合成配基的应用和配基偶联技术的发展，亲和层析技术更加适用化。特别是由于任何蛋白质都具有抗原性，通过杂交瘤技术均可制备相应的特异性单抗，以单抗为亲和配基，去分离对应的目标蛋白质，可以实现各种天然、重组蛋白质的高效、快速分离纯化。近年来，随着人们对蛋白质分子结构的深入研究和其它学科的发展，又出现了一些新的蛋白质层析方法，如金属螯合层析、层析聚焦等。这些层析技术在蛋白质分离纯化上都发挥着重要作用。下表给出了一些常用的层析方法及其特征。表二常用的层析方法及其特征层析方法作用原理分辨率容量分f 筛层析分于体积与形状低低离子交换层析离了交换中高疏水作用层析疏水作用中中反相作用层析疏水作用中中亲和层析：生物 一亲和屋析生物活性高高免疫亲和崖析抗原与抗体作用高高染料亲和层析蛋白质与染料分子吸刚中高金属螫台亲和层析蛋臼质与金属离子络台由高层析聚焦等电点高由( 4 ) 层析固定相1各种层析技术的成功应用，首先要有合适的层析固定相，可以说，层析固定相决定着层析技术的发展。大多数层析固定相是官能化的载体，所以，层析固定相又直接决定于层析载体。早期使用的各种强酸、强碱型离子交换树脂等固定相不适7南”火学项学位论文n # 吾用于蛋白质的分离。适用于蛋白质分离纯化的固定相必须具有高度的亲水性，并具有一定的三维空间结构和疏散度，以便丁二生物物质的扩散进出，通过表面作用或体积排阳实现蛋白矮的分离。到6 0 年代，纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖凝胶等的使用，使各种蛋白质层析技术的应用得以实现。琼脂糖由于其高度的亲水性、颗粒网孔结构的均一性和惰性，是一种很好的层析载体。但琼脂糖凝胶易压缩，使得层析柱的放大受到限制。交联琼脂糖的刚性、对p h 值和温度的稳定性比琼脂糖人大提高。到7 0 年代末，高效液相层析的开发成功，可以说是层析技术上的一次革命。高效液相层析大多以硅胶、合成聚合物为层析固定相载体。和常规层析1 i 同的是，高效液相层祈固定相颗粒刚性大，粒径小，一般在5 1 0 um ，目标产物在颗粒内传质快，层析操作时间短，分辨率高。通过对硅胶、合成聚合物表面进行修饰，可以实现分子筛、离子交换、疏水作用、反相作用、亲和等高效液相层析。目前，高效液相层析已被广泛用于各种生物物质的分析和制备。由于高效液相层析使用小颗粒固定相，所以操作压降很高，在设备上高效液相层析需要高压泵，层析柱、阀门、管道必须由不锈钢制造，设备价格昂贵。为了避免高压操作带来的问题，人们又开发出各种新型的制备层析介质，如灌注层析介质、膜介质等。】9 8 7 年美国p e r s e p t i v eb i o s y s t e m s 公司首推灌注层析介质。灌注层析的特点是含有双孔结构，即除了常规层析介质的大量微孔外，还含有纵横交错贯穿介质的“大孔”。快速蛋白质液相层析系统就是采用这种介质为固定相，其操作压降介于常规和高效液相层析之间。膜层析则是以膜为载体，对膜的内外表面进行修饰，接上宫能团来分离纯化蛋白质。出于膜具有良好的通透性和蒯压性，使得层析可以高效、快速进行。灌注层析介质与膜介质的开发，是层析技术的新突破。3 电泳电泳指蛋白质在不处于等电点状态时可在外加电场作用下向着与其自身电性相反的电极运动。电泳是分离蛋白质和鉴定蛋白质纯度的重要方法。由于不同蛋白质分子所带的净电荷及分子大小和形状不同，导致泳动速度彳i 同，移动距离不同，从而得到分离。常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳、s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳是由丙烯酰胺( a c t ) 和甲叉双丙烯酰胺( b is ) 聚合而成的网状结构物，“网孔”大小可以通过改变a c r 和b 【s 的含量来控制。凝胶具有分子筛的作用，比“网孔”大得多的分子几乎不可以移动，比“网孔”小的分子极易通过凝胶而移动，大小居中的分子则以_ i 同的难易程度通过凝胶而移动。南开大学硕士学位论文聚丙烯酰胺凝胶电泳可以是连续的，也可以是不连续的。常用的是不连续系统，即由两种不同浓度的凝胶、p h 和缓冲液成分组成的电泳系统，这种电泳系统具有高度的筛选效应和浓缩效应。电泳样品在浓缩区被压成了薄层再进入分离胶中进行电泳，可以减少电泳各成分间由于扩散而造成的区带重叠，提高了电泳分辨率。s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶中加入s d s ( 十二烷基硫酸钠) 。s d s 使蛋白质变性，并与蛋自质结合成净负电荷很多的s d s 一蛋白质复合体，复合物的电荷量远超过蛋白质本身的电荷，同时也改变了蛋臼质的构象，使s d s蛋白质复合体在电泳中的迁移率主要取决于分子量( 与分子量的对数成正比) ，而其它因素可以忽略不计。s o s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳具有快速、灵敏、分辨率高、重复性好的优点。0 1ug 的蛋白质可以在考马斯亮兰染色中显出清晰的条带，而银染色则可以检出0 ，0 2 u g 的蛋白质。因此s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前应用最广泛的高分辨率的电泳，用于蛋白质的分离鉴定和分子量测定。等电聚焦电泳根据蛋白质的等电点的不同来分离蛋白质。宅的特点是：在支持物凝胶中加入两性电解质，建立一个由正极到负极、低p h 到高p h 的连续而稳定的p h 梯度环境。蛋白质混合物在这种凝胶上电泳时，具有不同等电点的蛋白质就会分别带上正电荷或负电荷，移向与它们各自等电点相当的p h 环境位置，最后聚焦在此位置形成一条集中的蛋白质区带。这样，经过一段时间后不同的蛋白质组分便被分隔在不同的区域中，各蛋白质聚焦部位的p h 就是他们的等电点。等电聚焦电泳具有分离、制备和鉴定蛋白质等多种功能。它的优点很多，例如，分辨率高，可将p h 差小到0 0 1 的蛋白质分开；可以抵消扩散作用，使区带越走越窄：无论样品加在什么部位都可以聚焦到等电点；可以直接测出蛋白质的等电点，等等。如果将等电聚焦电泳和s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳结合起来，可以达到极高分辨率的分离效果。q 发展方向蛋白质分离纯化技术种类很多，而且发展很快。某些技术如超滤，在十几年前还不多见，现在已在国内得到广泛应用。最广泛使用的层析和电泳方面也有不少新技术出现。例如，层析方面，高压液相色谱( t t p l c ) 是一种具有快速和高分辨率的柱层析技术，在此基础上出现的微柱p i p l c 具有更高的灵敏度和回收率。s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳，样品不易从凝胶中进行回收，除去s d $ 也是一个问题，采用电印记法后可以把蛋白质从凝胶上转移到p v d f 膜上进行原位分析。又如等南开大学硼j 一学位论文剖舌电聚焦电泳，从柱状发展到超薄型的平板电泳，既节约了样品，也降低了两性电解质等试剂的消耗。而且除了分析型的等电聚焦电泳外，最近几年又兴起了制备型的颗粒胶等电聚焦电泳，上样量可达克级。另外，在电泳领域又有了一种新技术一毛细管电泳，其分离效果比h p i c 高2 3 倍，灵敏度更高，分析时间更少，所需样品量极少。总之，蛋白质的分析分离方法快速、灵敏、高自动化方向发展。四使用t i p 。c 分离纯化蛋白质蛋白质是生命有机体的主要成分，在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。所以分离和检测蛋白质一直是人们研究的热点。根据r e g n i e r 的说法：蛋白质是半僵硬的，大小、形状和表面都不均一，是各有特征的分子。这样就给分离和检测蛋白质赋予了不同的特点。目前，h p l c 技术广泛地应用于蛋白质的分离和检测。这是由于高效液相色谱法具有许多优点：( 1 ) 与结晶、过滤等传统分离方法比较，它可以提供更佳的分离效果，并且一次可以得到2 个以上的高纯度组分：( 2 ) 分析速度快，一般可以在3 0 m i n 内完成：( 3 ) 样品回收简单，检出范围达n g 或p g 级；( 4 ) 方法灵活机动，一台高效液相色潜仪只需更换不同的色谱柱和检测器，便可适用于不同的分离要求。近来，随着色谱泵的改进( 可产生l0 5 m p a 的压力) 出现了特高效液相色谱，使蛋白质的分离更快速高效。目前，h p l c技术同趋成熟，它己成为分离和检测蛋白质的重要工具。f 2 0 吲j l1 分离蛋白质的h p l c 模式蛋向质在物理、化学及功能等特征上的差异为蛋白质的分离检测提供了基础。根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、功能等特性以及蛋白质的来源、实验要求等可以选择不同的模式来分离目标蛋白质。( 1 ) 反相高效液相色谱( r e v e r s e p h a s em g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，r p i i p l c )在h p l c 各种模式中，r p h p l c 应用最为广泛。其固定相是非极性的，而流动相是比固定相极性更强的溶剂系统。蛋白质分子疏水性的不同使其在两相中的分配不同而得到分离。近十几年来，r pi t p l c 以其高分辨力、快速、重复性好等优点广泛应用于蛋白质的分离分析。有利于蛋白质分离的条件于1 9 7 0 年首次提出，即低p h 值流动相、室温或较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分。三氟乙酸( t f a ) 作为离子对试剂，是反相色谱中最常用的添加剂。蛋白质的保留性质和选择性还与键合固定相的性南开人学倾l 学位论文前言质有关，实验证明，大孔硅胶( 2 0 3 0 n m ) 短链烷基( c4 和c8 ) 键合固定相适合蛋白质的分离；另外，无孔径载体柱对分子量相差较大和疏水性很强的蛋白质混合物的分离效果很好。从分子量6 0 0 0 的胰岛素到分子量6 6 0 0 0 的牛血清白蛋白在无孔径载体杜上均能得到良好的分离，并且分离速度很快( 散25 m i n )较高的柱温还能改善蛋白质混合物的分离；d a nj e lb 。w a l l 等利用c18 非多孔硅粒载体柱实现了细胞浴菌物中蛋白质的快速分离。并且，利用这种方法，在15 m i e 内大肠杆菌的整个细胞溶菌物水溶液中的蛋白就可以得到很好的分离。( 2 ) 高效离子交换色谱( h i g hp e r f o r m a n c ei o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，h p t f c )h p i e c 是根据蛋白质分子在一定的p h 利离子强度条件下所带电荷的差异进行分离的方法。这种技术已经成功她用于分离蛋白质，并且，当选择的流动相的p lj 值合适时能维持蛋白质的生物活性。由于i i p i e c 是一吸附性的梯度洗脱过程，所以具有很好的负载力。近几年来h p i e c 也成为分离检测蛋白质的重要方法。并且，人们的研究证明h p i e c 与r p h p l c 都是分离膜蛋白的首选方法。在离予交换色谱填料研究方面，聚合物离子交换剂颇受重视。因为这种固定相具有稳定性好、离子交换容量大、对蛋白质的分离有选择性等特点。( 3 ) 高效凝胶过滤色谱( h i g hp e r f o r m a n c eg e lf i l t r a t i o nc 1 r o m a t o g r a p h y )凝胶过滤色谱也称体积排阻色谱( s i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y ，s e c ) ，是根据分子相对大小进行分离的一种色谱技术。相对于吸附性液相色谱技术而青，s e c 的分辨力和样品负载力都很低。s e e 又是一一种温和的技术，可用来平衡柱及分离样品的缓冲液范围较广。所以近年来关于利用s e c 分离蛋白质的报道也不少。例如，b t m g e r 等成功的分离出疏水性肺的表面活性剂蛋白s p b 、s p c ；另外s e c 特别适合对蛋白质分子量的研究，利用s e c 能够快速分离出人血清白蛋白t i a s 的降解产物，结合特定的检测器即可测定其单体和二聚体的分子量。( 4 ) 高效亲和色谱( h i g hp e r f o r m a n c ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，h p a f c )蛋白质在行使功能时必须和底物、受体或抑制剂等分子进行生物专一性结合，这种高度专一| 生结合特性可用于亲和色谱分离。h p a f c 是蛋白质检测中最专一的分离技术，可以从复杂的混合物中直接分离到目标蛋白质，特别适合疫苗、糖蛋白和抗体等的分离纯化。周冬梅等研究了蛋白a 高效亲和色谱对水溶液及人皿浆中免疫球蛋白g ( h i g g ) 的特异性吸附和定量测定，方法具有较高的精确度和重复性。通过h p a f c 可以分离纯化酶、抗体、抗原、结合蛋白、受体蛋白、辅助蛋白等，也可以分离变性蛋白、化学改性蛋白等，可见h p a f c 在蛋白质化学中起南开大学硕士学位论文前言着重要作用。( 5 ) 其它液相色谱模式高效疏水色谱( h t c ) 是用来分离构象不稳定蛋白质的技术之一，其分离机制类似予反相液相色谱，只是用水性缓冲液代替了有机溶剂：以键合氟化物作固定相，用s d s 或c t a 8 作流动相的胶束高效液相色谱中，胶束提供了一个溶质溶解的非均相环境，可用于蛋白质的分离。近年来，人们将非线性色谱理论应用于蛋白质分离中，更加完善了高效液相色谱技术。在实际应用中，特别是复杂样品，通常采用几种分离模式结合使用才能获得理想的目标产物。2 用于蛋白质分离检测的h p l c 检测器( 1 i p l c d )在t l p l c 分析蛋白质中，h p l c d 的优劣对于检测效果有着至关重要的作用。近年来，t t p l c d 技术发展很快，其检测蛋白质的灵敏度以及其它性能都得到了很大的提高。( 1 ) 紫外l 】及收检测器( u va b s o r p t i o nd e t e c t o r )u v 检测器是目前应用最广泛的检测器，它灵敏度高，线性范围宽，可用于梯度洗脱。近年来较大的改进包括：采用高效的光学系统，噪声水平降低；测定波长变宽，可达1 9 0 - - 9 0 0 n m ：用时间程序切换波长，通过基线调整功能消除基线漂移；极宽的线性范围( 2 5 a u ) 及测量范围( 0 0 0 0 1 4 a u f s ) ；漂移低( 小于l 1 0 1 ) ；波长的准确度以及重复性好。h p l c 结合u v 检测器检测蛋白质的研究很多，主要是应用了其灵敏度高、重复性好等优点。v i c k e r se r 等建立了利用u v 检测器检测唾液中舒缓激肽的新方法，此方法操作简单，重复性好；s o n gh 等将u v 检测器用于凝血酶抑制剂的检测。另外用h p l c 分离检测鼠i f 【l 清中c d r i 一8 5 9 2 时，u v 检测器的应用使检测下限达到1 2 5 n g m l 。( 2 ) 光电二极管矩阵检测器( p h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t o r ，p d a d )p d a d 是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一种新型紫外检测器，它具有以下优点：( d 可得到任意波长的色谱图；可以在分离时得到各组分的紫外一可见吸收光谱；色谱峰纯度鉴定、光谱图检索等功能，可提供组分的定性信息。p d a d 的应用使得蛋白质检测的灵敏度提高，检测更加方便，并且稳定性增强。( 3 ) 荧光检测器( f l u o r e s c e n c ed e t e c t o r )荧光检测器是一种专用型检测器，具有高的灵敏度和可靠性。一般情况下，荧光检测器比紫外吸收检测器的灵敏度要高出两个数量级，对仪器的稳定性依赖较小，可作梯度洗脱，但是定量分析时线性范用较窄。所以，荧光检测器适于蛋南开人掌砸卜学位论文前言白质的痕量分析，尤其在用荧光衍生剂后。有人利用h p i c 结合荧光检测器分离和检测人血清中含硒蛋白质，取得了很好的效果，其中采用2 ，4 - 二氨基萘( d a n )作荧光衍生剂。另外，激光诱导荧光检测器由于其高的灵敏度，在蛋白质的分析中也受到人们的重视和利用。( 4 ) 电化学检测器e 1e c t r o c h e m i c a ld e t e c t o r ，e c d )e c d 是一种有效的痕量、超痕量的检测器。目前，h p i c e c 检测在蛋白质科学领域中具有独特的优点：选择性高；灵敏度离，检测限为n g 或p g ，线性范同为4 5 个数量级；分析快速，可用于梯度洗脱。( 5 ) 蒸发散射检测器( g v a p o r a t i v el 1 9 h ts c a t t e r i n gd e t e c t o r ，8 l s d )e l s d 是质量型、高灵敏度的通用高效液相色谱检测器，对未知物可以得到准确的定量。灵敏度和稳定性都很好，并且适用于梯度洗脱。由于它的这些优点，e l s d 丌始广泛用于蛋白质检测中。b u n g e r 等建立了分离检测肺部表面活化剂蛋白( s p s ) 的新方法，即利用s e c e l s d 来分析s p b 和s p c ，效果很好。( 6 ) 多角激光光散射( m u